Die Zellkulturmedien, fötales Kälberserum (FKS) und sonstige Zusatzlösungen wurden von Biochrom KG, Berlin, bezogen. Vom FKS wurde über den gesamten Zeitraum die gleiche Charge verwendet und vor Gebrauch eine Hitze-Inaktivierung vorgenommen. Als Standardpuffer diente, wenn nicht anders bezeichnet, grundsätzlich Dulbecco´s Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) ohne Ca²⁺/Mg²⁺ (Life Technology, Karlsruhe). Kollagenase/Dispase, Desoxyribonuklease (DNAse), E.C.3.1.21.1 und Endothelzell-Wachstumsfaktor (ECGF) wurden von Böhringer/Mannheim, Mannheim, Kollagenase von SERVA, Heidelberg und Rinderserumalbumin (BSA) von PAA, Cölbe, bezogen.

Die Primärkulturen wurden von Wistar-Ratten, die vom Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterenärmedizin (BgVV) Berlin geliefert wurden, gewonnen. Die Narkotisierung der Tiere erfolgte mit Narkoseether der Hoechst AG, Frankfurt M. Die für die Zellkultur verwendeten sterilen Plastikartikel wurden von den Firmen Becton Dickinson, Heidelberg, und Nunc GmbH, Wiesbaden, bezogen.

HAM´S F10 (mit 1,2 g/l NaHCO3) mit den nachfolgend aufgeführten Zusätzen:

• 20 % FKS

• Penicillin/Streptomycin (100E/µg/ml)

• Amphotericin B (100E/µg/ml)

• 1,2 mM N-Acetyl-L-alanyl-L-glutamin, so genanntes "stabiles L-Glutamin"

• 20 mg/l Endothelial Cell Growth Factor (ECGF)

• 100 U/l Heparin

• 250 µg Vitamin C

• 10 % FKS

• 2 mM L-Glutamin

• 1 % Penicillin/Streptomycin

Vom Lyophilisat wurde eine Stammlösung mit einer Konzentration von 25 U/ml in DMEM hergestellt. Diese wurde steril filtriert und in Aliquots zu je 2 ml bei -20 °C gelagert. Die Endkonzentration betrug 2,5 U/ml.

100 mg Lyophilisat wurden in 1 ml destilliertem Wasser aufgenommen, mit PBS auf 10 ml aufgefüllt, steril filtriert und in Aliquots zu je 1 ml bei -20 °C gelagert. Das Enzymgemisch wurde in einer Endkonzentration von 0,1 U/ml (Kollagenase) bzw. 0,8 U/ml (Dispase) verwendet.

25 g BSA wurden in 75 ml PBS aufgelöst, mit Sterilfilter easy-flow 0,45 µm filtriert und bei 4 °C im Kühlschrank aufbewahrt.

8 mg Trockensubstanz wurden in 10 ml PBS aufgelöst, steril filtriert, aliquotiert zu je 250 µl und bei -20 °C aufbewahrt. Die DNAse wurde in einer Endkonzentration von 10 U/ml verwendet.

Drei bis vier Wochen alte Wistar-Ratten wurden narkotisiert und danach dekapitiert. Das Gehirn wurde sofort entfernt und in eiskaltem PBS gelagert. Alle weiteren Arbeitsschritte erfolgten unter sterilen Bedingungen. Die Kortizes wurden präpariert und die Meningen durch Abrollen auf einem sterilen Löschpapier sorgfältig entfernt. Anschließend erfolgte mit Hilfe eines Skalpells und durch mehrmaliges Aufziehen in einer 2 ml-Spritze eine mechanische Zerkleinerung des Gewebes. Das homogenisierte Gewebe wurde in ein 50 ml-Zentrifugenröhrchen überführt, mit Präparationsmedium auf 18 ml aufgefüllt und Kollagenase (2,5 U/l) zugegeben. Es folgten eine einstündige Kollagenase-Verdauung bei 37 °C im Wasserbad und eine 30-minütige Inkubation auf Eis. Im Anschluss wurde das Gewebehomogenisat mit kalter 25 %iger BSA-Lösung in einem Verhältnis von 1:1 aufgefüllt und gut durchmischt. Nach einer 25-minütigen Zentrifugation bei 1400 g und 4 °C wurde das entstandene Pellet in 10 ml Präparationsmedium resuspendiert und Kollagenase/Dispase zugegeben. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei 37 °C wurde das Homogenisat bei 4 °C und 550 g für 10 min zentrifugiert, und das Pellet in 5 ml Präparationsmedium resuspendiert. Der Zugabe von 125 µl DNAse und kurzer Inkubation folgte eine erneute 10-minütige Zentrifugation bei 550 g und 4 °C. Das Pellet wurde in 10 ml Präparationsmedium resuspendiert, nochmals bei 550 g abzentrifugiert, in Wachstumsmedium aufgenommen und sorgfältig homogenisiert. Diese Suspension von zerebralen Mikrokapillaren wurde in die beschichteten Kulturgefäße ausgesät. Dies erfolgte abhängig vom Experiment in Multischalen mit 6, 24 oder 96 Vertiefungen. Die Kulturgefäße wurden am Tag der Präparation mit Kollagen G, das zuvor in PBS mit Ca²⁺/Mg²⁺ 1:6 verdünnt wurde, beschichtet. Nach einer Einwirkzeit von 2-3 min wurde zweimal mit PBS mit Ca²⁺/Mg²⁺ gewaschen. Nach 2-3 h erfolgte der erste Mediumwechsel, danach wurde täglich das Medium erneuert. Ab dem 3. Tag nach Präparation wurde beim Mediumwechsel zusätzlich mit PBS gespült. Die Kulturen wurden bei 5 % CO₂/95 % Luft, 95 % Luftfeuchtigkeit und einer Temperatur von 37 °C gehalten. Nach 6-8 d bildeten die Kulturen einen konfluenten Monolayer und wurden für die Experimente verwendet.

