1 Einleitung

1.1 Untergang neuronaler Zellen: Apoptose und Nekrose

Der neuronale Zelltod lässt sich in zwei sehr unterschiedliche Formen unterteilen, die Apoptose oder programmierter Zelltod, und die Nekrose. Schon früh wurde das Konzept des Zelltods in der Pathologie besonders im Kontext verschiedener Krankheiten etabliert (Virchow, 1858). Es wurde beobachtet, dass zugrundegehende Zellen deutliche morphologische Unterschiede aufwiesen, die man in Zusammenhang mit unterschiedlichen Ursachen des Zelltodes brachte. So unterschied man zunächst den physiologischen vom pathologischen Zelltod (Glücksmann, 1951). Basierend auf morphologischen und biochemischen Unterschieden erfolgte die Klassifikation in Apoptose und Nekrose (Kerr et al., 1971, 1972; Wyllie, 1980; Gerschenson et al., 1992).

Apoptose ist die wesentliche Form des physiologischen Zelltods im Zentralnervensystem. Während der Ontogenese des Gehirns sterben bis zur adulten Hirnreife 20 - 80% der Neuronen durch Apoptose (Oppenheim, 1991). Auch zu späteren Zeitpunkten wird Apoptose als aktiver zellulärer Suizid induziert, um Zellen zu entfernen, die beispielsweise durch mutagene Einflüsse ihre physiologische Funktion nicht erfüllen können, tumorös entarten (Williams, 1991) oder mit Viren infiziert sind (Vaux et al., 1994). Ausserhalb des ZNS werden auch autoaggressive Lymphozyten durch die Induktion des programmierten Zelltods eliminiert, so dass sie nicht für den Organismus gefährlich werden können (Cohen, 1991; Golstein et al., 1991; Tsubata et al., 1994). Daher wird Apoptose in verschiedenen Geweben generell genutzt, um Zellen zu vernichten ohne systemische Entzündungskaskaden mit daraus resultierenden Gewebsuntergängen auszulösen. Neben der physiologischen Rolle der Apoptose ergaben sich jedoch immer mehr Hinweise für eine Beteiligung der Apoptose bei pathologischen Prozessen im ZNS (Thompson, 1995).

Nekrose tritt immer dann auf, wenn eine Zelle extremem physikalischen Stress oder starken chemischen Reizen ausgesetzt ist und eine kontrollierte Reparatur des Schadens z.B. aufgrund eines Energiemangels nicht möglich ist oder die Zellhomöostase nicht aufrecht erhalten werden kann (Wang, 2000).


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Eine Beteiligung der Apoptose wurde zunächst nur bei langsam-progressiven neurodegenerativen Erkrankungen wie der Alzheimer‘schen Krankheit, der Amyothrophen Lateralsklerose oder der Parkinsonschen Krankheit angenommen (Lassmann et al., 1995; Thompson, 1995; Mochizuki et al., 1996).

Bei neurologischen Erkrankungen, wie der zerebralen Ischämie, der traumatischen Hirnschädigung oder der Rückenmarksverletzung galt der nekrotische Zelltod als einzige Form des Zelluntergangs, bis erste Hinweise für apoptotische Charakteristika in einem in vivo-Modell für fokale Ischämie in der Ratte präsentiert (Linnik et al., 1993) und inzwischen durch viele Arbeiten ergänzt wurden (MacManus et al., 1993; Filipkowski et al., 1994; Namura et al., 1998; Fink et al., 1998; Endres et al., 1998; Chen et al., 1998). Derzeit finden sich bei neurologischen und neurodegenerativen Erkrankungen immer mehr Hinweise für das gleichzeitige Vorkommen sowohl von Apoptose als auch Nekrose (Martin et al., 1998; Nicotera et al, 1999).

Der Begriff Apoptose wurde von Kerr und seinen Mitarbeitern 1972 eingeführt und beschrieb charakteristische morphologische Veränderungen dieser Todesform (Kerr et. al., 1972). Zu diesen Veränderungen zählen das Schrumpfen des Zytoplasmas, die Bläschenbildung („blebbing“) an den Zellmembranen und die halbmondförmige, nukleäre Chromatin-Kondensation und auch Veränderungen der Zellmem-branoberfläche, auf der Phosphatidyl-Serin exponiert wird, ein Molekül, das sonst im Inneren der Zelle zu finden ist (Kerr et al., 1972; Fadok et al., 1992; Vanags et al., 1996). Durch enzymatische Spaltung wird die DNS zunächst in grosse Stücke (50kb) und später auch kleine (oligonukleosomale) Fragmente von circa 180 Basen Länge gespalten (Walker et al., 1993; Oberhammer et al., 1993; Majno und Joris, 1995; Wyllie, 1980). Schließlich werden Zellkern und die Organellen in apoptotische Körper aufgeteilt und in Zellmembranen verpackt. Das sind mehr oder weniger runde Elemente, die Chromatin enthalten und der schnellen Phagozytose durch Makrophagen und anderen Zellen mit phagozytischer Aktivität zugeführt werden.

