4 Diskussion

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Eine gewisse Vererbungslabilität - in Bezug auf die Inseration der Geschlechtsorgane - ist bei einigen Arten und/oder Hybriden aus Populus seit langem bekannt (LESTER, 1963). Dabei sind einschließlich androdiözische, gynodiözische und subdiözische Blütenstände beobachtet worden, die an verschiedenen Standorten und demzufolge unter extrem abweichenden Umweltbedingungen erscheinen. Die Ausprägung zweigeschlechtlicher Blüten sowohl in männlichen als auch in weiblichen Kätzchen wird mit dem im Genom programmierten Prozess der Geschlechtsdifferenzierung in Verbindung gebracht, der allerdings auch durch Umwelteinflüsse stimuliert werden kann (STETTLER, 1971, ROTTENBERG et al., 2000). Analysen zur genetischen Grundlage der Geschlechterdetermination haben gezeigt, dass Geschlechtschromosomen in Blütenpflanzen relativ selten sind (AINSWORTH, 2000). Determinierende Prozesse für die Geschlechtsausprägung haben sich unabhängig voneinander entwickelt, obgleich viele Gemeinsamkeiten anzunehmen sind (AINSWORTH et al., 1999). Verschiedene Bereiche von Chromosomen, die zur Inseration der Geschlechter beitragen, sind auch für ein bestimmtes Hormonverhältnis - wie zum Beispiel zwischen Auxin und Cytokinin verantwortlich. Es ist möglich, dass das Geschlecht einiger Pflanzen durch modifikative Wirkungen auf den Hormonhaushalt zustande kommt und so Umwelteinflüsse geltend gemacht werden.

Einflüsse genetisch fremder Gewebe bei der Organmorphogenese, wie zum Beispiel bei Blattknospen, wurden an MA von VOIGTSBERGER (1993) beschrieben. Ihm gelang der erste MA-Chimärennachweis durch die Regeneration von Adventivwurzeln (BATESON, 1916, 1926), woraus er die A-Komponente aus MA entmischte. Außerdem konnten auch Laubblattsektoren beobachtet werden, aus denen auf Epidermisreduplikationen und –perforationen geschlossen werden kann. Anhand der Entmischungskriterien entstand auf histomorphologischer Ebene ein zusätzlicher Beweis dafür, dass die M-Epidermis als Abschlussgewebe über dem A-Mesophyll liegt und demzufolge der MA-Sprossscheitel einer Periklinal-Chimäre mit Monekto-Konstitution entspricht (POHLHEIM et al., 2004a).

1999 wurden an MA erstmalig Blütenstände (Kätzchen) beobachtet. Vergleichende Untersuchungen auf morphologischer Ebene von A- und MA-Blüten zeigten, dass in den MA-Blüten keine Beeinflussung von M auf A stattgefunden hat. 2000 wurden an MA-Kätzchen erstmals Blüten festgestellt, die zusätzlich einen Fruchtknoten enthielten, sodass sich auch die Geschlechterdetermination anhand von Sexual-Chimären studieren lässt (WINKLER, 1907). Die von uns untersuchten Geschlechtsorgane aus den zwittrigen Blüten von MA sind durch individuelle Merkmale voneinander unterscheidbar; eine Zuordnung des Fruchtknotens kann ursächlich nicht auf histomorphologischer Ebene stattfinden, wenn auch die Beteiligung des M-Genoms diskutiert wird. Vereinzelt treten auch Antheren auf, die sich aufgrund eines Defektes in der Organogenese als petaloide Stamen etablieren. Aus diesen Beobachtungen heraus kann auf eine Ähnlichkeit zu den spontan auftretenden zweigeschlechtlichen Blüten bei Populus hingewiesen werden. Histomorphologische Untersuchungen zur Definition der einzelnen Entwicklungsstadien in der Blütenformation, Studien zur räumlichen und zeitlichen Gewebeverteilung und die Identifizierung beteiligter Genotypen in chimärischen Organen schafften das Fundament für einen Versuchsaufbau, dessen Zielstellung es sein soll, die Mechanismen zu studieren, die sowohl bei MA als auch in anderen Arten oder Hybriden aus Populus bei der Inseration von zweigeschlechtlichen Blüten wirksam sind.

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Dabei stehen sich zwei wesentliche Prozesse gegenüber. Auf der einen Seite besteht die Möglichkeit, dass durch eine Chimärenwechselwirkung zwischen den beiden verschiedengeschlechtlichen Ausgangseltern M und A eine induktive Wirkung von M auf A stattgefunden hat, sodass in einigen Blüten von MA ein Fruchtknoten inseriert ist, der außer der M-Epidermis auch aus A-Gewebe besteht. Auf der anderen Seite kann es aber auch sein, dass die zwittrigen Blüten durch Chimärenentmischung entstanden sind. In diesem Fall würde durch Reduplikation der Epidermis ein Sektor entstanden sein, der aus M-Gewebe gebildet wird und aus dem dann ein Fruchtknoten entstanden ist, der ausschließlich aus M-Gewebe besteht. In beiden Fällen ist die Identifizierung der Genotypen M und A in Staub– und Fruchtblättern notwendig.