In Anlehnung an Freyer et al. (1999) wurde die Reinheit der Endothelzellkulturen mit Hilfe von Antikörpern nachgewiesen, die gegen die Gliamarker saures Gliafaser-Protein (Dako, Hamburg), OX-42 (Genzyme, Cambridge, USA) und CD14 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA) gerichtet waren. Endothelzellen wurden durch Antikörper gegen von-Willebrandt-Faktor VIII (Dako, Hamburg) identifiziert. Die Darstellung der Zellen erfolgte mit HRP-konjugierten sekundären Antikörpern (Dako, Hamburg). Zur Auswertung wurden die Zellmonolayer von zwei erfahrenen Untersuchern lichtmikroskopisch (Vergrößerung 200-fach) untersucht, wobei die Gliamarker-positiven zu den von-Willebrandt-Faktor-positiven Zellen in Relation gesetzt wurden. Anschließend wurden die Zellen trypsiniert und in einer Fuchs-Rosenthal-Kammer gezählt. 0,05 % der Zellen waren GFAP-positiv, und 1 % der Zellen ließ sich mit Antikörpern gegen OX-42 und CD 14 anfärben. 99 % der Zellen zeigten eine positive Färbung für den von-Willebrandt-Faktor VIII.

• D39 Kapseltyp 2 (Rockefeller University, New York, USA)

• PlnA-, Pneumolysin-negative Mutante von D39 (D. Briles, University of Alabama, Birmingham,USA; Berry et al., 1989)

• PlnA-/SpxB-, Pyruvatoxidase- und Pneumolysin-negative Doppelmutante von D39 (E. Tuomanen, Memphis, USA; Braun et al., 2002)

• R6, unbekapseltes Derivat von D39 (Rockefeller University, New York, USA)

• CbpA-, Choline-binding protein A negative Mutante von R6 (Rosenow et al., 1997)

• Erythromycin (Biochrom, Deutschland)

• Chloramphenicol (Biochrom, Deutschland)

• Blutagarplatten (Merckoplate®, Merck, Deutschland)

C+Y-Medium

• 400 ml Prä C Medium

• 10 ml Adams III Lösung

• 13 ml Ergänzungsmedium

• 10 ml Hefe (5 %)

• 5 ml Pyruvat (2 %)

• 10 ml Glutamin (1 mg/ml)

• 15 ml Kaliumphosphatpuffer (1M)

Prä C Medium (ph 7.4)

3-fach-Salzlösung

• 1,45 g Natriumacetat

• 10 g MgCl₂

• 6 mg L-Tryptophan

• 50 mg CaCl₂

• 60 mg L-Cystein

• 20 µl MnSO₄

• 6 g Casamino Acids

• 100 ml H₂O

• 1,2 l H₂O

Ergänzungsmedium

Adams I Lösung

• 60 ml 3-fach Salzlösung

• 60 µl Biotin (0.5 mg/ml)

• 120 ml Glucose (20 %)

• 30 mg Nikotinsäure

• 6 ml Sucrose (50 %)

• 35 mg Pyridoxin

• 120 ml Adenosin (2 mg/ml)