Im Gegensatz dazu stellt sich die Nekrose in der Folge „katastrophaler Ereignisse“ nach extremem physischen oder toxischen Stress morphologisch in Form passiver, schneller Beschädigung zytosolischer Organellen wie der Mitochondrien mit frühzeitiger Energiedepletion, dem Zusammenbruch der internen Homöostase mit anschließender Lyse der Zelle, Freisetzung des zellulären Inhalts und konsekutiver Inflammation dar. Durch diese Vorgänge werden charakteristischerweise auch be[Seite 8↓]nachbarte Zellen geschädigt (Kerr and Harmon, 1991; Schwartz et al., 1993; Savill et al., 1993).

Eine Reihe biochemischer Eigenschaften erlauben eine Unterscheidung der beiden Todesarten. Zur Aufklärung der biochemischen Abläufe der Apoptose ist es besonders hilfreich gewesen, dass dieser Prozeß in der Evolution früh auftrat und hochkonserviert wurde. Tatsächlich basiert ein Großteil unseres Wissens auf Erkenntnissen aus dem Nematoden Caenorhabditis elegans (Ellis et al., 1991; Hengartner und Horvitz, 1994). Hier sind insgesamt 14 Gene beschrieben worden, die in drei verschiedene Gruppen von Genen eingeteilt werden können, die folgende Aufgaben haben: direkte Exekution der Apoptose, Vermittlung der Phagozytose apoptotischer Zellen, und Gene mit regulierender pro- und antiapoptotischer Funktion. Diese drei Gruppen sind zu den wichtigsten Genen in Säugetierzellen größtenteils strukturhomolog. Dabei sind die Caspasen aus der Familie der konservierten Aspartat-spezifischen Cysteinylproteasen die Säugetierhomologe für die Proteasen CED-3 in Caenorhabditis elegans. Es spielen aber auch antiapoptotische Gene wie Bcl-2 (Strukturhomologie zu CED-9), Bcl-xL oder proapoptotische Gene wie Bax eine zentrale Rolle. Diese sind auch im Nematoden nachweisbar und zunächst dort beschrieben worden (Steller, 1995).

In Säugetierzellen liessen sich bisher 14 unterschiedliche Caspasen charakterisieren. Diese Proteasen sind im Zytosol konstitutiv vorhanden und sind an der Endstrecke der Apoptose wesentlich beteiligt (Slee et al., 2001). Durch apoptogene Signale werden sie durch Proteolyse aus einer Pro-Caspase-Form aktiviert und aktivieren so ihrerseits zahlreiche Enzyme, die als Substrat fungieren und die morphologischen und biochemischen Veränderungen der Zelle wie Chromatinkondensation, nukleäre Fragmentation und Phosphatidyl-Serinexposition auslösen. Zu diesen Substraten der Caspasen gehören zum Beispiel die Poly-ADP-Ribosyltransferase, α-Fodrin, Gelsolin, und wichtige Enzyme für die Reparatur der Desoxyribonucleinsäure (DNS; Kothakota et al., 1997; Wang, 2000). Die Aktivierung der Caspasen liegt in der Kaskade vor der DNS-Degradation in Fragmente, aber oberhalb von initialen apoptogenen Stimuli, die nach heutigen Vorstellungen auf drei unterschiedlichen Wegen die Exekution der Apoptose initiieren können.

Auslöser der Caspaseaktivierung sind die Cytochrom-C und/oder AIF (apoptosis inducing factor)-Freisetzung aus den Mitochondrien, Stimulation von sogenannten Todesrezeptoren auf der Oberfläche der Zellen und neuerdings ein dritter Weg über [Seite 9↓]das endoplasmatische Retikulum mit Calciumfreisetzung und Aktivierung von Caspase 12 (Nakagawa et al., 2000; Mehmet, 2000; Yoneda et al., 2001; Rao et al., 2001). Abbildung 1 zeigt eine vereinfachte Darstellung der drei bisher bekannten Apoptsosewege:

Abb. 1: Vereinfachte Darstellung der Apoptosewege mit den wichtigen pro- und antiapoptotischen Modulatoren. Bei der neuronalen Apoptose scheint Typ II-Apoptose zu dominieren. Die skizierte Kaskade der Typ III-Apoptose ist nach Mehmet noch nicht vollständig bekannt (Mehmet, 2000).