4.1 Histologische Charakterisierung der Blütenformation

Viele Studien über genetische Mechanismen bei der Blütenbildung an Angiospermen zeigen, dass die Determinierung von Blütenorganen allgemein konserviert ist. Als erstes wurden sie in Arabidopsis und Antirrhinum ausfindig gemacht und als ABC-Modell der Blütenentwicklung formuliert (COEN und MEYEROWITZ, 1991). In diesem Modell wirken drei Gen-Klassen (A, B und C) sowohl selbstständig als auch in Kombination zueinander, um die vier Organtypen in einer Blüte zu etablieren. Anhand von Studien, die die Blütenentwicklung am Beispiel Petunia hybridia (Linie W115) und ihren transgenen Pflanzen umfassen, wurde gezeigt, dass das MADS-Box-Gen floral binding protein 11 (FBP11) ausschließlich in den Primordien der Eizellen also in den Samenanlagen expremiert wird. Transgene W115-Pflanzen, die ein chimärisches Genkonstrukt aus dem rekombinanten FBP11-Gen und dem 35S-Promotor enthielten, zeigten Strukturen, die auf der adaxialen Seite von Sepalen und auf der abaxialen Seite von Petalen Samenanlagen vermuten ließen. Morphologische Studien dieser Strukturen erbrachten den Nachweis, dass es sich um richtige Samenanlagen handelte. RNA-Gelblot-Analysen zeigten, dass FBP11 ein Identitätsgen für Samenanlagen repräsentiert. Aus diesem Zusammenhang heraus wurde geschlussfolgert, dass ein Wirtel für die Samenanlagen existiert (Wirtel 4B) der unter der Kontrolle eines weiteren MADS-Box-Gens (FBP11) steht, das einer weiteren Gen-Klasse (D) zugeordnet wurde. Letztendlich wurde für die Petunie das ABC-Modell zum ABCD-Modell erweitert, sodass die spezifizierten Identitätsfunktionen der Sepalen, Petalen Stamen, Karpelle und der Samenanlagen beschrieben werden können (COLOMBO et al., 1995, THEISSEN, 2001). Einen derzeitigen Überblick über weitere Gen-Klassen, die an der Genetik der Blütenentwicklung beteiligt sind, zeigen THEISSEN und SAEDLER (1999), und wie sie sich im Verlauf der Evolution von Angio- und Gymnospermen entwickelt haben, zeigen NAM et al., (2003).

Aus einer Studie an Populus trichocarpa Torr. geht hervor, dass Gene vorhanden sind, die mit großer Übereinstimmung der C-Aktivität zugeordnet werden können. Allerdings wird deutlich, dass die Produkte dieser Gene (PTAG1 und PTAG2) nicht direkt in der Entwicklungphase der Geschlechterdifferenzierung nachgewiesen werden können. Vielmehr wird gezeigt, dass beide Genprodukte auch in vegetativem Pflanzenmaterial nachweisbar sind, obgleich in einer wesentlich geringeren Konzentration (BRUNNER et al., 2000). Diese Gegenüberstellung zeigt, dass unterschiedliche Expressionsmuster vorherrschend sind, die, wie auch Hormonkonzentrationen und/oder –kombinationen bei der Organogenese regulierend wirken, über die Anzahl von Gen-Kopien bestimmte Effekte erzielen. Sind diese Expressionsmuster bei Genotypen mit labilem Vererbungsmuster über Umweltfaktoren beeinflussbar, dann kann davon ausgegangen werden, dass ein entsprechendes Umfeld dafür verantwortlich gemacht werden kann, welche Eigenschaften an einem Individuum ausgeprägt werden. Es ist also für MA nicht nur wichtig, die Genotypen und ihre Gewebemerkmale zu identifizieren, sondern genauso auch von Bedeutung, den Verlauf der Eigenschaften über Jahre mit unterschiedlichen Umweltfaktoren zu beobachten.

4.1.1 Organogenese in unmodifizierten Populus-Blüten

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Die Gattung Populus beinhaltet überwiegend diözische Arten, deren Blüten stark vereinfacht sind. Sie bestehen nur aus einem Perianth (Blütenbecher), das aus dem äußeren Wirtel gebildet wird und entweder den Stamen oder den Karpellen, die aus dem inneren Wirtel entstehen. Die Homologie zwischen Perianth, Sepalen und Petalen ist bisher noch unbestimmt. Allerdings gelten die reduzierten Pappelblüten als hoch entwickelt, da sie von Vorfahren abgeleitet werden, die auf typisch dicotyle Blüten mit vier Wirteln zurückzuführen sind (EICHLER, 1875-78, GRAF, 1921, SOLTIS et al., 1999). Aus dieser Tatsache heraus kann eine Parallele gezogen werden, die zu den zweigeschlechtlichen Blüten an einigen Populus-Arten führt.

Aus früheren morphologischen Befunden an Blüten zwittriger Kätzchen (SEITZ, 1953) und normalen Populus-Blüten (GRAF, 1921) kann geschlussfolgert werden, dass die Anzahl der fertilen Blütenorgane variiert. Die Untersuchungen an den Populus-Hybriden A und M bestätigen diese Ergebnisse. Es zeigten sich Schwankungen in der Anzahl der Antheren von A, die zwischen 10 bis 25 liegen - einerseits. Andererseits wurde bei Zählungen der Samenanlagen in einem Fruchtknoten eine variierende Anzahl zwischen 15 und 25 ermittelt.

