Resultate

Analyse der Transkriptionsfaktorbindungsstellen an den Positionen der TLR9-Polymorphismen T-1237C und T-1486C

Zur Identifikation von Bindungstellen von Transkriptionsfaktoren erfolgte eine computerbasierte Sequenzanalyse mittels des Programmes Alibaba 2. Durch beide SNPs, die im potentiellen Promotorbereich von TLR9 liegen (Abb. 3), ergeben sich Veränderungen an den Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren. Während das Wildtyp-Allel keine Transkriptionsfaktorbindungsstellen an -1486 und -1237 aufweist, wird durch den T/C-Austausch eine c-Rel/NF-κB-Bindungsstelle an -1237 geschaffen (Abb. 7). Durch den T-1486C-Polymorphismus entsteht zusätzlich eine neue Bindungsstelle für Sp-1 (Abb. 8).

Abb. 7: Neue c-Rel/NF-κB-Bindungsstelle durch den T-1237C-Polymorphismus

Abb. 8: Zusätzliche Sp-1-Bindungsstelle durch T/C-Austausch beim T-1486C-Polymorphismus

LightCycler-PCR zur Detektion der TLR9-Polymorphismen T-1486C und T-1237C

Um die Proben auf das Vorliegen der TLR9-Polymorphismen zu untersuchen, wurde ein Real-time-PCR-basiertes Verfahren entwickelt, das die simultane Genotypisierung für beide Polymorphismen erlaubt (Abb. 6). Zusätzlich zum Roche-Standardverfahren wurde ein kostengünstige Puffersystem entwickelt, mit dem die Genotypisierung mittels einer Standard-Taq-Polymerase in einem modifizierten ABgene-Reaktionsmix erfolgen kann (s. 3.10.3).

Bei der Reaktion hybridisieren die Sonden mit dem C-Allel des Polymorphismus (mutantes Allel). Bei Vorliegen des T-Allels (Wildtyp-Allel) kommt es zu einer Basenfehlpaarung, die Sonde löst sich früher und der Schmelzpunkt ist niedriger. Die für die einzelnen Allele gemessenen Schmelzpunkte sind in Tab. 13 aufgeführt.

Polymorphismus

Roche

ABgene

T-1237C

T- Allel

52,3°C

51,7°C

C- Allel

61,6°C

61,7°C

T-1486C

T- Allel

51,4°C

51,9°C

C- Allel

60,6°C

61,5°C

Tab. 13: Schmelzpunkte der Sonden

Anhand der Schmelzkurven können somit die verschiedenen Genotypen bestimmt werden. Heterozygote Proben (CT) zeigen zwei Schmelzpunkte und eine zweigipfelige Kurve, bei homozygotem Vorliegen des T- oder C-Allels ist nur ein Schmelzpunkt vorhanden (Abb. 9 und Abb. 10). Die Genotypisierung durch LC-PCR mit ABgene-Puffer/BSA führte zu den gleichen Ergebnissen wie mit dem Roche FastStart Mastermix, wenn auch die Gesamtfluoreszenz im Fluoreszenzkanal 3 (F3) geringfügig niedriger war (Abb. 9).

Bei der Bestimmung des T-1486C-Polymorphismus in Kanal 2 war die Gesamtfluoreszenz bei Gebrauch des ABgene/BSA-Mixes sogar höher. Die erzielten Ergebnisse waren reproduzierbar und konnten durch Anwendung anderer Genotypisierungsmethoden (Sequenzierung, RFLP s.u.) bestätigt werden. Ein Niederschlag von Reaktionskomponenten an den Wändern der Glaskapillaren konnte durch den Zusatz von BSA zuverlässig verhindert werden.

