Einleitung

1.1 Entzündung und Krankheitsabwehr

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Der menschliche Körper ist ständig einer Vielzahl von endogenen und exogenen Stimuli ausgesetzt, die die Schädigung von Zellen zur Folge haben können. Diese Stimuli werden durch belebte Stoffe (z.B. Mikroorganismen) oder unbelebte Stoffe (Toxine, Fremdkörper u. a.) ausgelöst. Im vaskularisierten Bindegewebe können diese Stimuli eine komplexe Reaktion auslösen, die Entzündung oder Inflammation genannt wird (Cotran, et al., 1999). Bei einer Entzündungsreaktion sammeln sich Flüssigkeit und Leukozyten im Bindegewebe an und verdünnen das eindringende Agens, grenzen es ein und zerstören es schließlich. Die Entzündung hat somit eine schützende Funktion, die sowohl der Beseitigung ihrer Ursachen (Mikroorganismen, Toxine u. a.) als auch der Folgen (Nekrosen) dient und soweit möglich heilende Prozesse in Gang setzt (Thomas, 1998). Die Entzündungsreaktion kann jedoch auch schädlich oder lebensbedrohlich sein. Dies zeigt sich z.B. bei der Hypersensitivitätsreaktion auf Insektenbisse oder Arzneimittel und bei chronischen Krankheiten wie der Lungenfibrose oder der rheumatoiden Arthritis. Dieser gefährliche Aspekt der Entzündung hat zur Entwicklung einer Vielzahl von antiinflammatorischen Medikamenten geführt, von der Azetylsalizylsäure über weitere Cyclooxygenasehemmer, synthetische Kortikosteroide bis zu spezifischen Hemmstoffen von einzelnen Entzündungsmediatoren (Cotran, et al., 1999).

Bei Entzündungen unterscheidet man die akute und die chronische Form. Die akute Inflammation dauert wenige Minuten bis einige Tage und ist durch das Ödem gekennzeichnet, einer Exsudation von Flüssigkeit und Plasmaproteinen, sowie der Einwanderung von Leukozyten, hauptsächlich neutrophilen Granulozyten (Cotran, et al., 1999). Als Folge der akuten Entzündung kann es zur kompletten Wiederherstellung des Gewebes kommen (Restitutio ad integrum), zur Ausbildung von Abzessen, zur Defektheilung mit Narbenbildung (Reparation) oder zur chronischen Entzündung. Diese Prozesse können nebeneinander vorkommen und ineinander übergehen (Abb.1).

Abb. 1: Akute und chronische Inflammation
Nach einer Verletzung entwickelt sich abhängig von Mediatoren und weiteren Faktoren die akute oder chronische Entzündung, die schließlich zur kompletten Wiederherstellung (restitutio ad integrum), zur Abszessbildung oder zur Reparation führen (verändert nach Cotran, 1999a)

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Die chronische Entzündung entwickelt sich meist aus der akuten Form und verläuft über Wochen, Monate oder Jahre. Sie ist histologisch gekennzeichnet durch das Auftreten von Lymphozyten und Makrophagen, der Proliferation von Gefäßen und Fibroblasten und dem Vorkommen von Nekrosen. Der Übergang von der akuten in die chronische Form kann auftreten, wenn die Beendigung der inflammatorischen Antwort ausbleibt, entweder durch Persistenz des eingedrungenen Agens oder durch eine Störung im normalen Heilungsprozess. Die chronische Inflammation kann jedoch auch ohne eine vorhergehende akute Inflammation aus einer unterschwelligen, meist asymptomatisch verlaufenden Immunantwort hervorgehen (Cotran, et al., 1999). Dies ist bei einigen der weltweit häufigsten Krankheiten der Fall, z.B. bei der Atherosklerose, der rheumatoiden Arthritis und der Tuberkulose. Voraussetzungen für die chronische Verlaufsform sind entweder die Persistenz von Mikroorganismen, z.B. von Mykobakterien oder Treponema pallidum, eine lang anhaltende Toxinexposition (exogen oder endogen) oder das Auftreten von Autoimmunität. Hierbei führen körpereigene Bestandteile unter bestimmten Bedingungen zu einer Immunantwort, die sich gegen bestimmte Körperbestandteile richtet und selbstunterhaltend verläuft. Zu den Autoimmunerkrankungen gehören z.B. die rheumatoide Arthritis (RA), der systemische Lupus erythematodes (SLE) und die systemische Sklerose (Janeway, et al., 1999).

1.2 Rheumatoide Arthritis

1.2.1 Definition und Epidemiologie

Die rheumatoide Arthritis ist eine entzündliche Systemerkrankung, die sich meist als symmetrische Polyarthritis der kleineren Hand- und Fußgelenke manifestiert. Charakteristisch ist die Produktion von Autoantikörpern. Im Verlauf der Krankheit entwickeln sich oft erosiv-destruktive Gelenkveränderungen und es kommt zur Ausbildung von Rheumaknoten. Die Prävalenz weltweit beträgt 0,5-1 %, die jährliche Inzidenz beträgt ca. 30/100 000 Einwohner. RA tritt meist zwischen dem 40. und 50. Lebensjahr auf, Frauen sind im Alter zwischen 20 und 50 dreimal häufiger betroffen als Männer (Villiger and Brühlmann, 1999).

Als häufigste entzündliche Gelenkserkrankung verursacht die rheumatoide Arthritis erhebliche finanzielle Belastungen sowohl für die Betroffenen als auch für das Gesundheitssystem. Die Arztbesuche von RA-Patienten in den Vereinigten Staaten summieren sich auf ca. drei Millionen pro Jahr. Die direkten medizinischen Kosten der RA in den USA werden auf 3,7 Milliarden US-Dollar pro Jahr geschätzt (Lipsky and Kavanaugh, 1999). Die durch Arbeitsunfähigkeit verursachten indirekten Kosten können dabei die direkten medizinischen Kosten sogar übertreffen (Pugner, et al., 2000). Der Anteil der Arbeitsunfähigkeitstage durch rheumatische Erkrankungen lag in Deutschland 1989 bei 14-23 %, in der gesetzlichen Rentenversicherung wurden 1990 etwa 30 Arbeitnehmer pro 10 000 Versicherte wegen rheumatischer Erkrankungen vorzeitig berentet (Altus, 2001).

