3 Ergebnisse

3.1 Histomorphologische Untersuchungen

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Der Aufklärung des Phänomens, das zur Determination des weiblichen Geschlechtes in den männlichen Blüten führt, soll mit dieser Arbeit entgegengegangen werden. Die Voraussetzung dafür sind fundierte Kenntnisse über den komplexen Organogeneseprozess intakter Blüten und hinreichende Erfahrungen mit modifikativen Wirkungen genetisch fremder Gewebe bei der Blütenformation unter exemplarischen Bedingungen. Das Hauptaugenmerk wurde dabei auf Entmischungsstrukturen und auf Übergangsformen an chimärischen Organen gelegt.

3.1.1 Dokumentation der Laubblätter

Abb. 1: M-, A- und MA-Laubblatt (Unterseite)

Das Laubblatt von M ist herzförmig, der Blattrand ist stark gekerbt und die Farbe der Blattunterseite ist dunkelgrün.
Das Laubblatt von A ist oval gespreizt, der Blattrand ist nur sehr schwach gekerbt und die Farbe der Blattunterseite ist silbergrau.
Das Laubblatt von MA ist breit oval und zugespitzt, der Blattrand ist gekerbt und die Farbe der Blattunterseite ist silbergrau. Der Pfeil deutet auf einen Blattsektor, bei dem auch das Mesophyll aus der L1-Komponente (M) gebildet wird.

Abb. 2: M-, A- und MA- Laubblatt (Querschnitt)

Der histologische Querschnitt aus einem M-Laubblatt zeigt wenig Aerenchym im Schwamm-parenchym.
Der histologische Querschnitt aus einem A-Laubblatt zeigt sehr viel Aerenchym im Schwamm-parenchym.
Der histologische Querschnitt aus einem MA-Laubblatt zeigt mittelmäßig ausgeprägtes Aerenchym im Schwammparenchym.

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Abb. 3: M-Sektor in einem MA-Laubblatt (Unterseite)

3.a) Eine Blattunterseite von MA zeigt einen stark ausgeprägten Blattsektor am Blattrand, bei dem auch das Mesophyll aus der L1-Komponente (M) gebildet wird. Der Sektor weist verschiedene Kombinationen der Blattgewebe aus M und A auf.
3.b) Der Blattausschnitt aus Abb. 3.a. zeigt im Randbereich eine Saumzone, die durch unterschiedliche Farben gekennzeichnet sind. Im oberen und unteren Teil des Sektors schließt sich ein Bereich an, der von dunkelgrün über silbergraugrün bis in den silbergrauen Blattbereich ragt. Im mittleren Teil befindet sich ein Bereich, der durch hellgrüne Farbe gekennzeichnet ist.
3.c) Für histologische Untersuchungen wurde aus dem silbergraugrünen oberen Bereich (C-1) und dem hellgrünen mittleren Bereich (C-2) des Blattsektors ein Fragment entnommen.

Abb. 4: geteilter Blattquerschnitt aus Bereich C-1 vom Blattsektor aus Abb. 3.c

4.a) Blattquerschnitt aus dem Bereich C-1 des Blattsektors (Abb. 3.c) Im Mesophyll der Blattunterseite liegen zwei verschiedene Gewebeschichten übereinander. Im Anschluss an die untere Epidermis folgt eine Zellschicht, die mit ihren großen Interzellularen dem Genotyp A entspricht. Die darüber liegende Schicht weist kaum Interzellularen auf und besteht aus kurzen Palisaden. Sie zeigen damit phänotypische Merkmale von M.
4.b) Blattquerschnitt vom Blattrand aus dem Bereich C-1 des Blattsektors (Abb. 3.c) von MA. Im Mesophyll der Blattunterseite ist im linken Bereich noch ein Teil des in Abb. 4.a. erkennbaren subepidermalen Gewebes vorhanden. Im Anschluss daran werden auch in dieser Lage die Zellen von M ausgefüllt.

Abb. 5: geteilter Blattquerschnitt aus Bereich C-2 vom Blattsektor aus Abb. 3.c

5.a) Blattquerschnitt aus dem unteren Fragment (Bereich C-2) des Blattsektors (Abb. 3.c) von MA. Im linken Bereich entspricht das Mesophyll den phänotypischen Merkmalen von MA. Im rechten Bereich entspricht die subepidermale Schicht den phänotypischen Merkmalen von M. Die beiden Bereiche werden durch ein Leitgefäß voneinander getrennt.
5.b) Blattquerschnitt aus dem Bereich C-2 des Blattsektors (Abb. 3.c) von MA. Im Mesophyll (abaxial) liegen zwei verschiedene Gewebeschichten übereinander. Im Anschluss an die untere Epidermis folgt eine Zellschicht, die mit ihren runden Zellen und kleinen Interzellularen dem Phämotyp M entsprechen. Die darüber liegende Schicht besteht aus kurzen quer liegenden Palisadenzellen. Sie zeigen phämotypische Merkmale von A.

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Abb. 6: Perforation der M-Epidermis am MA-Laubblatt

6.a) Eine Blattunterseite von MA zeigt einen stark ausgeprägten Sektor, bei dem die Epidermis der L2-Komponente (A) entspricht. Der Sektor weist darauf hin, dass während der frühzeitigen Blattentwicklung die M-Epidermis zerrissen und durch A-Gewebe ersetzt worden ist (POHLHEIM et al., 2004b).
6.b) Querschnitt durch den Sektor aus Abb. 6.a. Auf der linken Seite ist deutlich Aerenchym von A mit M-Einfluss ausgebildet, während rechts das Mesophyll durchgehend A-Charakter zeigt (POHLHEIM et al., 2004b).