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Eine weitere wichtige Beobachtung ist der Einfluss des Zellzyklus auf den Ablauf der Apoptose in postmitotischen neuronalen Zellen (Park et al., 1996, 1997; Busser et al., 1998; Osuga et al., 2000; Katchanov and Harms et al., 2001; Harms and Katchanov et al., manuscript submitted). Eine Zellzyklusaktivierung bis zur G1/S-Phase wurde in verschiedenen Modellen der neuronalen Apoptose nachgewiesen (Park et al., 1998).

Die Unterscheidung der beiden Todesformen hat in den letzten Jahren an Klarheit verloren, da Apoptose und Nekrose als „Extremformen“ des Zelluntergangs mit vielen Zwischenformen entlang eines „apoptotisch-nekrotischen Kontinuums“ verstanden werden müssen (Bonfoco et al., 1995; Martin et al., 1998). Es lässt sich bisher auch noch nicht ausschließen, ob nicht weitere Wege des Zelluntergangs entdeckt werden, die Charakteristika beider Todesarten gemeinsam aufweisen und als Apoptose-ähnlich beschrieben werden (Wang, 2000; Leist und Jäättelä, 2001). Abbildung 2 gibt die Abhängigkeit der Todesart von der Intensität bzw. der Dosis eines Zellstressors wieder:

Abb. 2: Eine gesunde Zelle geht entlang eines apoptotisch-nekrotischen Kontinuums in Abhängigkeit von der Dosis oder der Intensität des Zellstresses in Form der Apoptose, Zwischenformen oder Nekrose zugrunde (nach Modellvorstellung von Bonfoco et al., 1995 und Martin et al., 1998).


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Inwieweit die Qualität und Quantität der Form des Zelluntergangs Auswirkungen auf den Verlauf und die Geschwindigkeit pathopysiologischer Erkrankungen des ZNS haben, ist noch unklar. Jedoch trägt das wachsende Wissen über die Mechanismen, die zu apoptotischem oder nekrotischem Zelluntergang führen zu einem besseren Verständnis der pathogenetischen Prozesse im Rahmen von neurodegenerativen Erkrankungen bei. Es eröffnet neue Wege für therapeutische Strategien zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen. Die zunehmende Häufung neurodegenerativer Erkrankungen -z.B. rangiert die Alzheimer’sche Erkrankung als vierthäufigste Todesursache der westlichen Welt- erfordert eine hohe Priorität für die Entwicklung effektiver therapeutischer Maßnahmen. Bei der Suche nach neuen neuroprotektiven Strategien könnte die Berücksichtigung endogener Mechanismen einen wichtigen Stellenwert einnehmen.

1.2 Endogene Systeme der Neuroprotektion

In den letzten Jahren sind eine Reihe von endogenen Mechanismen oder Substanzen erkannt worden, die eine neuroprotektive bzw. antiapoptotische Wirkung vermitteln und / oder in den Ablauf der Apoptose regulierend eingreifen. Diese Substanzen können intrazellulär vorliegen, wie z.B. Vertreter der Bcl-Familie oder der IAP-Familie, oder auch von extrazellulär an die Zelle gelangen, wie z.B. Erythropoietin und antiinflammatorische Zytokine. Antiapoptotische Gene der Bcl-Familie und die IAPs (Inhibitoren der Apoptose) greifen an unterschiedlichen Stellen in die apoptotische Kaskade ein und schützen so vor dem Zelluntergang (Adams and Cory, 1998; Deveraux and Reed, 1999). Erythropoietin ist ein Beispiel für eine endogene neuroprotektive Substanz, die auch bei der stress-induzierten Präkonditionierung möglicherweise therapeutische Bedeutung erlangen könnte (Sakanaka et al., 1998; Brines et al., 2000; Digicaylioglu and Lipton, 2001; Dawson, 2002). Ob physiologische Konzentrationen ausreichen, um endogene Neuroprotektion durch Erythropoietin zu vermitteln, bleibt aber noch unklar (Dawson, 2002). Entscheidend für die Wirkung von Erythropoietin sind bisher die Applikation von Erythropoietin vor Beginn der Schädigung oder die intravenöse Gabe während der Reperfusion bei ischämischer Schädigung und die Gabe supraphysiologischer Konzentrationen (Dawson, 2002; Celik et al., 2002). Ein weiteres Beispiel für endogene Mechanismen der Neuroprotektion sind die endogenen Cannabinoide 2-Arachidonoyl-Glycerol und Anandamid, [Seite 12↓]die bei geschlossenem Hirntrauma in vivo, exzitotoxischer Schädigung hippokampaler Neurone in vitro und in vivo und Schädigung kortikaler Neurone durch OGD in vitro neuroprotektiv wirkten (Panikashvili et al., 2001; Mechoulam et al., 2002).