1.2.2 Pathologische Charakteristika

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Die Synovia der befallenen Gelenke ist bei der RA entzündlich verändert, verdickt und von T-Zellen, B-Zellen und Makrophagen infiltriert. Zusätzlich zur Synovialitis bildet sich der so genannte Pannus, ein mesenchymaler Zellverbund, der die Knorpel- und Knochenstrukturen angreift (Firestein, 2001). Besonders betroffen sind meist die Grund- und Mittelgelenke der Finger und Zehen, wohingegen Endgelenke bei der rheumatoiden Arthritis ausgespart bleibt. Der Verlauf ist überwiegend chronisch-progredient und resultiert oft in erosiv-destruktiven Gelenkveränderungen, die zu einem teilweisen oder vollständigen Funktionsverlust der betroffenen Gelenke führen (Harris, 2001).

1.2.3 Rheumafaktor

Rheumafaktoren (RF) werden definiert als eine heterogene Gruppe von Autoantikörpern, die sich gegen Antigene des Fc-Fragments von Immunoglobulin G (IgG) richten (Tighe and Carson, 2001). Sie wurden erstmalig in den 40er Jahren von Waaler und Rose beschrieben als Faktoren, die Schafserythrozyten agglutinieren (Rose, et al., 1949;Waaler, 1940).

Etwa 70 – 90 % der RA-Patienten sind RF-seropositiv (Dorner, et al., 2004;Wolfe, et al., 1991). Das Vorhandensein von RF ist jedoch nicht pathognomonisch für RA, auch bei einigen Gesunden und bei Patienten mit infektiösen und chronisch-inflammatorischen Krankheiten lassen sich RF nachweisen.Erhöhte RF-Werte finden sich u. a. bei viralen Infektionen wie Hepatitis B und C, bei chronisch-bakteriellen Erkrankungen wie Tuberkulose und Syphilis und bei lymphoproliferativen Erkrankungen wie dem Morbus Waldenström (Newkirk, 2002). Während bei den meisten anderen Erkrankungen mit RF-Produktion die Rheumafaktoren der IgM-Klasse angehören, polyspezifisch und von niedriger Bindungsaffinität sind, zeichnen sich die RFs bei der RA durch hohe Spezifität und Affinität für humanes IgG aus (Newkirk and Rauch, 1994;Tighe and Carson, 2001). RFs bei RA weisen neben dem IgM-RF auch Autoantikörper der Klassen IgG, IgA und IgE auf. Der Nachweis mehrerer RF-Isotypen, insbesondere in den Gelenken, gilt daher als hochspezifisches Kriterium der RA (Jonsson, et al., 1998).

1.2.4 Diagnostik

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Die Diagnose RA wird nach klinischen, serologischen und radiologischen Befunden gestellt. Es existiert kein einzelnes pathognomonisches Merkmal, dessen Existenz die Diagnose RA erlaubt. Erst wenn das Zusammentreffen typischer Symptome und Befunde festgestellt wird, kann die Diagnose gestellt werden (Villiger and Brühlmann, 1999). Der ausführlichen Anamnese folgt die klinische Untersuchung, bei der insbesondere die Erhebung eines detaillierten Gelenkstatus zur Diagnosefindung wichtig ist. Als bildgebendes Verfahren kommt die dorso-ventrale Röntgenaufnahme der Hände zum Einsatz, sowohl zur Erstuntersuchung wie auch zur Verlaufskontrolle. Weitere Informationen liefert die Zwei-Phasen-Skelettszintigraphie. Sie ist hilfreich, um das Entzündungsausmaß und das Gelenkverteilungsmuster zu beurteilen und erlaubt die Differenzierung zwischen Arthritis und Arthralgie. Neben den radiologischen Untersuchungen werden mehrere Laboruntersuchungen durchgeführt, die der Diagnosesicherung und differentialdiagnostischen Abgrenzung dienen. Als charakteristische Merkmale der RA gelten der positive Rheumafaktor, eine erhöhte Blutkörperchen-Senkungsgeschwindigkeit (BSG), eine Erhöhung des C-reaktiven Proteins (CRP), eine Leukozytose und Thrombozytose mit normochrom-normozytärer Anämie sowie ein erniedrigtes Serumeisen (Villiger and Brühlmann, 1999).

Zur Diagnosestellung dienen ferner die Kriterien des American College of Rheumatology (ACR). Hierzu gehören nach Arnett et al. (1988):

  1. Morgensteifigkeit der Gelenke von mindestens einer Stunde Dauer
  2. Ärztlich diagnostizierte Weichteilschwellung (Arthritis) von drei oder mehr Gelenkregionen
  3. Arthritis der proximalen Interphalangeal-, Metakarpophalangealgelenke oder der Handwurzelgelenke
  4. Symmetrische Arthritis
  5. Rheumaknoten
  6. Nachweis von Rheumafaktor im Serum
  7. Radiologisch festgestellte Gelenkveränderungen der Hand oder des Handgelenks

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Sind mindestens vier von sieben ACR-Kriterien erfüllt, gilt die Diagnose RA als gesichert (ACR-Score ≥ 4 bei RA). Die Kriterien 1-4 müssen hierbei für mindestens 6 Wochen bestehen (Arnett, et al., 1988).