Abb. 9: Repräsentative Schmelzkurven des T-1237C-Polymorphismus
A: Roche FastStart, dargestellt sind Schmelzkurven der Genotypen TT, CT und CC
B: ABgene, Schmelzkurven der Genotypen TT, CT und CC

Abb. 10: Repräsentative Schmelzkurven des T-1486C-Polymorphismus
A: Roche FastStart, Schmelzkurven der Genotypen TT, CT und CC
B: Abgene, Schmelzkurven der Genotypen TT, CT und CC

RFLP zur Detektion der TLR9-Polymorphismen T-1237C und T-1486C

Um das real-time-PCR-Verfahren zur Detektion der TLR9-Polymorphismen zu validieren, erfolgte eine zusätzliche Analyse auf Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen. Anhand der Fragmentlänge konnte eine Zuordnung zu den einzelnen Genotypen erfolgen. Bei der Genotypisierung von 20 Proben ließen sich keine Unterschiede bei Anwendung des RFLP- oder real-time-PCR-basierten Verfahrens feststellen.

T-1237C-Polymorphismus: Die Amplifikation mit den Primern TLR9F und TLR9R führt zu einem PCR-Produkt von 135 Basenpaaren (bp). Proben des TT-Genotyps haben nur eine Schnittstelle für das Restriktionenzym BstN I, es entstehen Fragmente von 27 bp und 108 bp Länge (Abb. 11a, Abb. 12). Der Austausch von Thymin durch Cytosin führt zur Schaffung einer zusätzlichen BstN I-Schnittstelle und Fragmenten von 27, 48 und 60 Basenpaaren bei homozygoten Mutanten (CC). Heterozygote Proben (CT) zeigen vier Fragmente der Längen 27, 48, 60 und 108 Basenpaaren (Abb. 12).

T-1486C-Polymorphismus: Die PCR mit den gleichen Primern, die zur Real-time-PCR eingesetzt werden, führt zu einem Produkt von 499 Basenpaaren. Das Wildtyp-Allel besitzt eine Afl II-Restriktionsschnittstelle an der Position des Polymorphismus (Abb. 11b). Der Austausch von Thymin durch Cytosin führt zum Verlust der Schnittstelle und resultiert in einer einzigen Bande von 499 Basenpaaren bei homozygoten Mutanten (CC). Heterozygote Proben (CT) zeigen Fragmente der Längen 172, 327 und 499 Basenpaare (Abb. 13).

Abb. 11: Prinzip des RFLP
A: T-1237C-Polymorphismus. Durch den Austausch von Thymin durch Cytosin entsteht eine zusätzliche BstN I-Restriktionschnittstelle.
B: T-1486C-Polymorphismus. Durch den T/C-Austausch fällt die beim Wildtyp-Allel vorhandene Afl II-Schnittstelle bei der Mutante weg.
▲ kennzeichnet die Schnittstelle eines Restriktionsenzymes, bp= Basenpaare

Abb. 12: T-1237C-Polymorphismus, Gelelektrophorese mit charakteristischem Bandenmuster nach BstN I-Verdau
Proben des TT-Genotyp zeigen Fragmente der Längen 108 bp und 27 bp, Proben des CC-Genotyps Fragmente von 60, 48 und 27 bp. Bei heterozygoten Proben (CT) führt der BstN I-Verdau zu Fragmenten aller vier möglichen Längen (27, 48, 60 und 108 bp). bp= Basenpaare

Abb. 13: T-1486-Polymorphismus, Gelelektrophorese mit charakteristischem Bandenmuster nach Afl II-Verdau
Proben des TT-Genotyps zeigen nach Verdau Banden der Länge 327 und 172 bp. Proben des CC-Genotyps besitzen keine Afl II-Schnittstelle, die Fragmentlänge beträgt daher 499 bp.

Der TLR9-Polymorphismus T-1237C bei RA-Patienten und Gesunden Verteilung der Genotypen des T-1237-Polymorphismus

Die Genotypisierung erfolgte durch Bestimmung der Schmelzpunkte am LightCycler (3.10.3). Die Ergebnisse wurden mit dem chi-Quadrat-Test auf Signifikanz untersucht. Die Häufigkeit der verschiedenen Genotypen sowie Werte des chi-Quadrat-Tests sind in Tab. 14 aufgeführt.

