3 Materialien und Methoden

3.1 Patientenproben

↓20

Die Proben der RA-Patienten wurden an der Klinik für Rheumatologie und klinische Immunologie der Charité gesammelt, asserviert und die klinischen Parameter bestimmt. Es handelt sich um 118 Berliner Patienten (29 männlich, 89 weiblich, Durchschnittsalter 56,2 Jahre, Standardabweichung 13,3 Jahre) mit rheumatoider Arthritis, deren Diagnose nach den Kriterien des American College of Rheumatology (ACR) gesichert war und die einen ACR-Score von vier oder mehr aufwiesen (s. 1.2.4). Bei 95 Patienten wurde der Rheumafaktor mittels ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) der Firma HYCOR (Autostat II RF) im Serum gemessen. Das Patientenkollektiv spiegelt sowohl in der Geschlechtsverteilung (weiblich : männlich = 3:1) als auch bei der RF-Seropositivität (23% RF-negativ, 77% RF-positiv) die allgemeinen epidemiologischen Charakteristika der RA-Erkrankung wieder.

Patienten mit juveniler rheumatoider Arthritis oder anderen Arthritiden wurden ausgeschlossen. Ein zu unserer Studie ähnliches Grundkollektiv ist bereits von Stuhlmüller et al. in einer Studie zur Genaktivierung von Monozyten bei RA-Patienten beschrieben (Stuhlmuller, et al., 2000). Die DNA-Isolierung erfolgte aus Vollblut oder Gewebeproben durch Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Präzipitation im Labor der Arbeitsgruppe Dr. Stuhlmüller/Dr. Häupl an der Klinik für Rheumatologie und klinische Immunologie der Charité. Die Studie wurde durch die Ethikkomission der Charité genehmigt und die Patienten haben ihr schriftliches Einverständnis zu Probenentnahme und Analyse der Proben erteilt.

↓21

Als Vergleichskollektiv dienten Proben von gesunden Freiwilligen aus Berlin und Konstanz, die Teilnehmer einer Studie des Instituts für Mikrobiologie und Hygiene zu TLR-Polymorphismen sind. Jedem RA-Patient wurde eine randomisierte Kontrollprobe eines Gesunden des gleichen Geschlechts zugeordnet. Die Randomisierung erfolgte über Zufallszahlen, die nach Mads Haahr/University of Dublin (www.random.org) generiert wurden. Die Kontrollgruppe umfasste 118 Gesunde, davon 67 aus Berlin und 51 aus Konstanz. Das Durchschnittsalter betrug 44,1 Jahre (Standardabweichung 14,4). Die Proben sind bereits teilweise auf TLR2- und TLR4-Polymorphismen genotypisiert worden (Schroder, et al., 2003;von Aulock, et al., 2003). Die DNA-Isolierung erfolgte aus Vollblut (Proben aus Konstanz) oder aus Abstrichen der Wangenschleimhaut (Berlin) mittels des QIAamp DNABlood Mini Kit (Qiagen).

3.2 Chemikalien und Reagenzien

Soweit nicht anders angegeben, wurden alle Chemikalien im höchsten Reinheitsgrad bezogen. Standardchemikalien wie Ethanol werden nicht aufgeführt.

Agarose, Standard

Roth, Karlsruhe

Agarose, low melt

Biozym, Hess. Oldendorf

Borsäure

Roth, Karlsruhe

Bovines Serum Albumin (BSA)

New England Biolabs (NEB), Beverly, USA

Deoxynukleotidtriphosphate (dNTPs)

Roche, Mannheim

DNA-Längenmarker

NEB, Beverly, USA

EDTA

Roth, Karlsruhe

Ethidiumbromid

Roth, Karlsruhe

Natriumchlorid

Fluka, Deisenhofen

Natriumacetat

Sigma-Aldrich, St. Louis, USA

Phenol

Roth, Karlsruhe

Chloroform

Roth, Karlsruhe

Isoamylalkohol

Roth, Karlsruhe

Glykogen

Beckman Coulter, Fullerton, USA

TE-Stocklösung

Roth, Karlsruhe

TRIS

Roth, Karlsruhe

3.3 Enzyme

↓22

Polymerasen

TaqDNA Polymerase

Qiagen, Hilden

Thermoprime Plus PCR Polymerase

Abgene, Epsom, UK

Gentherm Taq

Rapidozym, Berlin

FastStart DNA Master Hybridization Probes

Roche, Mannheim

Restriktionsenzyme

↓23

Aci I

NEB, Beverly, USA

Afl II

NEB, Beverly, USA

BstN I

NEB, Beverly, USA

3.4 Puffer

5x TBE

54 g/l

TRIS-Base

Roth, Karlsruhe

 

