2 Material und Methoden

2.1 Pflanzenmaterial

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Tabelle 1: Pflanzenmaterial

Familie:

Salicaceae (Weidengewächse)

 

Gattung:

Populus (Pappel)

 

Sektionen:

AIGEIROS

TACAMAHACA

 

(Schwarzpappel)

(Balsampappel)

   

Arten:

Populus nigra L.

Populus trichocarpa Torr. et Gray

 

(Europäische Schwarzpappel)

(Westliche Balsampappel)

   
 

P. deltoides Bartram

P. maximowiczii Henry

 

(Kanadische Schwarzpappel)

(Asiatische Balsampappel)

   

Hybriden:

P. x canadensis Moench

P. maximowiczii x P. trichocarpa

 

(P. nigra x P. deltoides)

’Androscoggin’ (A)

 

’Marilandica’ (M)

 

Mutante:

P. nigra L. ’Italica’ (I)

 
   

Chimären:

P. x canadensis ’Marilandica’ über P. maximowiczii x

 
 

P. trichocarpa ’Androscoggin’ (MA)

 
   
 

P. maximowiczii x P. trichocarpa ’Androscoggin’ über P. nigra L. ’Italica’ (AI)

2.2 Entstehung der Populus-Chimären

Zur experimentellen Synthese von Pfropfchimären bei Gehölzen ist eine gut lokalisierbare Sprossbildung notwendig. Für das Experiment wurden Populus-Klone aus verschiedenen Sektionen gewählt, die sich in ihren Geschlechtern, ihren Herkunftsgebieten und ihren äußeren Merkmalen weitgehend voneinander unterscheiden. Nach Pfropfung und erfolgreicher Verwachsung erfolgte im Bereich der Verwachsungsstelle die Decaptation. Aus dem Mischkallus wurden homohistische und heterohistische Adventivsprosse gebildet, aus denen durch die Aktivierung von Achselknospen in periklinalchimärischen Bereichen stabile Chimären aufgebaut werden konnten, die Veränderungen von einigen morphologischen Merkmalen der Ausgangsklone aufweisen.

2.3 Laborgeräte

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Tabelle 2: Laborgeräte

Gerät (Bezeichnung)

Hersteller

Biotechnik

 

Analysenwaage

SARTORIUS

Brutschrank: TWC-MB6

BINDER

Zentrifugen:

Biofuge A

Microfuge R

Speed Vac SC110

HERAEUS (sepatech)

BECKMAN

SAVANT

Elektrophoresekammer:

Horizontal-System – H5

GIBO-BRL

Elektrophorese-power-supply:

Transformator-118040

GIBO-BRL

Heizplatte: IKA-Combimag

RCT

PCR-Cycler:

Thermal-Reactor HYBAID

RoboCycler (Gradient 96)

MWG-Biotech

STRATAGENE

Thermorüttler: Swip SM 25 DIGI (TH25)

Edmund Bühler

Transiluminator:

Tisch TFX-20M

System Bio Doc Analyse

INTAS

BIOMETRA (Whatman)

Wasserbad: 3042

Köttermann Labortechnik

Histologie

 

Mikrotom: RM-2155

LEICA

digitale Bildbearbeitung

 

Software:

Adobe Photoshop 5.0

Corel, Version 10

Adobe Systems Inc.

Corel Corporation

2.4 Isolierung von Nukleinsäuren

2.4.1 DNA-Isolierung aus Pflanzenmaterial

Die Gewinnung von gesamtgenomischer DNA aus Blattmaterial erfolgte nach der von Dellaporta (Dellaporta et al., 1983) beschriebenen Extraktionsmethode.

2.4.2 Plasmidaufreinigung aus E. coli

Plasmid- DNA wurde mit Anionenaustauscher- Säulen nach Protokoll der Herstellerfirma (Invitek) isoliert.