4.1.2 Abweichende Organogenese in einigen Blüten von MA

Die histomorphologische Charakterisierung der zweigeschlechtlichen Blüten aus MA sollte die morphologischen Abweichungen der karpelloiden Stamen, aber auch die inserierten Fruchtknoten in ihren Ausmaßen ermitteln, um einen näheren Anhaltspunkt zu gewinnen, in welcher Form die Heterohistontenbildung in den Prozess der Blütenformation eingreift. Ausgehend von bereits vorhandenen Ergebnissen, die aus zahlreichen Untersuchungen an zwittrigen Populus-Blüten gewonnen wurden (VELENOVSKY, 1904, HASTINGS, 1918, SEITZ, 1952, 1953, SCHLENKER, 1953, SAUER, 1954), sollten die histomorphologischen Untersuchungen einen Vergleich bilden, der zeigt, inwiefern spontane und induzierte Zwittrigkeit unterscheidbar sind. Es kann gezeigt werden, dass der inserierte Fruchtknoten in einigen MA-Blüten Samenanlagen enthält, die das gleiche Erscheinungsbild wie normale Fruchtknoten bei M aufweisen – einerseits - und andere zwittrige Populus-Blüten – andererseits (VELENOVSKY, 1904, HASTINGS, 1918, SEITS, 1953). Anhand der histomorphologischen Untersuchungen konnte nicht festgestellt werden, ob MA-Fruchtknoten A-Gewebe enthalten. Eine Vermutung, dass A-Gewebe vorhanden ist entsteht nicht zuletzt aus der Tatsache heraus, dass karpelloide Stamen, aber auch stamenoide Karpelle gefunden wurden. Sie zeigen deutlich, dass in einem fertilen Blütenorgan Gewebe aus beiden Genotypen vorhanden sein können (Abb. 9b). Um die Frage, ob auch Blütenorgane ohne Missbildungen aus Geweben beider Genotypen gebildet werden, zu beantworten, wurden molekulargenetische Methoden zur Anwendung gebracht. Es wurden molekulare Marker erstellt, mit deren Hilfe es möglich ist, den A-Genotyp in MA-Fruchtknoten zu identifizieren.

4.2 Entwicklung molekularer Marker

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Ein vergleichbares Beispiel an mit rol-C transformierten Populus-Arten zeigt, dass mittels molekulargenetischer Analysen der Erfolg der Transformation durch den Nachweis von rol-C im Blattmaterial bestätigt werden konnte (FLADUNG et al., 1997). Beim Vergleich morphologischer Erscheinungsbilder konnte an einigen Blattsektoren gezeigt werden, dass einige transformierte Sprosse nur in der Epidermis das rol-C Gen enthalten, während in den übrigen Schichten rol-C nicht vorhanden oder denaturiert ist (FLADUNG und AHUJA, 1997). So wird deutlich, dass morphologische Kriterien oft nicht ausreichen, die Chimärennatur von Sprossen oder Sprossteilen zu bestätigen. Hierfür müssen aus DNA-Abschnitten molekulare Marker abgeleitet werden, in denen sich die Versuchsexemplare voneinander unterscheiden (SUGAWARA et al., 1995).

4.2.1 RAPD-PCR basierte Marker

Aufgrund der Verschiedengeschlechtlichkeit von M und A wurde - für den Nachweis dieser Genotypen in MA - die Erstellung geschlechtsspezifischer Marker in Betracht gezogen. Aus verschiedenen Züchtungsprogrammen mit diözischem Ausgangsmaterial wird berichtet, dass für die frühzeitige Selektion geschlechtspezifische Marker verwendet werden, die auf der RAPD-PCR basieren. Jedoch nicht bei allen Gattungen zeigten sich solche Erfolge, wie sie bei Cannabis sativa (SAKAMOTO et al., 1995), Silene latifolia (MULCAHY et al., 1992, DI STILIO et al.,1998, ZHANG et al., 1998), Pistacia vera L. (HORMAZA et al., 1994), Piper longum (BANNERJEE et al.,1999), Aspargus officinalis L. (JIANG und SINK, 1997), Actinidia chinensis (HARVEY et al., 1997), Hippophae rhamnoides (PERSSON und NYBOM, 1998), Salix viminalis (ALSTROM-RAPAPORT et al., 1998) und Atriplex garrettii (RUAS et al., 1998) verzeichnet werden konnten. Einige Beispiele aus der Gattung Populus erwiesen sich als besonders problematisch (MCLETCHIE und TUSKAN, 1994). Oft sind geschlechtsspezifische Marker mit Männlichkeit verbunden. Bei einigen Beispielen, in denen ein Geschlechtschromosomsystem existiert, wird der markierende Bereich auf der DNA mit der Heterogenität von Männlichkeit assoziiert (AINSWORTH, 2000). Diözisten, bei denen geschlechtsspezifische Marker erstellt werden konnten, basieren auf zwei Möglichkeiten; entweder sind Geschlechtschromosomen existent, aber noch nicht auf zytologischem Wege nachgewiesen, oder der Marker bindet an ein Gen, das mit der Geschlechterdetermination in Verbindung steht. Marker, die mit Weiblichkeit in Verbindung stehen; sind entweder mit einem Gen assoziiert, das für die Ausprägung weiblicher Geschlechtsorgane verantwortlich ist, oder sind ein Indikator für eine Sequenz, die von einem männlichen Elter auf dem X-Chromosom lokalisiert ist.