CC

CT

TT

Σ

N

(%)

N

(%)

N

(%)

N

Fg

χ²

p

Männer

RA

0

(0)

8

(27,6)

21

(72,4)

29

2

2,09

0,35

Kontr.

2

(6,9)

7

(24,1)

20

(69,0)

29

Frauen

RA

0

(0)

21

(23,5)

68

(76,5)

89

2

1,54

0,46

Kontr.

1

(1,1)

25

(28,1)

63

(70,8)

89

Σ

RA

0

(0)

29

(24,6)

89

(75,4)

118

2

3,36

0,19

Kontr.

3

(2,5)

32

(27,1)

83

(70,3)

118

Tab. 14: Häufigkeit der verschiedenen Genotypen im TLR9-Polymorphismus T-1237C
Fallzahl (N), Freiheitsgrade (Fg)

Bei beiden Geschlechtern ist der TT-Genotyp bei RA-Patienten und Kontrollen der häufigste. Homozygote Mutanten (CC) kommen sowohl bei Männern, als auch bei Frauen ausschließlich in der Kontrollgruppe, nicht jedoch bei den RA-Patienten vor. Bei den Männern tritt er häufiger als bei den Kontrollpatientinnen auf (6,9 % vs. 1,1 %, OR=6,5), jedoch liegt der Unterschied im nichtsignifikanten Bereich. Heterozygote Polymorphismusträger finden sich in unterschiedlicher Häufigkeit bei RA-Patienten und Gesunden, überwiegen jedoch leicht bei den RA-Patienten (27,9 % vs. 24,6 %, n.s.). Gesunde Probanden sind seltener Träger des TT-Genotyps (70,3 % vs. 75,4 % bei den RA-Patienten, n.s.).

Allelhäufigkeiten des T-1237-Polymorphismus

Aus der Verteilung der Genotypen wurde die Allelhäufigkeit mittels der folgenden Formel errechnet:

Cytosin (%) = (2x (Σ Proben CC-Genotyp) + Σ Proben CT-Genotyp)/ (2x Anzahl gemessener Proben)

C-Allel

T-Allel

Σ

N

(%)

N

(%)

N

Fg

OR

95 % KI

χ²

p

Männer

RA

8

(13,8)

50

(86,2)

58

1

0,68

0,25-1,84

0,57

0,45

Kontr.

11

(19,0)

47

(81,0)

58

Frauen

RA

21

(11,8)

157

(88,2)

178

1

0,75

0,41-1,38

0,87

0,35

Kontr.

27

(15,2)

151

(84,8)

178

Σ

RA

29

(12,3)

207

(87,7)

236

1

0,73

0,43-1,23

1,41

0,23

Kontr.

38

(16,1)

198

(83,9)

236

Tab. 15: Häufigkeit der verschiedenen Allele im TLR9-Polymorphismus T-1237C
Freiheitsgrade (Fg), Odds ratio (OR), Konfidenzintervall (KI)

Die Häufigkeiten der verschiedenen T-1237C-Allele sind in Tab. 15 aufgeführt. Sowohl bei RA-Patienten als auch bei Gesunden kommen das T-Allel häufiger als das C-Allel vor (Wildtyp-Allel). Bei den gesunden Kontrollpatienten ließ sich eine höhere Frequenz des C-Allels bestimmen (16,1 % vs. 12.3 % bei den RA-Patienten, n.s.). Das C-Allel, die Mutation, ist bei Männern sowohl bei den RA-Erkrankten als auch den Kontrollpatienten häufiger als bei den Frauen (n.s.). Der TLR9-Polymorphismus T-1237C scheint somit keinen prädisponierenden Faktor für die Erkrankung an RA darzustellen.

Der TLR9-Polymorphismus T-1486C bei RA-Patienten und Gesunden Verteilung der Genotypen des T-1486C-Polymorphismus

Die Genotypisierung erfolgte durch Bestimmung der Schmelzpunkte am LightCycler^® wie in 3.10.3 beschrieben. Die Häufigkeit der verschiedenen Genotypen bei RA-Patienten und Kontrollen unterscheidet sich nicht signifikant (Tab. 16).

