Aus dem Institut für Pharmakologie und Toxikologie
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

Dissertation

Endogene Systeme der Neuroprotektion: Charakterisierung von Melatonin und
17 β-Estradiol in neuronalen
Primärkulturen der Ratte

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Christoph Friedemann Harms
aus Detmold

Gutachter:
1. Prof. Dr. Klaus B. Fink, Universität Bonn
2. Prof. Dr. Heide Hörtnagl, Humboldt-Universität zu Berlin
3. Prof. Dr. Günther Sperk, Universität Innsbruck

Datum der Promotion:23.6.2003

Widmung:

Für Ulrike Susanne, Richard Jonathan und meine grosse, liebe Familie.

Inhaltsverzeichnis

• 1 Einleitung
  • 1.1 Untergang neuronaler Zellen: Apoptose und Nekrose
  • 1.2 Endogene Systeme der Neuroprotektion
    • 1.2.1 Melatonin als neuroprotektive Substanz
    • 1.2.2 Estradiol als neuroprotektive Substanz
  • 1.3 Modelle der Zelldegeneration in vitro
• 2  Aufgabenstellung
• 3 Material und Methoden
  • 3.1 Primäre, neuronale Zellkulturen
  • 3.2  Modelle der Zellschädigung
    • 3.2.1 Ethylcholin-Aziridiniumion (AF64A)
    • 3.2.2 Staurosporin
    • 3.2.3  Kombinierter Sauerstoff- und Glukoseentzug (OGD)
    • 3.2.4 OGD mit Blockade der exzitotoxischen Komponente mittels des N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptorantagonisten (NMDA) MK801
    • 3.2.5 Glutamat
  • 3.3  Vorbereitung der Zellkulturen, Versuchsaufbau und pharma-kologische Interventionen
  • 3.4 Evaluierung der Zellschädigung
    • 3.4.1 Phasenkontrastmikroskopie
    • 3.4.2  Laktatdehydrogenase (LDH)-Aktivitätsmessung
    • 3.4.3  Thiazolylblau (MTT)-Metabolismus
    • 3.4.4 Terminale-Deoxynukleotidyl-Transferase-mediiertes dUTP Nick-End Labeling und Zellzählung
    • 3.4.5  DNS-Isolation und Gelektrophorese
    • 3.4.6  α-Fodrin-Spaltprodukte (Westernblot-Analyse)
  • 3.5 Westernblots
    • 3.5.1 Ernten der Zellen und Zelllyse
    • 3.5.2  Proteinquantifizierung (BCA-Assay)
    • 3.5.3 Gelektrophorese, Blotting und Visualisierung der Banden
    • 3.5.4 Semiquantitative Analyse der Bandendichten
  • 3.6 Immunzytochemie
    • 3.6.1 Immunzytochemie zum Nachweis cholinerger Neurone
    • 3.6.2 Immunzytochemie zum Nachweis von Estrogenrezeptor-α und -β.
    • 3.6.3 Konfokale Mikroskopie
    • 3.6.4 Quantifizierung der Ergebnisse
  • 3.7 Messung der Lipidperoxidation
  • 3.8 Statistik
  • 3.9 Materialien
• 4  Ergebnisse
  • 4.1 Charakterisierung des AF64A-Schadensmodells
    • 4.1.1 Selektiver Zelltod cholinerger Neurone in septalen Kulturen bei niedriger AF64A-Dosis
    • 4.1.2 Kinetik des LDH-Anstiegs und der Reduktion des MTT-Metabolismus nach AF64A-Behandlung
    • 4.1.3 Phasenkontrastmikroskopie AF64A-behandelter Kulturen im Zeitverlauf
    • 4.1.4 Oligonukleosomale DNS-Fragmentierung nach AF64A-Behandlung
    • 4.1.5 AF64A-Toxizität und der unspezifische Caspase-Inhibitor Z-VAD-FMK
  • 4.2 Unterscheidung von apoptotischem und nekrotischem Zelltod
    • 4.2.1 Morphologische Charakterisierung mit Phasenkontrastmikroskopie: Vergleich von Apoptose und Nekrose
    • 4.2.2 TUNEL-Färbung
    • 4.2.3 Analyse der α-Fodrinspaltprodukte
  • 4.3 Effekte von Melatonin in den unterschiedlichen Schadens-modellen