1.2.5 Therapie

Die primäre Behandlung der RA erfolgt symptomatisch mit nichtsteroidalen Antirheumatika (NSAR), durch intraartikuläre Applikation von Glukokortikoiden sowie durch Physiotherapie. Orale Glukokortikoide werden insbesondere im akuten entzündlichen Schub eingesetzt. Bei chronisch-entzündlichem Verlauf wird die sogenannte Basistherapie eingeleitet. Dazu gehören Goldpräparate, Chloroquin, D-Penicillamin, Sulfasalazin, Leflunomid und Immunsuppressiva wie Methotrexat (Harris, 2001;Smolen and Steiner, 2003). Im Gegensatz zu den NSAR können die Basistherapeutika den Krankheitsverlauf beeinflussen. Sie werden daher auch als „disease modifying antirheumatic drugs“ (DMARDs) bezeichnet. Als neuere Therapeutika werden Antikörper gegen spezifische Entzündungsmediatoren eingesetzt („biologicals“). Insbesondere Anti-TNF-α-Antikörper (Infliximab und Adalimumab) sowie ein rekombinantes TNF-Rezeptor-Fusionsprotein (Etanercept) werden meist in Kombination mit Methotrexat erfolgreich zur Behandlung der RA angewandt (Kremer, et al., 2003;Maini, et al., 1999;Weinblatt, et al., 2003). Ein weiteres „biological“, das bei der RA-Therapie eingesetzt wird, ist Anakinra. Hierbei handelt es sich um einen Antikörper gegen das proinflammatorische Zytokin IL-1 (Bresnihan, 2002;Cohen, et al., 2002).

1.2.6 Ätiologie und Pathogenese

Über Ätiologie und Pathogenese der RA ist wenig bekannt, es werden sowohl eine genetische Prädisposition als auch hormonelle und Umweltfaktoren verantwortlich gemacht (Firestein, 2003). In Zwillingsstudien konnte gezeigt werden, dass hereditäre Faktoren nicht nur für die Krankheitsempfänglichkeit wichtig sind, sondern auch die klinische Ausprägung bestimmen. Die genetische Komponente der RA wird auf 30 – 60 % geschätzt (MacGregor, et al., 2000;Ollier and Worthington, 1997), wovon ein Drittel dieses Risikos durch Gene des Histokompatibilitätskomplexes (major histocompatibility complex, MHC) bestimmt sein soll (Gregersen, et al., 1987). Die HLA-DR-Moleküle (human leucocyte antigen), die zur RA prädisponieren (HLA-DR1, -4 und -14), weisen eine identische Sequenz in der dritten hypervariablen Region der HLA-DRβ-Kette, das so genannte „shared epitope“ auf (Gregersen, et al., 1986;Gregersen, et al., 1987;Nepom, et al., 1989).

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Neben der Assoziation mit dem MHC blieb jedoch bisher der größte Teil der genetischen Komponente der RA unbekannt, wenn auch eine Vielzahl von Genen mit dem Auftreten von rheumatoider Arthritis in Verbindung gebracht worden ist, so z.B. das Gen für den Tumornekrosefaktor-Rezeptor (TNF-R) (Glossop, et al., 2003) und für das „monocyte chemoattractant protein 1“, MCP-1 (Gonzalez-Escribano, et al., 2003). Die Identifikation weiterer Gene, die zur RA prädisponieren, gilt als eine der großen Herausforderungen bei der Erforschung der RA (Gregersen, 1997).

Der Einfluss von Hormonen auf Suszeptibilität und Ausprägung der Erkrankung zeigt sich in der Geschlechtsverteilung. Frauen vor der Menopause erkranken dreimal häufiger als Männer; nach der Menopause sind die Inzidenzen gleich. Ferner kommt es während Schwangerschaften oft zu Remissionen (Villiger and Brühlmann, 1999).

1.2.7 Verlauf und Prognose

Bei den meisten Patienten verläuft die rheumatoide Arthritis chronisch-progressiv und führt bei etwa einem Fünftel zu Invalidität. Bei 10 – 25 % kommt es zu jahrelangen Vollremissionen (Harris, 2001;Smolen and Steiner, 2003). Wovon der Verlauf der Erkrankung abhängt, lässt sich im einzelnen nicht vorhersagen, zuverlässige prädiktive Marker fehlen bislang. Als Risikofaktoren für einen aggressiveren Verlauf gelten jedoch weibliches Geschlecht, hochtitrige Rheumafaktorwerte im Serum, frühes Auftreten von Knochenerosionen und extraartikulären Manifestationen sowie initial hohe Werte für zirkulierende Immunkomplexe (Harris, 2001;Kaarela, 1985;Paimela, et al., 1995). Als genetischer Prognoseparameter gilt das HLA-DR4-Allel: sein Nachweis ist mit einem schwereren Krankheitsverlauf assoziiert (Calin, et al., 1989).

1.3 Genetische Polymorphismen und Krankheitsdisposition

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Für viele Krankheiten existieren prädisponierende genetische Faktoren. Dies konnte durch Familien- und Zwillingsuntersuchungen festgestellt werden. In einer dänischen Studie an Adoptivkindern wurde gezeigt, dass insbesondere Infektionskrankheiten und kardiovaskuläre Erkrankungen eine starke genetische Komponente haben und Umwelteinflüsse weniger als angenommen zur Mortalität beitragen (Sorensen, et al., 1988). Auch für Krebs- und Autoimmunerkrankungen scheinen genetische Faktoren eine wichtige Rolle zu spielen (Botstein and Risch, 2003;Risch, 2001;Vyse and Todd, 1996). Natürlich vorkommende Sequenzvariationen (Polymorphismen) im Genom tragen dabei wesentlich zur Krankheitssuszeptibilität für bei. Hierbei liegen 90 % aller Polymorphismen als Variationen eines einzelnen Nukleotids („single nucleotide polymorphism“, SNP) vor (Collins, et al., 1998).