3.1.2 Blütenbau und Blütenentwicklung der Populus-Exemplare M und A

Mikroskopische Studien wurden an Dünnschicht- und Frischpräparaten von M- und A-Blüten in verschiedenen Entwicklungsphasen durchgeführt. Es sollten sowohl die Unterschiede zwischen den Blütenorganen als auch der Einfluss der Gewebetransplantation auf die Organogenese herausgearbeitet werden. Jeweils eine ausgereifte weibliche Blüte (Abb. 8M), männliche Blüte (Abb. 8A) und die dazugehörigen Blütenstände (weiblich Abb. 7M und männlich Abb. 7A) werden dokumentiert. In Abb. 8MA wird eine zwittrige MA-Blüte gezeigt, in der ein Fruchtknoten gebildet wurde. Die Abb. 7MA zeigt die Verteilung der zwittrigen Blüten in einem MA-Blütenstand.

Die Blütenentwicklung wird bei den verwendeten Exemplaren I, M und A im späten Frühling induziert, fast ein Jahr bevor die Blüte (Anthese) beginnt. Die Blütenkätzchen erscheinen bei A und I noch vor dem Blattaustrieb, bei M treten sie mit dem Blattaustrieb in Erscheinung. Nach dem Abblühen werden an blühreifen Zweigen in den Blattachseln wieder neue Infloreszenzen induziert. Sie entwickeln sich zu Achselknospen, die sich akropetal anordnen und bis zum Herbst einen winterfesten Zustand erreichen. In diesem Zeitfenster werden entlang der Blütenachse Deckblätter (Brakteen) gebildet, in deren Achseln - durch mitotische Teilungen - ein Zellbereich entsteht, der für die Organogenese vorgesehen ist. Diese Zellen ordnen sich dann in einer abgeflachten Scheibenform an und bilden im weiteren Verlauf der Differenzierung das Blütenprimordium. Während sich am Rande des Primordiums ein Wirtel etabliert, der für die Ausprägung des Blütenbechers (Perianth) verantwortlich ist, wird im Zentrum ein Wirtel gebildet, aus dem die fertilen Blütenorgane hervorgehen. Nach der Winterruhe beginnt die Sporo- und Gametogenese (Meiose), gleichzeitig setzt auch die Zellteilung (Mitose) wieder ein und durch Volumenzunahme treten die Infloreszenzen als Kätzchen aus den Blütenknospen. Sie entsprechen dem Typus einer einfachen Traube, die aus eingeschlechtlichen Blüten zusammengesetzt ist.

↓36

Bei Untersuchungen an einzelnen Blüten von M, A und I konnte eine variierende Anzahl der Staubblätter (Antheren), Fruchtblätter (Karpelle) und Samenanlagen (Ovula) beobachtet werden. Außerdem wurden verschiedene Blütenzahlen und Kätzchenlängen ermittelt.

3.1.3 Blütenarchitektur von Populus x canadensis ’Marilandica’ (M)

Parallel zur Errichtung des Perianths formen sich aus dem inneren Wirtel Primordien, die für die Entwicklung der Karpelle vorgesehen sind.

Bei morphologischen Untersuchungen an M-Blüten können 2 bis 4 Karpelle gezählt werden, die im Verlauf der Organogenese zu einem Fruchtknoten (Ovarium) und Griffel (Stylus) verwachsen, aus dem dann auch die Narbe (Stigma) gebildet wird. Nachdem die Karpelle an ihren Rändern verwachsen sind (parietale Plazentation), so dass die Plazenten als Leiste auf der inneren Fruchtknotenwand erscheinen, werden archesporale Zellschichten angelegt, aus der die Nucellusscheitel hervorgehen. In ihnen entstehen - im weiteren Verlauf der Differenzierung - die Emryosackmutterzellen, sodass die Megasporogenese eingeleitet wird und sich der Embryosack formt. Das so reifende Gynoeceum enthält Ovarien, in denen Samenanlagen (Ovula) vorhanden sind, die um 180° (anatrop) zum Nabelstrang (Funiculus) angeordnet sind. An verschiedenen Ovarien kann eine Variabilität in der Anzahl der Samenanlagen zwischen 15 und 25 ermittelt werden.

3.1.4 Blütenarchitektur von P. maximowicii x P. trichocarpa ’Androscoggin’ (A)

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Im Gegensatz zu den M-Blüten, ist die Etablierung der fertilen Organe bei A nicht nur auf das Zentrum des Blütenapex beschränkt. Während der anhaltenden Expansion des äußeren Wirtels, aus dem, wie bei M, der Blütenbecher (Perianth) gebildet wird, entsteht durch langsamere Zellteilungen im Inneren eine konkav geformte meristematische Region (innerer Wirtel), aus welcher die Stamenprimordien hervorgehen. Im weiteren Verlauf der Differenzierung entstehen Antheren, von denen jede aus zwei Pollensäcken besteht. In ihnen befindet sich das Mikrosporangium, aus welchem Mikrosporenmutterzellen hervorgehen. In diesem Stadium überwintern die Staubblätter (Stamen). Nach der Dormanz reift das Mikrosporangium zum Tapetum und die Mikrosporenmutterzellen teilen sich meiotisch, wodurch Mikrosporen (Tetraden) entstehen. Während der Reifung der Mikrosporen teilen sich die Tetraden, sodass jeweils vier einzelne Pollen pro Tetrade gebildet werden.