Besonders hervorzuheben sind die beiden Hormone Melatonin und 17 β-Estradiol, die bereits Eingang in therapeutische Prinzipien bei der Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen gefunden haben. Das neuroprotektive Potential dieser Hormone wurde experimentell in vitro und in vivo demonstriert. Die Wirkungsweisen, mögliche Einschränkungen und ihr Potential bei unterschiedlichen pathophysiologischen Prozessen des ZNS sind jedoch noch weitgehend unverstanden.

1.2.1 Melatonin als neuroprotektive Substanz

Melatonin ist das Hauptprodukt der Zirbeldrüse (Glandula pinealis), bestimmt maßgeblich die circadianen Rhythmen und weist viele Wechselbeziehungen mit dem neuroendokrinen System auf (Reiter et al., 1995). Auf diese physiologischen Eigenschaften wird in dieser Studie nicht weiter eingegangen, da sie für die in vitro-Untersuchungen von geringer Relevanz sind. Die neuroprotektiven Eigenschaften von Melatonin erklären sich zum großen Teil über seine antioxidativen Eigenschaften. Melatonin wird als ausserordentlich potenter, antioxidativer Radikalfänger im Konzentrationsbereich 10-6 beschrieben (Reiter, 1998; Pappolla et al., 1997). Daher möchte ich im folgenden Abschnitt näher auf die Funktionsweise als Antioxidans eingehen.

Melatonin soll mittels Elektronenabgabe direkt freie Radikale einfangen und auf diese Weise entgiften (Reiter et al., 1995, 1997; Reiter, 1998). Diese Radikale entstehen meistens aus dem Sauerstoffmolekül und werden in aerob lebenden Organismen ständig gebildet. So können Superoxidradikale (O2— •), das Hydroxylradikal (•OH) und Stickstoffmonoxid (NO) entstehen. Freie Radikale sind hochreaktive chemische Strukturen, die mit organischen Makromolekülen wie Lipiden, Proteinen oder DNS reagieren können und dadurch funktionelle Störungen auslösen. Diese Form der oxidativen Schädigung ist ein wichtiger Faktor in der Pathophysiologie vieler Erkrankungen, einschließlich von Gehirnerkrankungen. Durch das Abfangen dieser gewebsschädigenden Radikale könnten daher Krankheitsprozesse verlangsamt oder verhindert werden. Abb. 3 zeigt einen Vorschlag von Reiter, wie Melatonin ein Hydroxylradikal mittels Elektronenabgabe entgiften kann (Reiter et al., 1997):


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Abb. 3: Bei der Wechselwirkung von einem Radikal (hier das Hydroxylradikal •OH mit einem Nichtradikal (hier Melatonin) muss ein Radikal entstehen, das Indolyl-Kationradikal. Dieses Zwischenprodukt kann dann zum Beispiel das Superoxidanion-Radikal entfernen, so dass N-acetyl-N-formyl-5-methoxykynuramin (5-MAFK) entsteht.

Melatonin ist auch in der Lage, das Peroxylradikal ( LOO• ) zu entfernen, das bei der Lipidperoxidation eine Kettenreaktion mit der Folge der ausgeprägten Oxidation von mehrfach ungesättigten Fettsäuren auslöst. Auch Vitamin E kann diese Ketten-reaktion unterbrechen und trägt so zur Erhaltung der Membranintegrität und damit zum Erhalt der Zellfunktion bei (Reiter et al., 1997).

