5 Diskussion

5.1 Real-time-PCR zur Detektion der TLR9-Polymorphismen T-1237C und T-1486C

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Toll-like-Rezeptoren nehmen eine zentrale Rolle in der Abwehr von Infektionen ein, sie erkennen konservierte molekulare Pathogenstrukturen, sogenannte PAMPs, und lösen nach Bindung derselben die Aktivierung des angeborenen und schließlich des adaptiven Immunsystems aus (Akira, et al., 2001;Medzhitov and Janeway, 1998). Genetische Polymorphismen in TLRs sind entsprechend erster Ergebnisse mit infektiösen Krankheiten wie Sepsis und Meningokokkeninfektion sowie inflammatorischen Krankheiten wie Atherosklerose und Asthma assoziiert (Kiechl, et al., 2002;Lazarus, et al., 2003;Lorenz, et al., 2000;Smirnova, et al., 2003). Die Erkennung von genetischen Polymorphismen kann u. U. wertvolle Informationen zur Einteilung in Risikogruppen und zur Therapie geben. TLR9-Polymorphismen sind bisher wenig erforscht, es liegt bislang nur eine Publikation vor, in der die Assoziation des T-1237C-Polymorphismus mit dem Auftreten von Asthma beschrieben ist (Lazarus, et al., 2003). Angaben aus weiteren Quellen zur Häufigkeit dieses Polymorphismus in der Bevölkerung oder Ergebnisse zu seiner Beteiligung in anderen Krankheiten fehlen bislang vollständig. Dies könnte auch durch das Fehlen von Methoden zur schnellen und kostengünstigen Bestimmung des Polymorphismus bedingt sein. Bislang erfolgte die Detektion der TLR9-Polymorpismen durch Sequenzieren, was ein sowohl zeit- als auch kostenintensives Verfahren ist.

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Es wurde daher im Rahmen dieser Arbeit ein Real-time-PCR-basiertes Verfahren etabliert, das die Genotypisierung von Patientenproben auf den T-1237C- und T-1486C-Polymorphismus hin ermöglicht. Beide Polymorphismen können simultan in einer einzigen PCR-Reaktion bestimmt werden. Dies gelingt durch den Einsatz sequenzspezifischer Sonden, die mit zwei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind. Eine Genotypisierung von bis zu 30 Proben kann in einem einzigen LC-Lauf innerhalb von 90 Minuten erfolgen. Um die Kosten weiter zu senken, wurde ein Puffersystem eingeführt, das die Real-time-PCR am LightCycler mit einer handelsüblichen Taq-Polymerase erlaubt. Die Ergebnisse mit diesem Puffer sind vergleichbar mit den unter Verwendung des Roche FastStart Mixes erzielten (Abb. 9 und Abb. 10). Die Bestimmung der Genotypen konnte in allen Fällen anhand der Schmelzpunktanalyse erfolgen.

Im Vergleich zum Original-Mix der Firma Roche enthält der von uns verwendete BSA-supplementierte Puffer keine Hotstart-Polymerase und kann daher prinzipiell zu einem höheren Anteil von Nebenprodukten wie Primer-Dimeren führen. Durch das Primer-Design konnte dies jedoch verhindert werden. Es wurde weiterhin eine zweite Methode entwickelt, die eine Genotypisierung der TLR9-Polymorphismen anhand von Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen erlaubt. Zur Validierung der Real-time-PCR wurden die Ergebnisse durch die Analyse auf RFLPs hin überprüft. Es konnten hierbei keine Abweichungen zwischen den Verfahren festgestellt werden und es traten keine falsch-positiven oder falsch-negativen Ergebnisse auf. Proben aller T-1237C- und T-1486C-Genotypen wurden zusätzlich sequenziert als Abgleich mit dem bisher praktizierten Verfahren zur Genotypisierung von TLR9-Polymorphismen. Auch hier traten keine Unterschiede zu den durch Real-time-PCR erzielten Resultaten auf. Im Vergleich zum RFLP-basierten Verfahren erlaubt die Real-time-PCR-basierte Methode eine bedeutend schnellere und einfachere Genotypisierung der Proben, da beide Polymorphismen in einer Reaktion bestimmt werden können sowie weitere zeit- und arbeitsaufwendige Bearbeitungsschritte nach der PCR entfallen (Restriktionsverdau, Gelelektrophorese). Die Interpretation der Ergebnisse der Schmelzkurven ist einfacher, da zusätzliche Fehlermöglichkeiten mit der Post-PCR-Bearbeitung wegfallen (unvollständiger Verdau, Elektrophoresefehler etc.).