Aus einer Zählung der Antheren von einzelnen Blüten konnten Unterschiede in der Anzahl der Blüten pro Kätzchen (52-76) und der Antheren pro Blüte (25-50) festgestellt werden.

3.1.5 Blütenarchitektur der Chimäre aus M über A (MA)

Neben den überwiegend männlichen Blütenständen von MA konnten Blüten ausfindig gemacht werden, die sowohl Staubblätter als auch einen Fruchtknoten zeigten. Vereinzelt wurden auch Staubblätter gefunden, die Abnormalitäten aufwiesen, die in ihrer Form und Farbe einer Narbe oder Samenanlagen ähnelte.

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Die histomorphologischen Untersuchungen zeigten, dass solche Fruchtknoten oder fruchtblattähnlichen Gebilde stets im Blütenzentrum zu finden waren (Abb. 8MA). Außerdem konnte - anhand von Pollenkeimungen - nachgewiesen werden, dass der Pollen keimfähig war (Abb. 9c). Die Ovarien zeigten Samenanlagen, die sich von solchen wie aus M nicht unterschieden (Abb. 9a). An den normal gebildeten MA-Staubblättern konnten keine Unterschiede zu A-Staubblättern festgestellt werden.

Einige MA-Zweige mit Blütenknospen wurden unter Gewächshaus-bedingungen und unter Zugabe von Nährstoff (Zucker) zur Blüte gebracht und anschließend mit MA-Pollen bestäubt. Es konnte ein Anschwellen der Fruchtknoten beobachtet werden, das sich aber nicht aufrechterhalten ließ, weil sich die MA-Blüten wie männliche A-Blüten verhielten, in dem sie nach dem Abreifen abfielen. Unter denselben Bedingungen wurden auch M-Blüten bestäubt, die anschließend das gleiche Ergebnis zeigten. Auch unter Freilandbedingungen blieben bei den MA-Bäumen keine Blüten über dieses Stadium hinaus an den Zweigen hängen, sodass davon ausgegangen werden kann, dass sich die zweigeschlechtlichen MA-Blüten wie eingeschlechtliche A-Blüten verhalten, die nach der Entleerung der Antheren von den Zweigen abfallen.

3.1.6 Dokumentation der Blüten von M, A und MA

Abb. 7: Blütenstand (Kätzchen) von M, A und MA

M-Kätzchen (weiblich)
zwei A-Kätzchen (männlich) an einem Blütenspieß mit Terminalknospe
MA-Kätzchen, mit vereinzelt auftretenden zweigeschlechtlichen Blüten im mittleren Bereich

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Abb. 8: Einzelblüte von M, A und MA

M-Einzelblüte (weiblich),
A-Einzelblüte (männlich),
MA Einzelblüte (zwittrig)

Abb. 9: hisomorphologische Untersuchung von MA-Blütenorganen

9.a) Der histologische Dünnschnitt eines Fruchtknotens aus einer zweigeschlechtlichen Einzelblüte von MA zeigt eine vollständig ausgeprägte Samenanlage im Querschnitt.
9.b) Das Staubblatt aus dem Zentrum einer Einzelblüte von MA zeigt im Ansatz der Pollensäcke zwei Samenanlagen und narbenähnliches Gewebe, diese morphologischen Merkmale deuten auf M.
9.c) Der Pollen aus Pollensäcken einer zwittrigen Blüte von MA bildet einen Pollenschlauch.

3.2 Hydathoden und Exsudate der Versuchspflanzen

An Hand der Populus-Chimäre kann die Biosynthese von Balsam (Exsudat) gut untersucht werden. Exsudate werden oft für die Klassifizierung von Pappeln verwendet. Bei der Zuordnung werden artspezifische Begleitelemente zu Hilfe genommen.

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Anhand der Konstitution der Chimäre MA, die bereits als monektoperiklinal bestätigten ist, kann der epidermale Einfluss bei der Exsudatsynthese studiert werden. Durch die genetisch andersartige Epidermis ist eine Kombination der Begleitelemente aus M und A entstanden. Die Sekretion erfolgt sowohl an den Blattspitzen und Blattrandzacken (Abb. 10a) als auch an der dem Spross zugewandten Seite der Knospenschuppen (Abb. 11a). Das Sekret wird durch Hydathoden ausgeschieden. Es sind passive Epithemhydathoden, in denen sich unter den nicht verschließbaren Öffnungen in der Regel ein als Epithem bezeichnetes Gewebe mit tracheidalem Anschluss befindet (Abb. 10b und Abb. 11b). Das Exudat dient unter anderem auch als zusätzliche Barriere für epidermisüberwindende Schaderreger.

3.2.1 Hydathodenarchitektur der Populus-Exemplare

Die Ausscheidung von ätherischen Ölen oder Harzen erfolgt bei den Versuchsexemplaren M, I, A und MA durch spezifische Organe (Hydathoden). Solche Hydathoden befinden sich an Blattspitzen und -randzacken, aber auch an der dem Spross zugewandten Seite von Knospenschuppen. In ihnen befindet sich unter den nicht verschließbaren Öffnungen in der Regel ein als Epithem bezeichnetes Gewebe, das einen tracheidalen Anschluss besitzt. Durch das Epithem wird dem Druck des austretenden Xylemsaftes ein genau angepasster Widerstand entgegengesetzt, der spezifische Bewegungsabläufe wie Streckung, Entfaltung oder Ausrichtung des Blattes ermöglichen kann. Die hisomorphologischen Untersuchungen an Dünnschnitten zeigen, dass palisadenartige Zellen aus der Epidermis gebildet werden, die bei der Bildung von Sekretbegleitelementen von Bedeutung sind.