    • 4.3.1 Eigenwirkung von Melatonin in nativen, neuronalen Primärkulturen
    • 4.3.2  AF64A und Melatonin
      • i) AF64A und andere antioxidative Substanzen
    • 4.3.3 Staurosporin und Melatonin
      • i) Staurosporin und andere antioxidative Substanzen
    • 4.3.4 OGD und Melatonin
    • 4.3.5 OGD mit MK-801 und Melatonin
  • 4.4 Effekt von 17 β-Estradiol in den unterschiedlichen Schadensmodellen
    • 4.4.1 AF64A und 17 β-Estradiol
    • 4.4.2  Staurosporin und 17 β-Estradiol
    • 4.4.3 Glutamat und 17 β-Estradiol
    • 4.4.4  OGD und 17 β-Estradiol
  • 4.5  Rezeptor-abhängige und unabhängige neuroprotektive Wirkungen von 17 β-Estradiol
  • 4.6 Modulation der Expression von Bcl-2, Bcl-xL und Bax durch 17 β-Estradiol in hippokampalen und kortikalen Kulturen
  • 4.7 Expression von Estrogenrezeptor-α und -β in septalen, hippokampalen und kortikalen Kulturen
    • 4.7.1 Immunzytochemischer Nachweis von Estrogenrezeptor-α
    • 4.7.2 Immunzytochemischer Nachweis von Estrogenrezeptor-β
  • 4.8  Beteiligung der Phospho-Inositol-3-Kinase (PI-3-Kinase)-Kaskade an der zellschützenden Wirkung von 17 β-Estradiol
  • 4.9 Zusammenfassende Darstellung der Ergebnisse in Bezug auf die Arbeits-hypothesen bzw. Fragestellungen
• 5 Diskussion
  • 5.1 Melatonin
  • 5.2 17 β-Estradiol
• 6  Zusammenfassung und Ausblick
• Literatur
• Abkürzungsverzeichnis
• Danksagung
• Eidesstattliche Erklärung

Tabellen

• Tab. 1: Verwendete Substanzen, Lösungsvehikel, Auflösung, Verdünnung und verwendete Endkonzentration für die verwendeten Substanzen in alphabetischer Reihenfolge.
• Tabelle 2: Veränderung der LDH-Freisetzung nach 24, 48 und 72 h in nativen, kortikalen Primärkulturen nach einmaliger Melatoningabe (10 – 500 μM). n = 4 – 16, * p < 0,05 versus Vehikel-behandelte Kulturen; one-way ANOVA gefolgt von Tuckey´s posthoc-Test. LDH-Aktivitäten in Units / ml Medium.
• Tabelle 3: Unveränderte LDH-Freisetzung nach 24, 48 und 72 h in nativen, kortikalen Kulturen durch die einmalige Behandlung mit DMTU oder PBN. n = 4 – 16.
• Tabelle 4: Auswirkungen der Antioxidantien Dimethylthiourea (DMTU) und N-tert-Butyl-α-Phenylnitron (PBN) auf die LDH-Aktivität (gemessen nach 72 h) und die Bildung von Malondialdehyd (gemessen nach 24 h) in kortikalen Neuronen nach Behandlung mit 40 µM AF64A. n = 6 – 8; 3 unabhängige Experimente; * p < 0,001 versus Vehikel.
• Tabelle 5: Einfluss von Melatonin auf die durch Staurosporin induzierte Apoptose. Stau = Staurosporin; Mel = Melatonin. Die Ergebnisse aus 2 – 3 unabhängigen Experimenten wurden zusammengefasst. n = 8 – 16 für die LDH-Werte und n = 8 für den MTT-Umsatz. * p < 0,001 versus Vehikel; + p < 0,05 versus 100 nM Staurosporin + Vehikel.
• Tabelle 6: Auswirkung der Antioxidantien Dimethylthiourea (DMTU) und N-tert-Butyl-α-Phenylnitron (PBN) auf die LDH-Aktivität und die Bildung von Malondialdehyd in kortikalen Neuronen nach Behandlung mit 300 nM Staurosporin. Malondialdehyd wurde nach 5 h, die LDH-Aktivität 48 h nach Behandlungsbeginn gemessen; n = 8 – 10; * p < 0,001 versus Vehikel.
• Tabelle 7: Wirksamkeit von MK-801 (10 μM) oder Melatonin (0,5 mM) auf die LDH-Freisetzung (Units / ml Medium), 24 h und 48 h nach 120-minütiger OGD. n = 5-8; * p < 0,05 versus OGD + Vehikel.