Mit dem vorgestellten Puffergemisch konnten die Reaktionskosten gegenüber dem Roche FastStart-Mix um ca. 50% gesenkt werden; es kann auch zur Genotypisierung anderer Polymorphismen mit anderen Hybridization Probes verwendet werden und wurde bereits erfolgreich zur Bestimmung von TLR2- und TLR4-Polymorphismen eingesetzt (Hamann, et al., 2004).

5.1.1 Vor- und Nachteile gegenüber der bisherigen Methode zur TLR9-Genotypisierung

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Im Vergleich zum bislang einzigen Verfahren zur Genotypisierung von TLR9, dem Sequenzieren, wie von Lazarus et al. 2003 beschrieben, weist die neu entwickelte Real-time-PCR vielfältige Vorteile auf. Das Sequenzieren umfasst mehrere Arbeitsschritte: die PCR, die Überprüfung der PCR-Produkte am Gel, die Reinigung der PCR-Produkte, das Cycle Sequencing, die Fällung der Cycle-Sequencing-Produkte sowie den eigentlichen Sequenzierlauf. Diese Methode ist daher sowohl personal- als auch zeitaufwendig. Vom ersten Arbeitsschritt bis zum Ergebnis vergehen bei der Sequenzierung ca. 12 Stunden, wohingegen bei der real-time-PCR die Resultate bereits nach 90 Minuten vorliegen. Die Real-time-PCR erfordert nur einen Arbeitsschritt und weist weniger Fehlermöglichkeiten und damit „Ausschuss“ von wertvollem Patientenmaterial auf. Die Materialkosten der Genotypisierung mittels Real-time-PCR mit dem von uns entwickelten Mix liegen bei ca. 1,50 Euro, die Sequenzierung kostet etwa das Fünffache. Der höhere Arbeitsaufwand beim Sequenzieren und die damit verbundenen Personalkosten dürften die Ersparnis bei Anwendung des Real-time-PCR-Verfahrens noch deutlich steigern.

Der Vorteil des Sequenzierens liegt in seiner höheren Auflösung. Die Abfolge der einzelnen Basen kann bestimmt werden und dies ermöglicht auch den Nachweis weiterer Polymorphismen, die mit der Real-time-PCR und Hybridisierungssonden nicht erfasst werden. Dies ist wichtig bei der Suche nach neuen Polymorphismen; zur Beantwortung der Fragestellung, ob der T-1237C- und der T-1486C-Polymorphismus in unterschiedlichen Populationen oder Krankheitsgruppen vermehrt auftreten, ist dies jedoch nicht von Bedeutung. Ferner ist die Auswertung der Sequenzierergebnisse erheblich zeitaufwendiger und mit mehr Fehlermöglichkeiten behaftet.

Zusammenfassend wurde im Rahmen dieser Arbeit eine neue Methode entwickelt, die eine einfache und schnelle Genotypisierung von zwei TLR9-Polymorphismen erlaubt und damit die Erforschung der Rolle dieser Polymorphismen bei verschiedenen Krankheiten erleichtert. Zusätzlich wurde ein neues Puffersystem etabliert, das die Genotypisierung dieses Polymorphismus zu deutlich geringeren Kosten ermöglicht und auch bei weiteren Polymorphismen anwendbar ist.