27,5 g/l

Borsäure

Roth, Karlsruhe

 

20 ml 

0,5 M EDTA (pH 8,0)

Roth, Karlsruhe

3.5 Synthetische Oligonukleotide

Alle Primer und Sonden wurden von der Firma MWG Biotech/ Ebersbach oder TIB-MOLBIOL/ Berlin synthetisiert, HPSF- oder HPLC- gereinigt und als Lyophilisat geliefert. Das Lyophilisat wurde in Aqua dest. gelöst, eine Stammlösung von 100 pmol/µl hergestellt und bei –20°C gelagert. Aus der Stammlösung wurden Aliquots in der Gebrauchskonzentration von 10 pmol/µl (Primer) oder 4 pmol/µl (Sonden) hergestellt.

↓24

Tab. 2: Primer für Standard-PCR

TLR-2 Genotypisierung, GenBank acc. no.: NM003264

TLR2 combi forward

5 -GCCTACTGGGTGGAGAACCT-3

TLR2 combi reverse

5 -GGCCACTCCAGGTAGGTCTT-3

  

TLR 9 Genotypisierung, Genbank acc. no.: NM_017442

TLR9-sense (TLR9s)

5’-TCCCAGCAGCAACAATTCATTA-3’

TLR9-forward (TLR9F)

5’-ATGGGAGCAGAGACATAATGGA-3’

TLR9-antisense (TLR9as)

5'-CTGCTTGCAGTTGACTGTGT-3'

Tab. 3: Primer für real-time-PCR

TLR-2, Genotypisierung, GenBank acc. no.: NM003264

TLR2-sense (TLR2s)

5'-AGTGAGCGGGATGCCTACT-3'

TLR2-antisense (TLR2as)

5'-GACTTTATCGCAGCTCTCAGATTTAC-3'

  

TLR-9, Genotypisierung, Genbank acc. no.: NM_017442

TLR9-sense (TLR9s)

5’-TCCCAGCAGCAACAATTCATTA-3’

TLR9-antisense (TLR9as)

5'-CTGCTTGCAGTTGACTGTGT-3'

Tab. 4: Sonden für real-time-PCR
Fluoreszein (FL), LightCycler Red-640 (LC Red640), LightCycler Red-705 (LC Red705)

TLR-2, SNP ID: rs5743708 (G2408A)

TLR2-sensor

5'-CAAGCTGCAGAAGATAATGAACACCAAG-3'-FL

TLR2-anchor

LC Red640-5'-CCTACCTGGAGTGGCCCATGGACG-3'

  

TLR-9, SNP ID: 1. rs5743836 (T-1237C) und 2. rs187084 (T-1486C)

TLR9-sensor-1

5’-GGAGTTTCCAGGCAGAGG-3’-FL

TLR9-anchor-1

LC Red705-5’-ACAGCACATCCCAAGGCCCT-3’

TLR9-sensor-2

5’-ATCACTGCCCTCAAGAAGCT-3'-FL

TLR9-anchor-2

LC Red640-5’-ACATTCCAGCAGGGGAATAAGACGATA-3’

3.6 Kitsysteme

↓25

CEQ Sequencing Kit

Beckman Coulter, Fullerton, USA

PCR Purification Kit

Qiagen, Hilden

3.7 Einwegmaterialien

Reaktionsgefäße

Eppendorf, Hamburg

 

Biozym, Hess. Oldendorf

 

Roth, Karlsruhe

Pipettenspitzen

Roth, Karlsruhe

 