• Tabelle 8: Fehlender Einfluss der Kurzzeitbehandlung (1 h) mit 17 β-Estradiol auf die LDH-Freisetzung (Δ U / ml Medium) in hippokampalen, septalen und kortikalen primären, neuronalen Kulturen nach 72 h Behandlung mit AF64A (40 µM). n = 9 – 12; Die LDH-Freisetzung in den Kontrollkulturen war 56,3 ± 3,4 in hippokampalen, 27,0 ± 2,5 in septalen und 55,5 ± 5,8 U / ml Medium in kortikalen Kulturen; * p < 0,01 versus korrespondierende Kontrollkulturen.
• Tabelle 9: Auswirkung von Kurz- und Langzeitvorbehandlung (1 h und 20 h) mit 17 β-Estradiol in hippokampalen und kortikalen Kulturen 48 h nach der Gabe von Staurosporin (300 nM). * p < 0,05 versus Vehikel-behandelte Schwesterkulturen.
• Tabelle 10: Effekt der Kurzzeit- und Langzeitbehandlung (1 h und 20 h vorher) mit 17 β-Estradiol auf die LDH-Freisetzung (Δ in U / ml Medium) in kortikalen und hippokampalen Kulturen 24 h nach der Glutamatgabe (100 µM). n = 4 – 24; Die LDH-Freisetzung in vehikel-behandelten Schwesterkulturen war 61,5 ± 5,0 (1 h) und 54,8 ± 4,9 U / ml Medium (20 h); * p < 0,001 versus Vehikel-behandelte Kulturen; + p < 0,05 versus Glutamat + Vehikel; n.d. = nicht durchgeführt.
• Tabelle 11: Verlust der neuroprotektiven Wirkung von 17 β-Estradiol auf den Zelltod durch 40μM AF64A in hippokampalen und septalen Zellen nach Vorbehandlung mit Tamoxifen, ICI 182,780 Cycloheximid (LDH-Anstieg in Δ Units / ml Medium, 48 h post). Die basale LDH-Ausschüttung in den korrespondierenden Kontrollkulturen war 43,3 ± 4,9 für die hippokampalen Zellen und 41,7 ± 3,2 Units/ml medium für die Zellkulturen aus dem Septum. n = 4 – 9. a p < 0,05 und b p < 0,001 versus AF64A + Vehikel; c p < 0,05 und d p < 0,001 versus AF64A + Estradiol.
• Tabelle 12: Verlust der neuroprotektiven Wirkung von 17 β-Estradiol auf den Zelltod durch 40μM AF64A in hippokampalen und septalen Zellen nach Vorbehandlung mit LY 294002 (LDH-Anstieg in Δ Units / ml Medium, 48 h post). Die basale LDH-Ausschüttung in den korrespondierenden Kontrollkulturen war 43,3 ± 4,9 für die hippokampalen Zellen und 41,7 ± 3,2 Units/ml medium für die Zellkulturen aus dem Septum. n = 4 – 9. a p < 0,05 und b p < 0,001 versus AF64A + Vehikel; c p < 0,05 und d p < 0,001 versus AF64A + Estradiol.

Bilder

• Abb. 1: Vereinfachte Darstellung der Apoptosewege mit den wichtigen pro- und antiapoptotischen Modulatoren. Bei der neuronalen Apoptose scheint Typ II-Apoptose zu dominieren. Die skizierte Kaskade der Typ III-Apoptose ist nach Mehmet noch nicht vollständig bekannt (Mehmet, 2000).
• Abb. 2: Eine gesunde Zelle geht entlang eines apoptotisch-nekrotischen Kontinuums in Abhängigkeit von der Dosis oder der Intensität des Zellstresses in Form der Apoptose, Zwischenformen oder Nekrose zugrunde (nach Modellvorstellung von Bonfoco et al., 1995 und Martin et al., 1998).
• Abb. 3: Bei der Wechselwirkung von einem Radikal (hier das Hydroxylradikal •OH mit einem Nichtradikal (hier Melatonin) muss ein Radikal entstehen, das Indolyl-Kationradikal. Dieses Zwischenprodukt kann dann zum Beispiel das Superoxidanion-Radikal entfernen, so dass N-acetyl-N-formyl-5-methoxykynuramin (5-MAFK) entsteht.
