3 Material und Methoden

3.1 Primäre, neuronale Zellkulturen

Die primären, neuronalen Zellkulturen der Großhirnrinde (Kortex), des Hippokampus und des Septums wurden aus Embryonen am Embryonaltag E17 von trächtigen Wistarratten gewonnen. Die Kulturen wurden nach der Methode von Brewer (1995) mit folgenden Veränderungen präpariert.

Die Wistarrattenweibchen wurden mit Äther in eine tiefe Narkose versetzt und dann durch Genickbruch getötet. Sofort wurde das Fell mit 70% Alkohol desinfiziert, der Uterus entnommen und in eine sterile Glaspetrischale überführt. Alle weiteren Schritte wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Die Embryonen wurden aus dem Uterus bicornis herauspräpariert und in kalte phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Calcium/Magnesium (PBS) überführt. Die äußere Haut des Kopfes und [Seite 22↓]der knöcherne Anteil der Schädelplatte wurden unter dem Mikroskop (Leica 2000) eröffnet und die Gehirne entnommen. Nach Entfernung der Hirnhäute (Meningen) wurden Kortex, Hippokampus und Septum herauspräpariert, dreimal mit PBS ohne Calcium/Magnesium gespült und 15 min bei 36,5 ° C mit Trypsin/EDTA [0,05 / 0,02% Gewicht pro Volumen (w/v)] in PBS ohne Calcium/ Magnesium inkubiert. Anschließend wurde wieder mit PBS und danach mit Nährmedium gespült (Eagle´s modifiziertes Medium, im folgenden Dissoziationsmedium genannt, mit 10% fötalem Kälberserum, 10 mM HEPES, 44 mM Glukose, 100 internationalen Einheiten (IE) Penicillin und Streptomycin / ml, 2 mM L-Glutamin, 100 IE Insulin / l).

Das Gewebe der drei Hirnregionen wurde dann mit einer Glaspasteurpipette in diesem Medium vorsichtig dissoziiert und dann zentrifugiert (210 x g für 2 min bei Raumtemperatur).

Das Pellet wurde in sogenanntem Startermedium aufgenommen (Neurobasales Medium (NBM) mit B27-supplement (10 ml auf 500 ml), 100 IE Penicillin / Streptomycin / ml, 0,5 mM L-Glutamin und 25 µM Glutamat).

Die Zellzahl wurde mittels einer Fuchs-Rosenthal-Zählkammer bestimmt. Trypanblau wurde zur Färbung toter Zellen verwendet. So konnte ein Überblick über das Verhältnis von lebenden zu toten Zellen gewonnen werden und eine Aussage zur Qualität der Präparation gemacht werden.

Die Zellen wurden in einer Dichte von 200.000 / cm2 in Zellkulturplatten mit 6 oder 24 Vertiefungen in Startermedium ausgesät, die zuvor in folgender Weise beschichtet wurden: Inkubation mit Poly-L-Lysin (0,5% w/v in PBS) für 1 h bei Raumtemperatur, Spülen mit PBS, erneute Inkubation mit Kollagen G (0,03% w/v in Dissoziationsmedium) für 1 h bei 37° C, anschließendes zweimaliges Spülen der Zellkulturplatten mit PBS.

In die Vertiefungen der Zellkulturplatten wurde dann Startermedium vorgelegt und im nächsten Schritt die Zellen ausgesät. Die Kulturen wurden in Brutschränken mit 5% CO2-Gehalt und 36,5° C gehalten. Das Medium wurde am 4. Tag beginnend zweimal pro Woche jeweils zur Hälfte durch neues Neurobasales Medium ersetzt, jetzt aber ohne Beigabe von 25 µM Glutamat (sonst wie oben beschrieben.)


[Seite 23↓]

3.2  Modelle der Zellschädigung

Die Kulturen wurden in allen Zellschädigungsmodellen nach 10 – 14 Tagen Kulturzeit behandelt (days in vitro; DIV). Vor Versuchsbeginn wurde das Medium aller Vertiefungen einer oder mehrerer Platten gesammelt, gemischt und zur Hälfte durch neues Medium ersetzt. Dieses Gemisch wurde allen Zellen vor dem Start des Experiments verabreicht. Das Ergebnis waren identische Volumina und Zusammensetzung des Mediums für alle Vertiefungen als Ausgangsbedingung zu Beginn des Experiments.

3.2.1 Ethylcholin-Aziridiniumion (AF64A)

AF64A wurde aus Acetylethylcholin Mustard nach der Methode von Fisher hergestellt (Fisher et al., 1982). Die Mustard-Form wurde in bidestilliertem Wasser in der Konzentration von 1 mM Stammlösung aufgelöst und für 20 Minuten auf einen pH von 11,5, danach für eine Stunde auf einen pH von 7,3 titriert. Die Kontrolllösung wurde ebenfalls auf die pH-Werte eingestellt, anschließend filtriert und zur Verdünnung der Stammlösung verwendet.