2.4.3 DNA-Isolierung aus Agarosegelen

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Die Elution von DNA aus Agarosegelen erfolgte mittels Kit nach Herstellerangaben (Qiagen).

2.5 DNA-Amplifizierung mittels PCR

Die Random Amplified Polymorphic DNA - Polymerase Chain Reaction (RAPD-PCR) liefert durch die Verwendung von kurzen Zufallsprimern komplexe Bandenmuster.

Die Amplifizierung wird in einem Reaktionsvolumen von 30μl mit folgenden Reagenzien durchgeführt:

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  1. 25µl Merck PCR-Mastermix
  2. 4µl Primer
  3. 1µl (5ng) DNA

Der Reakionsansatz wird mit 20 µl Öl (8042-47-5) SIGMA überschichtet.

Es wird in einer PCR-Maschine nach folgendem Programm amplifiziert:

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  1. Vordenaturierung der DNA bei 94 °C für 2 min 30 s
  2. Denaturierung bei 92 °C für 20 s
  3. Anlagerung der Random-Primer bei 38 °C für 15 s, Temperatur-rampe zur Polymerase-Reaktion für 1 min 42 s
  4. Polymerase-Reaktion bei 72 °C für 1 min
  5. abschließende Polymerisierung bei 72 °C für 7 min

Die Schritte b -d werden 40 x wiederholt.

2.6 Gelelektrophorese

Agarosegel-Elektrophorese von Nukleinsäuren

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Vorbereitung des Gels:

  1. je nach gewünschter Agarosekonzentration des Gels (0,8 - 2,5 %) Agarose in 1 x TBE- oder 1 x TAE-Puffer aufkochen (5 x TBE: 54 g Tris-Base, 27,5 g Borsäure, 20 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) auf 1 l Wasser; 50 x TAE: 242 g Tris-Base, 57,1 ml Eisessig, 100 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) auf 1 l Wasser)
  2. nach Abkühlen auf ca. 50° - 60°C Gel luftblasenfrei in einen vorbereiteten Gelträger mit Kamm gießen
  3. nach dem Erstarren des Gels Kamm vorsichtig herausziehen
  4. Gelträger in eine Pufferkammer einsetzen und mit Puffer überschichten
  5. DNA-Proben mit 20% Bromphenolblau-Ladungspuffer versetzen und je nach Geltaschengröße 5-25 μl in die Geltaschen pipettieren

Elektrophorese:

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Die Dauer der Gelelektrophorese ist abhängig von der verwendeten Gelkammer. Meistens werden 80 bis 100 Volt Spannung angelegt, was bei den meisten Kammern 4-5 V/cm entspricht. Die Stromstärke sollte hierbei unter 100 mA liegen.

Färbung und Fotografieren des Gels:

Zum Anfärben der DNA-Banden wird das Gel für 5 - 15 min in einem Ethidiumbromid (EtBr.) Färbebad getränkt. Dabei kommt es zur Interkalierung des EtBr in die DNA. Anschließend wird das Gel für 5-20 min gewässert, um überschüssiges EtBr aus dem Gel zu entfernen. Da das in die DNA eingelagerte EtBr unter UV-Licht fluoresziert, wird das Gel auf einen Transilluminator (302 nm) gelegt und mit der Videokamera fotografiert.

2.7 Transformation von E. coli mit Plasmid-DNA

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Kompetente E. coli Zellen wurden nach dem Herstellerprotokoll (Promega) mit dem Vektor pGEM-T Easy transformiert, selektiert und vermehrt.

2.8 Kunststoffeinbettung

Einbettung in Glycolmethacrylat:

Durch Kunststoffeinbettungen lassen sich sehr dünne Einzelschnitte für mikroskopische Untersuchungen anfertigen. Das verwendete Verfahren wurde von der Firma Kulzer entwickelt. http://www.ebsciences.com/papers/papers.htm#plastic

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Schneiden der Präparate:

Das Schneiden der Proben am Rotationsmikrotom RM 2155 der Firma Leica geschieht mit Schnittstärken von 8 µm. Die Schnitte müssen einzeln auf den Objektträger überführt, mit einigen Tropfen Wasser gestreckt und danach getrocknet werden. Die Schnitte gehen innerhalb von 24 Stunden eine feste Verbindung mit dem Objektträger ein.