Abgesehen von RAPD-basierten, geschlechtsspezifischen Markern sind verschiedene Bandenmuster aus Populus-Populationen bekannt (BUCCI und MENOZZI, 1993), sodass sich die genetische Variabilität zwischen den Arten; P. trichocarpa (SIGURDSSON et al., 1995) sowie P. euphratica (SAITO et al., 2002), P. adenopoda, P. alba (YIN et al., 2001) und den Hybriden aus P. x canadensis (RAJORA und RAHMAN, 2003) nachweisen lässt. RAPD-basierte Nachweise von Chimären werden aus den Gattungen Citrus (SUGAWARA et al., 1995, ZHOU et al., 2002) und Chrysanthemum (SHIBATA et al., 1998) demonstriert. Die Untersuchungen unterstützen diese Ergebnisse, indem für M und A (aus Blattmaterial) spezifische Bandenmuster erzeugt wurden, die kombiniert im Blattmaterial von MA erscheinen. Daraus kann geschlussfolgert werden, dass die MA-Blätter sowohl von M- als auch von A-Gewebe gebildet werden (HANSEN et al., 2004). Dieser zusätzliche Chimärennachweis zeigt, dass die RAPD-PCR geeignet ist, verschiedene Genotypen in einem gemeinsamen Phänotyp zu identifizieren (SUGAWARA et al., 1995, SHIBATA et al., 1998, ZHOU et al., 2002, HANSEN et al., 2004).

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Zusätzliche Banden, wie sie von ZHOU et al. (2002) beobachtet und als Beeinflussung auf genetischer Ebene interpretiert wurden, traten auch bei Kreuzungsversuchen in F1-Nachkommenschaften – einerseits und andererseits bei Vergleichen von Bandenmustern aus Freiland- und Gewebekulturen der Kartoffel auf (ISENEGGER et al., 2003). Sie werden im allgemeinen darauf zurückgeführt; dass durch Rekombination der DNA neue Bindungsstellen für die verwendeten Primer entstanden sind, dass eine Konkurrenz zwischen Bindungsstellen und Primern vorherrschend ist und dass eine Amplifikation eines DNA-Abschnittes stattfand, obwohl der Primer nicht vollständig gebunden hat (PILLAY und KENNY, 1996). Bei vergleichenden Untersuchungen von Kartoffelbandenmustern wurde festgestellt, dass die zusätzliche Bande ihren Ursprung durch eine Infektion des Bakteriums Bacillus pumilus hat (ISENEGGER et al., 2003).

Abweichende Banden in spezifischen Bandenmustern können auch entstehen, indem Schwankungen beim Einsatz der DNA-Menge auftreten. Aus diesem Grund müssen unbedingt die Reaktionsbedingungen übereinstimmen, mit denen ein bestimmtes Bandenmuster erzeugt worden ist. Allerdings sind nur in wenigen Ausnahmefällen Laborbedingungen identisch, weshalb die Reproduzierbarkeit von RAPD-Ergebnissen in verschiedenen Labors fragwürdig ist. Auch bei Untersuchungen von Organen aus chimärischen Sprossen liefert die DNA-Extraktion kein homogenes Ausgangsmaterial, wenn es um den Einsatz gleicher DNA-Mengen aus beiden Chimäreneltern geht. Um zuverlässige und übertragbare Ergebnisse zu erhalten, die mit der RAPD-Methode assoziiert sind, ist es vorteilhaft; aus spezifischen Bandenmustern im Gel (wie zum Beispiel von Ausgangseltern) kennzeichnende DNA-Fragmente zu isolieren, in Escherichia coli zu transformieren, zu klonieren und anschließend zu sequenzieren. Aus den Sequenzen können dann spezifische Primerpaare abgeleitet werden (SCAR-Marker), die unter spezifischen PCR-Bedingungen auf ihre Zuverlässigkeit als Marker getestet werden können (NKONGOLO et al., 2002). Als Beispiel kann der bereits erwähnte Vergleich von Kartoffelbandenmustern gelten, wo nach Klonierung und Sequenzierung der zusätzlichen Bande festgestellt wurde, dass die ermittelte Sequenz aus einer Infektion des Pflanzenmaterials mit Bacillus pumilus stammt (ISENEGGER et al., 2003). Im MA-Versuchsbeispiel haben die SCAR-Marker aus den M- und A-Sequenzen diese Tests nicht bestanden. Wenn auch die M- und A-Marker nur im geringen Umfang mit genomischer A- und M-DNA eine Bande erzeugten, so ist doch die Zuverlässigkeit dieser Marker infrage gestellt. In gleicher Weise ist es ratsam, bei RAPD-Bandenmustern, die bei verschiedenen Anwendungen in der Kombination zusätzliche Banden aufweisen, eine Klonierung dieser Banden vorzunehmen, damit eine Sequenz ermittelt werden kann, aus der sich spezifische Primer (SCAR-Marker) ableiten lassen. Erzeugen diese SCAR-Marker bei der Verwendung unter spezifischen PCR-Bedingungen und mit der genomischen DNA der Ausgangseltern kein Produkt, dann lassen sich daraus detaillierte Aussagen ableiten, die als Bestätigung gelten können, dass Unterschiede zwischen den Ausgangseltern und ihrer Chimäre auf genotypischer Ebene vorhanden sind.

