Humboldt-Universität zu Berlin

DISSERTATION

Genotyp- Identifizierung und Wechselwirkungen an zwei Populus-Chimären

doctor rerum agriculturarum (Dr. rer. agr.)

Landwirtschaftlich-Gärtnerische Fakultät

Mario J. Hansen

Dekan: Prof. Dr. Dr. h. c. Uwe J. Nagel

Gutachter:
1. Prof. Dr. rer. nat. habil. F. Pohlheim
2. Prof. Dr. rer. nat. habil. M.-B. Schröder
3. PD Dr. rer. nat. habil. K. Zoglauer

eingereicht: 04.11.2004

Datum der Promotion: 14.07.2005

Zusammenfassung

Zwei Populus-Pfropfchimären (MA und AI), die aus P. x canadensis ‘Marilandica’ (M), P. maximowizcii x P. trichocarpa ‘Androscoggin’ (A) und P. nigra L. ’Italica’ (I) aufgebaut sind, wurden für Untersuchungen zur Laub- und Blütenblattentwicklung genutzt. In MA bildet M die äußere Lage (L1) und ihr Derivat, die Epidermis, während die inneren Lagen (L2, L3 etc.) von A gebildet werden. Bei AI stammt die L1 von A und L2, L3 etc. werden von I gebildet. Die genotypisch andersartige Epidermis bedingt bei Periklinal-Chimären morphologische Effekte wie zum Beispiel einen Fruchtknoten in einigen MA-Blüten. Morphologische Besonderheiten verschiedener Gewebe sowohl von M und A als auch von MA wurden verglichen, um festzustellen, wie sie durch die Gewebetransplantation verändert oder beeinflusst wurden und, um mögliche Genotyp- Interaktionen oder -Wechselwirkungen in einem Gewebe ausfindig zu machen. Für die Genotypidentifizierung in verschiedenen Organen wurde die RAPD-PCR getestet. Einer von 20 getesteten 10mer Zufallsprimern (GGAGTGGACA) ermöglichte bei der Verwendung von DNA aus Blattmaterial die Erzeugung verschiedener Bandenmuster für M und A. Bei der Verwendung von MA-Blattmaterial zeigte sich eine Kombination der Muster von M und A, sodass ein Chimärennachweis für das MA-Blattmaterial erbracht wurde. Für ein übertragbares System wurde die spezifische PCR getestet. Unter Verwendung spezifischer Primer für die 16s-rDNA zeigten die PCR-Produkte einheitliche Banden und nach anschließender Sequenzierung eine weitgehende Übereinstimmung der phylogenetischen Verwandtschaft von I, M und A. Weiterhin wurden die kernkodierten rDNA Bereiche ITS 1 und ITS 2 zwischen 18S und 25S getestet. Für I, M und A konnten jeweils zwei Banden von unterschiedlicher Größe und Sequenz ermittelt werden, die vermutlich auf funktionierende rDNA aber auch auf Pseudogene (beschnitten) in niedriger Kopienzahl hinweisen. Die ITS-Regionen von I, M und A wurden charakterisiert, um einen Einblick in die Struktur und Phylogenie der Salicacaee-Familie zu erhalten. Aus den Sequenzunterschieden konnten für I und A spezifische Primerpaare abgeleitet werden, die für die Identifizierung von I und A in AI und MA verwendet werden können. Mittels A-Marker konnte nachgewiesen werden, dass Fruchtknoten aus MA-Blüten neben M-Gewebe auch den A-Genotyp enthalten.