• Abb. 4: AF64A und Cholin. Die Strukturhomologie erklärt die Aufnahme von AF64A über den Cholintransporter in Zellen. Der Aziridiniumring am AF64A-Molekül ist hochreaktiv und führt zu chemischen Interaktionen mit Makromolekülen.
• Abb. 5: ChAT-Immunzytochemie zur Darstellung cholinerger Neurone in septalen Zellkulturen. 5 μM AF64A wurde den Zellen am 18. DIV zugegeben und die Zellen nach 72 h fixiert und die ChAT-Immunzytochemie durchgeführt. A: Die ChAT-positiven Neurone zeigen eine retrograde Degeneration der Dendriten und den Beginn der Desintegrität des Perikarions (siehe Pfeil). ChAT-negative Neurone scheinen bei dieser Dosierung morphologisch nicht verändert. B: Kontrollkulturen zeigen intakte ChAT-positive Neurone mit verschiedenen weit ausgedehnten Fortsätzen. Zahlreiche kleine, sogenannte „dendritic spines“ sind am Ausläufer sichtbar. Vergrößerung x500.
• Abb. 6: Zeit- und dosisabhängige Veränderungen in kortikalen Neuronen nach AF64A-Exposition (5 – 80 μM AF64A). Die LDH-Aktivität ist hier als prozentuale Zunahme gegenüber den Vehikel-behandelten Kontrollkulturen dargestellt, um einen besseren Vergleich mit der Reduktion des MTT-Metabolismus zu ermöglichen. LDH-Freisetzung: n = 12; MTT-Assay: n = 5 pro Zeitpunkt und Zustand. Nach 24 h war im gesamten Dosisbereich von AF64A keine bis geringfügige LDH-Ausschüttung in das Medium detektierbar. Die LDH-Aktivität stieg nach 48 h bei den höheren Dosen markant an und war maximal erhöht nach 72 h. Bei der Dosierung von 40 und 80 μM fiel der MTT-Umsatz kontinuierlich bis 72 h ab, während in der niedrigsten Dosis von AF64A (5 μM) der MTT-Umsatz anfänglich anstieg.
• Abb. 7: A: Zusammenhang zwichen LDH-Freisetzung und morphologischer Veränderungen in kortikalen Neuronenkulturen nach 40 μM AF64A. A: Nach 24 h war noch kein signifikanter LDH-Anstieg detektierbar, nach 48 h und 72 h zeigte sich eine kontinuierliche Zunahme der LDH-Freisetzung; n = 12 - 16. * p < 0,05 versus Vehikel-behandelte Kontrollen.. B: In diesen Versuchen wurden parallel Photographien von mikroskopischen Beobachtungen mit der Phasenkontrast-Mikroskopie angefertigt (Vehikel von AF64A; AF64A-Behandlung (40 μM) nach 24, 48 und 72 h). Nach 24 h zeigten sich in den kortikalen Neuronen morphologisch noch keine Unterschiede im Vergleich zu den Kontrollkulturen, während nach 48 – 72 h die neuronalen Zellen zunehmend morphologische Charakteristika der apoptotischen Degeneration aufwiesen (siehe 4.2.1.). Der Balken entspricht 10 μm.Abb. 7
• Abb. 8: DNS-Fragmentierung in kortikalen Kulturen nach 48-stündiger Behandlung mit AF64A (40 and 80 µM) im Vergleich zu Vehikel-behandelten Schwesterkulturen. Für jeden Zustand wurden 2 Proben von unterschiedlichen Zellkulturen benutzt. Als Standard wurde eine 100 bp Leiter aufgetragen.
• Abb. 9: Caspase-Hemmung durch Z-VAD-FMK schützte kortikale Neurone vor der AF64A-Toxizität. Die Kulturen wurden mit 100 µM Z-VAD-FMK 1 h vor und 24 h und 48 h nach Applikation von 40 µM AF64A behandelt. Der Zelltod wurde durch den Anstieg der LDH-Aktivität im Medium dokumentiert (24, 48 und 72 h). In der Gruppe der Behandlung mit Z-FAD-FMK + AF64A blieb die LDH-Aktivität auf Kontrollniveau. n = 4 – 6 für jede Gruppe; * p < 0,01 vs. Vehikel; + p = 0,001 vs. AF64A. cVehikel, g AF64A, g AF64A + Z-VAD-FMK.