4.2.2 Sequence Characterised Amplified Region (SCAR-) Marker

Unter Verwendung spezifischer Primer, die aus hochgradig konservierten DNA-Sequenzen abgeleitet sind, konnten DNA-Regionen amplifiziert werden, die heterogene, artspezifische Bereiche enthalten. Bei den Untersuchungen wurden eine Region im Plastom (16S-rDNA) und die ribosomalen RNA-Gene mit ihren Internal Transcribed Spacer (ITS-) Regionen im Genom getestet.

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Mittels spezifischer 16S-rDNA-Primer (NICKRENT et al., 1997 a) konnte dieser Bereich amplifiziert und anschließend direkt sequenziert werden. Signifikante Sequenzunterschiede zwischen M und A sind auf diese Weise nicht auffindbar. Während die Anzahl der 16S-rDNA-Basen für I, M und A identisch ist, zeigt die I-Basenabfolge - im Vergleich zu M und A – auch nur geringe Unterschiede, die für die Ableitung von SCAR-Markern nicht ausreichend sind. Für den weiteren Verlauf der Untersuchungen wurde auf Bereiche des Genoms (ITS-Regionen) zugegriffen.

Zwischen den ITS-Regionen; 18- und 5,8S (ITS1), 5,8- und 25S (ITS2) liegen heterogene, artspezifische Bereiche (CAMPBELL et al., 1995, DOWNIE und KATZ- DOWNIE, 1995), die für die verschiedenen Populus-Arten; P. alba (AJ006437), P. deltoides (AJ006438), P. deltoides (X64764) (D'OVIDIO, 1992), P. lasiocarpa (AJ006439) und P. trichocarpa (AJ006440) Unterschiede zeigen. Mittels Primer, die für die Amplifikation der ITS-Region (KOLLIPARA et al., 1997) in der spezifischen PCR für I, M und A verwendet wurden, konnten PCR-Produkte erzeugt werden, die durch elektrophoretische Untersuchungen im Gel zeigten, dass jeweils zwei Banden vorhanden sind, die sich nur geringfügig in ihrer Größe unterscheiden. Um für I, M und A aus beiden Banden die Sequenzen zu gewinnen, oder überhaupt eine Sequenzierung zu ermöglichen, wurden die Amplifikate in E. coli transformiert und kloniert. Anschließend konnten dann Klone mit verschiedengroßen Inserts selektiert und sequenziert werden. Aus den Sequenzen von I, M und A wurden neben den funktionellen (f) ITS-Bereichen auch verkürzte (truncated = t) ausfindig gemacht. Die t-Sequenzen zeigen Deletionen von ca. 40 bp. Aus den heterogenen Bereichen konnten bisher für A und I Primer abgeleitet werden, die für die Unterscheidung dieser Genotypen auf molekulargenetischer Ebene geeignet sind (HANSEN und POHLHEIM, 2004).

4.2.3 Extensive ITS-Variation bei Hybriden

„Die für die 18S-, 5,8S- und 25S-rRNA-kodierenden Gene (rDNA)“, so steht es bei HEMLEBEN (1990), „können bei vielen Pflanzen einen enorm hohen Anteil am Gesamtgenom ausmachen, z.B. bis zu 10% bei Cucurbitaceen“. Weiter heißt es: „Die Anzahl der ribosomalen RNA-Gene ist sehr unterschiedlich sowohl bei Arten einer Familie, wie auch schon bei Varietäten einer Art“. Zwischen den rRNA-Sequenzen 18S und 5,8S liegt ITS1 und zwischen 5,8S und 25S liegt ITS2 (HEMLEBEN, 1990, COOPER, 2000). Das menschliche Genom, z.B., enthält ca. 200 Kopien dieses Gens (COOPER, 2000). Bei P. deltoides wird die Kopienzahl bis auf 2000 geschätzt (D'OVIDIO et al., 1991). Restriktionsenzymkartierungen der ribosomalen Geneinheiten, die im Genom tandemartig angeordnet sind, haben ergeben, dass diese Repeats bei verschiedenen Pflanzen unterschiedlich lang sein können und dass nach Hybridisierung zweier Arten beide elterlichen ITS-Sequenzen in der F1-Generation vorhanden sein können (SANG et al., 1995, SOLTIS and SOLTIS, 2000, HANDA et al., 2003). Als eindeutiges Beispiel soll ein Versuch dargestellt werden, wo durch die Hybridisierung von Menziesia multiflora mit einigen Arten aus der Gattung Rhododendron interspezifische Hybriden der Ericaceae-Familie entstanden, in denen die elterlichen ITS-Regionen nachgewiesen werden konnten. Zu diesem Zweck wurden mittels PCR sowohl aus den Eltern als auch von den Sämlingen die ITS-Regionen amplifiziert und anschließend die PCR-Produkte mit Restriktionsenzymen, die spezifisch für die Ausgangseltern sind, verdaut. Für die Eltern konnten Bandenmuster ermittelt werden, die bei den Sämlingen in kombinierter Form vorlagen (HANDA et al., 2003).