• 120 mg Ca-pentithotat

• 120 ml Uridin (2 mg/ml)

• 32 mg Thiamin

• 14 mg Riboflavin

Adams II Lösung

Adams III Lösung

• 64 ml Adams I Lösung

• 50 mg FeSO₄

• 16 ml Adams III Lösung

• 50 mg CuSO₄

• 800 mg Asparagin

• 50 mg ZnSO₄

• 80 mg Cholin

• 20 mg MgCl₂

• 0,64 ml CaCl₂ (1%)

• 1 ml HCl

• 400 ml H₂O

• 100 ml H₂O

Die Pneumokokkenstämme wurden in C+Y-Medium und 15 % Glycerol bei - 80 °C aufbewahrt. Zur Durchführung der Experimente wurden in Anlehnung an Braun et al. (2002) 4 ml C+Y-Medium mit der jeweiligen tiefgefrorenen Bakteriensuspension beimpft und über Nacht in einem Brutschrank bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubiert. Zur Anzucht der Mutanten wurde das Medium mit Erythromycin in einer Endkonzentration von 1,5 µg/ml versetzt, die Doppelmutante zusätzlich mit Chloramphenicol (Endkonzentration 2 µg/ml). Am nächsten Morgen erfolgte eine Rückverdünnung der Pneumokokkensuspension mit 3 ml frischem Medium auf 1 ml Bakteriensuspension, wobei die Optische Dichte (OD), gemessen im Helios Σ Spectrometer von Thermospectronic bei einer Wellenlänge von 620 nm, unter 0,2 betragen sollte. Die Bakterienkulturen wurden daraufhin im Brutschrank bis zu einer OD von 0,5-0,6 inkubiert. Bei dieser Dichte kann von einer linearen Phase des Wachstums der Bakterien ausgegangen werden. Danach wurden sie in ein Eppendorfgefäß überführt und bei 8000 rpm in einer Zentrifuge (Eppendorf Centrifuge 5415 D) für 3 min zentrifugiert. Das Pellet wurde anschließend in 1400 µl Zellstimulationsmedium ohne Antibiotika vorsichtig resuspendiert und durch Verdünnung mit Zellstimulationsmedium auf eine OD von 0,1 eingestellt. Diese Optische Dichte korrespondiert mit einer Pneumokokkenkonzentration von 108 colony forming units pro ml (cfu/ml). Dies wurde durch entsprechende Verdünnungen und das Ausstreichen auf Blutagarplatten verifiziert. Durch weiteres Verdünnen mit Zellstimulationsmedium wurde die jeweils benötigte Pneumokokkenkonzentration eingestellt und zur Stimulation auf die vorbereiteten Endothelzellen pipettiert.

• InCert Agarose (Biozym, Hessisch Oldendorf)

• 0,5 x TBE

• Ethidiumbromid (Sigma, St. Louis, USA)

5 x TBE

NDS Puffer

• 500ml Aqua bidest

• 0,5 M EDTA pH 7,5

• 54g Trisbase

• 1 % Laurylsarcosin

• 27,5 g BorAcid

• 1 mg/ml Proteinase K

• 3,802 g EDTA

In Platten mit 6 Vertiefungen kultivierte zerebrale Endothelzellen wurden nach Stimulation mit Pneumokokken oder PBS 2 x mit PBS gewaschen, in PBS vorsichtig abgekratzt und zentrifugiert. Das Pellet wurde in 75 µl PBS resuspendiert. 60 mg InCert Agarose wurden in 4 ml PBS gelöst (Konzentration 1,5 %), im Wasserbad bei ca. 65 °C geschmolzen und danach bei 50 °C warmgehalten. Inzwischen wurde die Form für die Blöckchen (Geiger Handling GmbH, Dornhan) gründlich mit destilliertem Wasser gespült und mit Tesafilm abgeklebt. Nach Zusammenpipettieren und Mischen von 75 µl Zellsubstrat und 75 µl der erwärmten 1,5 %igen InCert Agarose konnte das Zell-Agarose-Gemisch in die Form gefüllt werden und bei 4 °C für 30 min abkühlen. Danach erfolgte ein Proteinverdau der entstandenen Zell-Agarose-Blöckchen mit NDS Puffer für 36-48 h bei 50 °C.