CC

CT

TT

Σ

N

(%)

N

(%)

N

(%)

N

Fg

χ²

p

Männer

RA

5

(17,2)

15

(51,7)

9

(31,0)

29

2

1,82

0,40

Kontr.

6

(20,7)

10

(34,5)

13

(44,8)

29

Frauen

RA

15

(16,9)

42

(47,2)

32

(36,0)

89

2

0,15

0,93

Kontr.

17

(19,1)

41

(46,1)

31

(34,8)

89

Σ

RA

20

(16,9)

57

(48,3)

41

(34,7)

118

2

0,65

0,72

Kontr.

23

(19,5)

51

(43,2)

44

(37,3)

118

Tab. 16: Häufigkeit der verschiedenen Genotypen des TLR9-Polymorphismus T-1486C

Beim T-1486C-Polymorphismus kommt der CT-Genotyp am häufigsten insgesamt und in allen Untergruppen vor, gefolgt vom TT-Genotyp. Der CC-Genotyp (homozygote Mutation) kommt mit einer Frequenz von 16,9 % bis 20,7 % vor, mit einem leichten Überwiegen bei den Gesunden gegenüber den RA-Patienten. Heterozygote Träger des Polymorphismus sind bei den RA-Patienten häufiger (n.s.). Es lassen sich keine signifikanten geschlechtsspezifischen Unterschiede feststellen.

Allelhäufigkeiten des T-1486C-Polymorphismus

Die Allelhäufigkeiten wurden aus der Verteilung der Genotypen wie beschrieben errechnet. Die Allelverteilung weist nur geringe, nicht signifikante Unterschiede zwischen Männern und Frauen und zwischen Patienten und Kontrollen auf. Dieser Polymorphismus scheint somit ebenfalls keinen prädisponierenden Faktor für die Erkrankung an RA darzustellen (Tab. 17).

C-Allel

T-Allel

Σ

N

(%)

N

(%)

N

Fg

OR

95 % KI

χ ²

p

Männer

RA

25

(43,1)

33

(56,9)

58

1

0,72

0,59-2,60

0,32

0,57

Kontr.

22

(37,9)

36

(62,1)

58

Frauen

RA

72

(40,4)

106

(59,6)

178

1

0,93

0,61-1,42

0,10

0,75

Kontr.

75

(42,1)

103

(57,9)

178

Σ

RA

97

(41,1)

139

(58,9)

236

1

1,00

0,69-1,44

0,00

1,00

Kontr.

97

(41,1)

139

(58,9)

236

Tab. 17: Häufigkeit der verschiedenen Allele im TLR9-Polymorphismus T-1486C

Der TLR2-Polymorphismus G2408A bei RA-Patienten und Gesunden Verteilung der Genotypen des G2408A-Polymorphismus

Die Bestimmung der Genotypen erfolgte durch das von Schröder et al. publizierte Verfahren (Schroder, et al., 2003). Einige Proben, die mit diesem Verfahren schwer zu genotypisieren waren, wurden zusätzlich durch Analyse der Schmelzpunkte am LightCycler untersucht (s. 3.10.3.2). Die ermittelten Häufigkeiten sind in Tab. 18 dargestellt. Die Daten zur Häufigkeit des G2408A-Polymorphismus in der Kontrollgruppe wurden in Zusammenarbeit mit Dr. med. N. Schröder, Sabine Bobbe und Diana Wörner (Institut für Mikrobiologie und Hygiene der Charité) erhoben.

GG

GA

Σ

N

(%)

N

(%)

N

Fg

OR

95% KI

χ²

p

Männer

RA

26

(89,7)

3

(10,3)

29

1

1,00

0,18-5,42

0,00

1,00

Kontr.

26

(89,7)

3

(10,3)

29

Frauen

RA

84

(94,4)

5

(5,6)

89

1

1,43

0,44-4,70

0,36

0,55

Kontr.