3.2.2 DC-Vergleich von M-, A- und MA-Bandenmuster aus Knospenexsudat

Auf Dünnschichtchromatographie (DC) -Platten wurde jeweils von M, A und MA Knospensekret aufgetragen. Es entstanden Bandenmuster, die unbestimmte, artspezifische Begleitstoffe in den verschiedenen Sekreten zeigten. Eine Sekretkomponente von M, die nicht beiA nachgewiesen werden konnte, ist in der Chimäre MA wieder zu finden (Abb. 12). Das zeigt, dass durch die Gewebekombination von M und A eine neue Sekretkombination in MA entstanden ist. Der DC-Bandenmuster-Vergleich ist ein weiterer Chimärennachweis für MA.

3.2.3  Penicillium sp.-Pilzbefall als M-Indikator an MA-Knospen

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Die Quelle aller oberirdischen Organe (Sprossscheitel) ist bei der MA-Chimäre mit einer M-Epidermis „überzogen“. Folglich sind die daraus entstehenden Sprosse umhüllt. Epidermen als Abschlussgewebe haben für die Ausprägung bestimmter Resistenzen eine wesentliche Bedeutung. Die Überlagerung von A–Gewebe mit einer M-Epidermis bei MA-Blättern und Knospen eröffnet eine geeignete Plattform für Untersuchungen, die sich auf die entsprechenden Resistenzeigenschaften von M beziehen.

Die experimentelle Ansiedlung von Penicillium sp. auf M-, A- und MA-Knospen und die mangelhafte Ausprägung des Pilzes bei A ist ein weiteres Indiz für die Übertragung von bisher unbestimmten M-Sekretbestandteilen auf A durch die Epidermistransplantation. Die Penicillium sp.-Besiedlung von MA-Knospen wird durch die M-Epidermis möglich (Abb. 13). Das zeigt, dass zwar die Funktion der MA-Hydathoden unbeeinträchtigt bleibt, aber die Sekretsynthese durch die M-Epidermis mitbestimmt wird.

3.2.4 Dokumentation der Hydathoden und Exsudate

Abb. 10: Blattzacke von M-Laubblatt und histologischer Dünnschnitt

10.a) Blattzacke mit Sekrettropfen am Blattrand von einem M-Laubblatt.
10.b) Histologischer Dünnschnitt einer M-Blattzacke.

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Abb. 11: Knospenschuppe von M und histologischer Dünnschnitt

11.a) M-Knospenschuppe mit Zottengewebe (adaxial).
11.b) Dünnschnitt aus einer M-Knospenschuppe mit Zottengewebe.

Abb. 12: Dünnschichtchromatographie (DC) mit Knospensekret von M, A und MA

Für M und A existieren spezifische Bandenmuster. Das Bandenmuster aus MA ist eine Kombination der verschiedenen Muster aus M und A.

Abb. 13: Infektionsversuch mit Knospen von M, A und MA mit Penicillium sp.

Die Knospe von M und MA zeigt einen starken Befall. Bei der Knospe von A ist der Befall nur schwach am Knospenansatz.

3.3 Molekulargenetische Untersuchungen

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Für das schrittweise Vorgehen auf molekulargenetischer Ebene muss als erstes genomische DNA gewonnen werden, die dann in den verschiedenen Variationen (RAPD und spezifisch) der Polymerase Chain Reaction (PCR) verarbeitet wird.

3.3.1 Anwendung der RAPD-PCR für die Unterscheidung zwischen M und A

Die Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) -PCR liefert durch den Einsatz von Zufallsprimern ein Bandenmuster, das aus vervielfältigten Fragmenten von unbestimmten Teilbereichen der gesamtgenomischen DNA besteht. Zur Erzeugung spezifischer Bandenmuster aus M-, A- und MA-Blattmaterial werden gesamtgenomische DNA (5 ng/µl) und der Primer (GGAGTGGACA) zum Einsatz gebracht. Das PCR-Produkt wird auf ein Gel aufgetragen, in dem die amplifizierten DNA-Abschnitte aufgetrennt werden, sodass spezifische Bandenmuster für M und A ermittelt werden können.

Abb. 14: RAPD-PCR-Produkte von M-, A- und MA-DNA aus Blattmaterial

(Agarosegel 1,8%)Die Bandenmuster aus der RAPD-PCR mit dem Primer (GGAGTGGACA) sind für M und A spezifisch. Der Lauf MA zeigt eine Kombination der Bandenmuster aus M und A.

3.3.2 DNA-Extraktion aus RAPD-Banden von M- und A

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Mittels RAPD-PCR wurden spezifische Bandenmuster für M und A ermittelt. Aus den Mustern werden kennzeichnende Banden ausgeschnitten und die DNA aus den Gel-Ausschnitten extrahiert. Als Test für die korrekte Extraktion wird ein Teil des Extraktes neben den RAPD-Bandenmustern auf ein Gel aufgetragen und nach der Elekrophorese die Lage und Konzentration bestimmt. Bei erfolgreicher Extraktion können die Fragmente (FA und FM) aufgereinigt, kloniert und sequenziert werden.

Abb. 15: RAPD-PCR-Produkte aus M-, A- und MA-DNA und die Fragmente FA und FM

Gelelektrophoretische Auftrennung der RAPD-PCR mit M-, A- und MA-DNA zu spezifischen Bandenmustern für M und A (Agarosegel 1,8%). Aus den Bandenmustern wurden kennzeichnende Banden aus dem Gel extrahiert und zum Vergleich mit auf das Gel aufgetragen. Die Läufe FA und FM zeigen die Fragmente aus den Bandenmustern von M und A in einer verwertbaren Konzentration.