Schlagwörter: Populus-Pfropfchimären, RAPD-PCR, 16s-rDNA, kernkodierten rDNA (ITS-Regionen)

Abstract

Two Populus graft chimeras (MA and AI) produced of P. x canadensis ‘Marilandica’ (M), P. maximowizcii x P. trichocarpa ‘Androscoggin’ (A) and P. nigra L. ’Italica’ (I) were used for investigations of leaf and flower development. In MA the exogenous layer (L1) forms the epidermis and is derived from M while inner layers (L2, L3 etc.) descend from A whereas in AI L1 is formed by A while L2, L3 etc. descend from I. The exogenous epidermis of the periclinal chimeras imposes morphological effects such as an extra female sex in some of the MA flowers. The morphological characteristics of different plant tissues of parents and chimera were compared to determine how they were modified or altered by the tissue transplantation and possibly identify co-existing or interacting genotypes in one tissue. RAPD-PCR was tested for its usefulness to amplify polymorphic fingerprints including donor specific DNA fragments. One random 10mer primer (GGAGTGGACA) out of 20 tested revealed the amplification of patterns including donor specific DNA bands using extracts from leaf tissues of the M and A parents that were combined using extract from leaf tissue of the MA chimera. This indicates that the leaves of the MA chimera are formed by tissues of M and A. However, the inherent disadvantage of RAPD-PCR is the reproducibility of PCR product generation. Therefore the discriminative potential of the ITS region located between the rRNA genes was investigated. The application of specific 16S ribosomal DNA (rDNA) primers for amplification and sequencing of PCR products revealed a closely phylogenetic relationship between I, M and A. Consequently the ITS1 and ITS2 of nuclear rDNA between 18S and 25S were used. The amplified fragments were purified, cloned in E. coli and sequenced. Analyses of multiple clones demonstrated extensive paralogy within and between I, M and A ITS operons. For each parent were at least two rDNA operons as well as multiple paralogous sequences within operons identified. The use of PCR and sequence analyses showed that one of the operons encodes a putative expressed (functional) rDNA whereas the second encodes a pseudogen (truncated) in low copy number. We also characterized the ITS regions of I, M and A to gain insights into structure and phylogeny of the Salicacaee family. Based on sequence divergence primers were designed for A and I and used for the identification of A in MA carpels.

Keywords: Populus graft chimeras, RAPD-PCR, 16s-rDNA, nuclear rDNA (ITS regions)