SNPs werden definiert als Positionen im Genom, an denen sich die DNA bei normalen Individuen in einer einzelnen Base unterscheidet. Hierbei tritt das seltenste Nukleotid mit einer Häufigkeit von 1 % oder mehr auf (Nussbaum, et al., 2001). Durch die Ergebnisse des Human Genome Project und das Vorliegen einer Referenzsequenz hat die Forschung an genetischen Polymorphismen in den letzten Jahren, insbesondere die Untersuchung von Assoziationen von SNP mit verschiedenen Krankheiten, zunehmend an Interesse gewonnen. Inzwischen sind für viele verbreitete Krankheiten prädisponierende Polymorphismen bekannt (Botstein and Risch, 2003). Es konnte so z.B. gezeigt werden, dass homozygote Träger des Apolipoprotein-E4-Allels ein zehnfach höheres Risiko haben, an der Alzheimer Krankheit zu erkranken als Nichtträger des Allels (Strittmatter und Roses, 1995). Das Auftreten von Morbus Crohn ist assoziiert mit einem Polymorphismus im NOD2/CARD15-Gen und erhöht das relative Risiko auf 6.0 (Ogura, et al., 2001).

Genetische Polymorphismen können jedoch nicht nur zu Krankheiten prädisponieren, sondern auch davor schützen. In endemischen Malariagebieten tritt z.B. eine Vielzahl von Polymorphismen in Genen auf, die für Erythrozytenproteine kodieren. Diese Polymorphismen bieten einen Schutz vor schwerem Krankheitsverlauf oder Infektion und wurden deshalb in diesen Regionen im Laufe der Jahre selektiert (Fortin, et al., 2002).

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Die SNP-Frequenz in genomischer DNA beträgt 1/1000 Basenpaare (bp), ist in kodierenden Exons aber um den Faktor vier geringer (Li and Sadler, 1991). Die Unterschiede einzelner Basen zwischen zwei Individuen summieren sich so auf mehrere Millionen Basenpaare in den Genomen und etwa 100 000 Aminosäurenunterschiede in ihren Proteomen. Es wird angenommen, dass SNPs für die Empfänglichkeit und Schwere einer Erkrankung eine bedeutende Rolle spielen. Eine direkte kausale Beziehung zwischen Polymorphismus und Krankheit ist hierbei selten, allerdings scheinen SNPs das Risiko des Auftretens einer Erkrankung zu beeinflussen. Dabei sind das gleichzeitige Vorhandensein mehrerer SNPs in Schlüsselgenen, verbunden mit Umweltfaktoren, vermutlich die entscheidenden Faktoren (Brookes, 1999).

1.3.1 Methoden zur SNP-Erkennung

Zum Nachweis von Polymorphismen einzelner Nukleotide stehen verschiedene Methoden zur Verfügung. Die heute hauptsächlich eingesetzten Techniken sind PCR-basiert (Polymerase-Kettenreaktion, polymerase chain reaction) und ermöglichen eine unterschiedlich hohe Auflösung. Standardverfahren sind die Sequenzierung, die Untersuchung auf Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLPs), und der Einsatz von fluoreszenzmarkierten Sonden (TaqMan®-PCR, LightCycler®-PCR). Eine weitere Möglichkeit zur Analyse von SNPs stellt die massenspektrometrische Analyse von Primerextensionsprodukten dar (matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS) (Haff and Smirnov, 1997). Diese Methode erlaubt einen sehr hohen Probendurchsatz und wird in Zukunft insbesondere bei großen Genotypisierungsprojekten vermehrt zum Einsatz kommen.

1.4 Regulation der Immunantwort

1.4.1 Angeborenes und adaptives Immunsystem

Der menschliche Organismus interagiert mit einer Vielzahl von Mikroorganismen. Um Infektionen und daraus resultierende Komplikationen zu verhindern, existiert ein komplexes Immunsystem, das die Unterscheidung pathogener und nichtpathogener Strukturen ermöglicht (Janeway, et al., 1999). In höheren Wirbeltieren besteht es aus zwei Bereichen, dem angeborenen Immunsystem („innate immunity“) und dem adaptiven Immunsystem („adaptive immunity“). Das phylogenetisch ältere angeborene Immunsystem lässt sich bei allen mehrzelligen Organismen nachweisen (Hoffmann, et al., 1999). Das adaptive Immunsystem hat sich erst bei höheren Wirbeltieren ausgebildet. Beim Menschen sind beide Systeme durch ein komplexes System von Signalen miteinander verbunden und arbeiten bei der Krankheitsabwehr koordiniert zusammen, z.B. über die Rekrutierung der gleichen Effektorzellen. Das angeborene Immunsystem wird unmittelbar nach Eindringen von Pathogenen in den Körper aktiv und wirkt deren Wachstum und Ausbreitung im Anfangsstadium einer Infektion direkt entgegen. Komponenten des angeborenen Immunsystems sind u. a. Epithelien, die Barrierefunktionen wahrnehmen, das Komplementsystem, das zur Lyse von Mikroorganismen führt, und ein System zur Phagozytose von Pathogenen. Beteiligt hieran sind insbesondere Makrophagen, Granulozyten und dendritische Zellen (Akira and Hemmi, 2003).

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Die Erkennung von Pathogenen wird durch Rezeptoren des angeborenen Immunsystems vermittelt, die als „pathogen recognition receptors“ (PRRs) bezeichnet werden. Zu den PRRs gehören CD14, der Macrophage Scavenger Receptor (MSR), Toll-like-Rezeptoren (TLRs) und Komplement-Rezeptoren (Gordon, 2002). Sie erkennen molekulare Muster oder Moleküle von Mikroorganismen („pathogen associated molecular patterns“, PAMPs). PAMPs sind vielen Bakterienarten gemeinsame Strukturen wie Lipopolysaccharide, Lipoteichonsäure, Peptidoglykane oder bakterielle DNA. Anders als der Begriff PAMP nahe legt, sind diese Strukturen sowohl auf pathogenen Mikroorganismen als auch auf Kommensalen zu finden. Nach Bindung von PAMPs an PRRs werden kostimulatorische Oberflächenmoleküle verstärkt exprimiert und Mediatoren ausgeschüttet, z.B. proinflammatorische Zytokine (Akira, 2003). Dies führt zur Aktivierung weiterer Komponenten des angeborenen Immunsystems und schließlich zur Antigenpräsentation, die eine antikörpervermittelte Immunantwort durch das adaptive Immunsystem einleitet (Akira, et al., 2001;Medzhitov and Janeway, 1998).