5.2 Assoziation von genetischen Polymorphismen in TLR9 und TLR2 mit dem Auftreten von rheumatoider Arthritis

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Die Pathogenese der RA kann bislang nur unzureichend erklärt werden. Neuere Hypothesen nehmen eine zweistufige Entwicklung an, bei der zuerst das angeborene und anschließend das adaptive Immunsystem aktiviert werden (Firestein, 2003). Durch ihre zentrale Rolle im angeborenen Immunsystem scheinen Toll-like-Rezeptoren hierbei eine entscheidende Rolle zu spielen, insbesondere TLR2 und TLR9 (s. 1.5). Eine genetische Komponente in der Pathogenese der RA ist gesichert, jedoch bleibt der Großteil der hieran beteiligten Faktoren bisher ungeklärt. Trotz der vielen Daten, die auf die wichtige Rolle der TLRs in der Pathogenese der RA hinweisen, sind genetische Variationen in Toll-like-Rezeptoren bei RA-Patienten bislang kaum untersucht. Es wurden daher in der vorliegenden Arbeit der TLR2-Polymorphismus G2408A und die TLR9-Polymorphismen T-1486C und T-1237C auf eine Assoziation mit dem Auftreten von RA untersucht. Bei bisherigen Polymorphismus-Studien wird bei der Auswahl der Kontrollgruppe selten auf die gleiche Zusammensetzung von Geschlecht und Alter wie in der Patientengruppe geachtet, oft fehlen Angaben zur Geschlechts- und Altersverteilung völlig. Dies trifft auch zu auf bisherige Untersuchungen zu genetischen Polymorphismen bei RA-Patienten, z.B. bei den Untersuchungen von Gonzalez-Escribano et al. (2003) oder Kilding et al. (2003). Gerade bei der rheumatoiden Arthritis ist jedoch die Geschlechtsverteilung wichtig und wurde daher von uns berücksichtigt. Es wurde in dieser Arbeit auf eine möglichst gleiche Zusammensetzung der Patienten- und Kontrollgruppe hinsichtlich Alter und Geschlecht geachtet. Anhand von Zufallszahlen wurde jedem RA-Patienten ein Kontrollpatient desselben Geschlechts und einer ähnlichen Altersgruppe zugeordnet. Der Altersunterschied zwischen Erkrankten und Gesunden in dieser Untersuchung ist im Vergleich zu anderen Studien gering, ließ sich jedoch aufgrund einer begrenzten Zahl von Kontrollpatienten nicht vollständig auf Null reduzieren.

5.2.1 Der TLR9-Polymorphismus T-1486C

Die Untersuchung zur Prävalenz des T-1486C-Polymorphismus zeigte ein häufiges Auftreten in der Bevölkerung. Es konnten drei verschiedene Genotypen unterschieden werden: TT, CT und CC. In der Kontrollgruppe fanden sich hierbei 43,2% heterozygote Träger (CT), 19,5% für Cytosin homozygote Träger (CC) und 37,3% Träger von zwei Thymosin-Allelen (TT). Mit 58,9% ist das T-Allel zwar das häufigere Allel, bei den Genotypen überwiegt jedoch die heterozygote CT-Form gegenüber der TT-Form. Die mit 41,1% bestimmte Allelfrequenz für Cytosin liegt leicht über der von Lazarus et. al. mit 39% bei Europäern gemessenen Häufigkeit (Lazarus, et al., 2003).

Der Vergleich der Häufigkeiten zwischen Patienten- und Kontrollgruppe zeigte keine signifikanten Differenzen. Zwar unterschieden sich beide in der Häufigkeit der drei vorkommenden Genotypen, die Allelfrequenz ist jedoch bei der Gesamtgruppe identisch (58,9%T, 41,1%C), die Unterschiede in der männlichen und weiblichen Untergruppe gering. Diese Daten deuten darauf hin, dass der T-1486C-Polymorphismus nicht zur Suszeptibilität für RA beiträgt.

5.2.2 Der TLR9-Polymorphismus T-1237C

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Der T-1237C-Polymorphismus kommt deutlich seltener vor als der T-1486C-Polymorphismus, seine Allelfrequenz beträgt 16,1% bei Gesunden. In der Kontrollgruppe konnten drei Genotypen unterschieden werden: Wildtyp (TT), heterozygote (CT) und homozygote Träger (CC). Der TT-Genotyp war mit 70,3% der häufigste, gefolgt vom heterozygoten (27,1%) und CC-homozygoten (2,5%) Genotyp. Im Vergleich zu den von Lazarus et al. publizierten Ergebnissen kam das C-Allel damit in unserer Population geringfügig häufiger vor, die Heterozygotenhäufigkeit war um 3,1% höher, wogegen die Homozygotenfrequenz gleich war (2,6% vs. 2,5%). Die Anzahl von Homozygoten liegt damit in unserer Population im Hardy-Weinberg-Equilibrum (erwartete Anzahl von Homozygoten: 2,6 %).