AF64A wurde dem Medium im Verhältnis 1 : 25 für 5 oder 72 h zugegeben, so dass eine Endkonzentration von 10, 40 oder 80 µM erreicht wurde. Nach einmaligem Auswaschen wurde konditioniertes Medium, also Medium das vorher auf neuronalen Kulturen durch die Zellen in seiner Zusammensetzung optimiert worden war, ohne AF64A zurückgegeben. Vehikel-behandelte Zellen erhielten die gleiche Behandlung mit Kontrolllösung.

3.2.2 Staurosporin

Staurosporin wurde als 10 mM Stammlösung in Dimethylsulfoxid (DMSO) hergestellt und mit PBS zu 10 und 30 µM Lösungen verdünnt, die dem Medium im Verhältnis 1 : 100 zugegeben wurden. Daraus ergaben sich Endkonzentrationen von 100 und
300 nM Staurosporin im Medium. Das Vehikel wurde in gleicher Weise verdünnt und mit der höchsten DMSO-Konzentration dem Medium zugegeben.


[Seite 24↓]

3.2.3  Kombinierter Sauerstoff- und Glukoseentzug (OGD)

Für die OGD wurde das Medium abgenommen und bei 36,5° C aufgehoben. Die Kulturen wurden zweimal mit PBS mit Ca2+ und Mg2+ gespült und in einer deoxygenierten gepufferten Salzlösung ohne Glukose, BSL0 (bestehend aus: 143,8 mM Na+, 5,5 mM K+, 0,8 mM Ca2+, 0,8 mM Mg2+, 125,3 mM Cl-, 26,2 mM HCO3-, 1,0 mM H2SO42-, 0,8 mM SO42-, 0,01 mM Glycin, pH 7,4) der OGD bei einem pO2 < 2 mm Hg (5% CO2 / 95% N2) für 120 – 140 Minuten unterzogen (Bruer et al., 1997). Der pO2 wurde mit einer polarographischen Elektrode gemessen (Licox, GMS, Kiel). In der Hypoxiekammer wurde die Temperatur bei 36,5 + 0,5° C und die Luftfeuchtigkeit (> 90%) konstant gehalten. Anschließend wurde das aufgehobene Medium wieder zurückgegeben.

Für eine Standardisierung des Zellschadens wurde ein maximaler Zellschaden mit 5 mM Glutamat ausgelöst (als „totaler Zelltod“ bezeichnet).

Als Kontrollen wurden Schwesterkulturen für die gleiche Zeit (120 – 180 Minuten) mit bilanzierter Salzlösung mit 20 mM D-Glukose (BSL20) inkubiert und im Brutschrank belassen.

3.2.4 OGD mit Blockade der exzitotoxischen Komponente mittels des N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptorantagonisten (NMDA) MK801

MK801 wurde dem Medium der Zellkultur in einer Endkonzentration von 10 µM
(100 x Stammlösung in PBS) 30 Minuten vor der OGD (180 Minuten) und den jeweiligen bilanzierten Salzlösungen (BSL0 und BSL20) zugegeben.

3.2.5 Glutamat

Vor der Glutamatexposition wurde die Hälfte des Mediums abgenommen und bis zur Wiederverwendung bei 36,5° C gelagert. 100 µM Glutamat (100 x Stammlösung in PBS) wurde dem Medium der Zellkultur für 0,5 Stunden zugesetzt, anschließend mit PBS mit Ca2+ und Mg2+ gespült und das ursprüngliche Medium wieder zugeführt.


[Seite 25↓]

3.3  Vorbereitung der Zellkulturen, Versuchsaufbau und pharma-kologische Interventionen

Neuronale Primärkulturen wurden nach 10 DIV Kultivierungszeit am Versuchstag ein Teil des Mediums entnommen und in einem Falcon-Tube gemischt. Die gleiche Menge frisches neurobasales Medium wurde dem schon konditionierten Medium zugegeben und 0,5 ml dieser Mischung pro 24er-Vertiefung oder 2 ml pro 6er-Zellkulturvertiefung zugegeben, nachdem zuvor das restliche Medium aus den Zellkulturen abgesaugt wurde. So wurden mögliche Unterschiede in der Zusammensetzung und Menge des Mediums vor Versuchsbeginn ausgeglichen. Die folgenden Substanzen sind in unterschiedlichen Vehikeln aufgelöst worden. Diese Vehikel werden in Tabelle 1 für jede Substanz einzeln aufgeführt und wurden bei Verdünnungsreihen immer in der höchsten Konzentration den Kontroll-schwesterkulturen zugegeben. Vehikel und Substanzen wurden als 100fach-konzentrierte Lösung angesetzt, so dass 5 μl pro 24er-Vertiefung und 20 μl pro 6er-Vertiefung in die Kultur zugegeben wurden. Angegeben sind Endkonzentrationen in der Zellkultur. Die Konzentrationen sind der Literatur entnommen und / oder in eigenen Versuchen überprüft worden. Die Applikationszeitpunkte variierten je nach Substanz und Schadensmodell und sind im Ergebnisteil aufgeführt.