Die neuroprotektive Wirkung von Melatonin wurde vorwiegend in neuronalen Schadensmodellen gezeigt, in denen freie Radikale aus Sauerstoff beteiligt waren und exzitotoxische Aminosäuren und Toxine eingesetzt wurden. In den beiden Parkinsonmodellen, in denen mit N-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+) oder 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) dopaminerge Neurone geschädigt werden, war Melatonin in der Lage, den Anstieg der Produkte der Lipidperoxidation und den Abfall der Tyrosinhydroxylase im Striatum und der Substantia nigra zu verhindern und rettete dopaminerge Zellen in Kultur vor dem Zelluntergang (Acuna-Castroviejo et al., 1997; Iacovitti et al., 1997; Jin et al., 1998; Kim et al., 1998). Melatonin verhinderte auch den durch das exzitotoxisch wirkende Kainat entstandenen neuronalen Zellverlust und reduzierte die Lipidperoxidationsprodukte in Ratten und Mäusen in vivo (Melchiorri et al., 1995; Giusti et al., 1996; Tan et al., 1998). Melatonin schützte die klonierte hippokampale Zelllinie HT22 vor Glutamattoxizität (Lezoualc´h et al., 1996) und verhinderte den verzögerten Zelltod, der in hippokampalen Pyramidenzellen in Zellkultur [Seite 14↓]durch verstärkte, erregende synaptische Übertragung ausgelöst wurde (Skaper et al., 1998). Neuroblastomazellen, die mit β-Amyloid, dem bei der Alzheimer’schen Erkrankung akkumulierten toxischen Fragment des β-Amyloid-Precursorproteins behandelt wurden, konnten durch Melatonin erhalten werden (Pappolla et al., 1997).

Eine antikonvulsive Wirkung von Melatonin konnte in verschiedenen Epilepsiemodellen gezeigt werden, wie bei Quinolinat-, Kainat- und Glutamat-induzierten Schädigungen in Mäusen sowie bei durch Eisen- und Amygdala-kindling verursachte Schädigungen in Ratten (Lapin et al., 1998; Kabuto et al., 1998; Mevissen und Ebert, 1998; Southgate et al., 1998). Melatonindefizit führte in Ratten nach Schlaganfall und exzitotoxischen Läsionen zu größerer Schädigung des Gehirns und bestätigen die antioxidative Wirkung des Melatonins (Manev et al., 1996).

Neben dem antioxidativen Potential des Melatonins sind eine Reihe von anderen neuroprotektiven Mechanismen diskutiert worden. Dazu gehörten Interaktionen mit Calmodulin (Benitez-King und Anton-Tay, 1993; Huerto-Delgadillo et al., 1994) und mikrotubulären Komponenten (Huerto-Delgadillo et al., 1994), die Blockade des Anstiegs intrazellulärer Ca2+-Spiegel (Pappolla et al., 1997), die Erhaltung der zellulären Glutathionhomöostase (Floreani et al., 1997; Dabbeni-Sala et al., 2001), die Hemmung der Aktivierung von NF-κB (Nukleärer Faktor kappa B) durch Zytokine wie Tumor-Nekrose-Faktor-α (Mohan et al., 1995), Hemmung der Expression der induzierbaren NO-Synthase auf Transkriptionsebene (Gilad et al., 1998) und die Veränderungen der Genexpression antioxidativer Enzyme (Antolin et al., 1996).

Über eine mögliche Beteiligung des Melatonins bei der Alzheimer’schen Erkrankung wurde spekuliert, da die physiologischen Melatoninspiegel im Alter abnehmen, bei Patienten mit der Alzheimer’schen Erkrankung jedoch im Vergleich zum gleichen Alterskollektiv gesunder Probanden zusätzlich vermindert sind (Übersicht bei Cardinali et al., 2002). In den ersten, an sehr kleinen Patientenkollektiven durchgeführten, klinischen Studien zur Wirkung von Melatonin bei Patienten mit der Alzheimer’schen Erkrankung wurden erste Hinweise für eine Verlangsamung der Progression der Erkrankung unter Melatoninbehandlung (9 mg Melatonin pro Tag für 22 – 35 Monate) gefunden (Brusco et al., 1998; 2000; Cardinali et al., 2002).

1.2.2 Estradiol als neuroprotektive Substanz


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Das Steroidhormon Estrogen spielt eine essentielle Rolle im Wachstum, Differenzierung und Funktion der peripheren Gewebe des Reproduktionssystems. Daneben beeinflusst dieses Hormon auch die Knochenhomöostase und das kardiovaskuläre System, in dem es auch kardioprotektive Wirkungen vermittelt (Übersichtsarbeit bei Kuiper et al., 1998). Von besonderem Interesse ist, dass Estrogen auch im Zentralnervensystem, in dem sowohl der Estrogenrezeptor-α als auch der erst 1995 entdeckte Estrogenrezeptor-β ubiquitär exprimiert sind, diverse neuronale Funktionen, einschließlich Lern- und Gedächtnisprozesse, beeinflusst. Die Verteilung der Estrogenrezeptoren im Gehirn ist geschlechtsunspezifisch (Kuiper et al., 1997; 1998).

