von

• 1  EINLEITUNG

  • 1.1 Bakterielle Meningitis

    • 1.1.1 Einführung

    • 1.1.2  Pathogenese und Pathophysiologie der Pneumokokkenmeningitis

  • 1.2 Virulenzfaktoren von S. pneumoniae

    • 1.2.1  Autolysin

    • 1.2.2 CbpA

    • 1.2.3 Wasserstoffperoxid (H₂O₂)

    • 1.2.4  Pneumolysin

  • 1.3 Die Blut-Hirn-Schranke

    • 1.3.1 Aufbau der Blut-Hirn-Schranke und Besonderheiten des zerebralen Endothels

    • 1.3.2 Pathophysiologie der Blut-Hirn-Schranke bei der bakteriellen Meningitis

  • 1.4  Apoptose - Der programmierte Zelltod

    • 1.4.1 Biologisches Phänomen

    • 1.4.2 Die Bedeutung des Programmierten Zelltodes

    • 1.4.3 Morphologische Kennzeichen

    • 1.4.4 Ablauf der Apoptose

      • 1.4.4.1 Termination der Apoptose

      • 1.4.4.2 Induktion und Regulation der Apoptose

    • 1.4.5  Caspasen-unabhängiger programmierter Zelltod

    • 1.4.6 Mechanismen des Caspasen-unabhängigen programmierten Zelltodes

      • 1.4.6.1  AIF

  • 1.5  Zielsetzung der Arbeit

• 2  MATERIAL UND METHODEN

  • 2.1 Kulturen der primären zerebralen Kapillarendothelzellen

  • 2.2 Bakterienkulturen

  • 2.3  Stimulation der zerebralen Endothelzellen

  • 2.4  Untersuchung der Zellkernmorphologie mit DNS-Farbstoffen (AO/EB)

  • 2.5  Untersuchung der DNS-Degradation mit der TUNEL-Methode

  • 2.6  Elektronenmikroskopische Aufnahmen

  • 2.7 Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE)

  • 2.8 Messung der Caspaseaktivität

  • 2.9 Messung der intrazellulären Calciumkonzentration

  • 2.10  Messung des mitochondrialen Membranpotentials ΔφM

  • 2.11 Proteinbestimmung

  • 2.12 Subzelluläre Fraktionierung

  • 2.13  Western-Blot

  • 2.14 Angewandte statistische Verfahren

• 3  ERGEBNISSE

  • 3.1 Nachweis des Pneumokokken-induzierten endothelialen Zelltodes

    • 3.1.1 Lebende Pneumokokken induzieren einen programmierten Zelltod in zerebralen Endothelzellen

      • 3.1.1.1 Untersuchung der Kernmorphologie mit der Acridinorange-Ethidiumbromid-Methode

      • 3.1.1.2 Untersuchung der Zellmorphologie mit Hilfe der Elektronenmikroskopie

      • 3.1.1.3  Untersuchung der DNS-Degradation mit der TUNEL-Methode

    • 3.1.2 Der Zelltod zerebraler Endothelzellen ist direkt abhängig von Inkubationszeit und Konzentration der Pneumokokken

  • 3.2 Untersuchung der Rolle der Caspasen

    • 3.2.1 Der Pneumokokken-induzierte Zelltod ist durch den Pan-Caspase-Inhibitor zVAD-fmk nicht blockierbar

    • 3.2.2 Die Caspasen-3, -8 und -9 werden beim endothelialen Zelltod durch lebende Pneumokokken nicht aktiviert

    • 3.2.3  Beim endothelialen Zelltod kommt es nicht zur Entstehung Caspasen-abhängiger Spaltprodukte von α-Fodrin

  • 3.3  Untersuchung weiterer intrazellulärer Mechanismen

    • 3.3.1 Nach Stimulation zerebraler Endothelzellen mit Pneumokokken kommt es zu einem raschen Anstieg des intrazellulären Calciums

  • 3.4 Untersuchung der Beteiligung von Apoptosis Inducing Factor (AIF)

    • 3.4.1 Lebende Pneumokokken induzieren eine AIF-spezifische DNS-Degradation in zerebralen Endothelzellen

    • 3.4.2 Beim endothelialen Zelltod durch lebende Pneumokokken kommt es zur Freisetzung von AIF aus den Mitochondrien in das Zytosol

  • 3.5  Untersuchung der Rolle Pneumokokken-spezifischer Eigenschaften

    • 3.5.1 Kapsel- und Adhäsionseigenschaften der Pneumokokken haben keinen Einfluß auf den programmierten Zelltod zerebraler Endothelzellen