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Für die Interpretation der Ergebnisse ist ein weiteres Phänomen von besonderer Bedeutung. Wie die Literatur für verschiedene Gattungen bekannt gibt (HEMLEBEN, 1990, HARTMANN et al., 2001) zeigt auch der Populus-Versuch (Kap. 3.3.7), dass die tandemartig angeordneten ITS-Repeats innerhalb eines Genoms nicht immer einheitlich lang sind. Sie weisen sowohl unterschiedliche Kopienzahlen als auch Sequenzheterogenitäten auf, die artspezifisch sind. An dieser Stelle ist ein weiteres Beispiel aus der Literatur geeignet, um die ermittelten ITS-Sequenzen einzuordnen. Aus verschiedenen Individuen einer Lophocereus-Population wurden die ITS-Regionen amplifiziert. Die Verwendung von spezifischen ITS-Primern zeigte, dass ein ITS-Operon vorhanden ist, das für ein Pseudogen codierend ist (truncated=t) und in einer sehr geringen Kopienzahl vorkommt – einerseits und andererseits ein ITS-Operon amplifiziert wird, das eine höhere Anzahl Basen hat und mit einer höheren Kopiezahl im Gesamtgenom vorliegt (functional=f). Die Möglichkeit einer Infektion wird in diesem Versuch aus zwei Gründen ausgeschlossen. Erstens wurde das Gewebe aus einer noch geschlossenen Knospe entnommen und zweitens zeigten Sequenzvergleiche mit der Genbank kein signifikantes Ergebnis. Vielmehr konnte festgestellt werden, dass die t-Sequenz der f-Sequenz ähnelt (HARTMANN et al., 2001). Diese Ergebnisse zeigen ein Erscheinungsbild, das mit dem Versuch, der im Kap. 3.4.5. dargestellt wird, identisch ist. Aus der Gegenüberstellung von ITS-Sequenzen aus der Gattung Salix in einem ITS-Phylogramm (Kap. 3.4.6., Abb. 34) wird deutlich, dass die f-ITS-Sequenzen von I, M und A mit anderen Populus-ITS-Sequenzen aus der Genbank (NCBI/EMBL) vergleichbar sind. Es ist aber auch zu erkennen, dass die jeweils t-Sequenzen von I, M und A nicht unbedingt genotypisch den f-ITS-Sequenzen entsprechen, obgleich deutlich wird, dass sie der Populus-Gattung zugehörig sind.

Zusammenfassend kann über die Existenz von ITS-Regionen von verschiedenen Beispielen aus unterschiedlichen Familien gesagt werden, dass es eine gewisse Heterogenität sowohl innerhalb von f-Sequenzen als auch zwischen f- und t-Sequenzen gibt. Daraus lässt sich ableiten, dass ITS-Sequenzen einer Art nicht ohne Einschränkungen für die Erstellung spezifischer Primer geeignet sind. Vielmehr ist es wichtig, auf diese Weise gewonnene Primerpaare auf ihre Zuverlässigkeit als Marker mehrfach zu testen. So konnten in diesem Beispiel für I und A ITS-Marker ausfindig gemacht werden, die sich in solchen Testreihen bewährt haben. Jedoch ist es bisher noch nicht gelungen, einen ITS-basierten M-Marker zu erstellen. Aus diesem Zusammenhang heraus lässt sich die Heterogenität der M-ITS-Sequenzen ableiten.

4.2.4 Verwendung der molekularen Marker für A und I

Basierend auf den ITS-Bereichen von A und I konnten Primer abgeleitet werden, die für die entsprechenden Genotypen spezifisch sind. Dabei muss unbedingt berücksichtigt werden, dass diese Aussage nur im Rahmen der untersuchten Populus-Chimären (MA und AI) Gültigkeit hat. Eine zuverlässige Anwendung auf andere Populus-Arten wurde bisher noch nicht getestet und kann deshalb nicht garantiert werden.

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Anhand des A-Markers (a) konnte gezeigt werden, dass die MA-Fruchtknoten den A-Genotyp enthalten. Zu diesem Zweck wurden mehrfach Fruchtknoten aus MA-Blüten präpariert, aus denen dann DNA extrahiert werden konnte, die in spezifischer PCR mit a eine Bande zeigte. Daraus lässt sich schließen, dass die M-Epidermis in einigen MA-Blüten die Fähigkeit besitzt, das A-Mesophyll zur Bildung eines Fruchtknotens anzuregen.

Durch die Erstellung der A- und I-Marker können Versuche mit der AI-Chimäre angestellt werden, in denen die Genotypen A und I in verschiedenen Organen identifiziert werden können. Als Beispiel wäre es möglich, den BATESON-Test auf molekulargenetischer Ebene durchzuführen. Zu diesem Zweck ist es nur noch nötig, aus den Wurzeln von AI DNA zu extrahieren und diese dann in PCR-Reaktionen mit den A- und I-Markern zu verwenden. Wird dann mit dem A-Marker kein PCR-Produkt erzeugt, kann daraus abgeleitet werden, dass Adventivwurzeln aus der inneren Chimärenkomponente (I) gebildet werden.

4.3 Strukturelle Klassifizierung der ermittelten Sequenzen

In dieser Arbeit wurden 11 neue Sequenzen der Gattung Populus ermittelt, die aus den verschiedenen Genotypen I, M und A resultieren. Sequenzähnlichkeiten, die gegenüber entsprechenden Arten in der Genbank (NCBI/EMBL) zu finden sind, können als Nachweis dafür gelten, dass die verwendete Methodik ihre Richtigkeit hat. Aus RAPD-Bandenmustern wurden kennzeichnende Banden für M und A kloniert und sequenziert. Für I, M und A wurden die 16S-rDNA und die ITS-Bereiche zwischen 18S und 25S sequenziert und die Sequenzen miteinander und mit der Genbank (Blast) (ZHANG und MADDEN, 1997, ALTSCHUL et al., 1997) verglichen.