Ein 1 %-iges Agarosegel in 0,5 x TBE wurde gegossen und für 1 h auspolymerisiert. Die Blöckchen wurden 3 x mit TBE gewaschen, aus der Form genommen und in die Taschen des Agarosegels gefüllt, die anschließend mit Agarose versiegelt wurden. Als Elektrophoresepuffer wurden 2,5 l 0,5 x TBE verwendet. In einem Bio-Rad CHEF-DR II-Gerät (Richmond, CA) erfolgte eine 24-stündige Elektrophorese bei 190 V und einer Pulsrichtungsveränderung alle 60 s im Winkel von 120 °. Das Gel wurde in einem Ethidiumbromid-Bad für 30 min gefärbt, in TBE wieder entfärbt und in einem Typhoon-Gerät gescannt und ausgewertet. Als kb-Marker wurde der Lamda Ladder PFG Marker (New England Biolabs, USA) benutzt.

• Lysepuffer (Pharmingen, Heidelberg)

• HEPES (Calbiochem, Heidelberg)

• Caspase-3 (MW 675,6; AMC-gekoppelt, Stammlösung: 1,5 mM in DMSO)

• Caspase-8 (MW 821,8; AFC-gekoppelt, Stammlösung: 1,5 mM in DMSO)

• Caspase-9 (MW 765,7; AFC-gekoppelt, Stammlösung: 1,5 mM in DMSO)

Zur Bestimmung der Aktivität von Caspasen in Extrakten, wurden diese mit Tetrapeptidsubstraten für Caspasen versetzt. Der Umsatz dieser Substrate lässt sich durch die Freisetzung einer fluorophoren (Aminotrifluoromthylcoumarin, AFC bzw. Aminomethylcoumarin, AMC) Gruppe, die an Position 1 des Tetrapeptids gekoppelt ist, quantifizieren. Die Aktivität berechnet sich aus der freigesetzten Gruppe (AFC bzw. AMC) in pmol der Inkubationszeit (in min) und der eingesetzten Gesamtproteinmenge (in mg) nach folgender Formel:

Aktivität = Produktmenge (pmol) / Proteinmenge (mg) x Inkubationszeit (min).

In Anlehnung an Braun et. al (2001) wurden die Caspaseaktivitätsbestimmungen als Einzeitmessungen nach 60 min durchgeführt. Diese Vorgehensweise wurde gewählt, weil in diesem Zeitraum auch für höhere Caspasekonzentrationen eine nahezu lineare Korrelation zwischen Reaktionszeit und gemessener Fluoreszenz (Emission) angenommen werden kann, wie Implementierungsversuche in unserem Labor sowie Namura et al. (1998) zeigten.

Die Endothelzellen wurden stimuliert, 2 x mit PBS gewaschen und anschließend in PBS abgekratzt. Die Zellsuspension wurde in vorgekühlte 2 ml Eppendorfröhrchen überführt und zentrifugiert (5 min/1000 g/4 C°). Der Überstand wurde verworfen und das trockene Pellet schnell auf Trockeneis überführt und bei -80C° gelagert. Das Pellet wurde in 180µl kaltem Lysepuffer resuspendiert, 5 min auf Eis inkubiert und gut durchmischt. Nach einer Zentrifugation (10 min/23000 g/4 C°) wurde das Zellysat auf Eis gestellt und das Pellet verworfen. Im Anschluß wurden folgende Substanzen in eine Vertiefung einer 96-ger Platte pipettiert:

• 80 µl HEPES

• 2 µl fluoreszenzgekoppeltes Caspasesubstrat (Stamm: 1,5mM)

• 20 µl Zellysat

Die Platte wurde mit Parafilm oder Alufolie abgedichtet und für 1h bei 37 °C inkubiert.

Die Messung der Caspaseaktivität erfolgte in einem Fluoreszenzreader (Cyto Fluor, Per Septive Biosystems, Framingham, USA). Jede Platte wurde bei verschiedenen Lichtstärken (gains) gemessen. Die Exzitations-Emissionsspektren betrugen für AMC-gekoppelte Substrate 360/40-400/30 und für AFC-gekoppelte Substrate 400/30-508/20. Standard-7-Amino-4-Methyl-Coumarin- und -7-4-Trifluoromethyl-Coumarin-Lösungen wurden als Standards zur Berechnung der Caspaseaktivität nach oben beschriebener Formel eingesetzt. Die Proteinmengen wurden mit der BCA-Methode quantifiziert.

