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Hamann, L.*, Hamprecht, A.*, Gomma, A. und Schumann, R.R. (2004)

Rapid and inexpensive real-time PCR for genotyping functional polymorphisms within the Toll-like receptor -2, -4, and -9 genes.

J Immunol Methods 285, 281-91

*contributed equally

• 1  Einleitung

  • 1.1 Entzündung und Krankheitsabwehr

  • 1.2 Rheumatoide Arthritis

    • 1.2.1 Definition und Epidemiologie

    • 1.2.2 Pathologische Charakteristika

    • 1.2.3 Rheumafaktor

    • 1.2.4 Diagnostik

    • 1.2.5 Therapie

    • 1.2.6 Ätiologie und Pathogenese

    • 1.2.7 Verlauf und Prognose

  • 1.3 Genetische Polymorphismen und Krankheitsdisposition

    • 1.3.1 Methoden zur SNP-Erkennung

  • 1.4 Regulation der Immunantwort

    • 1.4.1 Angeborenes und adaptives Immunsystem

    • 1.4.2 Toll-like-Rezeptoren

      • 1.4.2.1 Toll-like-Rezeptor 2

      • 1.4.2.2 Toll-like-Rezeptor 9

      • 1.4.2.3 Genetische Polymorphismen in TLR-Genen

  • 1.5 Rheumatoide Arthritis und das angeborene Immunsystem

• 2 Aufgabenstellung

• 3 Materialien und Methoden

  • 3.1 Patientenproben

  • 3.2 Chemikalien und Reagenzien

  • 3.3 Enzyme

  • 3.4 Puffer

  • 3.5 Synthetische Oligonukleotide

  • 3.6 Kitsysteme

  • 3.7 Einwegmaterialien

  • 3.8 Geräte

  • 3.9 Software

  • 3.10 Molekularbiologische Methoden

    • 3.10.1 Isolierung von DNA durch Phenol-/Chloroform-/Isoamylextraktion und Ethanolpräzipitation

    • 3.10.2 Genotypisierung durch Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLP) und Hybridisierungssonden

    • 3.10.3 Real-time-PCR-basierte Genotypisierung von Polymorphismen am LightCycler mittels eines neuen Reaktionsmixes

      • 3.10.3.1  Genotypisierung der TLR9-Polymorphismen T-1486C und T-1237C

      • 3.10.3.2  Genotypisierung des TLR-2-Polymorphismus G2408A

    • 3.10.4 Genotypisierung durch Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen

      • 3.10.4.1 RFLP des TLR9-Polymorphismus T-1486C

      • 3.10.4.2 RFLP des TLR9-Polymorphismus T-1237C

      • 3.10.4.3 RFLP des TLR2-Polymorphismus G2408A

    • 3.10.5 Agarose-Gelelektrophorese von PCR-Produkten für analytische Zwecke

    • 3.10.6 Bestimmung der DNA-Konzentration von genomischer DNA

    • 3.10.7  Cycle Sequencing von PCR-Produkten

  • 3.11 Statistische Auswertung

• 4 Resultate

  • 4.1  Analyse der Transkriptionsfaktorbindungsstellen an den Positionen der TLR9-Polymorphismen T-1237C und T-1486C

  • 4.2 LightCycler-PCR zur Detektion der TLR9-Polymorphismen T-1486C und T-1237C

  • 4.3 RFLP zur Detektion der TLR9-Polymorphismen T-1237C und T-1486C

  • 4.4 Der TLR9-Polymorphismus T-1237C bei RA-Patienten und Gesunden

    • 4.4.1 Verteilung der Genotypen des T-1237-Polymorphismus

    • 4.4.2 Allelhäufigkeiten des T-1237-Polymorphismus

  • 4.5 Der TLR9-Polymorphismus T-1486C bei RA-Patienten und Gesunden

    • 4.5.1 Verteilung der Genotypen des T-1486C-Polymorphismus

    • 4.5.2 Allelhäufigkeiten des T-1486C-Polymorphismus

  • 4.6 Der TLR2-Polymorphismus G2408A bei RA-Patienten und Gesunden

    • 4.6.1 Verteilung der Genotypen des G2408A-Polymorphismus

  • 4.7 TLR-Polymorphismen bei RF-positiven und RF-negativen RA-Patienten

  • 4.8 Rheumafaktorspiegel in Abhängigkeit vom TLR9- und TLR2-Genotyp

• 5 Diskussion

  • 5.1 Real-time-PCR zur Detektion der TLR9-Polymorphismen T-1237C und T-1486C

    • 5.1.1 Vor- und Nachteile gegenüber der bisherigen Methode zur TLR9-Genotypisierung

  • 5.2 Assoziation von genetischen Polymorphismen in TLR9 und TLR2 mit dem Auftreten von rheumatoider Arthritis