Eine Reihe von epidemiologischen Studien assozierten die Substitutions-therapie mit Estrogenen in der Menopause mit einem verminderten Risiko für das Auftreten der Alzheimer’schen Erkrankung und des M. Parkinson (Paganini-Hill und Henderson; 1994; Robinson et al., 1994; Sherwin, 1994; Birge, 1996; Tang et al., 1996; Yaffe et al., 1998; Costa et al., 1999; Saunders-Pullman et al., 1999). So konnten z.B. Tang und Mitarbeiter (1996) in einer Longitudinalstudie über 1 – 5 Jahren an 1120 Frauen zeigen, dass abhängig von der Dauer der Estrogensubstitution eine Verminderung des Risikos an Morbus Alzheimer zu erkranken, zu beobachten war (Risiko 5.8% bei Estrogenbehandlung versus 16.3% ohne Estrogenbehandlung). Insgesamt sind die günstigen Wirkungen auf die Kognition jedoch als marginal zu bewerten (siehe Metastudie Yaffe et al., 1998). Günstige Effekte von Estrogen auf die Mortalität und Morbidität wurden hingegen bei zerebraler Ischämie demonstriert (Lafferty and Fiske, 1994; Grodstein et al., 1996; Hurn and MacRae, 2000).

Die epidemiologischen Hinweise auf die Verminderung des Risikos des Auftretens der Alzheimer’schen Erkrankung ließen auch therapeutische Erfolge bei Manifestation der Erkrankung erwarten. Die erste prospektive, doppelblinde, randomisierte, placebo-kontrollierte Studie mit einer ausreichend hohen Zahl von Patienten mit milder oder mittelgradiger Alzheimer’scher Erkrankung wurde im Februar 2000 veröffentlicht. Der Erfolg einer Estrogensubstitutionstherapie wurde an insgesamt 120 Patienten über ein Jahr getestet. Es wurden jedoch weder Hinweise für eine Verbesserung der Kognition und funktioneller Veränderungen gefunden, noch wurde die Progression der Alzheimer’schen Erkrkankung verlangsamt (Mulnard et al., 2000). Ähnlich negative Befunde wurden in einer 12-Wochen-Studie an 50 Patienten mit Alzheimer’scher Erkrankung erhoben (Wang et al., 2000). In Summe weisen die vorliegenden Untersuchungen darauf hin, dass eine Estrogensubstitutionstherapie zwar [Seite 16↓]möglicherweise in der Lage ist, das Risiko für das Auftreten einer Alzheimer’schen Erkrankung herabzusetzen, jedoch bei bereits manifester Erkrankung ineffektiv bleibt.

Diese klinischen Befunde könnten nach einer Hypothese von Hogervorst und Smith auf mögliche Interaktionen von Estrogenen mit Faktoren zurückgeführt werden, die mit der Alzheimer’schen Erkrankung assoziiert sind (Hogervorst und Smith, 2002). Im Rahmen des „Oxford project to investigate memory and ageing“ zeigte sich an 66 Frauen mit Alzheimer’scher Erkrankung und Kontrollgruppe eine Assoziation der Krankheit mit einer erhöhten Ratio von Estradiol zur Gesamtmenge aller Estrogene (Estradiol + Estron), so dass in einer schrittweisen logistischen Regressionsanalyse im Vergleich zur Kontrollgruppe diese Ratio als Prädiktor für die Erkrankung eruiert werden konnte (Odds Ratio: 1,06; 95%-Confidenzintervall: 1,01 – 1,11; p < 0,01). In einer multiplen Regressionsanalyse zeigte sich, dass die Schwere der Demenz mit einer Interaktion zwischen der hohen Ratio von Estradiol zur Gesamt-estrogenmenge und dem Serumfolatspiegel assoziiert war. Die Erkrankung war also mit einer hohen Estrogenratio assoziiert, jedoch war in Individuen mit einer hohen Ratio die Schwere der Demenz niedriger bei denjenigen mit hohen Serumfolatspiegeln. Die Autoren folgern, dass bei kausalem Zusammenhang der Faktoren, eine Estrogensubstitutionstherapie in Kombination mit Folat-Substitution möglicherweise erfolgversprechend sein könnte (Hogervorst und Smith, 2002). Andere mögliche Ursachen für den fehlenden Therapieerfolg der Estrogensubstitutionstherapie werden in der folgenden Untersuchung angesprochen.