Inhaltsverzeichnis

• 1 Einleitung
  • 1.1 Einführung
  • 1.2 Historischer Hintergrund
  • 1.3 Chimären und Burdonen
  • 1.4 Proliferation
  • 1.5 Chimären als Modellsystem
    • 1.5.1 Klassifizierung pflanzlicher Chimären
    • 1.5.2 Wechselwirkungen zwischen Chimärenkomponenten
  • 1.6 Kompatibilität von Chimäreneltern und Segregation
  • 1.7 Das Teilungsverhalten einzelner Tunikalagen
  • 1.8 Die phytomedizinische Nutzung von Chimären
  • 1.9 Zell-Zell-Interaktionen zwischen Zelllagen in Chimären
    • 1.9.1 Partnerinduktion
    • 1.9.2 Die regulierende Funktion von Plasmodesmen (PMD)
  • 1.10 Chimären aus der Gattung Populus
    • 1.10.1 Beispiele von Pfropf-Chimären
    • 1.10.2 Beispiel einer gentechnisch erzeugten Chimäre
    • 1.10.3 Cyto-Chimären
    • 1.10.4 Die Sexual-Chimäre MA
  • 1.11 Blütenvariationen in der Gattung Populus
    • 1.11.1 Zwittrigkeit in der Gattung Populus
  • 1.12 Blütenentwicklung und homöotische Mutationen
    • 1.12.1 Das ABC-Modell und die MADS-Box
    • 1.12.2 Diözisten und ihre Blütengenetik
  • 1.13 Erstellung molekularer Marker
    • 1.13.1 Die RAPD-PCR
    • 1.13.2 Die spezifische PCR
  • 1.14 Aufgabenstellung
• 2 Material und Methoden
  • 2.1 Pflanzenmaterial
  • 2.2 Entstehung der Populus-Chimären
  • 2.3 Laborgeräte
  • 2.4 Isolierung von Nukleinsäuren
    • 2.4.1 DNA-Isolierung aus Pflanzenmaterial
    • 2.4.2 Plasmidaufreinigung aus E. coli
    • 2.4.3 DNA-Isolierung aus Agarosegelen
  • 2.5 DNA-Amplifizierung mittels PCR
  • 2.6 Gelelektrophorese
  • 2.7 Transformation von E. coli mit Plasmid-DNA
  • 2.8 Kunststoffeinbettung
  • 2.9 Dünnschichtchromatographie (DC)
• 3 Ergebnisse
  • 3.1 Histomorphologische Untersuchungen
    • 3.1.1 Dokumentation der Laubblätter
    • 3.1.2 Blütenbau und Blütenentwicklung der Populus-Exemplare M und A
    • 3.1.3 Blütenarchitektur von Populus x canadensis ’Marilandica’ (M)
    • 3.1.4 Blütenarchitektur von P. maximowicii x P. trichocarpa ’Androscoggin’ (A)
    • 3.1.5 Blütenarchitektur der Chimäre aus M über A (MA)
    • 3.1.6 Dokumentation der Blüten von M, A und MA
  • 3.2 Hydathoden und Exsudate der Versuchspflanzen
    • 3.2.1 Hydathodenarchitektur der Populus-Exemplare
    • 3.2.2 DC-Vergleich von M-, A- und MA-Bandenmuster aus Knospenexsudat
    • 3.2.3  Penicillium sp.-Pilzbefall als M-Indikator an MA-Knospen
    • 3.2.4 Dokumentation der Hydathoden und Exsudate
  • 3.3 Molekulargenetische Untersuchungen
    • 3.3.1 Anwendung der RAPD-PCR für die Unterscheidung zwischen M und A
    • 3.3.2 DNA-Extraktion aus RAPD-Banden von M- und A
    • 3.3.3 Ligation von spezifischen M- und A-Banden und Plasmid
    • 3.3.4 Lysis von Plasmid-DNA aus E.coli
    • 3.3.5 Test spezifischer Primer aus RAPD-Fragmenten
    • 3.3.6 Amplifizierung der 16S-rDNA von I, M und A
    • 3.3.7 Amplifikation der ITS-Bereiche aus I, M und A
    • 3.3.8 Identifikation verschiedener Klone mit ITS-Insert aus I, M und A
    • 3.3.9 Selektion verschiedener Klone mit ITS-Insert für I, M und A
    • 3.3.10 Ableitung molekularer Marker
    • 3.3.11 A-Markertest
    • 3.3.12 Anwendung der Marker aus I und A
  • 3.4 Sequenzvergleiche
    • 3.4.1 A-Sequenz (RAPD-Bande)
    • 3.4.2 M-Sequenz (RAPD-Bande)
    • 3.4.3 Sequenzvergleich (M-Bande) zwischen A und M
    • 3.4.4 16S-rDNA-Vergleich verschiedener Familien mit I, M und A
    • 3.4.5 Gegenüberstellung von verschiedenen ITS-Bereichen aus M
    • 3.4.6 Vergleich von ITS-Regionen aus Salicaceae-Arten mit I, M und A
• 4 Diskussion
  • 4.1 Histologische Charakterisierung der Blütenformation
    • 4.1.1 Organogenese in unmodifizierten Populus-Blüten
    • 4.1.2 Abweichende Organogenese in einigen Blüten von MA
  • 4.2 Entwicklung molekularer Marker
    • 4.2.1 RAPD-PCR basierte Marker
    • 4.2.2 Sequence Characterised Amplified Region (SCAR-) Marker
    • 4.2.3 Extensive ITS-Variation bei Hybriden
    • 4.2.4 Verwendung der molekularen Marker für A und I
  • 4.3 Strukturelle Klassifizierung der ermittelten Sequenzen
    • 4.3.1 Sequenzen aus M- und A-RAPD-Banden
    • 4.3.2 Vergleich der 16S-rDNA-Sequenzen aus I, M und A
    • 4.3.3 Vergleich der ITS-Sequenzen aus I, M und A
  • 4.4 Hypothesen zur bidirektionalen Kommunikation von Zellschichten
• Abkürzungsverzeichnis
• Literaturverzeichnis
• Danksagung
• Lebenslauf
• Eidestattliche Erklärung