[Seite 26↓]

Tab. 1: Verwendete Substanzen, Lösungsvehikel, Auflösung, Verdünnung und verwendete Endkonzentration für die verwendeten Substanzen in alphabetischer Reihenfolge.

Substanz

Vehikel

Auflösung und Verdünnung

N-tert-Butyl-α-Phenylnitron (PBN)

DMSO (0,2% End-konzentration)

500 mM Stammlösung; Verdünnung mit H2O; Endkonzentrationen von
0,1 und 1,0 mM

Cycloheximid (CHX)

Neurobasales Medium

500 ng / ml Endkonzentration

Dimethylthiourea (DMTU)

PBS

Endkonzentrationen von

1 und 10 mM

17 β-Estradiol (Cyclodextrin-gekoppelt)

PBS

Wasserlösliches 17 β-Estradiol mit Endkonzentrationen von
30 nM – 10 μM

ICI 182,780

DMSO

(0,001% Endkonzentration)

100 mM Stammlösung, Verdünnung mit H2O, Endkonzentration: 1 μM

LY 294002

DMSO

(0,008% Endkonzentration)

65 mM Stammlösung, Verdünnung mit H2O,
5 μM Endkonzentration

Melatonin

Ethanol (Endkonzentration von 0,01% in der Zellkultur)

20 mM Stammlösung in 40% Ethanol in H2O, Verdünnung in PBS mit Endkonzentrationen von 0,01 – 2,00 mM.

Tamoxifen

Ethanol

(0,01% Endkonzentration)

10 mM Stammlösung in reinem Ethanol, Verdünnung in H2O, Endkonzentration 1 μM

Z-VAD-FMK

DMSO

(0,2 % Endkonzentration)

50 mM Stammlösung in DMSO wurde mit H2O weiterverdünnt und eine Endkonzentration von 100 μM eingesetzt

3.4 Evaluierung der Zellschädigung

Das Schädigungsausmaß wurde erstens qualitativ durch Beurteilung der Morphologie der Zellen mittels Phasenkontrastmikroskopie oder demTerminale-Deoxynukleotidyl-Transferase-mediierten dUTP Nick-End Labeling (TUNEL-Färbung) [Seite 27↓]apoptotischer Zellen sowie Analyse der oligonukleosomalen DNS-Fragmentierung und zweitens quantitativ mit verschiedenen biochemischen Assays vorgenommen. Dazu gehörten die Bestimmung der Laktatdehydrogenase (LDH)-Aktivität im Medium als Maß des Verlusts der Zellmembranintegrität sterbender Zellen, sowie die Messung des Thiazolylblau (MTT)-Metabolismus lebender Zellen. Ebenfalls wurden TUNEL-gefärbte Zellen gezählt. Auch die semiquantitative Analyse der Spaltprodukte des α-Fodrins infolge von Protease-aktivität durch Calpaine und / oder Caspasen wurde zur Beurteilung der Zellschädigung eingesetzt.

Ein Schwerpunkt bei der Evaluierung der Zellschädigung lag auf der Unterscheidung von Apoptose und Nekrose bzw. möglichen Zwischenformen des Zelluntergangs. Die unten näher beschriebenen Methoden der Evaluierung von Zellschäden sind zur Unterscheidung der Art des Zelluntergangs unterschiedlich geeignet worauf bei der Beschreibung der Methode jeweils kurz eingegangen wird.

3.4.1 Phasenkontrastmikroskopie

Die morphologischen Veränderungen der Zellkulturen nach Schädigung wurden mit einem Phasenkontrastmikroskop (Leitz, DM IL) und einer Photokamera (Minolta, Dynax 5xi) nach 24, 48 und 72 h dokumentiert. Die lebenden Neurone erscheinen hier mit relativ grossen Zellkörpern mit glatter Zellmembran, im Verhältnis zum relativ schmalem Zytoplasmasaum grossen Zellkern mit mehreren Nukleolen und einem ausgeprägten Netzwerk aus langen Neuriten.

Morphologische Charakteristika der Apoptose sind Neuritendegeneration, Schrumpfung des Zellkörpers und Ansammlung kondensierter Partikel im Zellkern und Zerfall in apoptotische Körperchen, die in der Zellkultur mangels der Möglichkeit der Phagozytose schliesslich lysiert werden.

Die Nekrose geht mit einer Schwellung des Zellkörpers und des Zellkerns einher. Die Zellen zeigen ein balloniertes Bild mit doppelter Grösse des Zellkörpers und glatt begrenzter Membran. Freie Kernreste nach Zelllyse treten auf.