82

(92,1)

7

(7,9)

89

Σ

RA

110

(93,2)

8

(6,8)

118

1

1,27

0,48-3,35

0,24

0,62

Kontr.

108

(91,5)

10

(8,5)

118

Tab. 18: Häufigkeit der verschiedenen Genotypen des TLR2-Polymorphismus G2408A

Die Polymorphismen kommen bei RA-Patienten und Gesunden annähernd ähnlich häufig vor (Tab. 18). Männer wiesen den Polymorphismus öfter als Frauen auf (n.s.). Homozygote Mutanten (AA) ließen sich nicht nachweisen, die Allelfrequenzen sind daher nicht separat aufgeführt. Die Häufigkeit des A-Allels beträgt in diesem Fall die Hälfte der Häufigkeit des GA-Genotyps.

TLR-Polymorphismen bei RF-positiven und RF-negativen RA-Patienten

Bei 95 von 118 RA-Patienten wurde der Serostatus für den Rheumafaktor ermittelt. Bei 73 Patienten betrug der RF-ELISA-Wert 24 U/ml oder mehr (RF positiv), bei 22 Patienten unter 24 U/ml (RF-negativ). Um den Einfluß der TLR-Polymorphismen auf den RF-Serostatus zu überprüfen, wurden die Polymorphismenhäufigkeiten bei RF-positiven und -negativen RA-Patienten untersucht (Tab. 19, Tab. 20 und Tab 21).

C

T

Σ

N

(%)

N

(%)

N

Fg

OR

95% KI

χ ²

p

RF+

19

(13)

127

(87)

146

1

0,95

0,35 – 2,54

0,01

0,915

RF-

6

(14)

38

(86)

44

Σ

25

165

190

Tab. 19: Allelhäufigkeit des TLR9-Polymorphismus T-1237C bei RF-positiven und RF-negativen Patienten; Freiheitsgrade (Fg), Odds ratio (OR), Konfidenzintervall (KI)

C

T

Σ

N

(%)

N

(%)

N

Fg

OR

95% KI

χ2

p

RF+

64

(44)

82

(56)

146

1

2,08

1,00 – 4,36

3,86

0,049

RF-

12

(27)

32

(73)

44

Σ

76

114

190

Tab. 20: Allelhäufigkeit des TLR9-Polymorphismus T-1486C bei RF-positiven und RF-negativen Patienten

A

G

Σ

N

(%)

N

(%)

N

OR

95% KI

p

RF+

4

(3)

142

(97)

146

1,21

0,13 – 11,13

0,756

RF-

1

(2)

43

(98)

44

Σ

5

185

190

Tab. 21: Allelhäufigkeit des TLR2-Polymorphismus G2408A bei RF-positiven und RF-negativen Patienten (χ²-Test nicht anwendbar, da zwei Zellwerte < 5)

Bei den RF-positiven Patienten kam das C-Allel des TLR9-Polymorphismus T-1486C signifikant häufiger vor als bei den RF-negativen Patienten (44 % vs. 27 %, OR 2,08, p = 0,049).

Die Häufigkeit des TLR9-Polymorphismus T-1237C und des TLR2-Polymorphismus G2408A unterscheidet sich dagegen nicht signifikant zwischen den RF-positiven und -negativen Patienten (Tab. 19 und Tab. 21). Bei der Untersuchung dieser beiden Polymorphismen wurden nur Wildtypen (TT bzw. GG) und heterozygote Polymorphismusträger gefunden, jedoch keine homozygoten Mutanten. Die Häufigkeit der T-1237C- und G2408A-Genotypen bei RF-positiven und –negativen Patienten ist daher hier nicht gesondert aufgeführt, da ihre Häufigkeit in diesem Falle einfach aus der Allelhäufigkeit errechnet werden kann.

Im Gegensatz dazu ließen sich sowohl bei RF-positiven als auch RF–negativen RA-Patienten alle drei Genotypen des T-1486C-Polymorphismus nachweisen (Tab. 22).