Eppendorf, Hamburg

LightCycler® Kapillaren

Roche, Mannheim

3.8 Geräte

Kühlzentrifuge Centrifuge 5403

Eppendorf, Hamburg

Feinwaage BA200

Sartorius, Göttingen

Gelelektrophoreseanlage

Biorad, Hercules, USA

Kamera CF 1/8 FMC CCD, Eagleeye

Stratagene, La Jolla, USA

Kapillarsequencer CEQ8000

Beckman Coulter, Fullerton, USA

LightCycler®

Roche, Mannheim

Speed Vac Uni Vapo 100H

Uniequip, Martinsried

Spektrophotometer Bio

Eppendorf, Hamburg

Steril-Arbeitsbank Antair BSK

Anthos, Siegburg

Thermocycler T3

Biometra, Göttingen

Thermomixer 5436

Eppendorf, Hamburg

Tischzentrifuge Centrifuge 5415

Eppendorf, Hamburg

Ultrazentrifuge L8-70M

Beckman Coulter, Fullerton, USA

3.9 Software

↓26

Zum Design von Oligonukleotiden wurde das Programm Primer3 des Whitehead Institute, Cambridge/USA eingesetzt (Rozen and Skaletsky, 2000). Die Analyse auf Transkriptionsfaktorbindungsstellen erfolgte mittels der Software Alibaba2 (Grabe, 2002). Für nichtparametrische Tests und Häufigkeitsberechnungen wurde das Programm SPSS 11.0 (SPSS Inc., Chicago, USA) eingesetzt. Die Berechnung der Odds Ratio, der p-Werte (Fisher´s Exact Test und chi-Quadrat-Test) erfolgte mit der Epiinfo-Software (CDC, The Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, USA) sowie mit StatXact 6 (Cytel Soft ware Corporation, Cambridge, USA).

3.10 Molekularbiologische Methoden

3.10.1 Isolierung von DNA durch Phenol-/Chloroform-/Isoamylextraktion und Ethanolpräzipitation

Die Aufreinigung der DNA aus dem Nukleinsäure/Protein-Gemisch erfolgte durch Extraktion mittels Phenol-/Chloroform-/Isoamylalkohol. Die in RLT-Puffer (Qiagen, Hilden) gelösten und eingefrorenen Leukozyten oder Gewebeproben wurden hierzu mit einem äquimolaren Teil Phenol-/Chloroform-/Isoamylalkohol-Gemisch (25:24:1) überschichtet und 30 min mittels eines Rotators gemischt. Das entstandene Gemisch wurde für 5 min bei 14 000 U/min in der Eppendorf Tischzentrifuge zentrifugiert, die obere Phase vorsichtig abgenommen und in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Um die letzten DNA-Reste vollständig zu isolieren, wurde die untere Phase des Zentrifugats mit TE-Puffer überschichtet, erneut wie beschrieben gemischt und zentrifugiert. Der klare Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß pipettiert.

Die erhaltenen Überstande wurden nun mit 0,1 Volumenteilen 3 M Natriumacetat und 2 Volumenteilen 99,8 % Ethanol gemischt und für mindestens 30 min bei –20°C inkubiert. Nach Zentrifugation für 15 min und 14 000 U/min bei 4°C wurde der Überstand dekantiert, die DNA-Pellets mit 900 µl 70 % igem Ethanol gewaschen und erneut für 3 min bei 14 000 U/min zentrifugiert. Der überschüssige Alkohol wurde mit einer Pipette vorsichtig abgenommen, das Pellet bei Raumtemperatur getrocknet und in 200 µl TE-Puffer aufgenommen.

3.10.2 Genotypisierung durch Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLP) und Hybridisierungssonden

↓27

Die RFLP-Analyse beruht auf dem Prinzip, dass durch einen Nukleotidaustausch Schnittstellen für Restriktionsenzyme wegfallen oder geschaffen werden. Nach einer Polymerase-Kettenreaktion („polymerase chain reaction“, PCR) mit sequenzspezifischen Primern wird das PCR-Produkt mit einem Restriktionsenzym verdaut und anschließend auf einem Agarose-Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Anhand des Bandenmuster bzw. der Fragmentlängen können die Proben genotypisiert werden.