Die neuroprotektive Wirksamkeit von Estrogenen wurde inzwischen experimentell in verschiedenen Modellen der Neurodegeneration und ischämischen Schädigung in vivo und in vitro nachgewiesen. In ovarektomierten Ratten verkleinerte Estradiol das Ausmaß der Hirnschädigung nach zerebraler Ischämie (Dubal et al., 1998). Aber auch in nicht mehr reproduktionsfähigen alten weiblichen Ratten schützte Estradiol vor ischämischer Schädigung (Alkayed et al., 2000). In primären neuronalen Kulturen, in organotypischen hippokampalen Kulturen und in der hippokampalen Zellinie HT22 verkleinerte Estradiol die neuronale Schädigung in Reaktion auf Hypoxie, Exzitotoxine, Superoxidanionen und H2O2 (Goodman et al., 1996; Singer et al., 1996; Behl et al., 1997; Regan und Guo, 1997; Weaver et al., 1997; Sawada et al., 1998). Darüberhinaus reduziert Estradiol die neurotoxischen Wirkungen von β-Amyloid sowie die Bildung von β-Amyloid in Zellkulturen (Gridley et al., 1997; Keller [Seite 17↓]et al., 1997; Mook-Jung et al., 1997; Bonnefont et al., 1998; Xu et al., 1998; Pike, 1999). In transgenen Mausmodellen der Amyloidose entwickelten ovarektomierte Mäuse mit Estradioldefizienz höhere Spiegel von β-Amyloid und diese Akkumulation von β-Amyloid in senilen Plaques des Gehirns konnte in den ovarektomierten Mäusen durch Substitution von Estradiol verhindert werden (Zheng et al., 2002). Die Überexpression von β-Amyloid-Precursorprotein-mRNA nach fokaler Ischämie in weiblichen ovarektomierten Ratten wurde durch eine einzige subkutane Injektion von 17 β-Estradiol (100 µg / kg) 2 h vor Okklusion der Arteria cerebri media vermindert (Shi et al., 1998).

Als Mechanismen für die neuroprotektive Wirkung der weiblichen Sexualhormone werden sowohl genomisch als auch nicht-genomisch vermittelte Effekte beschrieben (Übersichtsarbeiten von Behl und Holsboer, 1999; Lee und McEwen, 2001; Behl, 2002). Für die von Estrogenrezeptoren unabhängigen Wirkungen spielen sowohl direkte antioxidative Eigenschaften als auch eine Interaktion an möglichen Bindungsstellen an der neuronalen Membran (Membranrezeptoren) eine Rolle (Behl und Holsboer, 1999). Über derartige Membranrezeptoren könnten die Neurotrans-mission und Erregbarkeit der neuronalen Membran moduliert werden (Bicknell, 1998; Gu et al.,1999). Die über die klassischen Estrogenrezeptoren-α und β-vermittelten Effekte auf die neuronale Gentranskription führen zum Auswachsen von Neuriten, Synaptogenese, Expression von neurotrophischen Faktoren und erhöhter Synthese von Acetylcholin.