RF+

RF-

Σ

Genotyp

N

(%)

N

(%)

N

TT

22

(30)

11

(50)

33

CT

38

(52)

10

(45)

48

CC

13

(18)

1

(5)

14

Σ

73

22

95

Tab. 22: T-1486C-Genotypen bei RF-positiven und –negativen RA-Patienten (χ²-Test nicht anwendbar, da ein Zellwert < 5)

Der T-1486C-Polymorphismus kommt deutlich häufiger in der homozygoten Form bei den RF-positiven Patienten vor (18% vs. 5%, OR=4,6; Fisher’s exact test p=0,10). Die heterozygote Form ist bei den RF-positiven geringfügig häufiger vertreten (52% vs. 45%).

Rheumafaktorspiegel in Abhängigkeit vom TLR9- und TLR2-Genotyp

Es wurde im Folgenden untersucht, ob TLR-Polymorphismen einen Einfluss auf die Höhe der Rheumafaktor-Spiegel haben. Die Verteilung der Rheumafaktor-ELISA-Werte wurde daher in Abhängigkeit vom Genotyp analysiert, Mediane, Quartile, Minima und Maxima bestimmt (Tab. 23).

Perzentile

25

50

75

Min

Max

N

p

T-1237C

TT

27

91

266

0

3452

70

0,622

CT

13

117

304

0

1630

25

T-1486C

Non-C

0

65

209

0

1540

33

0,023

C*

46

170

327

0

3452

62

TT

0

65

209

0

1540

33

0,049

CT

30

114

319

0

3452

48

TT

0

65

209

0

1540

33

0,044

CC

61

222

378

0

1557

14

G2408A

GG

25

98

293

0

3452

90

0,893

GA

23

117

402

0

625

5

Tab. 23: RF-Werte (ELISA, units/ml) bei den verschiedenen TLR2- und TLR9-Genotypen
C: Alle Träger eines C-Allels (Genotypen CT und CC)

Die Verteilung der RF-Werte unterscheidet sich nur geringfügig in Abhängigkeit vom T-1237C-Genotyp (Tab. 23). Die Mediane liegen bei 91 U/ml (TT) bzw. 117 U/ml (CT), die Quartilen bei 27; 266 U/ml (TT) und 13; 304 U/ml (CT). Die Überprüfung mittels Mann-Whitney-U-Tests zeigte, dass keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen bestehen (p= 0,622). Auch die Verteilung der RF-Werte beim TLR2-Polymorphismus G2408A unterscheidet sich nicht signifikant zwischen Wildtyp (GG) und Polymorphismus (GA). Die Mediane liegen bei 98 U/ml (GG) und 117 U/ml (GA), p= 0,893.

Im Gegensatz dazu scheint das Auftreten des T-1486C-Polymorphismus nicht nur mit dem RF-Serostatus, sondern auch mit der Höhe des Rheumafaktorspiegels zu korrelieren. Proben der Patienten, die kein C-Allel tragen (Non-C, Tab. 23) weisen niedrigere RF-Werte auf, als Proben von Patienten die ein oder zwei C-Allele tragen (C, Tab. 23), p= 0,023. Vergleicht man die Werte der 25. und 50. Perzentile, so fällt der stetige Zuwachs der RF-Werte mit dem Auftreten eines C-Allels auf. Die 25. Perzentile liegt beim TT-Genotyp bei 0 U/ml, bei der heterozygoten Form bei 30 U/ml, bei der homozygoten Mutante bei 61 U/ml. Die Mediane betragen 65 U/ml (TT), 114 U/ml (CT), und 222 U/ml (CC). Auch der Wert der 75. Perzentile der TT-Proben ist niedriger (209 U/ml) als bei den CT- (319 U/ml) und CC-Proben (378 U/ml). Homozygote Mutanten (CC) zeigen somit die höchsten RF-Werte, gefolgt von den heterozygoten Proben (CT) und den Proben des TT-Genotyps. Die beobachteten Unterschiede zwischen TT- und CT- oder CC-Genotyp sind signifikant (p= 0,049 bzw. 0,044).