Neuere Methoden wie der 5’Nuklease-Assay (TaqMan®-PCR) oder Hybridisierungssonden (LightCycler®-PCR) ermöglichen die Mutationsanalyse in einer einzigen Reaktion ohne weitere Nachbearbeitung der Proben. Bei beiden Verfahren wird eine PCR durchgeführt, jedoch werden zusätzlich zu den Primern sequenzspezifische fluoreszenzmarkierte Sonden eingesetzt, die mit den gebildeten PCR-Produkten hybridisieren. Das LightCycler-Verfahren ist eine der schnellsten Methoden zur SNP-Analyse. Der LightCycler ist ein Thermocycler mit integriertem Fluorimeter (Wittwer, et al., 1997). Wie in der Standard-PCR erfolgt eine Amplifikation von DNA oder RNA (template), es werden dazu sequenzspezifische Primer und eine Polymerase eingesetzt. Im Gegensatz zur konventionellen PCR erfolgt die Reaktion in Glaskapillaren, die lichtdurchlässig sind und durch die große Oberfläche schnelle Heiz- und Abkühlgeschwindigkeiten ermöglichen und somit die Reaktionsdauer verkürzen.

Zur Genotypisierung von Proben werden Hybridisierungssonden eingesetzt („hybridization probes“), die aus zwei Oligonukleotiden bestehen und mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind (Anker- und Sensorsonde). Die Sensorsonde ist mit Fluoreszein am 3’-Ende markiert, die Ankersonde mit LightCyclerRed640 oder LightCyclerRed705 am 5’-Ende. Die Sonden binden nach Denaturierung an den komplementären Strang des sich bildenden PCR-Produkts zwischen den Primern (Abb. 4a). Binden Anker- und Sensorsonde nebeneinander (≤ 5 Basenpaare) und werden sie durch einen Lichtimpuls angeregt, emittiert die Sensorsonde ein Lichtsignal von 530 nm, das den Farbstoff der Ankersonde anregt und zur Emission eines zweiten Signals führt (640 oder 705 nm), das vom LC-Gerät gemessen wird (Abb. 4b). Die Sensorsonde wird daher als Donor-Fluorophor, die Ankersonde als Akzeptor-Fluorophor bezeichnet. Die Anregung des Akzeptor-Fluorophors durch den Donor-Fluorophor wird als „Fluorescence Resonance Energy Transfer“ (FRET) bezeichnet und kann nur bei Bindung der Sonden unmittelbar nebeneinander erfolgen. Dies verhindert die Anregung freier Sonden und damit eine Fehlbestimmung. Mit zunehmender Zyklenzahl wird mehr Amplifikat gebildet, mehr Sonden können binden und die Fluoreszenzintensität steigt proportional zur Menge des entstandenen PCR-Produktes. Dies ermöglicht die Quantifizierung des PCR-Produktes in Echtzeit („quantitative real time PCR“).

↓28

Im Anschluss an die PCR wird eine Schmelzkurve erstellt. Dazu wird von einem Ausgangswert von 45-60°C die Temperatur kontinuierlich erhöht, was bei Überschreiten der Schmelztemperatur zum Ablösen der Sonden und Abbruch des Fluoreszenzsignals führt. Dieser Schmelzpunkt ist ein für jede Sonde und Reaktion charakteristischer Wert. Liegt eine Fehlpaarung von zwei Basen vor, z.B. bei einem Nukleotidaustausch durch einen Polymorphismus, löst sich die Sonde bereits bei niedrigeren Temperaturen und der Schmelzpunkt ist verschoben (Abb. 4c). Bei heterozygoten Proben liegen zwei verschiedene Allele vor und entsprechend werden zwei Schmelzpunkte gemessen (Abb. 5). Zur einfacheren Ablesung der Schmelzpunkte wird die erste negative Ableitung der Fluoreszenz gegen die Temperatur aufgetragen (Abb. 4d, Abb. 5). Anhand der Schmelzwerte und des Kurvenverlaufs kann dann die Genotypisierung erfolgen (Roche, 1998).

Abb. 4: Genotypisierung am LightCycler
A: Prinzip der LightCycler-PCR. Die Sensorsonde hybridisiert mit dem DNA-Bereich, in dem der SNP vorliegt. Das 3’-Ende der Sensorsonde ist mit Fluoreszein markiert (Donor-Fluorophor). Die Ankersonde bindet wenige Basenpaare entfernt vom 3’-Ende der Sensorsonde. Das 5’-Ende der Ankersonde ist mit LightCycler Red markiert (Akzeptor-Fluorophor)