Färben der Dünnschnitte:

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Zum nachfolgenden Färben werden die Objektträger für ca. 15 min in Hämatoxylin (0,1%ig, in 2,5%iger wässriger Natriumhydrogencarbonat - Lösung) getaucht und anschließend unter fließendem Wasser gespült.

Konservieren der Dünnschnitte:

Abschließend an das Trocknen werden die Schnitte in "Fulka 44581 DPX - Einschlussmittel für die Histologie" zwischen Objektträger und Deckglas konserviert.

2.9 Dünnschichtchromatographie (DC)

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Für eine qualitative aber auch quantitative Bestimmung der Wachs-komponenten eignet sich das Verfahren der Dünnschichtchromatographie. Das chromatographische Prinzip beruht auf der unterschiedlichen Wechselwirkung der Komponenten eines zu trennenden Substanzgemisches durch unterschiedliche Verteilungs- oder Adsorptionsgleichgewichte in einem Zweiphasensystem. Hierbei handelt es sich um begrenzt miteinander mischbare Stoffe, die unterschiedliche Aggregatzustände haben können. Eine der beiden Phasen ist ortsunveränderlich; sie wird daher als die „Stationäre Phase“ bezeichnet. Die zweite Phase ist ein strömendes Medium, also eine Flüssigkeit oder ein Gas. Sie trägt deshalb auch die Bezeichnung „ Mobile Phase “. An der Grenzfläche beider Phasen tritt das mit der mobilen Phase transportierte Stoffgemisch in Wechselwirkung mit der stationären Phase, und es kommt zu abweichenden Verteilungs- und/oder Adsorptions-gleichgewichten für jede einzelne Gemischkomponente. Je nach Art und Größe der Gleichgewichte ergeben sich daraus ungleiche Wanderungs-geschwindigkeiten der Komponenten längs der Phasengrenzschicht. Die unterschiedliche Laufzeit der Komponenten führt letztlich zu ihrer Trennung und ermöglicht so eine Analyse.

Vorbereiten der DC – Platte (Kieselgel 60 F 254):

Die Startlinienmarkierung (1 cm vom unteren Rand) der DC-Platte wird mit Bleistift durchgeführt. Damit das Laufmittel ungehindert und gleichmäßig aufsteigen kann, darf die Sorbtionsmittelschicht dabei nicht beschädigt werden.

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Auftragen der Probesubstanz:

Substanz wird auf die Startlinie der DC-Platte mittels Schmelzpunktröhrchen aufgetragen.

Entwickeln des Chromatogramms:

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Die vorbereitete DC–Platte wird in die Trennkammer gestellt und bei gleichbleibenden Bedingungen entwickelt. Die Kammer darf während des Entwicklungsvorgangs nicht mehr geöffnet werden! Nach ausreichender Entwicklung wird die Platte aus der Kammer gehoben und die Laufmittelfront mit Bleistift markiert. Anschließend wird die DC-Platte unter dem Abzug getrocknet.

Sichtbarmachung der Substanzen:

UV-Lichtbestrahlung mit 365 nm für fluoreszierende Substanzen. Die Substanzflecken erscheinen als hellleuchtende, farbige Flecken auf der dunklen Platte. UV-Lichtbestrahlung mit 254 nm für UV-Licht absorbierende Substanzen. Auf der mit Leuchtstoffindikator imprägnierten Sorbtionsmittelschicht erscheinen die Substanzen als dunkle Flecken auf dem hellgrün fluoreszierenden Grund.


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24.10.2005