    • 3.5.2 H₂O₂ und Pneumolysin sind gemeinsam für den endothelialen Zelltod verantwortlich

    • 3.5.3 Purifiziertes Pneumolysin und H₂O₂ können jeweils einen Zelltod in zerebralen Endothelzellen auslösen

    • 3.5.4  Die Induktion des endothelialen Zelltodes durch purifiziertes Pneumolysin ist an dessen zytolytische Aktivität gebunden

• 4  DISKUSSION

  • 4.1  Pneumokokken als Auslöser von programmiertem Zelltod

  • 4.2 Nachweis des programmierten Zelltodes

  • 4.3 Fehlende Aktivierung der Caspasen

  • 4.4 Intrazelluläres Calcium und mitochondriales Membranpotential

  • 4.5 Beteiligung von Apoptosis Inducing Factor (AIF)

  • 4.6  Kapsel- und Adhärenzeigenschaften von S. pneumoniae

  • 4.7 Rolle von Wasserstoffperoxid und Pneumolysin

  • 4.8 Ausblick

• 5  ZUSAMMENFASSUNG

• LITERATURVERZEICHNIS

• Abkürzungsverzeichnis

• Danksagung

• Anhang

• Lebenslauf

• Eidesstattliche Erklärung

• Tabelle 1: Zusammenfassung der wichtigsten morphologischen Unterschiede zwischen apoptotischem und nekrotischem Zelltod. DNS = Desoxyribonukeinsäure

• Tabelle 2: Nukleäre Veränderungen beim AIF-induzierten Zelltod und der klassischen Apoptose im Vergleich (nach Leist, 2000). Kbp = Kilobasenpaare. DNS = Desoxyribonukleinsäure.

• Abbildung 1: Schematische Darstellung ausgewählter Virulenzfaktoren von S. pneumoniae einschließlich ihrer Lokalisation und Funktion. H₂O₂ = Wasserstoffperoxid. CbpA = Cholin-binding protein A.

• Abbildung 2: Vereinfachte schematische Darstellung der Blut-Hirn-Schranke (nach Rubin, 1999).

• Abbildung 3: Vereinfachte schematische Darstellung des intrinsischen und extrinsischen Weges der klassischen Apoptose (nach Roy, 2000). ΔφM= Symbol für das Mitochondriale Membranpotential. APAF-1 = Apoptosis activating protease-1. Cyt c = Cytochrom c. FADD = Fas-associated death domain.

• Abbildung 4: Schematische Darstellung des Proteins Pneumolysin. Durch Punktmutation entstanden Pneumolysin-Proteine mit veränderten Eigenschaften. Bei D385N ("Komplement-") führte der Austausch von Aspartat durch Asparagin an Stelle 385 zum Verlust der Komplementaktivierung, bei W433F ("Zytolyse-") kam es durch den Austausch von Tryptophan durch Phenylalanin an Stelle 433 zu einem Verlust der zytolytischen Aktivität.

• Abbildung 5: Färbung zerebraler Endothelzellen mit Acridinorange und Ethidiumbromid nach 12-stündiger Inkubation mit S. pneumoniae (Stamm R6, 107 cfu/ml) [A], Staurosporin (1µM) [B] oder PBS (Kontrolle) [C]. Fluoreszenzmikroskop, Vergrößerung 1:400. Balken = 10 µm. Die Pfeile markieren apoptotische Körperchen.

• Abbildung 6: Elektronenmikroskopische Aufnahme zerebraler Endothelzellen nach 4-stündiger Inkubation mit Pneumokokken (R6, 107 cfu/ml) [A] oder PBS (Kontrolle) [B]. Vergrößerung 1:4400. Der Balken entspricht 1,4 µm. Die Pfeile markieren das „Blebbing“ der Kernmembran. N = Nukleus, M = Mitochondrium.

• Abbildung 7: EM-Aufnahme zerebraler Endothelzellen mit Darstellung des Chromatins. Vergrößerung 1:12.000. Der Balken entspricht einer Länge von 0,6 µm. Die Pfeile markieren die periphere Kondensation des Chromatins. N = Nukleus.

• Abbildung 8: EM-Aufnahme der Mitochondrien von Endothelzellen 4 h nach Inkubation mit Pneumokokken (Stamm R6, 107 cfu/ml) [A] oder PBS [B]. Vergrößerung 1:12000. Balken = 0,6 µm. N = Nukleus, M = Mitochondrium .Die Pfeile markieren die Mitochondrien.