B: Prinzip des FRET. Wird der Donor-Fluorophor durch einen Lichtimpuls (h
ν) angeregt, kommt es zur Energieübertragung auf den Akzeptor-Fluorophor. Bei niedrigen Temperaturen kommt es sowohl beim Wildtyp-Allel (linke Abb.) wie auch beim mutierten Allel (rechte Abb.) zum FRET.
C: Bei höheren Temperaturen löst sich die Sonde bei Vorliegen des mutierten Allels (SNP), während sie beim Wildtyp-Allel noch bindet. Es kann daher bei Existenz des mutierten Allels keine Energie
über tragung mehr stattfinden.D: Resultierende Schmelzkurven. Das Wildtyp-Allel weist einen höheren Schmelzpunkt (SP) als das mutierte Allel auf (verändert nach Roche AG, 1998)Fluorescein (FL), Schmelzpunkt (SP), Lichtimpuls (hν)

Abb. 5: Erste negative Ableitung der Schmelzkurven, Darstellung der Schmelzpunkte (SP)
Die homozygote Mutante (HM) weist einen niedrigen Schmelzpunkt auf, bei Vorliegen des Polymorphismus in heterozygoter Form (HZ) treten zwei Schmelzpunkten auf. Der Wildtyp (WT) hat einen höheren Schmelzpunkt als die homozygote Mutante.

3.10.3 Real-time-PCR-basierte Genotypisierung von Polymorphismen am LightCycler mittels eines neuen Reaktionsmixes

↓29

Die LightCycler-PCR wird normalerweise mit einem speziellen Reaktionsmix der Firma Roche durchgeführt, der die besonderen Bedingungen der PCR in Glaskapillaren berücksichtigt, dessen Zusammensetzung jedoch nicht veröffentlicht ist. Konventionelle Taq-Polymerasen (z.B. Qiagen Taq Polymerase) können nicht eingesetzt werden. Der Einsatz des „Roche FastStart Hybridization Probes Mix“ ist jedoch mit erheblichen Kosten verbunden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Puffersystem entwickelt, das die Genotypisierung von TLR-Polymorphismen am LightCycler mit einer konventionell erhältlichen Taq-Polymerase zu deutlich reduzierten Kosten erlaubt.

Natrium- und Kaliumsalze interferieren mit dem Verfahren der real-time-PCR (Wittwer, 1991). Sie sind aber in den Reaktionspuffern der meisten handelsüblichen Polymerasen enthalten. Es wurde daher ein natrium- und kaliumfreier Puffer auf der Basis von Ammoniumsulfat verwendet (ABgene oder Rapidozym), der mit 3 mg bovinem Serumalbumin (BSA) versetzt war. Normalerweise kommt es im Laufe der Amplifikation zu einem Niederschlag von Reaktionsprodukten an der Wand der Glaskapillaren. Dies sollte durch die Verwendung von BSA verhindert werden. Alle Reaktionen wurden in einem Volumen von 20 µl durchgeführt, eine Negativkontrolle wurde stets mitgeführt und eine Kalibrierung des LightCyclers für Zweifluoreszenzbestimmung durchgeführt.

3.10.3.1  Genotypisierung der TLR9-Polymorphismen T-1486C und T-1237C

Die beiden TLR9-Polymorphismen T-1237C und T-1486C wurden neben dem TLR2-Polymorphismus G2408A zur Analyse bei RA-Patienten und Gesunden ausgewählt. Durch beide Polymorphismen entsteht eine neue Transkriptionsfaktorbindungsstelle (s. 4.1). Der T-1237C-Polymorphismus ist ferner der bisher einzige bekannte TLR9-Polymorphismus, der mit einer Erkrankung (Asthma) assoziiert ist. Beide TLR9-Polymorphismen liegen nur 249 Basenpaare voneinander entfernt. Zur simultanen Detektion der Polymorphismen wurden Primer verwendet, die beide Polymorphismen umspannen (TLR9s und TLR9as, s. Abb. 6). Es wurden sequenzspezifische, fluoreszenzmarkierte Sonden eingesetzt, die mit den Polymorphismusbereichen des Amplikons hybridisierten. Durch Bestimmung der Schmelzpunkte der Sonden konnte eine Genotypisierung der Proben erfolgen. Es wurde jeweils ein Protokoll für den Roche-Mix sowie die konventionelle Taq-Polymerase (ABgene) entwickelt.