3.3.3 Ligation von spezifischen M- und A-Banden und Plasmid

Aus den M- und A-Bandenmustern konnten kennzeichnende DNA-Fragmente (FA und FM) extrahiert werden; die anschließend getestet, bestimmt (Konzentration) und aufgereinigt wurden. Diese Fragmente können - für die Transformation in E. coli – in ein Plasmid (pGEM-T Easy) ligiert werden. Mittels Ligase wird das Fragment (FA oder FM) und das Plasmid verknüpft. Ein Teil des Ligationsproduktes wird auf ein Gel aufgetragen, um den Erfolg zu testen.

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Abb. 16: Ligation aus M- und A-Fragment (FM und FA) mit dem Plasmid pGEM-T Easy

Die Läufe A und M zeigen in der gelelektrophoretischen Auftrennung (Agarosegel 1,8%) jeweils eine Fragmentbande FA (ca. 600bp) oder FM (ca. 1000bp), eine einheitliche Plasmidbande (3015bp) und eine Bande aus Plasmid und Insert. Die schematische Darstellung zeigt das Plasmid (pGEM-T Easy mit 3015bp) und Insert.

3.3.4 Lysis von Plasmid-DNA aus E.coli

Nach Transformation von E. coli-Bakterien mit rekombinanter Plasmid-DNA erfolgte die Identifizierung von rekombinanten Transformanten-Kolonien: (weiß) im Blau/Weiß-Screening. Mit einer sterilen Pipettenspitze wurde ein Teil der Bakterienkolonie auf eine durchnummerierte Masterplatte überführt und der Rest für die Anzucht größerer Mengen über Nacht in 5ml LB mit Antibiotikazusatz 25µg/ml (= 50µl 50mg/ml Ampicillin auf 100ml LB flüssig) bei 37°C kultiviert. Für die Lysis der Plasmide (pGEM-T Easy) wird die Bakteriensuspension (1,5ml) mit 8000 rpm, 3min zentrifugiert und das Pellet getrocknet. Anschließend wird für die Plasmid-DNA-Isolation das Bakterium verdaut. Das Produkt aus der Isolation wird zur Kontrolle auf ein Gel aufgetragen und elektrophoretisch getrennt.

Abb. 17: Lysis-Produkte aus transformanten E. coli mit Plasmid und Insert (FM und FA)

In der gelelektrophoretischen Auftrennung (Agarosegel 1,8%) zeigt der erste Lauf neben der Leiter (LT) das Lysis-Produkt aus einem Klon ohne Insert (o.I). Die Läufe A (1-4) und M (1-4) zeigen jeweils eine Bande, die für M bei ca. 4000bp und für A bei ca. 3600bp liegt. Alle Läufe zeigen eine gemeinsame Bande (>15000bp), die aus chromosomaler Bakterien-DNA stammt.

3.3.5 Test spezifischer Primer aus RAPD-Fragmenten

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Nach Klonierung und Sequenzierung kennzeichnender Banden aus den spezifischen Bandenmustern von M und A konnten aus den M- und A-Sequenzen spezifische Primerpaare (m und a) abgeleitet werden, die in der PCR auf ihre Zuverlässigkeit getestet werden sollen. Dazu wird A-DNA mit a-Primer, A-DNA mit m-Primer, M-DNA mit a-Primer und M-DNA mit m-Primer zum Einsatz gebracht. Außerdem werden die m- und a-Primer mit A- und M-DNA in einer PCR mit Temperaturgradient von 50°- 64° getestet. Die PCR-Produkte werden auf ein Gel aufgetragen und elektrophoretisch getrennt.

Abb. 18: PCR-Produkte mit spezifischen Primern aus FM und FA

Die gelelektrophoretische Auftrennung (Agarosegel 1,8%) zeigt PCR-Produkte aus A-DNA mit a-Primer (Aa), A-DNA mit m-Primer (Am), M-DNA mit a-Primer (Ma) und M-DNA mit m-Primer (Mm).

Abb. 19: PCR-Produkte mit spezifischem Primer aus FM und Temperaturgradient

Die gelelektrophoretische Auftrennung (Agarosegel 1,8%) zeigt Produkte aus PCR mit Temperatur-Gradient von 50°- 64° und A-DNA mit m-Primer (Am) und M-DNA mit m-Primer (Mm).

3.3.6 Amplifizierung der 16S-rDNA von I, M und A

↓47

Die Amplifizierung des 16S-rDNA-Abschnitts aus I, M und A wird mittels geeigneter Primer (16S+/16S-) in der spezifischen PCR durchgeführt.

Abb. 20: 16S-rDNA-PCR-Produkte von I, M und A

Das Agarosegel (1,8%) zeigt in den Läufen I, M und A eine typische Bande im Bereich von ca. 1500bp.

3.3.7 Amplifikation der ITS-Bereiche aus I, M und A

Die Amplifizierung der ITS-Bereiche aus I, M und A wird mittels geeigneter Primerkombination (SSF und 25Srev) in der spezifischen PCR durchgeführt.

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Abb. 21: PCR-Produkte von I, M und A mit spez. ITS-Primern

Die gelelektrophoretische Auftrennung (Agarosegel 1,8%) der PCR-Produkte von I, M und A mit spez. ITS-Primern zeigt zwei Banden mit ca. 650bp und 620bp. Die jeweils größere Bande zeigt eine höhere Konzentration.