Fluo-4 AM (Molecular Probes-Mobitec, Heidelberg) 50 µg in 45 µl DMSO (Stamm:1mM)

Die in Platten mit 24 Vertiefungen ausgesäten primären Endothelzellen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten mit Pneumokokken 107 cfu/ml bzw. PBS (Kontrollen) behandelt. Nach Abschluß der Stimulation wurde das Zellkulturmedium verworfen und die Endothelzellen mit dem Fluoreszenzfarbstoff Fluo-4 AM in einer Endkonzentration von 5 µM (in Zellkulturmedium) inkubiert (45 min/37 C°). Im Anschluß an die Inkubation wurden die Zellen vorsichtig 2-3 x mit 400 µl PBS gespült und vor der Messung für 10 min bei einer Temperatur von 37°C gelagert. Die Messung der intrazellulären Calciumkonzentration erfolgte in 400 µl PBS in einem Fluoreszenzreader bei einer Exzitation von 485 nm und einer Emission von 530 nm.

Zur Proteinbestimmung wurde die von Detergentien nicht-beeinflußbare BCA-Methode (Bicinchoninsäure-Methode) verwendet. Die dazu benötigten Lösungen wurden als "BCA Protein Assay Reagentkit" (Pierce, Rockford, IL, USA) bezogen. Die Durchführung erfolgte nach Firmenvorschrift.

• Digitonin (Sigma; St. Louis, MO) 0,25 mg/ml in Puffer A

RIPA-Puffer

Puffer A (pH 7,4)

• 150 mM NaCl

• Sucrose 0,25 M

• 50 mM Tris (pH 7,4)

• Imidazol 3 mM

• 1% Triton X-100

• Aqua bidest

• 0,1% SDS

• 1% NaDeoxycholat

Die Auftrennung der Zellen in ihre subzellulären Bestandteile (zytosolische und mitochondriale Fraktion) wurde nach einem leicht modifizierten Protokoll nach Bronfman et al. (1998) durchgeführt. Diese Methode basiert einerseits auf der spezifischen Digitonin-induzierten Freisetzung von zellulären löslichen Enzymen und Komponenten zur Gewinnung der cytosolischen Fraktion und andererseits auf einer Differential-Zentrifugation zur Trennung der weiteren subzellulären Bestandteile.

Alle Schritte wurden, wenn nicht anders beschrieben, auf Eis durchgeführt. Nach Inkubation der Endothelzellen mit lebenden Pneumokokken bzw. PBS für 2, 3 und 5h wurden die Zellen 2 x mit PBS gespült, anschließend in PBS abgekratzt, in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß überführt und bei 370 g für 5 min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet gewogen. Das Pellet wurde daraufhin in je 400 µl Puffer A resuspendiert und bei 16.000 g für 20 s zentrifugiert. Nach erneutem Verwerfen des Überstandes wurde 0,25 mg/ml Digitonin in Puffer A (10µl/mg Pellett) zupipettiert. Es folgte eine erneute Zentrifugation bei 16.000 g für 20 s. Der Überstand, der für 20 min bei 62.000 g zentrifugiert wurde, enthält nun alle löslichen Komponenten und Enzyme der Zelle und stellt damit die zytosolische Fraktion der Zellen dar. Die zytosolische Fraktion wurde in ein Eppendorfgefäß überführt und bis zur weiteren Verarbeitung bei -80 °C eingefroren. Das verbliebene Pellet wurde in 350 µl Puffer A resuspendiert und mit 30 Hüben in einem dounce Homogenisatorhomogenisiert. Nach einer Zentrifugation von 10 min bei 200 g wurde der Überstand in ein anderes Röhrchen verbracht und erneut für 10 min bei 800 g zentrifugiert. Um die mitochondriale Fraktion zu erhalten, wurde der Überstand für 30 min bei 13200 g zentrifugiert und das Pellet in 50 µl RIPA-Puffer aufgenommen. Auch diese Probe wurde bis zur weiteren Verarbeitung bei –80 °C aufbewahrt. Die Proteine der erhaltenen zytosolischen und mitochondrialen Fraktionen wurden in ihrer Konzentration quantifiziert (siehe 2.11.) und einem Western-Blot-Verfahren zugeführt. Dabei erfolgte der Nachweis von AIF unter Verwendung eines Anti-AIF-Antikörpers von Santa Cruz.

Mit dem Kolmogoroff-Smirnoff-Test für die Güte der Anpassung wurde die Normalverteilung der Meßwerte überprüft. Die statistische Signifikanz der Meßwerte wurde anschließend entweder mit dem ungepaarten t-Test, dem One-Way-ANOVA-Test oder dem Student-Newman-Keuls-Test bestimmt. Die Fehlerbalken in den Abbildungen zeigen in dieser Arbeit durchgehend die Standardabweichung (SD) an.