4.3.1 Sequenzen aus M- und A-RAPD-Banden

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Aus den verschiedenen M- und A-Bandenmustern, die aus der RAPD-PCR erstellt wurden, konnten spezifische Banden für M und A kloniert und sequenziert werden. Aus den Sequenzen wurden Primer abgeleitet, die in der spezifischen PCR zur Anwendung gebracht wurden. Beide Primerpaare zeigten für M und A Banden (Abb. 19), die sich auch bei einer PCR mit Temperaturgradient nicht signifikannt unterschieden. Anschließend wurden die M-Primer verwendet, um M- und A-PCR-Produkte zu sequenzieren. Die ermittelten Sequenzen sind für M und A identisch (Kap. 3.4.3.).

4.3.2 Vergleich der 16S-rDNA-Sequenzen aus I, M und A

Für Vergleiche von 16S-rDNA-Sequenzen aus I, M und A mit Sequenzen aus der Genbank (BENSON et al., 2000, 2003) wurde ein Blast durchgeführt, das zeigt, dass die 16S-rDNA aus Arabidopsis thaliana (AP000423) (SATO et al., 1999), Nicotiana tabacum (Z00044) (SHIMADA und SUGIURA, 1991), Zea mays (X86563) (MAIER et al., 1995) Glycine max (X06428) (ALLMEN und STUTZ, 1988) und die ermittelten Sequenzen für I, M und A eine eigenständige Heterogenität aufweisen, die aber durchaus im entsprechenden Format (16S-rDNA) angesiedelt ist (Kap. 3.4.4. Abb. 31: 16S-Phylogramm). Die 16S-Sequenzen aus I, M und A sind nicht geeignet, um daraus artspezifische Marker abzuleiten. Aus diesem Grund wurden die kernkodierten ITS-Regionen in die Untersuchungen einbezogen.

4.3.3 Vergleich der ITS-Sequenzen aus I, M und A

Die Ergebnisse zeigen, dass die ITS-Bereiche zwischen 18S, 5,8S und 25S für phylogenetische Unterscheidungen von verschiedenen Arten bzw. Hybriden der Gattung Populus geeignet sind und bestätigen damit die Aussage, dass auf diese Weise Artenunterschiede ausfindig gemacht werden können (CAMPBELL et al., 1995, DOWNIE und KATZ- DOWNIE, 1995). Primer für die Amplifikation von ITS-Bereichen lassen sich in der Literatur finden (KOLLIPARA et al., 1997). Mittels spezifischer PCR wurden jeweils zwei ITS-Regionen für I, M und A amplifiziert, die sich nur geringfügig in ihrer Größe unterscheiden. Um die Amplifikate zu trennen, wurden sie kloniert. Die PCR-Produkte wurden mittels Plasmid (pGEM-T Easy) in Escherichia coli transformiert. Die Transformanten wurden anschließend auf ein geeignetes Selektionsmedium überführt, auf dem nur Klone mit Plasmid überlebten. Der zweite integrierte Selektionsmechanismus (Blau-Weiß-Test) zeigte, welche Klone ein Plasmid mit Insert enthalten. Für die Weiterverarbeitung wurden weiße Klone selektiert. Anhand gelelektrophoretischer Untersuchungen wurde ermittelt, welche Klone ein kurzes oder langes Insert enthalten. Daraus ergab sich die Möglichkeit, Klone nach ihrem Insert zu selektieren. Die selektierten Klone wurden; in einem Vermehrungsmedium hoch konzentriert, anschließend aufgereinigt und danach sequenziert.

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ITS-Sequenzen für verschiedene Populus-Arten können der Genbank (EMBL/NCBI) entnommen werden. Die ITS-Sequenzen von P. alba (AJ006437), P. deltoides (AJ006438), P. deltoides (X64764) (D'OVIDIO, 1992), P. lasiocarpa (AJ006439), P. trichocarpa (AJ006440) und die ermittelten I-, M- und A-Sequenzen wurden verglichen (ITS-Phylogramm Kap. 3.4.6., Abb. 34). Aus dem ITS-Phylogramm geht hervor, dass die ermittelten- und die Genbank-Sequenzen aus der Gattung Populus eine gewisse Zusammengehörigkeit darstellen, die nur durch die individuelle Sequenzheterogenität von I, M und A unterbrochen wird. Außerdem wird deutlich, dass die t-Sequenzen der untersuchten Populus-Individuen eine über die Artgrenzen hinaus reichende Diversität aufweisen.