[Seite 28↓]

3.4.2  Laktatdehydrogenase (LDH)-Aktivitätsmessung

Die LDH-Aktivität wurde im Überstand der Zellkulturen nach verschiedenen Zeiten gemessen. Die LDH-Ausschüttung in das Medium der Zellen gilt als Maß für die Desintegrität der Zellmembran. Der Anstieg der LDH-Aktivität ist unabhängig von der Art des Zelluntergangs zu beobachten. Entscheidende Unterschiede ergeben sich aus der Kinetik und den Maximalwerten der LDH-Ausschüttung bei den verschiedenen Zellschädigungsmodellen. Die LDH-Ausschüttung läßt keinen Rückschluß auf die Todesform zu, korreliert aber außerordentlich gut mit der Zahl untergegangener Zellen (Koh et al., 1987).

Zur Messung der LDH-Aktivität wurden 25 µl Medium jeder Vertiefung als Probe entnommen und in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte gegeben. Außerdem wurden noch 25 µl Enzyme-Standard control-2-E in Doppelbestimmung auf jede Platte pipettiert. Dieser Standard von Sigma enthielt eine LDH-Aktivität von 500 Units/ml.

Jeder Vertiefung der Platte wurde anschließend 125 µl 0,1 M LDH-Puffer zugefügt. Dieser Puffer wurde als 10 x Stammlösung (1 M) zubereitet. Dazu wurden 45,3 g KH2PO4 (MW 136,1) und 116,1 g K2HPO4 (MW 174,2) in circa 800 ml H2Obidest gelöst, der pH-Wert auf 7,4 eingestellt, auf 1000 ml aufgefüllt und mit H2O 1 : 10 verdünnt.

Jeder Vertiefung wurde im darauffolgenden Schritt 100 µl β-NADH-Lösung zugefügt, die jeden Tag frisch hergestellt wurde [3 mg β-NADH, reduzierte Form (MW 709,4) / 10 ml 0,1 M LDH-Puffer]. Die Mikrotiterplatte wurde im nächsten Schritt in das Plattenlesegerät gestellt. Den Vertiefungen wurde nun 25 µl Pyruvatlösung zugefügt [1,25 g Na-Pyruvat (MW 110) / 500 ml 0,1 M LDH-Puffer] und diese sofort anschließend bei 340 nm Wellenlänge zehn Mal alle 20 Sekunden gemessen. Die Extinktionsabnahme bei 340 nm zeigte die Abnahme von Substrat (β-NADH) in dieser Zeit als annähernd lineare Funktion. Die negative Steigung dieser Funktion konnte nun auf die Extinktionsabnahme der Standardlösung mit 500 Units Aktivität (Sigma enzyme control 2-E) bezogen werden, so dass sich die LDH-Aktivitäten in Units / ml Medium der Proben errechnen ließen.


[Seite 29↓]

3.4.3  Thiazolylblau (MTT)-Metabolismus

Dieser metabolische Assay basiert auf der Spaltung des gelben Tetrazoliumsalzes MTT (Thiazolylblau) in das purpurrote Formazan durch mitochondrielle Enzyme in metabolisch aktiven Zellen. Eine Unterscheidung von Apoptose und Nekrose ergibt sich nur aus der Kinetik des Verlusts der metabolischen Aktivität, tritt jedoch grundsätzlich bei beiden Zelluntergangsformen auf.

Es wurden den Zellen 500 µg MTT / ml Medium zugegeben. Nach einer Inkubationszeit von 70 – 80 Minuten bei 36,5° C wurde die Reaktion mit 10%-igem Natrium-Dodecyl-Sulfat (SDS) in 0,01 M HCl gestoppt und anschließend 48 h bei 36,5° C mit Verdunstungsschutz durch Parafilm nochmals inkubiert. Die Detektion erfolgte photometrisch im Plattenlesegerät bei 550 nm. Als Leerwert wurde dieselbe Prozedur mit Medium ohne Zellen durchgeführt. Dieser Leerwert wurde von jeder Probe abgezogen. Die quantitative Darstellung erfolgte in Prozentanteilen der Kontrollen.

3.4.4 Terminale-Deoxynukleotidyl-Transferase-mediiertes dUTP Nick-End Labeling und Zellzählung

Terminale-Deoxynukleotidyl-Transferase-mediiertes dUTP Nick-End Labeling (TUNEL-Färbung) wurde mit dem kommerziell erwerblichen ApopTag Kit (Qbiogene, Grünberg) nach den Angaben des Herstellers durchgeführt. Durch dieses Verfahren werden Strangbrüche der DNS markiert, die durch Endonukleaseaktivität in apoptotischen Zellen gebildet werden.