Tabellenverzeichnis

• Tabelle 1: Pflanzenmaterial
• Tabelle 2: Laborgeräte
• Tabelle 3: Abkürzungen und Nummern für 16S-rDNA-Sequenzen
• Tabelle 4: Abkürzungen und Nummern für ITS-Sequenzen

Abbildungsverzeichnis

• Abb. 1: M-, A- und MA-Laubblatt (Unterseite)
• Abb. 2: M-, A- und MA- Laubblatt (Querschnitt)
• Abb. 3: M-Sektor in einem MA-Laubblatt (Unterseite)
• Abb. 4: geteilter Blattquerschnitt aus Bereich C-1 vom Blattsektor aus Abb. 3.c
• Abb. 5: geteilter Blattquerschnitt aus Bereich C-2 vom Blattsektor aus Abb. 3.c
• Abb. 6: Perforation der M-Epidermis am MA-Laubblatt
• Abb. 7: Blütenstand (Kätzchen) von M, A und MA
• Abb. 8: Einzelblüte von M, A und MA
• Abb. 9: hisomorphologische Untersuchung von MA-Blütenorganen
• Abb. 10: Blattzacke von M-Laubblatt und histologischer Dünnschnitt
• Abb. 11: Knospenschuppe von M und histologischer Dünnschnitt
• Abb. 12: Dünnschichtchromatographie (DC) mit Knospensekret von M, A und MA
• Abb. 13: Infektionsversuch mit Knospen von M, A und MA mit Penicillium sp.
• Abb. 14: RAPD-PCR-Produkte von M-, A- und MA-DNA aus Blattmaterial
• Abb. 15: RAPD-PCR-Produkte aus M-, A- und MA-DNA und die Fragmente FA und FM
• Abb. 16: Ligation aus M- und A-Fragment (FM und FA) mit dem Plasmid pGEM-T Easy
• Abb. 17: Lysis-Produkte aus transformanten E. coli mit Plasmid und Insert (FM und FA)
• Abb. 18: PCR-Produkte mit spezifischen Primern aus FM und FA
• Abb. 19: PCR-Produkte mit spezifischem Primer aus FM und Temperaturgradient
• Abb. 20: 16S-rDNA-PCR-Produkte von I, M und A
• Abb. 21: PCR-Produkte von I, M und A mit spez. ITS-Primern
• Abb. 22: Restriktionsverdau mit Eco R1 von Plasmid mit Insert aus Klonen von I, M und A
• Abb. 23: PCR-Produkte aus ITS- und Klon (Insert kurz und lang) spezifischer PCR
• Abb. 24: PCR-Produkte mit spezifischen Primern für M-t, M-f und M-its
• Abb. 25: PCR-Produkte mit spezifischen Primern für A und die 16S-rDNA
• Abb. 26: PCR-Produkt mit spezifischen Primern für A (a) und für die 16S-rDNA
• Abb. 27: PCR-Produkte aus spezifischen Primern für I (i) und für die 16S-rDNA
• Abb. 28: Sequenz der Fragmentbande (FA) aus RAPD-Bande A
• Abb. 29: Sequenz der Fragmentbande (FM) aus RAPD-Bande M
• Abb. 30: Sequenzvergleich (M-Bande) zwischen A und M
• Abb. 31: 16S-Phylogramm
• Abb. 32: ITS-Schema
• Abb. 33: Sequenzvergleich zwischen M-f und M-t
• Abb. 34: ITS-Phylogramm aus ermittelten und entnommenen (Genbank) ITS-Sequenzen