4.4 Hypothesen zur bidirektionalen Kommunikation von Zellschichten

„Der Zellkern bzw. seine in den Chromosomen aufgestapelten Gene scheiden bestimmte Wirkstoffe aus, gestaltbildende, formative, organbildende Stoffe, morphogene Substanzen“, so heißt es bei HABERLANDT (1941), „die dem Zytoplasma angeben, was es zu tun hat“. HABERLANDT stützte seine Ansicht auf einen homohistischen Rückschlag an einem Chimärenbeispiel der +Crataegomespili von Bronvaux, das zeigt, dass trotz vorangegangener Entmischung zu Mespilus noch Eigenschaften ausgeprägt werden, die dem anderen Chimärenelter (Crataegus) zugehörig sind. Er formulierte die Hypothese, „dass sich die morphogenen Substanzen von Crataegus, die bei der Anlage des Rückschlages nach Mespilus aus dem Crataegus-Meristem in ihn hineintreten, nach Art eines Virus fortwährend vermehren und so im ganzen Verzweigungssystem des Rückschlagsastes dauernd wirksam sind“. Daraus leitet er weiter ab, „dass die morphogenen Substanzen bzw. die Mikrogene weit über den Zellkern hinaus, innerhalb welcher sie von den Chromosomen abgeschieden werden, sich im Pflanzenkörper verbreiten“. In Bezug auf WINKLER’s (1912) Chimärenklassifizierung beschreibt HABERLANDT mit seinem Rückschlagbeispiel eine Chimäre, die ursprünglich als „Beeinflussungspfropfbastard“ eingestuft wurde, wo sich spezifische Eigenschaften nach vegetativer Vermehrung dauerhaft in einem neuen „Biotyp“ behalten lassen.

BERGANN (1961 b, 1962 b) nannte eine Kompensationswirkung im Sinne eines Farbdefektes an Brakteen bei Euphorbia pulcherrima Willd. ‘Eckes Rosa’ „Partnerinduktion“. In gleicher Weise äußerten sich POHLHEIM und POHLHEIM (1974) über ein Vergilbungsmuster der Blätter von +Crataegomespilus dardari und einer Sprossvariante von Pelargonium zonale ‘Kleiner Liebling’ und POHLHEIM und RÖSSEL (1989) bei chimärischen Blatt- und Blütenfarbmustern bei Pelargonium. Die durch BERGANN und BERGANN (1984) gelungene experimentelle Synthese zweier neuer Pfropfchimären, die Rotdornmispeln von Potsdam (+Chrataegomespilus potsdamiensis cv. Diekto und cv. Monekto) zeigten denselben Effekt (BERGANN und BERGANN, 1984, POHLHEIM et al., 2004b). POHLHEIM vermutet bei der „Monekto“-Chimäre eine Genotypwechselwirkung als Partnerinduktion, da das Mesophyll der Blütenblätter, das keine Anthozyanfärbung erkennen lässt und genotypisch zur roten Blütenfarbe veranlagt ist, die Mispelepidermis, die genotypisch zur weißen Blütenfarbe veranlagt ist, anregt, Anthozyan zu bilden. Interzelluläre Genwirkungen bei direktem Kontakt genetisch verschiedener Gewebe konnten auch von PLASCHIL (1997) und RODRIGUEZ (2001) beobachtet werden.

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An induzierten Periklialchimären aus Antirrhinum majus wurde der Nachweis erbracht, dass bestimmte Gene induktiv über Zellgrenzen hinaus wirksam sein können (CARPENTER und COEN, 1995, HANTKE et al., 1995, PERBAL et al., 1996), sodass über die Plasmodesmata (PMD) interzellulare Diffusionen von Metaboliten und kleinen Molekülen stattfinden, die Signale von Zelle zu Zelle übermitteln (LUCAS et al., 1993, MEZITT und LUCAS, 1996, HAYWOOD et al., 2002). In diesem Sinne kann der Teil der HABERLANDT-Hypothese (1941), in der es heißt, dass die morphogenen Substanzen bzw. Mikrogene über den Zellkern hinaus wirksam sind, bestätigt werden. Obgleich damit noch nicht eindeutig nachgewiesen ist, dass sich diese Gene auf den gesammten Pflanzenkörper virusartig ausbreiten und vermehren können.

Der Nachweis des A-Genoms in MA-Fruchtknoten – einerseits und der Epidermisauswuchs an einigen MA-Antheren, der auf eine Bildung von Narbengewebe hinweist - andererseits, weisen in dem MA-Chimären-Beispiel auf die Möglichkeit, dass der Transport von Makromolekülen wie Proteinen oder RNA eine Signalübertragung von der M-Epidermis auf das A-Mesophyll ausgelöst haben kann, die dann unter bestimmten Voraussetzungen zur Induktion eines Fruchtknotens in einigen MA-Blüten führte.

Bei Untersuchungen zur Blütenentwicklung der diözischen P. trichocarpa wurden zwei Gene isoliert (PTAG1 und PTAG2), die dem homeotischen Arabidopsis Blütengen, AGAMOUS (AG), homolog sind (BRUNNER et al., 2000). Sowohl PTAG1 als auch PTAG2 kommen bei der Entwicklung von männlichen und weiblichen Blütenmeristemen in den inneren Wirteln zur Expression. Sie unterstützen die Spezifizierung reproduktiver Organidentität und die Blütendetermination. Die wesentlich geringere Expression beider Gene in vegetativen Organen ist im Vergleich zu AG bei Arabidopsis ungewöhnlich. Die beiden Gene werden im Perianthwirtel nicht expressiert, obgleich eine Expression sowohl in den Stamen- und Karpellwirteln nachgewiesen werden konnte, bevor diese Primordien bilden, als auch wieder in den sich entwickelnden Stamen und Karpellen. Die Abb. 9b zeigt ein Staubblatt von MA, das aufgrund der Chimärenkombination einen Auswuchs zeigt, der mit einer Narbe von M-Karpellen verglichen werden kann. Anhand dieser Beispiele wird deutlich, dass das Entwicklungsprogramm zur Musterbildung einer Blüte durch eine Gewebeverpflanzung mit Gewebe verschiedengeschlechtlichen Genotyps beeinflusst werden kann.


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