• Abbildung 9: TUNEL-Färbung (Tdt mediated dUTP Nick End Labeling). Zerebrale Endothelzellen wurden 12 h mit Pneumokokken (Stamm R6, 107 cfu/ml) [A] oder PBS (Kontrolle) [B] inkubiert, mit der TUNEL-Methode gefärbt und unter einem Lichtmikroskop (Vergrößerung 1:100) betrachtet. Der Balken entspricht einer Länge von 50 µm.

• Abbildung 10: Kinetik des Zelltodes zerebraler Endothelzellen nach Inkubation mit S. pneumoniae (R6, 107 cfu/ml). Prozentuale Darstellung der lebenden Zellen (grau), der Zellen mit typischer Morphologie eines programmierten Zelltodes [Apoptose] (schwarz) und nekrotischen Zellen (weiß). Acridinorange-Ethidiumbromid-Methode. n = 9 bei 3 unabhängigen Experimenten.

• Abbildung 11: Konzentrationsabhängigkeit des Zelltodes zerebraler Endothelzellen nach Inkubation mit S. pneumoniae (106, 107, 108 cfu/ml) oder PBS (Negativkontrolle). n = 9 bei 3 unabhängigen Experimenten.

• Abbildung 12: Hemmbarkeit der Staurosporin-induzierten sowie fehlende Hemmbarkeit des Pneumokokken-induzierten Zelltodes durch den Pan-Caspase-Inhibitor zVAD-fmk (100 µM). Acridinorange-Ethidiumbromid-Methode. n = 9 bei 3 unabhängigen Experimenten. Statistische Signifikanz markiert mit * für p<0,001 (ungepaarter t-Test).

• Abbildung 13: Caspase-3-Aktivität in zerebralen Endothelzellen. Die Zellstimulation erfolgte mit Staurosporin (12 h, 1 µM), S. pneumoniae (R6, 107 cfu/ml) oder PBS (Kontrolle). n = 9 bei 3 unabhängigen Experimenten. Statistische Signifikanz markiert mit * für p<0,001 (ungepaarter t-Test).

• Abbildung 14: Aktivitäten der Caspase-8 (links) und der Caspase-9 (rechts) in zerebralen Endothelzellen. Die Zellstimulation erfolgte mit Staurosporin (12 h, 1 µM), S. pneumoniae (R6, 107 cfu/ml) oder PBS (Kontrolle). n = 9 bei 3 unabhängigen Experimenten. Statistische Signifikanz bei * für p<0,001 (ungepaarter t-Test).

• Abbildung 15: Fehlende Spaltung des Zytoskelettproteins α-Fodrin (240 kDa) in seine Caspasen-spezifischen Spaltprodukte (140 und 120 kDa). Zerebrale Endothelzellen wurden 3 und 6 h mit Staurosporin (1µM), 1, 3 und 7 h mit S. pneumoniae (R6, 107 cfu/ml) oder PBS (Kontrolle) inkubiert und ein Western-Blot mit einem Anti-α-Fodrin-Antikörper durchgeführt. KDa = Kilo-Dalton. Stauro = Staurosporin

• Abbildung 16: Kinetik des intrazellulären Calciums nach Stimulation mit lebenden Pneumokokken (R6, 107 cfu/ml). Die Messung des intrazellulären Calciumgehaltes erfolgte mit dem fluoreszierenden Farbstoff Fluo-4 AM nach verschiedenen Stimulationszeiten. n=9, aus 3 unabhängigen Experimenten.

• Abbildung 17: Hemmung der endothelialen Zelltodrate durch Präinkubation mit dem Calcium-Chelator BAPTA-AM (5 µM). 12 h Inkubation der Zellen mit R6, PBS (Kontrolle) mit oder ohne BAPTA-AM. n = 9 bei 3 unabhängigen Experimenten. Statistische Signifikanz bei * für p<0,001 (ungepaarter t-Test).

• Abbildung 18: Kinetik des mitochondrialen Membranpotentials ΔφM nach Inkubation von zerebralen Endothelzellen mit lebenden Pneumokokken (R6, 107 cfu/ml). Die Messung erfolgte mit dem Farbstoff Tetramethylrhodaminester (TMRE). n = 9, aus 3 unabhängigen Experimenten.

• Abbildung 19: Nachweis einer large scale fragmentation in 50-kbp-Fragmente. Endothelzellen wurden mit S. pneumoniae (R6, 107 cfu/ml) oder PBS (Kontrolle) inkubiert. Anschließend erfolgte eine Auftrennung der DNS mit Hilfe einer Pulsfeldgelelektrophorese. Ko=Kontrolle, M=Marker, kbp=Kilobasenpaare.