Für jedes Schadensmodell wurden die TUNEL-positiven Zellen aus 2 unabhängigen Präparationen bzw. Experimenten ausgewertet. Hierzu wurden vom verblindeten Experimentator in 20 zufällig ausgewählten, hochauflösenden Feldern (high power fields, entspricht 400x Vergrößerung) TUNEL-positive Zellen ausgezählt. Die Färbung wurde jeweils an drei Glasplättchen pro Kondition und Experiment durchgeführt.


[Seite 30↓]

3.4.5  DNS-Isolation und Gelektrophorese

Die Fragmentierung der DNS in der Gelektrophorese beruht auf der Aktivität von Endonukleasen, die bei Apoptose zu DNS-Fragmenten von charakteristischer Grösse (circa 180 Basenpaare) führt.

Die DNS wurde aus 2 x 106 Zellen isoliert, die 48 bzw. 72 h nach Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen von AF64A mit einem Zellschaber vom Boden der Plattenvertiefung gekratzt und im Medium in ein 2-ml Eppendorfgefäß überführt wurden. Die Zellsuspension wurde für 3 Minuten und 5000 rpm (Umdrehungen pro min) bei 4° C zentrifugiert (Hettich Universal RF, Rotor 1412, im folgenden immer eingesetzt). Es wurde ein modifizierter kommerzieller Easy-DNA-Kit (Invitrogen, Niederlande) benutzt. In Kürze beschrieben, wurde dem Pellet 350 μl von Lösung A (Lysepuffer) zugegeben, nach Durchmischung 10 min bei 65° C inkubiert und 150 μl von Lösung B (Präzipitationspuffer) zugegeben. Nach Zusatz von 500 μl Chloroform erfolgte eine Zentrifugation (15000 rpm, 10 min, 4° C). Die obere, wäßrige Phase wurde in ein neues Eppendorfgefäß überführt. Die weitere DNS-Präzipitation erfolgte dann durch die Zugabe von 1 ml eiskalten Ethanols (100%) und Inkubation für 30 min auf Eis. Nach erneuter Zentrifugation (15000 rpm, 10 min, 4° C) wurde der Überstand vorsichtig dekantiert und 500 μl Ethanol (80%) zum Waschen der DNS dazugegeben, ohne das Pellet erneut zu resuspendieren. Nach einer weiteren Zentrifugation (15000 rpm, 10 min, 4° C) wurde der Überstand vorsichtig abgesaugt und der Restalkohol konnte kurz verdunsten. Nach Resuspension der Pellets in 25 μl Tris / EDTA-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8) mit RNAse (2 μl RNAse / 100 μl Puffer) wurde die DNS quantifiziert. Dazu wurde die Probe 1 : 40 mit H2O verdünnt und bei 260 nm Wellenlänge die Extinktion bestimmt. Zur Berechnung der DNS-Menge in ng / μl wurde die folgende Formel eingesetzt:

Extinktion260 x 50 ng / μl x Verdünnungsfaktor = DNS-Menge in ng / μl. Ein Mikrogramm DNS wurde in einem einprozentigem Agarosegel in TBE-Puffer [1 Liter Puffer setzte sich zusammen aus 108 g Tris, 55 g Borsäure und 40 ml EDTA-Lösung (0,5 M, pH 8,0)] bei 70 Volt Spannung circa 180 Minuten aufgetrennt und die DNS mit Ethidiumbromid in einer Konzentration von 50 µg / ml gefärbt. Unter UV-Licht konnte die DNS visualisiert und mit einer Videokamera Bilder zur Dokumentation aufgenommen werden.


[Seite 31↓]

3.4.6  α-Fodrin-Spaltprodukte (Westernblot-Analyse)

Um zwischen vorwiegend nekrotischem oder apoptotisch induziertem Zelltod besser differenzieren zu können, haben wir uns die α-Fodrin-Spaltprodukte in den unterschiedlichen Modellen zur Differenzierung der Todesarten speziell angeschaut. Hierbei ist die Spaltung des intakten 240 kDa Proteins in die 150, 145 und 120 kDa großen Bruchstücke durch unterschiedliche Proteasen vermittelt, die Calpaine und die Caspasen. Laut Nath und Mitarbeitern (1996) ist das 120 kDa-Fragment spezifisch für die Apoptose und ist durch Caspase-3 vermittelt während das 150 kDa-Fragment sowohl durch Calpaine als auch durch Caspase-3 geschnitten wird (Übersichtsarbeit bei Wang, 2000).

3.5 Westernblots

3.5.1 Ernten der Zellen und Zelllyse

Vor dem Ernten wurden die Zellen einmal mit PBS gespült und dann mit
150 μl Lyse-Puffer pro 6-well-Vertiefung aufgenommen. Der Lysepuffer setzte sich aus folgenden Substanzen zusammen: 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, pH 7,8, 1% Triton x-100 und Proteinase-Inhibitor-Cocktail (Boehringer-Mannheim, Deutschland). Die Zellen wurden mit einer umgedrehten blauen Eppendorfpipettenspitze vom Boden der Plattenvertiefung gekratzt.