3.3.8 Identifikation verschiedener Klone mit ITS-Insert aus I, M und A

Mittels spezifischer PCR konnten ITS-Bereiche für M, A und I amplifiziert werden. Die PCR-Produkte weisen jeweils zwei Banden auf, die sich nur geringfügig in ihrer Größe unterscheiden. Um die Sequenzen für beide Banden zu erhalten, wurden die Amplifikate kloniert. Dazu wurden die PCR-Produkte mittels Plasmid (pGEM-T Easy) in E. coli transformiert. Auf geeignetem Selektionsmedium überlebten nur Klone mit Plasmid, weshalb ein zweiter Selektionsmechanismus (Blau-Weiß-Test) integriert ist, der zeigt, welche Klone ein Plasmid mit Insert enthalten. Selektierte Klone (weiß) wurden dann im Vermehrungsmedium hoch konzentriert. Anschließend konnte anhand von gelelektrophoretische Untersuchungen ermittelt werden, welche Klone ein kurzes oder langes Insert enthalten. Daraus ergab sich die Möglichkeit, Klone nach ihrem Insert zu selektieren.

Abb. 22: Restriktionsverdau mit Eco R1 von Plasmid mit Insert aus Klonen von I, M und A

Gelelektrophoretische Auftrennung (Agarosegel 1,8%) von Plasmid mit Insert aus verschiedenen Klonen von I, M und A nach Restriktionsverdau mit Eco R1. Der Vergleich der Inserts aus den Klonen i1-i4, m1-m4 und a1-a4 zeigt jeweils größere und kleinere Inserts im Bereich zwischen 750bp und 900bp. Die größeren Inserts befinden sich in den Läufen I2, I3, I4, M1, A1, A4 und die kleineren befinden sich in den Läufen I1, M2, M3, M4, A2 und A3.

3.3.9 Selektion verschiedener Klone mit ITS-Insert für I, M und A

↓49

Das Plasmid (pGEM-T Easy) enthält Bindungsstellen für Primer (SP6 und T7), die für Sequenzierungen vorgesehen sind. Mittels dieser Primer kann das Insert aus einem selektierten Klon in der spezifischen PCR amplifiziert und anschließend im Gel kontrolliert werden. Als Template für die PCR wird einerseits gesamtgenomische DNA und andererseits Plasmid mit Instert aus den verschiedenen Klonen; I (i1 und i4), M (m1 und m2) und A (a1 und a3) verwendet. Für die PCR mit der gesamtgenomischen DNA werden die spezifischen Primer SSF und 25S- verwendet. Für die PCR mit Plasmid werden die Primer SP6 und T7 eingesetzt.

Für I, M und A werden jeweils eine Kontrolle aus der PCR mit ITS-Primer, das PCR-Produkt mit kurzem und mit langem Insert auf ein Gel aufgetragen.

Abb. 23: PCR-Produkte aus ITS- und Klon (Insert kurz und lang) spezifischer PCR

Die gelelektrophoretische Auftrennung (Agarosegel 1,8%) der PCR-Produkte aus ITS- und Klon (Insert kurz und lang) spezifischer PCR zeigt in den Läufen I1, M1 und A1 jeweils zwei Banden in der Größenordnung zwischen 620bp und 650bp, die als Template für die Klonierung verwendet wurde. Die Läufe I2, M2 und A2 zeigen jeweils ein PCR-Produkt, in dem ein kurzes Insert aus den Klonen i1, m2 und a3 amplifiziert worden ist. Die Läufe I3, M3 und A3 zeigen jeweils ein PCR Produkt, in dem ein langes Insert aus den Klonen i4, m1 und a1 amplifiziert wurde.

3.3.10 Ableitung molekularer Marker

↓50

Nachdem jeweils für I, M und A zwei verschiedengroße ITS-DNA-Fragmente kloniert wurden, sodass durch anschließende Sequenzierung die jeweiligen Sequenzen vorliegen, sollen Marker für die kleinen und großen Mitglieder der ITS-Genfamilie abgeleitet und getestet werden. Dazu müssen aus M sowohl für die lange als auch für die kurze Sequenz spezifische Primer (lang: ymf und zmr, kurz: xmf und xmr) erstellt werden (Kap. 3.4.5.), die in der PCR mit M-DNA zum Einsatz kommen sollen. Aus den PCR-Produkten soll das Verhältnis der Sequenzen (Mitglieder der Genfamilie) zueinander abgelesen werden. Die Konzentration der einzelnen Amplifikate zeigt, wie viele Kopien der jeweiligen Sequenz in der gesamtgenomischen DNA von M vorhanden sind. Dazu werden die PCR-Produkte auf ein Gel aufgetragen und die Bandenintensität bestimmt. Je höher die Konzentration der Bande ist, je häufiger kommt die Sequenz im Genom vor.

Abb. 24: PCR-Produkte mit spezifischen Primern für M-t, M-f und M-its

Die spezifischen PCR-Produkte wurden mit Primern für den beschnittenen ITS Bereich aus M (M-t), den funktionellen ITS-Bereich aus M (M-f) und für den gesamten ITS-Bereich aus M erzeugt. Das Agarosegel (1,5%) zeigt im Lauf M-t eine sehr schwache Bande mit einer Größe von 434bp. Der Lauf M-f zeigt eine sehr starke Bande mit einer Größe von 406bp. Der Lauf M-t zeigt eine sehr starke Bande mit einer Größe von 659bp.