↓30

Abb. 6: Prinzip der TLR9-LightCycler-PCR
Fluoreszein (FL), LightCycler Red (LCred), Primer TLR9s/TLR9as, Polymorphismen T-1486C und T-1237C. Die Länge des PCR-Produktes beträgt 499 Basenpaare.

Roche FastStart Hybridization Probes

Der Reaktionsansatz enthielt 5 µl DNA (2-10 ng/µl) und 2 µl FastStart Hybridization Probes, die Konzentration von Magnesiumchlorid betrug 2 mM, die der fluoreszenzmarkierten Sonden 0,14 µM und der Primer 0,5 µM (TLR9s) bzw. 1 µM (TLR9as). Die Bedingungen für die PCR und Schmelzkurve sind in Tab. 5 aufgeführt.

↓31

Tab. 5: Parameter für die LC-PCR zur TLR9-Genotypisierung (Roche-Puffer)

Reaktionsschritt

Zyklenanzahl

Temperatur (°C)

Zeit (s)

Initiale Denaturierung

1

95

600

Amplifikation

55

  

Denaturierung

95

0

Primerhybridisierung

58

10

Extension

72

18

Schmelzkurve

1

  

Initiale Denaturierung

95

0

1. Teil

53

30

2. Teil

53-80, 0,1°C/s

270

ABgene Thermoprime Taq

Zur Verwendung einer konventionellen Taq-Polymerase wurde das Protokoll wie folgt angepasst: In einem Volumen von 20 µl wurden 5 µl DNA (2-10 ng/µl), 3 mg BSA, 1,5 units Taq Polymerase und 2 µl 10x Puffer eingesetzt. Die Konzentration der Primer betrug 0,5 µM (TLR9s) bzw. 1 µM (TLR9R), 1,4 µM für die Hybridisierungssonden, 0,125 mM für Desoxynukleotide (dNTP) und 1,625 mM für MgCl2. Die Bedingungen für die PCR und Schmelzkurve sind in Tab. 6 aufgeführt.

↓32

Tab. 6: Parameter für die LC-PCR zur TLR9-Genotypisierung (ABgene-Puffer)

Reaktionsschritt

Zyklenanzahl

Temperatur (°C)

Zeit (s)

Initiale Denaturierung

1

95

240

Amplifikation

55

  

Denaturierung

95

0

Primerhybridisierung

57

10

Extension

72

20

Schmelzkurve

1

  

Initiale Denaturierung

95

0

1. Teil

45

60

2. Teil

45-80, 0,1°C/s

350

3.10.3.2  Genotypisierung des TLR-2-Polymorphismus G2408A

Roche FastStart Hybridization Probes

Der Reaktionsansatz enthielt 5 µl DNA (2-10 ng/µl) und 2 µl FastStart Hybridization Probes, die Konzentration von Magnesiumchlorid betrug 4 mM, die der fluoreszenzmarkierten Sonden 0,14 µM und der Primer 0,25 µM (TLR2s) bzw. 0,5 µM (TLR2as). Die Parameter der PCR und der Schmelzkurve sind in Tab. 7 aufgeführt.

↓33

Tab. 7: Parameter für die LC-PCR zur G2408A-Genotypisierung (Roche-Puffer)

Reaktionsschritt

Zyklenanzahl

Temperatur (°C)

Zeit (s)

Initiale Denaturierung

1

95

600

Amplifikation

40

  

Denaturierung

95

0

Primerhybridisierung

55

10

Extension

72

18

Schmelzkurve

1

  

Initiale Denaturierung

95

0

1. Teil

53

30

2. Teil

53-80, 0,1°C/s

270

ABgene Thermoprime Taq

Der Reaktionsmix enthielt 5 µl DNA, 2 units Taq Polymerase, 2 µl 10x Puffer, 2,1 mM MgCl2, 0,25 µM TLR2s-Primer, 0,5 µM TLR2as-Primer, 0,125 mM dNTP und 0,14 mM der Sensor- und Ankerprobe. Die Bedingungen für die PCR und Schmelzkurve sind in Tab. 8 aufgeführt.