• Abb. 10: Phasenkontrastmikrospie kortikaler Neurone, die mit Vehikel behandelt, 48 h mit AF64A behandelt oder 120 min der OGD ausgesetzt wurden (Vergrößerung 250 x). A: Die Vehikel-behandelten Kontrollkulturen zeigten gesunde Neurone mit einem dichten Netzwerk von Neuriten. B: 24 h nach der OGD (120 min) zeigte sich eine Schwellung der Zellköper- und kerne (siehe Pfeile) als Zeichen des vorwiegend nekrotischen Zelluntergangs (D: Ausschnittsvergrösserung). C: 72 h nach AF64-Gabe (40 μM) erschienen in einer Schwesterkultur die typischen morphologischen Charakteristika der Apoptose. Die Neuriten degenerierten, die Zellkörper schrumpften und kondensierte Partikel sammelten sich im Zellkern (siehe Pfeile). E: Ausschnittsvergrösserung.
• Abb. 11: TUNEL-positive Zellen in den unterschiedlichen Schadensmodellen. Die kortikalen Kulturen wurden entweder mit 100 µM Glutamat für 30 Minuten (Färbung nach 24 h), OGD (Färbung nach 24 h), 300 nM Staurosporin (Färbung nach 24 h) oder 40 µM AF64A (Färbung nach 48 h) behandelt. 20 hochauflösende Felder wurden verblindet ausgezählt (400 x Vergrößerung). Zwei unabhängige Experimente mit jeweils drei Glasplättchen pro Experiment wurden gefärbt. * p < 0,05 versus Kontrolle.
• Abb. 12: Das Muster der α-Fodrinspaltprodukte als Marker für Calpain- und Caspaseaktivierung in den unterschiedlichen Schadensmodellen. Die Zellen wurden für den Western-blot nach 24, 48 und 72 h geerntet. A: Western-blot-Darstellung von α-Fodrin und seiner Spaltprodukte p150 und p120. Die Spalten entsprechen: 1: Vehikel-behandelte Kontrollkulturen; 2: Glutamat (100 μM), 24 h nach Behandlung); 3: OGD (circa 135 Min.), 24 h nach Behandlung; 4: Staurosporin (300 nM), 24 h nach Behandlung; 5: Staurosporin (300 nM), 48 h nach Behandlung; 6: AF64A (40 μM), 24 h nach Behandlung; 7: AF64A (40 μM), 48 h nach Behandlung; 8: AF64A (40 μM), 72 h nach Behandlung. B: Die semiquantitative Analyse der 120 kDa-Bande (p120) mit Densitometrie erfolgte von drei separaten Experimenten.
• Abb. 13: Anstieg der Malondialdehyd-Konzentration durch Melatonin in nativen, kortikalen Zellkulturen. Am 10. DIV wurden die Zellen mit Vehikel oder 0,5, 1,0 oder 2,0 mM Melatonin behandelt. Die Zellen wurden nach 24 h Melatoninexposition geerntet. n = 4 – 6 für jede Konzentration, * p = 0,004, ** p < 0,001 versus Vehikel-behandelte Zellen.
• Abb. 14: Wirkung von Melatonin auf die LDH-Ausschüttung durch AF64A in kortikalen Kulturen. Am 10. DIV wurden die Zellen 2 h vor der AF64A-Exposition mit 0,1 und 0,5 mM Melatonin vorbehandelt. Die AF64A (10, 40, 80 µM)- und Vehikel-Behandlung erfolgte dann für 5 h mit anschließendem Auswaschen mit PBS und Wiedergabe des konditionierten Mediums, das Melatonin oder das Vehikel enthielt. Die LDH-Aktivität im Überstand wurde nach 72 h gemessen. Dargestellt ist hier im Diagramm die Differenz zu den vehikel-behandelten Schwesterkulturen (Kontrollen), die im Mittelwert eine LDH-Aktivität von 61,2 + 4,7 Units / ml Medium besaßen. n = 4 – 11 für jede Gruppe, erhoben in 2 unterschiedlichen Experimenten; * p < 0,001 versus Vehikel-behandelte Kontrollkulturen; +p < 0.,005 versus AF64A. c Vehikel des Melatonins, g 0,1 mM Melatonin, g 0,5 mM Melatonin.