Das Zelllysat wurde in ein Eppendorfgefäß überführt und für 15 min auf Eis bis zur vollständigen Zelllyse inkubiert, gemischt und 20 min mit 12.000 Umdrehungen pro Minute bei 4° C zentrifugiert.

Der Überstand wurde in ein neues Eppendorfgefäß überführt und die Proteinkonzentration mit dem BCA-Protein Assay von Pierce bestimmt (siehe 3.5.2.).


[Seite 32↓]

3.5.2  Proteinquantifizierung (BCA-Assay)

Dazu wurde in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte eine Standardreihe mit einer Albuminkonzentration von 1 mg / ml in Doppelbestimmung pipettiert. Es wurden also 0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 15 und 20 μg Albuminstandardlösung pipettiert. Als Leerwert wurden 0 μl verwendet. Von den Proben wurden jeweils in Doppelbestimmung 2 und 4 µl pipettiert und alle Vertiefungen mit 250 µl der BCA-Reaktionslösung versehen. Die Mikotiterplatte wurde dann für 30 min bei 36,5° C inkubiert und darauf im Plattenlesegerät Extinktionen bei 550 nm gemessen.

Die Extinktionswerte der Proben lagen immer im Bereich der Standardkurve und die Extinktionswerte waren in diesem Bereich annähernd linear und proportional zur Proteinkonzentration. Nach linearer Regressionsanalyse der Standardkurve konnten die Proteinwerte errechnet werden.

3.5.3 Gelektrophorese, Blotting und Visualisierung der Banden

Die Proben wurden zu gleichen Teilen mit 2 x SDS-Probenpuffer (Laemmli-Puffer) verdünnt, der wie folgt zusammengesetzt war: 2 ml 0,625 M Tris/HCl, pH 6,8; 0,2 g SDS; 5 ml Glycerin; 0,1 ml Bromphenolblau (1%ige Lösung. in Ethanol); 2,4 ml H2Obidest. β-Mercaptoethanol wurde den Proben immer frisch in einer Konzentration von 1 : 20 zugesetzt.

Anschließend wurden die Proben 3 min im Wasserbad gekocht. Auf einem 10-prozentigen SDS-Polyacrylamid-Minigel wurden 10 µg Protein pro Slot geladen und über 40 Minuten elektrophoretisch aufgetrennt. Die Proteine wurden halbtrocken (semidry) auf Polyvinyldifluoridmembranen (PVDF-Membranen) mit 1 mA pro cm2 für 90 Minuten transferiert. Die PVDF-Membran wurde für eine Stunde mit 5% Trockenmilch in Tris-gepufferter Salzlösung mit Tween 20 (TBS-T-Puffer: 20 mM Tris/HCl, pH 7,5; 0,9% NaCl; 0,1% Tween 20) zum Block unspezifischer Bindungen der Antikörper inkubiert. Die Primärantikörperinkubation erfolgte über Nacht in TBS-T-Puffer mit 1% Trockenmilch mit 0,02% Natrium-Azid. Alle verwendeten Primärantikörper waren monoklonale Maus-Antikörper (siehe Materialien und Ergebnisse). Danach wurde die Membran für eine halbe Stunde mit TBS-T-Puffer mit mehrmaligem Austausch des Puffers gewaschen. Die Sekundärantikörperinkubation erfolgte gegen monoklonale [Seite 33↓]Maus-Antikörper, die mit Merrettichperoxidase gekoppelt waren. Die PVDF-Membranen wurden für eine Stunde in einprozentiger Trockenmilch in TBS-T-Puffer mit dem Sekundärantikörper inkubiert (Titer 1:5000). Danach wurde erneut eine halbe Stunde mit TBS-T-Puffer gewaschen. Die Detektion des Signals erfolgte mit einem ECL-Kit (enhanced-chemiluminescence-Kit) und Röntgenfilmen.

3.5.4 Semiquantitative Analyse der Bandendichten

Für die semiquantitative Auswertung der Bandenintensitäten wurden die gescannten Immunoblotfilme mit dem Computerprogramm Scion Image Software, Version Beta 4.0.2 (Scion Corporation) gemessen und ausgewertet. Dazu wurden die Bandendichten von drei verschiedenen und unabhängigen Western-blots getrennt für die jeweilige Struktur (kortikale und hippokampale Neurone) und für die unterschiedlichen Proteine verglichen. Die Bandendichten der jeweiligen Gruppen wurden für jeden Film addiert und als Gesamtsignal als 100% Pixel-Intensität definiert, so dass die individuellen Banden als Prozentzahl des Gesamtsignals errechnet werden konnten.