↓34

Tab. 8: Parameter für die LC-PCR zur G2408A-Genotypisierung (ABgene-Puffer)

Reaktionsschritt

Zyklenanzahl

Temperatur (°C)

Zeit (s)

Initiale Denaturierung

1

95

240

Amplifikation

40

  

Denaturierung

95

0

Primerhybridisierung

58

10

Extension

72

18

Schmelzkurve

1

  

Initiale Denaturierung

95

0

1. Teil

50

30

2. Teil

50-80, 0,1°C/s

300

3.10.4 Genotypisierung durch Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen

3.10.4.1 RFLP des TLR9-Polymorphismus T-1486C

Zur Überprüfung des LC-Verfahrens wurden die Proben auf Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen untersucht. Die PCR erfolgte in einem Gesamtvolumen von 30 µl. Es wurden 3 µl DNA (2-10 ng/µl) eingesetzt, 0,75 Einheiten Qiagen Taq Polymerase, 3 µl 10x Reaktionspuffer, 6 µl Q-Solution, 1,5 mM MgCl2, 0,166 mM dNTP, 0,3 µM Primer TLR9s und 0,6 µM Primer TLR9as. Eine Negativkontrolle wurde stets mitgeführt. Die PCR wurde unter den folgenden Temperaturbedingungen auf einem Biometra T3 Thermocycler durchgeführt:

Tab. 9: PCR-Parameter zur Genotypisierung des T-1486C-Polymorphismus mittels RFLP

Reaktionsschritt

Zyklenanzahl

Temperatur (°C)

Zeit (s)

Initiale Denaturierung

1

95

240

Amplifikation

35

  

Denaturierung

95

30

Primerhybridisierung

60

20

Extension

72

30

Terminale Extension

1

72

300

↓35

Es folgte ein Verdau von 6 µl des PCR-Produkts mit dem Enzym Afl II bei 37°C über Nacht in einem Gesamtvolumen von 15 µl (1,5 µl NEB Puffer 2, 20 U Afl II). Anschließend wurde das Produkt auf einem 2 % igen Agarose-Gel elektrophoretisch aufgetrennt.

3.10.4.2 RFLP des TLR9-Polymorphismus T-1237C

In 30 µl Gesamtvolumen waren enthalten: 3 µl DNA (2-10 ng/µl), 0,8 µM der Primer TLR9F und TLR9R, 2,2 mM MgCl2, 0,166 mM dNTP, 2 U Taq Polymerase, 3 µl 10x Puffer und 6 µl Q-Solution. Eine Negativkontrolle wurde stets mitgeführt.

Die PCR-Parameter sind in Tab. 10 aufgeführt.

↓36

Tab. 10: PCR-Parameter zur Genotypisierung des T-1237C-PM mittels RFLP

Reaktionsschritt

Zyklenanzahl

Temperatur (°C)

Zeit (s)

Initiale Denaturierung

1

95

240

Amplifikation

40

  

Denaturierung

95

30

Primerhybridisierung

61

20

Extension

72

18

Terminale Extension

1

72

300

Anschließend wurde das PCR-Produkt mit BstN I enzymatisch verdaut. Es wurden 12 µl PCR-Produkt mit 2 µl NEB Puffer 2 und 7,5 U BstN I in einem Gesamtvolumen von 20 µl bei 60°C für 3 Stunden inkubiert, auf ein 4 % iges low-melt-Agarosegel aufgetragen und elektrophoretisch getrennt.

3.10.4.3 RFLP des TLR2-Polymorphismus G2408A

Die Untersuchung auf Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen erfolgte nach dem von Schröder et al. publizierten Verfahren (Schroder, et al., 2003). Die PCR wurde unter Verwendung von 5 µl DNA (2-10 ng), 2,5 µl 10x Puffer, 2 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, 0,75 units Taq Polymerase und 1 µm der Primer T2combi forward und T2combi reverse in einem Ansatz von 25 µl durchgeführt. Eine Negativkontrolle wurde stets mitgeführt. Die Parameter der PCR sind in Tab. 11 aufgeführt.

↓37

Tab. 11: PCR-Parameter zur Genotypisierung des G2408A-PM mittels RFLP

Reaktionsschritt

Zyklenanzahl

Temperatur (°C)

Zeit (s)

Initiale Denaturierung

1

95

600

Amplifikation

30

  

Denaturierung

95

30

Primerhybridisierung

58

30

Extension

72

25

Terminale Extension

1

72

300

4 µl des PCR-Produktes wurden anschließend über Nacht bei 37°C mit 0,75 U Aci I und 1 µl NEB-Puffer 3 in Volumen von 10 µl enzymatisch verdaut. Die entstandenen Fragmente wurden auf einem Gel aus 1,5 % Agarose und 0,75 % low-melt-Agarose nach Elektrophorese für 90 min bei 70 V analysiert.