• Abb. 15: Melatonineffekt auf den AF64A-induzierten Verlust des MTT-Stoffwechselumsatzes in kortikalen Zellen. Am 10. DIV wurden die Zellen mit 0,1 oder 0,5 mM Melatonin für 2 h vorbehandelt und dann der AF64A-Exposition (10, 40 oder 80 μM) oder dem entsprechenden Vehikel für 5 h ausgesetzt, anschließend mit PBS gewaschen und mit den konditionierten Medien mit den unterschiedlichen Melatonindosen oder dem Vehikel versorgt. Der MTT-Stoffwechselumsatz wurde nach 72 h nach der Gabe von AF64A gemessen. Die Daten sind als relativer Prozentanteil der vehikel-behandelten Kontrollen dargestellt (100% Stoffwechselaktivität). Es wurden die Daten aus 2 unterschiedlichen Experimenten gepoolt. n = 4 – 11 für jede Gruppe; * p < 0,001 versus Vehikel-behandelte Kontrollen. c Vehikel des Melatonins, g 0,1 mM Melatonin, g 0,5 mM Melatonin.
• Abb. 16: Melatonin verhinderte den Anstieg der Malondialdehyd-Konzentration durch AF64A in neuronalen Primärkulturen der Ratte. Am 10. – 14. DIV wurden die Zellen 1 h vor 40 µM AF64A-Gabe mit 0,1 mM Melatonin vorbehandelt. Nach 24 h wurden die Zellen geerntet und die Malondialdehyd-Konzentration bestimmt. n = 6 –13 für jede Kombination, erhoben aus 2 unterschiedlichen Experimenten; *p < 0,001 versus Vehikel-behandelte Zellen; + p < 0,001 versus AF64A-behandelte Zellen.
• Abb. 16: Abschwächung des durch OGD ausgelösten neuronalen Zelltodes durch Melatonin. Am 14. DIV wurden die Zellen 140 min der OGD ausgesetzt. Melatonin wurde im Konzentrationsbereich von 0,1 – 2 mM den Kulturen über den gesamten Zeitraum zugegeben. Die LDH-Aktivität wurde 24 h nach dem Beginn der OGD gemessen. Der totale Zelltod repräsentiert die freigesetzte LDH-Menge nach kompletter Destruktion der Zellen durch 5 mM Glutamatexposition über 24 h. Die Daten werden als Zunahme der LDH-Aktivität im Vergleich zu den Vehikel-behandelten Schwesterkulturen präsentiert. Diese Zellen wurden mit Puffer mit Glukose über 140 Minuten im Brutschrank mit dem Vehikel von Melatonin behandelt und hatten nach 24 h eine LDH-Aktivität von 61,8 + 1,7 Units / ml Medium. n = 12 – 19 für jede Kondition. Es wurden die Daten aus 2 unterschiedlichen Experimenten zusammengefaßt. * p < 0,05 versus OGD + Vehikel.
• Abb. 17: Melatonin zeigte keine Wirkung auf die apoptotische Komponente der OGD, die durch den Glutamatantagonisten MK-801 demaskiert wurde. Am 10. DIV wurden die Zellen 180 min der OGD ausgesetzt. Melatonin (0,1 und 0,5 mM) und MK-801 (10 μM) wurden 60 und 30 min vor Beginn der OGD zugegeben. Die OGD wurde von 120 auf 180 min verlängert um einen neuronalen Zelltod in Anwesenheit des Glutamatantagonisten MK-801 zu erreichen, der ungefähr vergleichbar zu der Zellschädigung bei 120-minütiger OGD ohne Glutamatantagonisten war. Z-VAD-FMK wurde zu Beginn der Reoxygenierungsphase und 24 h später zugegeben. Die LDH-Aktivität wurde 24 und 48 h nach der OGD gemessen. Die Daten wurden als Zunahme der LDH-Aktivität im Vergleich zu vehikel-behandelten Kontrollkulturen angegeben. Die Aktivität der LDH in den Kontrollkulturen war 53,5 + 3,4 und 65,5 + 7,6 Units / ml Medium nach 24 und 48 h. n = 5 – 8 für jede Kondition; * p < 0,05 versus OGD + Vehikel; + p < 0,05 versus OGD + MK-801.