3.3.11 A-Markertest

Aus den ermittelten ITS-Sequenzen für I, M und A wurden jeweils Primerpaare erstellt, die als molekulare Marker für die entsprechenden Genotypen verwendet werden sollen. Die Zuverlässigkeit der Marker wird getestet, indem z.B. ein Marker für I mit genomischer M- und A-DNA in spezifischer PCR zum Einsatz gebracht wird. Wird dann der I-spezifische ITS-Bereich in der PCR mit M- und A-DNA nicht amplifiziert, und ist das Ergebnis auch unter Verwendung verschiedener DNA-Konzentrationen reproduzierbar, dann kann der I-Marker als zuverlässig angesehen werden.

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Für die Identifizierung des A-Genotyps in den Fruchtknoten von MA-Blüten wird der A-Marker (a) mit M- und MA-DNA getestet. Mittels a-Primerpaar (xaf und xar) wird M-, A- und MA-DNA in spezifischer PCR untersucht. Die PCR-Produkte werden auf ein Gel aufgetragen, das zeigen soll, ob a mit M-, A- und MA-DNA einen DNA-Abschnitt amplifiziert. Um auszuschließen, dass Fehler aufgetreten sind, die die Amplifikation des DNA-Abschittes verhindert haben, wird ein zusätzliches Primerpaar (16s-rDNA) eingesetzt, dass zeigt, dass die Reaktionsbedingungen in Ordnung sind. Anhand der Bandenintensität kann abgelesen werden, ob die Konzentration des Ausgangsmaterials (genomische DNA) gleich ist.

Abb. 25: PCR-Produkte mit spezifischen Primern für A und die 16S-rDNA

Die gelelektrophoretische Auftrennung (Agarosegel 1,5%) der Produkte aus spezifischer PCR mit Primerpaaren für A und für die 16S-rDNA zeigt in den Läufen M, A und MA einheitliche Banden im 1500bp-Bereich (amplifizierte 16S-rDNA). Die Läufe A und MA zeigen zusätzliche Banden im 280bp-Bereich (amplifizierter A-ITS).

3.3.12 Anwendung der Marker aus I und A

Für A wurde ein Marker (a) erstellt (Kap. 3.3.11), der zur Identifizierung des A-Genotyps in MA-Fruchtknoten eingesetzt werden soll. Für den Test wurden aus MA-Blüten Fruchtknoten präpariert, aus den Fruchtknoten DNA extrahiert und die DNA einer PCR mit dem a-Marker und den spezifischen Primern für die 16S-rDNA unterzogen. Mittels 16S-rDNA-Primer kann nachgewiesen werden, dass die Reakionsbedingungen so gestaltet sind, dass DNA-Abschnitte amplifiziert werden können. Für einen erfolgreichen Test muss in jedem Fall eine Bande erscheinen, die für die 16S-rDNA kennzeichnend ist. Das PCR-Produkt wird auf ein Gel aufgetragen und elektrphoretisch analysiert. Erscheint eine zweite Bande, dann ist ein Nachweis erbracht, der zeigt, dass ITS-DNA aus A im Ausgangsmaterial vorhanden ist. Lässt sich ein solches Ergebnis dann noch reproduzieren, dann kann davon ausgegangen werden, dass der A-Genotyp im MA-Fruchtknoten vorhanden ist.

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Abb. 26: PCR-Produkt mit spezifischen Primern für A (a) und für die 16S-rDNA

Die gelelektrophoretische Auftrennung (Agarosegel 1,5%) des PCR-Produktes aus spezifischen Primen für A (a), die 16S-rDNA und DNA aus einem Fruchtknoten einer zwittrigen MA-Blüte zeigt im Lauf MA zwei Banden: Die Obere (ca. 1500bp) entspricht der amplifizierten 16S-rDNA und die Untere (ca. 280bp) dem spezifischen A-ITS-Bereich.

Die Zuverlässigkeit des I-Markers wurde in spezifischer PCR mit genomischer M- und A-DNA getestet. Der I-spezifische ITS-Bereich wurde in der PCR mit M- und A-DNA nicht amplifiziert, er kann also als zuverlässig angesehen werden. Der I-Marker soll eingesetzt werden, um den I-Genotyp in der AI-Chimäre zur identifizieren.

Aus AI-Blattmaterial wurde DNA extrahiert, die in PCR mit dem I-Marker und den spezifischen Primern für die 16S-rDNA eingesetzt werden konnte. Mittels 16S-rDNA-Primer wird gezeigt, dass die Reakionsbedingungen so sind, dass DNA-Abschnitte amplifiziert werden können. Dieser Test muss in jedem Fall eine Bande für die 16S-rDNA aufweisen. Für die Analyse des PCR-Produktes wird es auf ein Gel aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Erscheint die spezifische Bande für I, dann ist ein Nachweis erbracht, der zeigt, dass I-spezifische ITS-DNA im AI-Blattmaterial vorhanden ist.

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Abb. 27: PCR-Produkte aus spezifischen Primern für I (i) und für die 16S-rDNA

Die gelelektrophoretische Auftrennung (Agarosegel 1,5%) der Produkte aus der PCR mit spezifischen Primerpaaren für I (i) und für die 16S-rDNA zeigt in den Läufen I und A einheitliche Banden in einer Größe von ca. 1500bp (amplifizierte 16S rDNA). Der Lauf I zeigt eine zusätzliche Bande in einer Größe von ca. 400bp (amplifizierter ITS Bereich, spezifisch für I).