• Abbildung 20: Translokation von AIF aus den Mitochondrien in das Zytosol. Die Endothelzellen wurden mit S. pneumoniae (Stamm R6, 107 cfu/ml) oder PBS (Kontrolle) inkubiert und eine zytosolische und mitochondriale Fraktion hergestellt. Anschließend wurde ein Western Blot mit einem spezifischen Anti-AIF-Antikörper durchgeführt. Ko = Kontrolle, kDa = Kilodalton

• Abbildung 21: Kinetik des Zelltodes durch R6 (unbekapselt) und D39 (bekapselt). Zerebrale Endothelzellen wurden mit R6 (107 cfu/ml), D39 (107 cfu/ml) oder PBS (Kontrolle) inkubiert. Acridinorange-Ethidiumbromid-Methode. n = 9 bei 3 unabhängigen Experimenten.

• Abbildung 22: Rate des Zelltodes durch R6 (unbekapselter Pneumokokkenstamm) und CbpA- (Derivat von R6 mit fehlendem Choline-binding protein A). Zerebrale Endothelzellen wurden mit R6 (107 cfu/ml), CbpA- (107 cfu/ml) oder PBS (Kontrolle) für 12 h inkubiert. Acridinorange-Ethidiumbromid-Methode. n = 9 bei 3 unabhängigen Experimenten.

• Abbildung 23: Die gemeinsame Blockierung von Pneumolysin und Wasserstoffperoxid führt zur Inhibierung des S. pneumoniae-induzierten Zelltodes. Inkubation der Zellen mit D39, PlnA- (je 107 cfu/ml) oder PBS mit oder ohne Katalase (1250 U/ml) für 12 h und Färbung mit TUNEL (A-E) sowie mit Acridinorange und Ethidiumbromid (F-J). Balken = 50 µm.

• Abbildung 24: Die gemeinsame Blockierung von Pneumolysin und Wasserstoffperoxid führt zur Inhibierung des Zelltodes. 12 h Inkubation der Zellen mit D39, dem Pneumolysin-defizienten Stamm PlnA- (je 107 cfu/ml) oder PBS (Kontrolle) mit oder ohne Katalase (1250 U/ml). Acridinorange-Ethidiumbromid-Färbung. n=9 bei 3 unabhängigen Experimenten. Statistische Signifikanz bei * für p<0,001 (ungepaarter t-Test).

• Abbildung 25: Der Pneumolysin- und H₂O₂-defiziente Stamm PlnA-/SpxB- führt zur Inhibierung des endothelialen Zelltodes. 12-stündige Inkubation der Zellen mit D 39, dem Pneumolysin- und H₂O₂-defizienten Stamm PlnA-/SpxB- (je 107 cfu/ml) oder PBS (Kontrolle). Acridinorange-Ethidiumbromid-Methode. n = 9 bei 3 unabhängigen Experimenten.

• Abbildung 26: Zelltod zerebraler Endothelzellen nach Inkubation mit H₂O₂ (20-2000 µM) für 12 h. Prozentuale Darstellung der lebenden Zellen (grau), nekrotischen Zellen (weiß) und Zellen mit typischer Morphologie für programmierten Zelltod (grau). Acridinorange-Ethidiumbromid-Methode. n = 9 bei 3 unabhängigen Experimenten

• Abbildung 27: Kinetik des Zelltodes zerebraler Endothelzellen nach Stimulation mit purifiziertem Pneumolysin (0,1 µg/ml). Quantifizierung mit der Acridinorange-Ethidiumbromid-Methode. n=6, bei drei voneinander unabhängigen Experimenten.

• Abbildung 28: Vergleich der Rate des Zelltodes nach 12 h Inkubation mit unverändertem Pneumolysin (Pln wt), Zytolyse-defizientem (Pln Zyt^-) und Komplement-defizientem Pneumolysin (Pln Kompl^-). n = 9, bei drei unabhängigen Experimenten.

• Abbildung 29: Schematische Zusammenfassung der Mechanismen beim S. pneumoniae-induzierten endothelialen Zelltod. AIF = apoptosis inducing factor. H₂O₂ = Wasserstoffperoxid. BAPTA-AM (Bis-ethyleneglycol-tetraacetic acid, tetraacetoxymethyl ester) = intrazellulärer Calciumchelator. Endo G = Endonuklease G