    • 5.2.1 Der TLR9-Polymorphismus T-1486C

    • 5.2.2 Der TLR9-Polymorphismus T-1237C

    • 5.2.3 Der TLR2-Polymorphismus G2408A

  • 5.3 TLR9- und TLR2-Polymorphismen bei RF-positiven und -negativen Patienten und Höhe von RF bei verschiedenen Genotypen

    • 5.3.1 Bedeutung des TLR9-Genotyps für die Rheumafaktor-Produktion

  • 5.4 Fehlermöglichkeiten und Grenzen dieser Studie

  • 5.5 Ausblick

• 6 Zusammenfassung

• Literaturverzeichnis

• Abkürzungsverzeichnis

• Erklärung an Eides statt

• Danksagung

• Tab. 1: TLRs mit ihren wichtigsten Liganden (modifiziert nach Takeda et al, 2003)

• Tab. 2: Primer für Standard-PCR

• Tab. 3: Primer für real-time-PCR

• Tab. 4: Sonden für real-time-PCR Fluoreszein (FL), LightCycler Red-640 (LC Red640), LightCycler Red-705 (LC Red705)

• Tab. 5: Parameter für die LC-PCR zur TLR9-Genotypisierung (Roche-Puffer)

• Tab. 6: Parameter für die LC-PCR zur TLR9-Genotypisierung (ABgene-Puffer)

• Tab. 7: Parameter für die LC-PCR zur G2408A-Genotypisierung (Roche-Puffer)

• Tab. 8: Parameter für die LC-PCR zur G2408A-Genotypisierung (ABgene-Puffer)

• Tab. 9: PCR-Parameter zur Genotypisierung des T-1486C-Polymorphismus mittels RFLP

• Tab. 10: PCR-Parameter zur Genotypisierung des T-1237C-PM mittels RFLP

• Tab. 11: PCR-Parameter zur Genotypisierung des G2408A-PM mittels RFLP

• Tab. 12: Parameter zum Cycle-Sequencing von PCR-Produkten

• Tab. 13: Schmelzpunkte der Sonden

• Tab. 14: Häufigkeit der verschiedenen Genotypen im TLR9-Polymorphismus T-1237C Fallzahl (N), Freiheitsgrade (Fg)

• Tab. 15: Häufigkeit der verschiedenen Allele im TLR9-Polymorphismus T-1237C Freiheitsgrade (Fg), Odds ratio (OR), Konfidenzintervall (KI)

• Tab. 16: Häufigkeit der verschiedenen Genotypen des TLR9-Polymorphismus T-1486C

• Tab. 17: Häufigkeit der verschiedenen Allele im TLR9-Polymorphismus T-1486C

• Tab. 18: Häufigkeit der verschiedenen Genotypen des TLR2-Polymorphismus G2408A

• Tab. 19: Allelhäufigkeit des TLR9-Polymorphismus T-1237C bei RF-positiven und RF-negativen Patienten; Freiheitsgrade (Fg), Odds ratio (OR), Konfidenzintervall (KI)

• Tab. 20: Allelhäufigkeit des TLR9-Polymorphismus T-1486C bei RF-positiven und RF-negativen Patienten

• Tab. 21: Allelhäufigkeit des TLR2-Polymorphismus G2408A bei RF-positiven und RF-negativen Patienten (χ²-Test nicht anwendbar, da zwei Zellwerte < 5)

• Tab. 22: T-1486C-Genotypen bei RF-positiven und –negativen RA-Patienten (χ²-Test nicht anwendbar, da ein Zellwert < 5)

• Tab. 23: RF-Werte (ELISA, units/ml) bei den verschiedenen TLR2- und TLR9-Genotypen C: Alle Träger eines C-Allels (Genotypen CT und CC)

• Abb. 1: Akute und chronische Inflammation  Nach einer Verletzung entwickelt sich abhängig von Mediatoren und weiteren Faktoren die akute oder chronische Entzündung, die schließlich zur kompletten Wiederherstellung (restitutio ad integrum), zur Abszessbildung oder zur Reparation führen (verändert nach Cotran, 1999a)

• Abb. 2: Signaltransduktion bei IL-1R/TLR/Toll (nach Dunne und O’Neill, 2003)  Nach Bindung eines Liganden (z.B. LPS) kommt es über mehrere Adaptermoleküle zur Aktivierung eines Transkriptionsfaktors (NF-κB oder Dorsal), der die Expression verschiedener Gene induziert. Interleukin (IL), IL-1 receptor-associated kinase (IRAK), tumor necrosis factor receptor-associated factor 6 (TRAF6), Inhibitor von κB (IκB), nuclear transcription factor κB (NF-κB), Peptidoglykan (PGN), IL-1-Rezeptor (IL-1R), Adapterproteine MD-2 und MyD88, Lipopolysaccharid (LPS)

• Abb. 3: Das TLR9-Gen mit einer Auswahl von SNPs  Der Austausch der Basen ist gekennzeichnet, die Lage der SNPs ist jeweils relativ zum Translationsstart (Startcodon=0) angegeben. Der Transkriptionsstart (TS) liegt bei – 638 bp (nach Lazarus et al., 2003).