3.10.5 Agarose-Gelelektrophorese von PCR-Produkten für analytische Zwecke

Zur Auftrennung von PCR-Fragmenten wurden diese mit Ladepuffer versetzt und in einem mit Ethidiumbromid versetzten 0,8-4 % igen Agarose-Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Je nach zu erwartender Fragmentlänge erfolgte die Elektrophorese bei 70-100 V für 30-90 min. Ein DNA-Längenstandard wurde stets mitgeführt. Die Banden wurden durch Illumination mit UV-Licht sichtbar gemacht, mit einer CCD-Kamera aufgenommen und ausgedruckt.

3.10.6 Bestimmung der DNA-Konzentration von genomischer DNA

↓38

Zur Messung der Konzentration von Nukleinsäuren wurde die Optische Dichte (OD) der Probe mittels eines Photometers bestimmt. Nach Verdünnung in einer Einmalküvette mit 10 mm Schichtdicke wurde die OD bei 260 nm und 280 nm gemessen.

Aus der OD260 nm lässt sich die Konzentration von doppelsträngiger DNA berechnen:

c (µg/ml) =  OD260 nm x 50 x Verdünnungsfaktor

↓39

Der Proteingehalt der Probe wurde durch Messung bei der Wellenlänge von 280 nm ermittelt.

3.10.7  Cycle Sequencing von PCR-Produkten

Die Reaktionskomponenten wurden in einem Gesamtvolumen von 20 µl angesetzt, darin enthalten waren 2-4 µl gereinigtes PCR-Produkt, 2 µl Primer (1,6 pmol/µl), 4 µl Quick Start Master Mix und 10-12 µl Wasser, PCR-Grade. Nach Vortexen erfolgte das Cycle Sequencing im Thermocycler (Tab. 12).

Tab. 12: Parameter zum Cycle-Sequencing von PCR-Produkten

Reaktionsschritt

Zyklenanzahl

Temperatur (°C)

Zeit (s)

Initiale Denaturierung

1

96

240

Amplifikation

40

  

Denaturierung

96

20

Primerhybridisierung

50

20

Extension

60

240

↓40

Die Fällung der Cycle-Sequencing-Produkte erfolgte durch eine Lösung aus 2 µl 3 M Natriumacetat, 2 µl 100 mM EDTA und 1 µl Glykogen. 5 µl der Lösung wurden zusammen mit 20 µl des Cycle-Sequencing-Produkts sowie 60 µl 95 % igem Ethanol in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und durch Vortexen gründlich gemischt. Nach Zentrifugation für 15 min bei 14 000 U/min bei 4°C in der Eppendorf Centrifuge 5403 wurde der Überstand sorgfältig abpipettiert und das Pellet mit 200 µl 70 % Ethanol gewaschen. Nach erneutem Zentrifugieren wurde der Alkohol mit der Pipette entfernt und das Pellet für 10 min in der Speed Vac getrocknet.

Nach Überschichten des Pellets mit 25 µl SLS wurden die Reaktionsgefäße für 15 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Das in SLS gelöste Produkt wurde nun in eine 96-well-Platte überführt und mit einem Tropfen Mineralöl überschichtet. Parallel wurde die Pufferplatte vorbereitet und die entsprechenden wells einer 96-well-Flachbodenplatte wurden zu ¾ mit Separationspuffer gefüllt. Nach Erstellen des Belegungsblattes am Computer wurde das Sequenziergerät mit den Proben beladen und der Sequenzierlauf gestartet.

3.11 Statistische Auswertung

Zum Vergleich der Genotyp- und Allelverteilung wurde Pearsons chi-Quadrat-Test eingesetzt, Fisher´s Exact Test bei kleinen Untergruppen. Bei den klinischen, nicht normalverteilten Parametern (RF) wurden Quartile, Median, Minima und Maxima berechnet und auf Verteilungsunterschiede mittels des Mann-Whitney-U-Test getestet. Werte von p < 0,05 wurden als signifikant betrachtet.


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14.11.2005