3.6 Immunzytochemie

3.6.1 Immunzytochemie zum Nachweis cholinerger Neurone

Für die Immunzytochemie zum Nachweis cholinerger Neurone wurden die septalen neuronalen Zellkulturen 18 Tage kultiviert und mit eiskaltem Methanol 15 Minuten lang bei Raumtemperatur fixiert. Die Peroxidase-basierte Immunzytochemie wurde mit einem affinitätsgereinigten Cholinacetyltransferase-(ChAT)-Antikörper aus der Ziege und dem DAKO LSAB Plus-Kit mit 3,3´-Diaminobenzidin als Chromogen nach Angaben des Herstellers durchgeführt.

3.6.2 Immunzytochemie zum Nachweis von Estrogenrezeptor-α und -β.

Für die Immunzytochemie der Estrogenrezeptoren wurden die Zellen auf Glasplättchen mit einem Durchmesser von 15 mm ausgesät und 12 Tage kultiviert. Die Kultu[Seite 34↓]ren wurden einmal mit PBS gewaschen und mit frisch zubereitetem vierprozentigem Paraformaldehyd (4% PFA) in PBS 15 min bei Raumtemperatur fixiert. Danach wurde erneut zweimal mit PBS gewaschen, mit 0,3% Triton-X-100 in PBS permeabilisiert. Geblockt wurde mit einer Lösung aus 10% Ziegenserum und 1% Kälberserumalbumin in PBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Die Kulturen wurden dann entweder mit dem monoklonalen Antikörper gegen Estrogenrezeptor-α aus der Maus oder mit dem polyklonalen Antikörper aus dem Kaninchen gegen Estrogenrezeptor-β jeweils mit einer Konzentration von 5 μg / ml für 48 h bei 4° C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurde der primäre Antikörper mit einem mit Texas-rot gekoppeltem zweiten Antikörper gegen Maus- bzw. Kaninchenantikörper aus der Ziege detektiert (Antikörpertiter: 1:500, 30 min bei Raumtemperatur). Nach gründlichem Waschen wurden die Glasplättchen mit einem Einbettungsmittel (ImmunoFluor mounting Medium) auf Objektträgern aufgezogen und mit einem konfokalen Mikroskop angeschaut. Für die Negativkontrollen wurden die Immunzytochemien ohne den ersten Antikörper durchgeführt.

3.6.3 Konfokale Mikroskopie

Es wurde ein MRC600 Confokal Imaging System (Bio-Rad, Hemel Hempstead, England) in Verbindung mit dem Nikon Optiphot Mikroskop benutzt (Galazzey et al., 1996). Ein Argon-Krypton-Laser wurde zur Anregung von Texas-Rot bei einer Wellenlänge von 568 nm benutzt. Das Bild wurde mit einem 63/1,30-Ölimmersionsobjektiv der Firma Leitz sichtbar gemacht. Alle konfokalen Parameter wurden während des Experiments konstant gehalten, um eine unverfälschte Vergleichbarkeit der septalen, hippokampalen und kortikalen Kulturen zu erhalten.

3.6.4 Quantifizierung der Ergebnisse

Aus jeder der drei Gehirnregionen, Kortex, Septum, und Hippokampus wurden 50 Felder zufällig von einem verblindeten Wissenschaftler ausgewählt und mit langsamer Geschwindigkeit gescannt. Jedes digitale Bild bestand aus 768 x 512 Pixels. Die durchschnittliche Pixelintensität jeder Zelle wurde selektiv von einer zweiten Person bestimmt und mit dem CoMOS Software-Programm (Biorad, Version 7.0) ausgewer[Seite 35↓]tet. Dazu wurden circa 140 Zellen pro Region mit dem Cursor umfahren und das Median dieser Zellen errechnet. Das Median der Pixelintensitäten der 140 Zellen wurde dann als Kriterium für die relative Unterscheidung in Zellen „hoher“ oder „niedriger“ Intensität gewählt.

3.7 Messung der Lipidperoxidation

Die Lipidperoxidation ist ein indirektes Mass für die Menge der freigesetzten Radikale (Wong et al., 1987). So kann auftretender oxidativer Stress abgeschätzt werden, indem die Menge von Malondialdehyd, dem Hydrolyseprodukt der Lipidperoxide gemessen werden.

Die Zellen wurden dazu in 6-well-Platten ausgesät, zu verschiedenen Zeitpunkten mit PBS gewaschen, um mechanisch mit einer umgedrehten blauen Eppendorfspitze unter Zugabe von 1200 µl TBA-Reagenz pro Vertiefung geerntet zu werden. Diese Zellsuspension wurde in 2-ml-Eppendorfgefässen auf Eis aufgenommen.

Dreißig ml des vollständigen Thiobarbitursäure-Reagenz (TBA-Reagenz) bestanden aus 15 ml Phosphorsäure (0,7 %), 5 ml TBA-Lösung (0,6 %), 1 ml Methanol-Lösung (1 %) und 9 ml H2O.