• Abb. 4: Genotypisierung am LightCycler
  A: Prinzip der LightCycler-PCR. Die Sensorsonde hybridisiert mit dem DNA-Bereich, in dem der SNP vorliegt. Das 3’-Ende der Sensorsonde ist mit Fluoreszein markiert (Donor-Fluorophor). Die Ankersonde bindet wenige Basenpaare entfernt vom 3’-Ende der Sensorsonde. Das 5’-Ende der Ankersonde ist mit LightCycler Red markiert (Akzeptor-Fluorophor)
  B: Prinzip des FRET. Wird der Donor-Fluorophor durch einen Lichtimpuls (hν) angeregt, kommt es zur Energieübertragung auf den Akzeptor-Fluorophor. Bei niedrigen Temperaturen kommt es sowohl beim Wildtyp-Allel (linke Abb.) wie auch beim mutierten Allel (rechte Abb.) zum FRET.
  C: Bei höheren Temperaturen löst sich die Sonde bei Vorliegen des mutierten Allels (SNP), während sie beim Wildtyp-Allel noch bindet. Es kann daher bei Existenz des mutierten Allels keine Energie über tragung mehr stattfinden.D: Resultierende Schmelzkurven. Das Wildtyp-Allel weist einen höheren Schmelzpunkt (SP) als das mutierte Allel auf (verändert nach Roche AG, 1998)Fluorescein (FL), Schmelzpunkt (SP), Lichtimpuls (hν)

• Abb. 5: Erste negative Ableitung der Schmelzkurven, Darstellung der Schmelzpunkte (SP)  Die homozygote Mutante (HM) weist einen niedrigen Schmelzpunkt auf, bei Vorliegen des Polymorphismus in heterozygoter Form (HZ) treten zwei Schmelzpunkten auf. Der Wildtyp (WT) hat einen höheren Schmelzpunkt als die homozygote Mutante.

• Abb. 6: Prinzip der TLR9-LightCycler-PCR  Fluoreszein (FL), LightCycler Red (LCred), Primer TLR9s/TLR9as, Polymorphismen T-1486C und T-1237C. Die Länge des PCR-Produktes beträgt 499 Basenpaare.

• Abb. 7: Neue c-Rel/NF-κB-Bindungsstelle durch den T-1237C-Polymorphismus

• Abb. 8: Zusätzliche Sp-1-Bindungsstelle durch T/C-Austausch beim T-1486C-Polymorphismus

• Abb. 9: Repräsentative Schmelzkurven des T-1237C-Polymorphismus A: Roche FastStart, dargestellt sind Schmelzkurven der Genotypen TT, CT und CC B: ABgene, Schmelzkurven der Genotypen TT, CT und CC

• Abb. 10: Repräsentative Schmelzkurven des T-1486C-Polymorphismus A: Roche FastStart, Schmelzkurven der Genotypen TT, CT und CC  B: Abgene, Schmelzkurven der Genotypen TT, CT und CC

• Abb. 11: Prinzip des RFLP  A: T-1237C-Polymorphismus. Durch den Austausch von Thymin durch Cytosin entsteht eine zusätzliche BstN I-Restriktionschnittstelle.  B: T-1486C-Polymorphismus. Durch den T/C-Austausch fällt die beim Wildtyp-Allel vorhandene Afl II-Schnittstelle bei der Mutante weg.  ▲ kennzeichnet die Schnittstelle eines Restriktionsenzymes, bp= Basenpaare

• Abb. 12: T-1237C-Polymorphismus, Gelelektrophorese mit charakteristischem Bandenmuster nach BstN I-Verdau  Proben des TT-Genotyp zeigen Fragmente der Längen 108 bp und 27 bp, Proben des CC-Genotyps Fragmente von 60, 48 und 27 bp. Bei heterozygoten Proben (CT) führt der BstN I-Verdau zu Fragmenten aller vier möglichen Längen (27, 48, 60 und 108 bp). bp= Basenpaare

• Abb. 13: T-1486-Polymorphismus, Gelelektrophorese mit charakteristischem Bandenmuster nach Afl II-Verdau  Proben des TT-Genotyps zeigen nach Verdau Banden der Länge 327 und 172 bp. Proben des CC-Genotyps besitzen keine Afl II-Schnittstelle, die Fragmentlänge beträgt daher 499 bp.