Im Vergleich war die Häufigkeit des C-Allels bei den RA-Patienten mit 12,6 % geringer als bei den Gesunden (16,1 %). Zudem kamen in dieser Gruppe keine homozygoten Proben (CC-Genotyp) vor. Das geringere Vorkommen des C-Allels in der RA-Gruppe sowie das Fehlen von Homozygoten in dieser Gruppe könnte auf eine mögliche schützende Wirkung des C-Allels hindeuten, die beobachteten Unterschiede sind jedoch nicht signifikant (p = 0,23). Der T-1237C-Polymorphismus scheint nach diesen Daten nicht für die Erkrankung an RA zu prädisponieren bzw. davor zu schützen.

5.2.3 Der TLR2-Polymorphismus G2408A

Der TLR2-Polymorphismus G2408A kam in unserer Kontrollgruppe mit einer Häufigkeit von 8,5 % vor, homozygote Formen (AA) ließen sich nicht nachweisen. Über die Häufigkeit des G2408A-Polymorphismus in der Allgemeinbevölkerung gibt es verschiedenen Angaben, die je nach untersuchter Population und Methode von 1% bis 14,6% reichen (Lorenz, et al., 2000;Sanchez, et al., 2004;Schroder, et al., 2003). Die RA-Patienten und das Vergleichskollektiv in unserer Studie liegen mit 6,8 % bzw. 8,5 % zwischen diesen Extremen. Die beiden Untersuchungsgruppen unterscheiden sich nicht signifikant, auch die Unterschiede in der Männer- und Frauengruppe sind gering. Die gemessenen Unterschiede deuten nicht auf eine Assoziation von Polymorphismus und dem Auftreten von RA hin. Diese Ergebnisse stimmen mit kürzlich erschienenen Resultaten von Sanchez et. al. (2004) überein der bei spanischen Patienten keine Assoziation des G2408A-Polymorphismus mit dem Auftreten von RA fand. Im Vergleich zu dieser Publikation tritt in unserer Population der Polymorphismus sowohl in Patienten- als auch Kontrollgruppe jedoch wesentlich häufiger auf (8,5% bei den Kontrollpatienten im Vergleich zu 1% bei Sanchez et. al. (2004)). Dies könnte an ethnischen Variationen liegen oder durch das unterschiedliche Genotypisierungsverfahren bedingt sein. In einer größeren Studie könnte daher versucht werden, die Ursache der stark differierenden Polymorphismus-Häufigkeit zu bestimmen. Es sollte daher das Auftreten des G2408A-Polymorphismus an verschiedenen Populationen mit der gleichen Genotypisierungsmethode in einer großen Stichprobe bestimmt werden.

5.3 TLR9- und TLR2-Polymorphismen bei RF-positiven und -negativen Patienten und Höhe von RF bei verschiedenen Genotypen

5.3.1 Bedeutung des TLR9-Genotyps für die Rheumafaktor-Produktion

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Der Rheumafaktor ist ein Autoantikörper gegen das Fc-Fragment des Immunoglobulin-G-Moleküls. Sein Nachweis im Serum ist eines der ACR-Diagnosekriterien für RA (Arnett, et al., 1988), jedoch nicht pathognomonisch, da etwa 20% aller RA-Erkrankten RF-negativ sind und RF auch bei anderen Erkrankungen und z.T. bei Gesunden nachgewiesen werden kann. Ob der RF pathogenetisch wichtig ist und Ursache oder Folge der Erkrankung darstellt, ist bislang ungeklärt. Der RF hat jedoch eine prognostische Bedeutung, sein Nachweis ist mit einem destruktiveren Verlauf der Erkrankung assoziiert (Harris, 2001;Kaarela, 1985;Paimela, et al., 1995). Leadbetter et al. wiesen nach, dass TLR9 an der Aktivierung RF-produzierender B-Zellen beteiligt ist (Leadbetter, et al., 2002). Polymorphismen in diesem Rezeptor könnten daher sowohl die Seropositivität/ -negativität als auch die Höhe des RF-Wertes im Serum beeinflussen.