Das adaptive Immunsystem zeichnet sich durch hochspezifische Rezeptoren aus, die auf B- und T-Zellen exprimiert sind. T-Zellen sind für die zellvermittelte Immunantwort verantwortlich, interagieren mit antigenpräsentierenden Zellen und B-Zellen und nehmen regulatorische Aufgaben wahr. B-Zellen vermitteln die humorale Immunantwort durch Produktion von Antikörpern, die sezerniert werden und durch die Pathogene spezifisch erkannt werden. Das große Repertoire unterschiedlicher Rezeptoren entsteht durch somatische Rekombination der Immunglobulingene und der Gene des T-Zell-Rezeptors während der Entwicklung der unreifen Lymphozyten (Janeway, et al., 1999). Im Gegensatz dazu sind die Rezeptoren des angeborenen Immunsystems in den Keimzellen festgelegt und unterliegen keiner somatischen Rekombination (Medzhitov and Janeway, 1998). Durch die Antigenspezifität und die klonale Expansion antigenspezifischer Zellen ermöglicht das adaptive Immunsystem eine sehr effektive Immunantwort, deren Aufbau mehrere Tage dauert, jedoch einen lang anhaltenden Schutz hinterlassen kann, was z.B. bei der Impfung ausgenutzt wird.

1.4.2 Toll-like-Rezeptoren

Toll wurde zuerst bei Drosophila als Gen beschrieben, das die dorso-ventrale Achsenbildung des Embryos kontrolliert (Anderson, et al., 1985). Es kodiert für einen so genannten Typ-1-transmembranären Rezeptor, dessen extrazelluläre Domäne leuzinreiche Elemente enthält („leucine rich repeats“, LRR). Die intrazelluläre Domäne des Toll-Proteins weist Ähnlichkeiten zum Interleukin-1-Rezeptor auf und wurde daher Toll/IL-1R (TIR)-Domäne genannt (Dunne and O'Neill, 2003). Wegen dieser Ähnlichkeit wurde eine immunologische Funktion von Toll vermutet und konnte in einer Untersuchung an Drosophila-Mutanten gezeigt werden. Adulte Fliegen mit defektem Toll-Rezeptor können keine wirksame Immunantwort gegen Pilzinfektionen aufbauen, da das antifungale Peptid Drosomycin nicht exprimiert wird (Lemaitre, et al., 1996).

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Zu Toll homologe Strukturen können bei Pflanzen, Insekten und Wirbeltieren gefunden werden (Takeuchi and Akira, 2002). Medzhitov et al. charakterisierten 1997 einen strukturell verwandten Rezeptor, der an der Immunantwort des Menschen beteiligt ist. Dieser Rezeptor erkennt Lipopolysaccharide Gram-negativer Bakterien (Medzhitov, et al., 1997). Wegen der strukturellen und funktionellen Ähnlichkeit zum Toll-Protein von Drosophila wurde er als Toll-like-Rezeptor bezeichnet und wird heute TLR4 genannt. Bislang konnten 11 Rezeptoren aus der Familie der TLRs kloniert werden (Heil, et al., 2004;Takeda, et al., 2003;Zhang, et al., 2004).

Die Signaltransduktion von Toll, IL-1R und TLR weist weitere Ähnlichkeiten auf (Abb. 2). Nach Bindung des Rezeptorliganden wird eine Signalkaskade ausgelöst, die bei TLR und IL-1R über Adaptermoleküle zur Phosphorylierung des inhibitorischen IκB führt. Der Transkriptionsfaktor NF-κB wird freigesetzt, in den Zellkern transloziert und induziert die Expression verschiedener Gene, die an immunologischen, inflammatorischen und apoptotischen Prozessen beteiligt sind. Bei Drosophila erfolgt die Signaltransduktion über das IκB-Homolog „Cactus“ sowie das NF-κB-Homolog „Dorsal“ (Dunne and O'Neill, 2003).

Abb. 2: Signaltransduktion bei IL-1R/TLR/Toll (nach Dunne und O’Neill, 2003)
Nach Bindung eines Liganden (z.B. LPS) kommt es über mehrere Adaptermoleküle zur Aktivierung eines Transkriptionsfaktors (NF-κB oder Dorsal), der die Expression verschiedener Gene induziert.
Interleukin (IL), IL-1 receptor-associated kinase (IRAK), tumor necrosis factor receptor-associated factor 6 (TRAF6), Inhibitor von κB (IκB), nuclear transcription factor κB (NF-κB), Peptidoglykan (PGN), IL-1-Rezeptor (IL-1R), Adapterproteine MD-2 und MyD88, Lipopolysaccharid (LPS)

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TLRs sind in den verschiedenen Geweben unterschiedlich exprimiert. In den meisten Geweben kann mindestens ein TLR nachgewiesen werden, die Expression auf Leukozyten ist besonders hoch (Zarember and Godowski, 2002). Auch innerhalb einer Zellart kann die Expression variieren: bei den dendritischen Zellen nimmt die Expression von TLR1, TLR2, TLR4 und TLR5 mit der Reifung der Zellen ab; TLR3 wird nur auf ausgereiften dendritischen Zellen exprimiert (Muzio, et al., 2000;Visintin, et al., 2001).

Die von den Toll-like-Rezeptoren erkannten PAMPs sind in der Regel Bestandteile von Mikroorganismen und kommen nicht bei Wirbeltieren vor. Dem TLR-System kommt damit eine wichtige Rolle in der Unterscheidung von körperfremden und körpereigenen Stoffen zu (Janeway and Medzhitov, 2002). Diese Unterscheidung ist jedoch nicht vollständig, einzelne TLRs erkennen auch endogene Liganden, z.B. Hitzeschockproteine (HSP) oder synthetische Substanzen, wie Imidazoquinoline. Die wichtigsten TLRs und ihre Liganden sind in Tab. 1 aufgeführt, TLR2 und TLR9 werden im Folgenden ausführlicher beschrieben.