• Abb. 18: Wirkung von 17 β-Estradiol auf die LDH-Freisetzung nach AF64A in hippokampalen und septalen Kulturen. Am 10. DIV wurden die Zellen mit 0,1 oder 1,0 μM 17 β-Estradiol 20 h vorbehandelt. Nach dieser Zeit erfolgte die Gabe von AF64A oder korrespondierendem Vehikel. Die LDH-Freisetzung wurde im Medium 72 h nach Behandlung mit AF64A gemessen. Hier werden die Daten als Zunahme der LDH-Aktivität gegenüber den Vehikel-behandelten Kontrollkulturen gezeigt. Die LDH-Aktivität der hippokampalen Kontrollen betrug 38,5 + 3,7, die der septalen Kontrollen 34,1 + 2,4 Units /ml Medium. Es wurden Werte aus drei unterschiedlichen Experimenten gepoolt, n = 5 – 10 für jede Kondition; * p < 0,004 versus vehikel-behandelte Kulturen; + p < 0,05 versus AF64A.
• Abb. 19: Phasenkontrast-Mikroskopiebilder primärer neuronaler Zellkulturen nach den verschieden Schädigungsmodellen mit und ohne Vorbehandlung mit 17 β-Estradiol (Vergrößerung x250). a-c: Effekt der Langzeitvorbehandlung (20 h) mit 17 β-Estradiol auf das morphologische Bild hippokampaler Kulturen 72 h nach AF64A-Behandlung. a: Vehikel-behandelte Kontrollen; b: AF64A-behandelte Kulturen (40μM); c: AF64A-behandelte Kulturen mit 20-stündiger Vorbehandlung mit 0,1 μM 17 β-Estradiol. d-i: Effekt der Kurzzeitbehandlung (1 h) mit 17 β-Estradiol auf das morphologische Bild des neuronalen Zelltods 24 h nach Schädigung durch das Glutamat- oder OGD-Modell in kortikalen Neuronen. d: Vehikel-behandelte Kontrollkulturen; e: Kortikale Kulturen nach Glutamatexposition (100μM); f: Glutamatbehandlung 1 h nach der Vorbehandlung mit 10,0 μM 17 β-Estradiol; g: Kortikale Kulturen 24 h nach OGD-Behandlung; h: OGD-Exposition nach 1 h Vorbehandlung mit 0,1 μM 17 β-Estradiol; i: OGD-Exposition nach 1 h Vorbehandlung mit 0,5 μM 17 β-Estradiol.
• Abb. 20: Wirkung von 17 β-Estradiol auf die neuronale Schädigung durch Glutamat in kortikalen Kulturen. Am 10. DIV wurden die Zellen mit 0,1 – 10 μM 17 β-Estradiol für 1 h vorbehandelt und dann Glutamat (100 μM) oder das korrespondierende Vehikel zugegeben. Die LDH-Freisetzung in das Medium wurde nach 24 h untersucht. Die Daten werden als Zunahme der LDH-Aktivität gegenüber den Kontrollkulturen (63,8 + 1,2) gezeigt. n = 6 – 8, zusammengefaßt aus zwei unabhängigen Experimenten; * p < 0,001 versus Vehikel-behandelte Kontrollkulturen; + p < 0,005 versus Glutamat.
• Abb. 21: Effekt von 17 β-Estradiol auf die LDH-Freisetzung nach OGD in kortikalen Neuronen. Es wurde 1 h vor der OGD mit 0,1, 0,5, 1,0 oder 5,0 μM 17 β-Estradiol am 10. DIV vorbehandelt und die LDH-Aktivität nach 24 h gemessen. Es werden die Zunahme der LDH-Aktivitäten gegenüber den Kontrollkulturen (63,8 + 1,2) gezeigt. n = 9 – 24 für jede Kondition, gepoolt aus zwei verschiedenen Experimenten; * p < 0,001 versus Vehikel-behandelte Kontrollkulturen; + p < 0,05 versus OGD + Vehikel.
• Abb. 22: Die Auswirkung von 17 β-Estradiol (0,03 und 0,10 μM) auf die Expression von Bcl-2 in hippokampalen und kortikalen Kulturen. Die neuronalen Zellen wurden mindestens 10 Tage in vitro kultiviert bevor sie 24 – 48 h mit 17 β-Estradiol (30 oder 100 nM) behandelt wurden und mit Western-blots untersucht wurden. 1, Vehikel-behandelte Kulturen; 2, 24 h-Behandlung mit 100 nM 17 β-Estradiol; 3, 48 h-Behandlung mit 100nM 17 β-Estradiol 4, 48 h-Behandlung mit 30nM 17 β-Estradiol.