Bei der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchung der RF-positiven und negativen RA-Patienten wurden signifikante Unterschiede zwischen den verschiedenen TLR9-Genotypen im T-1486C-Polymorphismus nachgewiesen. Die RF-positiven Patienten waren häufiger Träger des selteneren C-Allels als die RF-negativen Patienten. Insbesondere homozygote Träger des C-Allels finden sich erheblich öfter unter den RF-positiven Patienten (OR= 4,6). Die Häufigkeit des C-Allels bei den RF-positiven Patienten lag jedoch nur unwesentlich über der in der Kontrollpopulation gemessenen (44% vs. 41,1%). Das Vorhandensein des C-Allels scheint daher nicht für die Erkrankung an RA zu prädisponieren, könnte aber bei den Erkrankten einen wichtigen Kofaktor bei der RF-Induktion darstellen.

Die Untersuchung der Höhe der RF-Spiegel bei den unterschiedlichen Genotypen weist in die gleiche Richtung. Der Vergleich von Trägern und Nichtträgern des C-Allels zeigt, dass die Träger des C-Allels einen signifikant höheren RF-Spiegel aufweisen (p=0,023).

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Das Auftreten des Polymorphismus in homozygoter Form (CC) führt dabei zu höheren RF-Werten als in heterozygoter Form.

Ein möglicher Grund für die höheren Rheumafaktor-Serumspiegel bei Trägern des C-Allels im T-1486C-Polymorphismus könnte die Existenz einer durch den Nukleotidwechsel entstandenen Sp-1-Bindungsstelle sein, die bei Trägern des T-Allels nicht vorliegt (Abb. 8). Sp-1 ist ein Zinkfinger-Protein, das die Transkription einer Vielzahl von Genen reguliert. Es ist beteiligt an der Steuerung von Zellfunktionen wie Proliferation, Apoptose, Differenzierung und neoplastischer Transformation (Kaczynski, et al., 2003). Sp-1 kann sowohl regulatorisch, als auch als basaler Transkriptionsfaktor wirken. Das Vorhandensein einer zusätzlichen Sp-1-Bindungsstelle könnte die Regulation von TLR9 beeinflussen und eine stärkere Expression bewirken. Betrachtet man die Ergebnisse von Leadbetter et al. (2002) zur Rheumafaktor-Produktion nach TLR9-Aktivierung, könnte eine verstärkte Expression von TLR9 auf B-Zellen die Wahrscheinlichkeit eines Zusammentreffens und der Bindung von Wirts-DNA-Molekülen mit dem Rezeptor erhöhen und zu einer gesteigerten Aktivierbarkeit der B-Zelle mit nachfolgender gesteigerter RF-Produktion führen.

Die Aktivität der neu entstandenen Transkriptionsfaktorbindungsstellen muss in Folgeprojekten z. B. durch Gelshift-Experimente bestätigt werden. Bislang ist die Regulation von TLR-Genen wenig erforscht. Für TLR9 ist nur für LPS, CSF-1 und IFN-γ nachgewiesen, dass sie die Transkription von TLR9 induzieren (An, et al., 2002;Sweet, et al., 2002). Die eigentliche Promotorstruktur, seine Länge, erforderliche Transkriptionsfaktoren und Enhancerelemente sind dagegen bisher weitgehend unbekannt. Die Analyse der Struktur müsste in weiteren Experimenten geschehen, um die funktionelle Bedeutung der Polymorphismen besser bewerten zu können. Eine Möglichkeit, dies zu erforschen, wäre ein Reportergen-Assay, z.B. ein Luciferase-Assay. Die Länge des TLR9-Promotors könnte durch verschieden lange Konstrukte analysiert werden, Transkriptionsfaktoren und wichtige Enhancerelemente identifiziert werden. Wenn die Länge und Struktur des TLR9-Promotors analysiert ist, könnten Konstrukte mit den verschiedenen Polymorphismen eingesetzt und ihre Luciferase-Aktivität verglichen werden. Damit könnten die beobachteten Unterschiede bei der Rheumafaktor-Produktion möglicherweise experimentell in vitro bestätigt werden. Diese Experimente werden gerade im Rahmen einer Anschlussstudie im Labor der AG Schumann durchgeführt.