Tab. 1: TLRs mit ihren wichtigsten Liganden (modifiziert nach Takeda et al, 2003)

TLR

Liganden

Herkunft

TLR1

Triacyl-Lipopeptide

Bakterien, Mykobakterien

TLR2

Peptidoglykane

Gram-positive Bakterien

Lipoproteine/Lipopeptide

Bakterien u.a. Pathogene

Lipoteichonsäure (LTA)

Gram-positive Bakterien

Porine

Neisserien

Glykolipide

Spirochäten

Zymosan

Hefe

GPI-Anker

Trypanosoma cruzi

Outer membrane Protein A

Klebsiellen

HSP70

Wirt

TLR3

Doppelsträngige RNA

Viren

TLR4

Lipopolysaccharid

Gram-negative Bakterien

F-Protein

RSV

Taxol

Pflanzen

HSP60

Wirt

HSP70

Wirt

TLR5

Flagellin

Bakterien

TLR6

Di-Acyl Lipopeptide

Mykoplasmen

TLR7

Imidazoquinolin

Synthetisch

Loxribin

Synthetisch

Bropirimin

Synthetisch

Einzelstrang-RNA

Viren

TLR8

Einzelstrang-RNA

Viren

TLR9

CpG-DNA

Bakterien

TLR11

Uropathogene E. coli

Uropathogene E. coli

1.4.2.1 Toll-like-Rezeptor 2

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Für den Toll-like-Rezeptor 2 ist im Vergleich mit anderen TLRs die größte Anzahl von Liganden bekannt. Darunter befinden sich Lipoproteine von Mykoplasmen, Spirochäten und Gram-negativen Bakterien, Lipoarabinomannan von Mykobakterien, Glykoinositolphospholipidanker von Trypanosoma cruzi, Zymosan von Hefen, atypisches LPS von Leptospira inter rogans oder Porphyromonas gingivalis und andere (Kirschning and Schumann, 2002). Insbesondere an der Immunantwort auf Gram-positive Bakterien, die kein LPS bilden, ist TLR2 beteiligt. Die Zellwand Gram-positiver Keime enthält Peptidoglykan (PGN) mit LTA und Lipoproteinen. Diese PAMPs lösen nach Bindung an TLR2 eine Immunantwort in Wirtszellen aus. Bei TLR2-defizienten Mäusen bleibt diese Immunreaktion aus, sie können keine wirkungsvolle Immunantwort auf Gram-positive Keime generieren (Takeuchi, et al., 1999).

Die Vielzahl der durch TLR2 erkannten Strukturen wird unter anderem durch Bildung von Heterodimeren mit anderen Rezeptoren erreicht, so interagiert TLR2 mit TLR6 zur Erkennung von PGN und Zymosan (Ozinsky, et al., 2000). Auch mit TLR1 kann TLR2 Heterodimere zur Erkennung von z.B. löslichen Faktoren aus N. meningitidis bilden (Wyllie, et al., 2000).

TLR2 wird auf Zellen des Immunsystems exprimiert, in erster Linie auf Monozyten und B-Zellen, in geringerem Maße auch auf Mastzellen, T-Lymphozyten und NK-Zellen (natural killer cells). Das TLR2-Gen wurde auf dem langem Arm des Chromosoms 4 lokalisiert (4q32). Es besteht aus zwei Exons, die gesamte kodierende Sequenz befindet sich jedoch auf Exon 2 und umfasst 2,3 kb (Chaudhary, et al., 1998;Rock, et al., 1998).

1.4.2.2 Toll-like-Rezeptor 9

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TLR9 ist ein Rezeptor, der bakterielle DNA erkennt (Hemmi, et al., 2000). DNA wurde lange Zeit für immunologisch inert gehalten, jedoch konnte inzwischen sowohl eine immunostimulatorische Wirkung von DNA nachgewiesen, als auch TLR9 als sein Rezeptor identifiziert werden (Hemmi, et al., 2000;Krieg, 1995;Sparwasser, et al., 1997;Stacey, et al., 1996).

TLR9 erkennt dabei spezifisch unmethylierte CpG-haltige Oligonukleotide (Bauer, et al., 2001). Dies sind CG-Dinukleotide innerhalb einer bestimmten Sequenz, des CpG-Motivs. Diese unmethylierten CpG-Oligonukleotide (CpG-ODN) wirken immunstimulatorisch und kommen häufig in bakterieller DNA vor (Krieg, et al., 1995). Im menschlichen Genom hingegen sind CpG-Oligonukleotide selten und überwiegend methyliert.

TLR9 wird im menschlichen Organismus in B-Zellen, plasmazytoiden dendritischen Zellen (PDC) und Makrophagen exprimiert und ist ferner in einigen Kolonepithelzelllinien und in Leberzellen nachweisbar (Akhtar, et al., 2003;Bauer, et al., 2001;Latz, et al., 2004).

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CpG-ODN führen zur Reifung und zu einer sehr starken Aktivierung dendritischer Zellen. Damit verbunden ist die Heraufregulierung von kostimulatorischen Rezeptoren und die Expression von Zytokinen wie IL-12 und IL-18, was einer Immunantwort vom TH1-Typ entspricht (Takeda, et al., 2003). CpG-DNA ist ein potentes Adjuvans, schon die alleinige Gabe von bakterieller DNA oder von CpG-ODN bewirkt durch Ausschüttung inflammatorischer Zytokine eine so starke Immunantwort, dass Mäuse gegen eine Infektion mit intrazellulären Pathogenen wie Listeria monocytogenes oder Leishmania major geschützt sind (Elkins, et al., 1999). Ein therapeutischer Einsatz von CpG-DNA zur Vakzinierung sowie bei infektiösen, atopischen und chronisch-entzündlichen Erkrankungen wird zur Zeit untersucht (Krieg, et al., 1998;Krieg and Wagner, 2000;Lipford, et al., 1997).