• Abb. 23: Der Einfluss von 17 β-Estradiol (100 nM) auf die Expressionsmuster von Bcl-2, Bcl-xL, Bax und β-Tubulin in Kulturen aus Hippokampus und Kortex. Die Zellen wurden mit Vehikel oder 17 β-Estradiol behandelt und 20 h später Vehikel oder AF64A appliziert. 48 h nach Gabe von AF64A (also 68 h nach 17 β-Estradiol-Behandlung) wurden die Zellen in Western-blots analysiert. Es wurden immer mindestens drei Experimente durchgeführt und ausgewertet. 1, Vehikel / Vehikel-behandelte Kulturen; 2, 17 β-Estradiol / Vehikel-behandelte Kulturen; 3, Vehikel / AF64A-behandelte Kulturen; 4, 17 β-Estradiol / AF64A-behandelte Kulturen. Die semiquantitative Auswertung der Western-blots durch Bandendichte-Bestimmung wird hier von drei separaten Experimenten als Mittelwert der Bandendichten gezeigt.
• Abb. 24: Wirkung von 17 β-Estradiol (100 nM) und Staurosporin (300 nM) auf die Bcl-2-Level in hippokampalen und kortikalen Kulturen. Die Kulturen aus den beiden Regionen wurden mindestens 10 DIV vor dem Experiment kultiviert. Zunächst wurden die Zellen mit Vehikel oder 17 β-Estradiol behandelt und im nächsten Schritt 20 h später Vehikel oder Staurosporin zugegeben. 1, Vehikel / Vehikel-behandelte Kulturen; 2, 17 β-Estradiol / Vehikel-behandelte Kulturen; 3, Vehikel / Staurosporin-behandelte Kulturen; 4, 17 β-Estradiol / Staurosporin-behandelte Kulturen. Die semiquantitative Auswertung der Western-blots durch Bandendichte-Bestimmung wird hier von 4 separaten Experimenten gezeigt.
• Abb. 25:Antagonismus der Wirkung von 17 β-Estradiol auf die BCL-2- und BCL-xL-Spiegel in hippokampalen Kulturen durch Cycloheximid und Tamoxifen. Am 10. DIV wurden die Kulturen für 48 h behandelt und dann für Western-blots geerntet. a: Vehikel-behandelte Kulturen, b: Cycloheximid (500 ng/ml Medium), c: Tamoxifen (1,0 µM), d: 17 β-Estradiol (0,1 µM) / Cycloheximid (500 ng/ml Medium), e: 17 β-Estradiol (0,1 µM) / Tamoxifen (1,0 µM), f: 17 β-Estradiol (0,1 µM), g: 17 β-Estradiol (1,0 µM).
• Abb. 26 A – C: Immunzytochemische Analyse der Lokalisation von Estrogenrezeptor-α (A) und Estrogenrezeptor-β (B) in kortikalen, hippokampalen und septalen Neuronen. Zellkulturen aus den drei Regionen wurden 12 DIV kultiviert und dann mit 4 % Formaldehyd für 15 Minuten bei Raumtemperatur fixiert. Die Immunzytochemie wurde, wie in den Materialien (Kap. 3.7.2.) beschrieben, durchgeführt. Die Kulturen wurden dann auf Objektträgern mit ImmunFluor Mounting Medium montiert und in der konfokalen Mikroskopie bei einer 630x-Vergrößerung digitalisiert. C: Verteilung von Estrogenrezeptor-α und Estrogenrezeptor-β-immunoreaktiven Neuronen anhand der Intensität der Fluoreszenz in kortikalen, hippokampalen und septalen Neuronen. Die quantitative Analyse wird in Kapitel 3.7.4. ausführlich beschrieben und erfolgte anhand der ermittelten mittleren Pixelintensitäten aus 139 bzw. 140 Neuronen je Region und Rezeptor. Diese Neuronen wurden in randomisierter und verblindeter Weise durch eine zweite Person ausgewählt. Die mediane Pixelintensität aller gezählten Neurone wurde als Grenze für die Zuordnung der Neurone zu Zellen mit niedriger oder hoher Intensität gewählt (8,9 für Estrogenrezeptor-α und 8,3 für Estrogenrezeptor-β).
• Abb. 27: Interaktion zwischen Estrogenrezeptor-α und dem IGF-1-Rezeptorweg (modifiziert nach einem Vorschlag von Kahlert et al., 2000).