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Ausser durch die Veränderung der Transkriptionsfaktorbindungsstelle könnten die TLR9-Polymorphismen T-1486C und T-1237C auf einem Allel gekoppelt mit Polymorphismen weiter stromaufwärts oder -abwärts liegen. Diese könnten im TLR9-Gen oder anderen Genen lokalisiert sein und eine weitere mögliche Erklärung der beobachteten RF-Unterschiede darstellen.

Neben Polymorphismen in TLR9 sind jedoch noch andere Möglichkeiten denkbar, die das Auftreten von Autoantikörpern wie RF bei der RA erklären könnten. Bei vielen Autoimmunerkrankungen fällt auf, dass Antikörper gegen DNA-haltige Strukturen wie Chromatin oder andere Nukleinsäure-Protein-Partikel gebildet werden. Normalerweise ist Wirts-DNA nicht immunogen, da die CpG-Elemente im menschlichen Genom weitgehend methyliert sind und daher keine TLR9-Aktivierung auslösen können. Bei RA und systemischen Lupus erythematodes (SLE) wurde hingegen gezeigt, dass die DNA-Methylierung erniedrigt ist (Richardson, et al., 1990). Ferner können Medikamente, die die DNA-Methylierung hemmen, Autoimmunerkrankungen auslösen (Yung, et al., 1995). Es wäre daher möglich, dass eine durch SNPs hervorgerufene strukturelle veränderte TLR9-Bindungsstelle Wirts-DNA-haltige Immunkomplexe besser binden kann und so zur Aktivierung von RF-produzierenden B-Zellen führt. Es sollte daher insbesondere der Bereich des TLR9-Gens auf neue SNPs untersucht werden, der für die CpG-Bindungsstelle am Rezeptor kodiert. Weiterhin könnten genetische Variationen in weiteren Molekülen der TLR-Signaltransduktion zu einem überschießenden Signal bei eigentlich normaler Aktivierung des Rezeptors führen. Eine Analyse auf SNPs in den Genen z.B. für MyD88, IRAK oder TRAF6 wäre daher notwendig. Auch Polymorphismen in den Genen der Enzyme, die DNA methylieren (Methylasen), könnten eine Ursache für die Bildung von Autoantikörpern gegen DNA-haltige Strukturen und die Aktivierung RF-produzierender B-Zellen sein und sollten daher in weiteren Projekten untersucht werden.

5.4 Fehlermöglichkeiten und Grenzen dieser Studie

Die Patienten, die in dieser Studie untersucht wurden, haben nicht alle die gleiche Therapie erhalten. Unterschiedliche Medikamente könnten einen Einfluss auf den Serumspiegel des Rheumafaktors haben. Der Forschungsstand hierzu ist nicht eindeutig. Bei einigen Patienten wird die Senkung der RF-Titer unter verschiedenen DMARDs beobachtet (Alarcon, et al., 1990;Rynes, 2001). Oft ist diese Senkung transient, nur bei bestimmten Untergruppen feststellbar oder es können überhaupt keine signifikanten RF-Veränderungen unter der DMARD-Therapie nachgewiesen werden (Pope, et al., 1986). Eine signifikante, persistente Reduktion der RF-Spiegel kann bei den meisten Patienten bislang nur mit der – bislang experimentellen – B-Zell-depletierenden Therapie durch monoklonale Anti-CD20-Antikörpern (Rituximab) erreicht werden (Edwards and Cambridge, 2001;Edwards, et al., 2004). Eine systematische, langandauernde Beeinflussung der RF-Serumspiegel durch die klassischen DMARDs hingegen erscheint aufgrund der vorliegenden Daten nicht wahrscheinlich, lässt sich jedoch nicht vollkommen ausschliessen.

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Eine Konversion von RF-negativen zu RF-positiven Serostatus kann jedoch im Verlauf der Krankheit stattfinden, einzelne Patienten bilden RF erst nach einer längeren Krankheitsdauer (Steiner and Smolen, 2002). Bei einigen Patienten, die in dieser Studie als RF-negativ eingestuft wurden, könnte inzwischen eine Serokonversion aufgetreten sein. Dieser Störfaktor lässt sich jedoch nicht im Vorhinein ausschließen. Bei bis zu 50 % der RA-Patienten lässt sich hingegen schon vor dem Auftreten der ersten Krankheitssymptome Rheumafaktor im Serum nachweisen (Aho, et al., 1991;MacGregor and Silman, 1991).