Im Gegensatz zu den anderen TLRs scheint für TLR9 die Aufnahme und endosomale Reifung von CpG-DNA notwendig, um seine immunologischen Effekte zu bewirken. Chloroquin und andere Substanzen, die die Ansäuerung von Endosomen inhibieren, unterbrechen die TLR9-Signaltransduktion (Hacker, et al., 1998). Kürzlich konnte ferner gezeigt werden, dass CpG-DNA und TLR9 in dendritischen Zellen und Makrophagen kolokalisieren (Latz, et al., 2004).

Das für TLR9 kodierende Gen wurde auf dem kurzen Arm des Chromosoms 3 lokalisiert (3p21.3). Es werden verschiedene Splicevarianten angegeben (Chuang and Ulevitch, 2000;Du, et al., 2000). Die Regulation von TLR9 ist bislang wenig erforscht, LPS, CSF-1 und IFN-γ scheinen hierbei eine Rolle zu spielen (An, et al., 2002;Sweet, et al., 2002). Der Promotorbereich von TLR9 wurde bislang nicht charakterisiert.

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Eine weitere mögliche Rolle für TLR9 wird auch bei viralen Erkrankungen gesehen, z.B. bei der Erkennung des Herpes-simplex-Virus (Krug, et al., 2003;Lund, et al., 2003) und bei der Induktion von HIV-1 (Agrawal and Martin, 2003;Equils, et al., 2003).

1.4.2.3 Genetische Polymorphismen in TLR-Genen

Durch die Schlüsselstellung der Toll-like-Rezeptoren im angeborenen und adaptiven Immunsystem haben genetische Variationen in TLR-Genen einen Einfluss auf Immunabwehr und Pathogenese inflammatorischer Krankheiten.

Ein Polymorphismus im TLR2-Gen wurde z.B. mit einem höheren Risiko für Staphylokokkeninfektionen assoziiert (Lorenz, et al., 2000). Der zugrunde liegende SNP (G2408A) liegt im kodierenden Bereich des TLR2-Gens und führt zum Aminosäurenaustausch von Arginin 753 zu Glutamin. Zwei Polymorphismen im TLR4-Gen führen ebenfalls zu einem Aminosäurewechsel, von Aspartat (Asp) 299 zu Glycin (Gly) und von Threonin (Thr) 399 zu Isoleucin (Ile). Der Asp299Gly-Polymorphismus erhöht das Risiko für bakterielle Infektionen und senkt das Risiko für Atherosklerose der Karotiden (Kiechl, et al., 2002). Der Thr399Ile-Austausch prädisponiert für Sepsis und Infektionen mit Gram-negativen Bakterien (Lorenz, et al., 2002). Für TLR2 und TLR4 sind inzwischen viele weitere Polymorphismen entdeckt und in der SNP-Database des National Center for Biotechnology Information (NCBI)hinterlegt.

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Durch die erst kürzer zurückliegende Entdeckung von TLR9 und seiner Klonierung ist bis jetzt wenig über TLR9-SNPs und Krankheitsassoziationen bekannt. Die Untersuchung auf Polymorphismen in diesem Rezeptor ist durch den Umstand erschwert, dass die Genstruktur noch nicht endgültig aufgeklärt ist und verschiedene Angaben über Gengröße und Splicevarianten publiziert sind (Chuang and Ulevitch, 2000;Du, et al., 2000). Mehrere SNPs sind in TLR9 beschrieben (Abb. 3), doch konnte bis jetzt erst ein SNP mit einer Krankheit assoziiert werden, der T-1237C-Polymorphismus, der im potentiellen Promotorbereich liegt und mit einem erhöhten Risiko für Asthma bei Europäern einhergeht (Lazarus, et al., 2003).

Abb. 3: Das TLR9-Gen mit einer Auswahl von SNPs
Der Austausch der Basen ist gekennzeichnet, die Lage der SNPs ist jeweils relativ zum Translationsstart (Startcodon=0) angegeben. Der Transkriptionsstart (TS) liegt bei – 638 bp (nach Lazarus et al., 2003).

1.5 Rheumatoide Arthritis und das angeborene Immunsystem

Die meisten Autoren gehen von RA als einer Autoimmunerkrankung aus, die durch eine Fehlregulation des adaptiven Immunsystems bedingt ist (Firestein, 2003). Diese These wird durch viele Forschungsergebnisse gestützt. Wie andere Autoimmunerkrankungen tritt RA bei Frauen gehäuft auf, und es scheint ein systemischer Prozess zugrunde zu liegen, da mehrere Gelenke betroffen sind (Harris, 2001). Es findet eine Immunreaktion gegen körpereigene Strukturen statt und Autoantikörper werden gebildet, z.B. der Rheumafaktor, der sich gegen den Fc-Teil des Immunglobulins richtet (s. 1.2.3). Das Synovium wird von aktivierten Lymphozyten, Monozyten und Makrophagen infiltriert. Die T-Zellen in RA-Patienten sind zum proinflammatorischen Typ TH1 polarisiert und proinflammatorische Zytokine wie TNF-α, IL-1 und IL-6 überwiegen. Ein spezifisches Autoantigen, das zur Auslösung oder Aufrechterhaltung der Gelenksentzündung führt, konnte bisher jedoch nicht identifiziert werden.