3.4 Sequenzvergleiche

3.4.1 A-Sequenz (RAPD-Bande)

Einzelne Banden wurden aus RAPD-Bandenmustern ausgeschnitten, die DNA aus dem Gel extrahiert, in E. coli kloniert und sequenziert.

Abb. 28: Sequenz der Fragmentbande (FA) aus RAPD-Bande A

3.4.2 M-Sequenz (RAPD-Bande)

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Abb. 29: Sequenz der Fragmentbande (FM) aus RAPD-Bande M

3.4.3 Sequenzvergleich (M-Bande) zwischen A und M

Abb. 30: Sequenzvergleich (M-Bande) zwischen A und M

Aus einem M-Bandenmuster wurde eine spezifische Bande extrahiert, kloniert und sequenziert. Aus der Sequenz wurde ein spezifisches Primerpaar (m) abgeleitet und mit A, und M-DNA getestet. Aus beiden Genotypen wurden identische DNA-Abschnitte amplifiziert. Die A-Sequenz wurde ermittelt und mit M verglichen. Die Sequenzen sind absolut identisch.

3.4.4 16S-rDNA-Vergleich verschiedener Familien mit I, M und A

16S-rDNA Sequenzen konnten in der Genbank (NCBI/EMBL) für die Arten Arabidopsis thaliana, Zea mays, Nicotiana tabacum, Ricinus communis und Glycine max ausfindig gemacht und mit den ermittelten 16S-rDNA Sequenzen für I,M und A verglichen werden. Aus den gesammelten Sequenzen wurde ein Phylogramm erstellt, das zeigen soll, dass die ermittelten Sequenzen ein Format aufweisen, das den vorhandenen Sequenzen in der Genbank entspricht.

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Tabelle 3: Abkürzungen und Nummern für 16S-rDNA-Sequenzen

Abkürzung

Gattung und Artname (ermittelte Sequenzen)

Basen

I

Populus nigra L. ’Italica’ (I)

1395

M

Populus x canadensis ’Marilandica’ (M)

1395

A

Populus maximowicii x P. trichocarpa ’Androscoggin’ (A)

1395

(EMBL) Nr.

16S-Sequenzen aus der Genbank EMBL

AP000423

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis)

1395

Z00044

Nicotiana tabacum (Tabacco)

1394

L37580

Ricinus communis (Ricinus)

1395

X06428

Glycine max (Soybean)

1375

Outgroup

M19943

Zea mays (Maize)

1395

Die Tabelle zeigt die Abkürzungen der ermittelten Sequenzen, die Nummern von entnommenen 16S-rDNA-Sequenzen aus der Genbank (EMBL), die Artnamen und die Basenanzahl

Abb. 31: 16S-Phylogramm

Für die Erstellung des Phylogramms wurden neben den ermittelten 16S-rDNA-Sequenzen aus I, M und A auch 16S-rDNA-Sequenzen von verschiedenen Arten aus der Genbank (EMBL / NCBI) verwendet.

3.4.5 Gegenüberstellung von verschiedenen ITS-Bereichen aus M

Abb. 32: ITS-Schema

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Abb. 33: Sequenzvergleich zwischen M-f und M-t

3.4.6 Vergleich von ITS-Regionen aus Salicaceae-Arten mit I, M und A

Tabelle 4: Abkürzungen und Nummern für ITS-Sequenzen

Abkürzung

Gattung und Artname (ermittelte ITS-Sequenzen)

Basen

I-f

Populus nigra L. ’Italica’

634 bp

I-t

Populus nigra L. ’Italica’

594 bp

M-f

Populus x canadensis ’Marilandica’

634 bp

M-t

Populus x canadensis ’Marilandica’

593 bp

A-f

Populus maximowicii x P. trichocarpa ’Androscoggin’

635 bp

A-t

Populus maximowicii x P. trichocarpa ’Androscoggin’

596 bp

(EMBL) Nr.

Gattung und Artname

AF174629

Populus deltoides (1)

635 bp

AJ006440

Populus trichocarpa

632 bp

AJ006438

Populus deltoides (2)

632 bp

AJ006439

Populus lasiocarpa

632 bp

AJ006437

Populus alba

633 bp

X64764

Populus deltoides (3)

624 bp

AJ006431

Salix retusa

635 bp

AJ006430

Salix purpurea

635 bp

AJ006428

Salix herbacea

635 bp

AJ006425

Salix dasyclados

635 bp

AJ006426

Salix exigua

634 bp

AJ006435

Salix viminalis

635 bp

AJ006433

Salix schwerinii

635 bp

AJ006432

Salix serpyllifolia

635 bp

AB096873

Salix reinii genes

635 bp

AJ006434

Salix triandra

635 bp

AJ006429

Salix pentandra

635 bp

AJ006427

Salix fragilis

634 bp

AJ006424

Salix amygdaloides

635 bp

AJ006423

Salix alba

634 bp

Outgroup

AY093548

Pisidium adamsi(Erbsenmuschel)

653 bp

Die Tabelle zeigt die Abkürzungen der ermittelten ITS-Sequenzen, die Nummern von entnommenen ITS-Sequenzen aus der Genbank (EMBL), die Artnamen und die Basenanzahl

Abb. 34: ITS-Phylogramm aus ermittelten und entnommenen (Genbank) ITS-Sequenzen

Für die Erstellung des Phylogramms wurden neben den ermittelten Sequenzen zwischen 18S und 25S aus I, M und A alle verfügbaren ITS-Sequenzen von den Gattungen Populus und Salix (Salicaceae) aus der Genbank (EMBL) entnommen.


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24.10.2005