Die klassischen Estrogenrezeptoren α und β weisen im Zentralnervensystem sowohl eine unterschiedliche Verteilung als auch unterschiedliche Regulation auf (Shughrue et al., 1997; Laflamme et al., 1998). Im zerebralen Kortex der Ratte ist die Estrogenrezeptor-α-mRNA nicht oder in wenigen Zellen der Lamina IV – V nur schwach nachweisbar, während die Estrogenrezeptor-β-mRNA in vielen Zellen verteilt über die Laminae IV – VI des Isokortex detektierbar ist (Shughrue et al., 1997; Laflamme et al., 1998). Der Estrogenrezeptor-α ist auch in kultivierten Neuronen des embryonalen Rattenkortex (E14) kaum exprimiert (Zhang et al., 2000). Beide Estrogenrezeptortypen weisen zwar die gleiche Affinität für das endogene Estrogen 17 β-Estradiol auf (Kuiper et al., 1997), jedoch besitzen beide Rezeptorformen unterschiedliche Affinitäten für die „Estrogen-Response-Elemente“ und zeigen somit ein unterschiedliches, teilweise konträres Muster der Genaktivierung (Hyder et al., 1999). [Seite 18↓]Für die neuroprotektive, antiapoptotische Wirkung kommen insbesondere zwei Transkriptionseffekte, die ausschließlich über den Estrogenrezeptor-α vermittelt werden, in Frage. Erstens führt der aktivierte Estrogenrezeptor-α zu einer raschen Aktivierung des Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor-1-Rezeptorwegs [Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) receptor pathway] und der damit verbundenen Signal-Kaskade (Kahlert et al., 2000). IGF-1 stellt einen wichtigen Faktor für das Überleben von Neuronen dar. Zweitens gibt es Hinweise für einen Zusammenhang zwischen Estrogenrezeptor-α und der unter 17 β-Estradiol auftretenden erhöhten Expression von Bcl-xL (Pike, 1999). Konträre Effekte beider Rezeptorformen wurden hinsichtlich der Regulation des AP1-Elements und der Transkriptionsfaktoren Fos und Jun beschrieben. Estrogenrezeptor-α vermittelt eine Aktivierung der Transkription, während Estrogenrezeptor-β die Transkription am AP1-Element inhibiert (Paech et al., 1997).

1.3 Modelle der Zelldegeneration in vitro

Zum Nachweis einer neuroprotektiven Wirkung einer Substanz stehen eine Reihe von in vitro-Modellen der Neurodegeneration zur Verfügung. In der vorliegenden Untersuchung wurden als Neurodegenerationsmodelle mit vorwiegend nekrotischem, neuronalem Schaden der Glutamat-induzierte Untergang der neuronalen Zellen und der Sauerstoff-Glukose-Entzug (oxygen-glucose deprivation; OGD) verwendet. Die OGD wurde als Modell für exzitotoxisch und durch oxidativen Stress ausgelösten Schaden gewählt. Von einem protektiven Effekt durch Behandlung mit Melatonin gegen Hypoxie bzw. Reoxygenierung in primären, kortikalen Neuronenkulturen der Ratte (Cazevieille et al., 1997) und gegen transiente Vorderhirnischämie in Ratten (Cho et al., 1997) wurde berichtet. Zur Auslösung einer neuronalen Apoptose wurden drei verschiedene Exzitotoxin-unabhängige Degenerationsmodelle ausgewählt. Als ein Standardapoptosemodell wurde Staurosporin eingesetzt, ein Mykotoxin, von dem bekannt ist, dass es virtuell in allen Zellarten, einschliesslich in neuronalen Primärkulturen einen programmierten Zelltod auslösen kann (Raff et al., 1993; Falcieri et al., 1993; Bertrand et al., 1994; Koh et al., 1995; Wiesner et al., 1996). Zusätzlich wurde durch Einsatz des Neurotoxins Ethylcholin-Aziridinium (AF64A) ein Modell entwickelt, das durch das Auftreten eines verzögerten apoptotischen Zelltodes charakterisiert ist. AF64A, das initial zur Erzeugung eines in vivo-Modells der cholinergen Hypofunk[Seite 19↓]tion eingeführt wurde (Fisher et al., 1982; Übersichtsarbeit bei Hanin, 1996) führt zur Auslösung eines neuronalen Zelltods in vivo und in vitro durch Aktivierung von Mechanismen der Apoptose (Rinner et al., 1997; Lautenschlager et al., 2000). Durch die Struktur-homologie mit dem Cholin-Molekül (siehe Abb. 4) wird AF64A über den nieder- und hochaffinen Cholintransporter in die Zellen aufgenommen.

Abb. 4: AF64A und Cholin. Die Strukturhomologie erklärt die Aufnahme von AF64A über den Cholintransporter in Zellen. Der Aziridiniumring am AF64A-Molekül ist hochreaktiv und führt zu chemischen Interaktionen mit Makromolekülen.

Eine Beteiligung von Glutamat bei der Neurotoxizität durch AF64A in vivo wurde ausgeschlossen (Hörtnagl et al., 1991). In primären, neuronalen Kulturen verschiedener Hirngebiete löst AF64A einen verzögerten, neuronalen Zelltod innerhalb von 2 – 3 Tagen aus (Lautenschlager et al., 1997; 2000). Als ein drittes Modell fungierte die apoptotische Komponente der OGD, die durch die Zugabe von Glutamatantagonisten demaskiert wurde (Gottron et al., 1997).


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18.04.2005