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Der Großteil der Untersuchungen der letzten Jahrzehnte konzentrierte sich auf Mechanismen des adaptiven Immunsystems bei der Pathogenese der RA. Nach neueren Ergebnissen könnte jedoch das angeborene Immunsystem eine bedeutende Rolle bei der Auslösung der RA spielen. Viele Forscher halten ein zweistufiges Modell für möglich, nach dem sowohl das angeborene als auch das adaptive Immunsystem beteiligt sind (Firestein, 2003;Smolen and Steiner, 2003). Die initiale Gelenksentzündung könnte durch ein Fremdantigen hervorgerufen werden, z.B. durch Mikroorganismen oder deren Produkte. Diese Entzündung könnte sich durch Beteiligung des adaptiven Immunsystems unter bestimmten Voraussetzungen wie z.B. das Vorliegen eines bestimmten HLA-DR-Typs in einen selbstunterhaltenden Prozess weiterentwickeln (Ebringer and Wilson, 2000;Firestein, 2003).

Den Toll-like-Rezeptoren als wesentlicher Komponente des angeborenen Immunsystems scheint bei der Induktion der initialen Inflammation eine wichtige Rolle zuzukommen. Insbesondere TLR2 und TLR9 könnten an der Pathogenese der RA beteiligt sein. So konnte der TLR9-Ligand CpG-DNA als möglicher Auslöser von Arthritis identifiziert werden (Deng, et al., 1999). Die intraartikuläre Gabe von CpG-DNA führt zu starker TNF-α-Ausschüttung und schließlich zur CpG-vermittelten Arthritis. Der Einsatz von synthetischen, suppressiv wirkenden Oligonukleotiden hingegen kann die CpG-induzierte Immunaktivierung und TNF-α-Ausschüttung hemmen und vor Auslösung einer Arthritis schützen (Zeuner, et al., 2002). In den Gelenken der meisten RA-Patienten konnte DNA unterschiedlicher Pathogene isoliert werden (Schaeverbeke, et al., 1997;van der Heijden, et al., 2000).

Auch nach einer anderen These könnten TLRs bei der Auslösung von Autoimmunität und damit auch der RA beteiligt sein: Mikrobielle Infektion mit folgender Gewebsnekrose und Inflammation können die Hochregulation von kostimulatorischen Molekülen auf ruhenden antigenpräsentierenden Zellen bewirken und damit zum Verlust der T-Zell-Anergie beitragen. Zusätzlich kann die Entzündungsantwort die Präsentation von dem Immunsystem sonst verborgenen Antigenen ermöglichen und damit zum „epitope spreading“ beitragen (Cotran, et al., 1999;Craft and Fatenejad, 1997).

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Auch TLR-Liganden außerhalb des Gelenks könnten zur Pathogenese der RA beitragen. In einem Mausmodell für RA konnte gezeigt werden, dass TLR9 an der Induktion der Rheumafaktorproduktion durch autoreaktive B-Zellen beteiligt ist (Leadbetter, et al., 2002). Immunkomplexe, die Wirts-DNA enthalten, werden vermutlich von B-Zellen an ihrem Antigenrezeptor gebunden. Nach Bindung des Wirts-DNA-haltigen Teils des Immunkomplexes an TLR9 und endosomaler Aufnahme wird die autoreaktive B-Zelle aktiviert und produziert RF. Die Aktivierung der B-Zelle kann durch den TLR9-Inhibitor Chloroquin blockiert werden. Unterstützt wird diese Theorie dadurch, dass Chloroquin seit langem erfolgreich in der Basistherapie der rheumatoiden Arthritis eingesetzt wird.

Wirts-DNA könnte dieser Untersuchung zufolge ein pathogener Faktor bei der Auslösung von RA sein. Normalerweise ist Wirts-DNA nicht immunstimulatorisch, die CpG-Elemente im menschlichen Genom sind überwiegend methyliert und können TLR9 daher nicht aktivieren. Bei RA und systemischem Lupus erythematodes (SLE) konnte aber gezeigt werden, dass die DNA-Methylierung herabgesetzt ist (Richardson, et al., 1990). Dies könnte auch erklären, warum viele Autoantikörper in Autoimmunerkrankungen sich gegen DNA-haltige Strukturen wie Chromatin oder andere Nukleinsäure-Protein-Partikel richten. Des weiteren können Autoimmunkrankheiten durch Medikamente induziert werden, die die DNA-Methylierung inhibieren (Yung, et al., 1995).

Auch für die Beteiligung von TLR2 an der Pathogenese der RA gibt es Hinweise. Neben bakterieller DNA wurde der TLR2-Ligand Peptidoglykan in Gelenken von RA-Patienten nachgewiesen (van der Heijden, et al., 2000), jedoch fehlen in dieser Studie Daten über das Vorliegen von Peptidoglykan in Gelenken Gesunder. Die Expression von TLR2 in synovialen Fibroblasten von RA-Patienten konnte gezeigt werden, besonders ausgeprägt an Stellen der Invasion in Knorpel oder Knochen (Seibl, et al., 2003). In gesunden Kontrollpatienten ist die TLR2-Expression dagegen deutlich schwächer ausgeprägt und es konnten keine Stellen lokal hoher Expression gefunden werden. Die TLR2-Expression in synovialen Fibroblasten ist regulierbar; nach Gabe von Peptidoglykanen werden sowohl TLR2-mRNA heraufreguliert, als auch die proinflammatorischen Zytokine IL-6 und IL-8 ausgeschüttet und Integrine und Matrix-Metalloproteinase verstärkt exprimiert (Kyburz, et al., 2003). Dieses Ergebnis könnte auch die Beobachtung erklären, dass intraartikulär verabreichte Peptidoglykane zu Arthritis führen können (Liu, et al., 2001). Auch die Regulation von TLR9 an synovialen Fibroblasten wurde untersucht (Kyburz, et al., 2003) und es konnten keine Veränderungen in der TLR9-Expression nach Stimulation mit CpG-ODN gefunden werden. Dieses Ergebnis ist jedoch übereinstimmend mit der Beobachtung, dass CpG-DNA als Ligand die Expression seines eigenen Rezeptors auch in anderen Zellen nicht hochreguliert, sondern senkt (Hornung, et al., 2002).


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14.11.2005