Eine Einschränkung dieser Studie könnte die kleine Anzahl an RF-negativen Patienten darstellen. Ihr Anteil liegt bei 23 %, was den in der Literatur angegeben Werten von 10-30 % entspricht (Dorner, et al., 2004;Wolfe, et al., 1991). Auch wenn sich große Unterschiede in der Verteilung der einzelnen T-1486C-Genotypen bei RF-positiven und negativen Patienten zeigen (z.B. OR= 4,6 beim CC-Genotyp, Tab. 22), erweisen sich diese Unterschiede bei der Fallzahl von 22 RF-negativen Patienten als nicht signifikant. Legt man die in dieser Studie beobachtete Genotyp-Verteilung bei RF-positiven und -negativen Patienten zugrunde, müsste zu einer besseren statistischen Beurteilbarkeit die N-Zahl der RF-negativen Patienten verdoppelt werden.

5.5 Ausblick

Die Ergebnisse dieser Studie weisen darauf hin, dass TLR2- und TLR9-Polymorphismen nicht zur Ausbildung von RA prädisponieren oder davor schützen. Die Untersuchung zur Höhe des Rheumafaktors bei den unterschiedlichen Genotypen deutet jedoch darauf hin, dass ein funktioneller Zusammenhang zwischen dem TLR9-Genotyp (T-1486C-Polymorphismus) und der Produktion von Rheumafaktor bestehen könnte. Der TLR9-Genotyp könnte somit Auswirkungen auf den klinischen Verlauf haben. In weiterführenden Studien mit größeren Fallzahlen sollten die in dieser Studie beobachteten Assoziationen überprüft werden. Insbesondere die Testung einer größeren Gruppe von RF-negativen RA-Patienten auf den TLR9-Polymorphismus T-1486C hin wäre wünschenswert. Die RF-Werte sollten bereits bei Diagnosestellung (vor Therapiebeginn) bestimmt werden, um einen möglichen Effekt der Medikamente auf die Antikörper-Spiegel auszuschließen. Auch das Auftreten der Polymorphismen in Untergruppen der RA sollte erforscht werden, insbesondere bei der juvenilen Form der RA (JRA), die meistens seronegativ verläuft.

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Weiterhin sollte überprüft werden, ob die verschiedenen TLR9-Genotypen mit einem unterschiedlichen Krankheitsverlauf assoziiert sind und der Genotyp als prognostischer Parameter dienen könnte. Da das Auftreten des C-Allels im T-1486C-Polymorphismus mit höheren RF-Spiegeln assoziiert ist, könnten Polymorphismusträger einen destruktiveren Krankheitsverlauf aufweisen. Eine früher einsetzende Basismedikamentation könnte daher sinnvoll sein, um den Beginn des schweren Krankheitsbildes und eine Behinderung hinauszuzögern. Auch der Erfolg einer medikamentösen Therapie sollte in Abhängigkeit vom Genotyp untersucht werden. Es wäre z.B. denkbar, dass Träger des C-Allels im T-1486C-Polymorphismus anders auf den TLR9-Antagonist Chloroquin ansprechen als Träger des Wildtyp-Allels. Es ist bekannt, dass Chloroquin und Hydroxychloroquin nur bei etwa 40% der RA-Patienten zu einer messbaren Verbesserung des Beschwerdebildes führen (Harris, 2001). Die Frage, weshalb die restlichen 60% weniger gut auf Chloroquin ansprechen, konnte bisher nicht beantwortet werden. Bislang fehlen prädiktive Marker, die eine rationale Therapieentscheidung bei der Behandlung der RA erleichtern, d.h. die jetzige RA-Therapie basiert auf dem trial-and-error-Prinzip (Scott, 2003). Der Erfolg einer Behandlung ist für die meisten Therapeutika zudem erst nach Wochen oder Monaten beurteilbar.

Die Kenntnis des TLR9-Genotyp könnte daher eine wertvolle Hilfestellung bei der Therapieentscheidung bieten. Die Erforschung und der Einsatz weiterer TLR-Antagonisten könnte ferner eine weitere neue Behandlungsmöglichkeit der rheumatoiden Arthritis darstellen.


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14.11.2005