Zur Erstellung einer Standardkurve wurden 0, 2, 4, 6, 8 und 10 μM Lösungen von Tetraethoxypropan verwendet, das bei Erwärmung Malondialdehyd freisetzt. Die Proben und die Standardreihe wurden 1 h bei 96° C inkubiert und anschließend bei 4° C und 12.000 Umdrehungen pro min für 5 min zentrifugiert.

Im Überstand wurde die Malondialdehydkonzentration in den Proben und der Standardreihe photometrisch bei 532 nm bestimmt. Im Bereich der Malondialdehydkonzentrationen der Standardreihe verlief die Extinktion linear und die Malondialdehydkonzentrationen der Proben lagen alle im Bereich der Standardkurve. So konnten die Konzentrationen von Malondialdehyd in den Proben anhand der Standardkurve ermittelt werden (Methode nach Wong et al., 1987).

3.8 Statistik

Alle Daten werden als Mittelwerte + Standardfehler (SEM) gezeigt. Es wurden immer 2 – 3 Experimente zusammengefaßt. Dabei wurden die Rohdaten (zum Beispiel [Seite 36↓]LDH-Werte in Units / ml Medium) zusammengefaßt und erst anschließend die Kontrollwerte (basale LDH-Werte) zur besseren graphischen Darstellung in einigen Abbildungen abgezogen. Die basalen LDH-Werte sind in diesen Graphen in den Legenden jeweils angegeben.

Zur statistischen Analyse wurde ein one-way ANOVA (one-way analysis of variance) mit dem Tukey-Test als posthoc-Test durchgeführt. Als statistisch signifikant wurden Werte mit p < 0,05 gekennzeichnet. Die einzelnen Werte für p sind in den Legenden gekennzeichnet.

3.9 Materialien


[Seite 37↓]

Produkt

Herkunft

Acetylcholin Mustard

Research Biochemicals International, Natick, MA, USA

Agarose

Sigma, Deisenhofen

ApopTag Kit

Qbiogene, Grünberg

Äether

Merck, Darmstadt

B27-Supplement

Life-Technologies/BRL, Eggenstein

BAX-Antikörper (Maus), monoklonal

Santa Cruz, Biotechnology, Heidelberg

BCA-Protein Assay

Pierce

Bcl-2–Antikörper (Maus), monoklonal

Transduction Laboratories, Lexington, KY, USA

Bcl-xL –Antikörper (Maus), monoklonal

Transduction Laboratories, Lexington, KY, USA

Borsäure

Sigma, Deisenhofen

Bromphenolblau

Sigma, Deisenhofen

N-tert-Butyl-α-Phenylnitron (PBN)

Sigma, Deisenhofen

ChAT-Antikörper

Chemicon, Harrow, UK

Chlorophorm

Sigma, Deisenhofen

DAKO LSAB Plus-kit

DAKO Diagnostika, Hamburg

Dimethylsulfoxid (DMSO)

Sigma, Deisenhofen

Dimethylthiourea (DMTU)

Sigma, Deisenhofen

Easy-DNATM Kit

Invitrogen BV, Holland

EDTA

Sigma, Deisenhofen

ELISA-Platten 96-Loch

Falcon, Heidelberg

Enhanced Chemiluminescence Kit

Amersham oder Pierce, Rockford, IL, USA

17-β-Estradiol (cyclodextrin-gekoppelt)

Sigma, Deisenhofen

Estrogenrezeptor-α-Antikörper,

(Maus), monoklonal (Nr. 803-004-C050)

Alexis, Grünberg

Estrogenrezeptor-β-Antikörper, (Kaninchen), polyklonal

(Nr. 210-135-C050)

Alexis, Grünberg

Ethidiumbromid

Sigma, Deisenhofen

α-Fodrin-Antikörper (Maus), monoklonal

Biotrend-Chemikalien, Köln

D-Glukose

Sigma, Deisenhofen

L-Glutamin

Biochrom, Berlin

Glycerin

Sigma, Deisenhofen

ICI 182,780

Tocris Biotrend, Köln

ImmunoFluor Mounting Medium

ICN, Eschwege

Insulin

Berlin-Chemie

HEPES

Biochrom, Berlin

Kälberserum, fötales

Biochrom, Berlin

100 kb Standard

Gibco,

KH2HPO4

Sigma, Deisenhofen

KH2PO4

Sigma, Deisenhofen

Kollagen G

Biochrom, Berlin

LY 294002

Calbiochem, Bad Soden

Melatonin

Sigma, Deisenhofen

β-Mercaptoethanol

Sigma, Deisenhofen

MK801

Research Biochemicals International, Natick, MA, USA

Modified Eagle´s Medium

Biochrom, Berlin

Molekularstandard, high range

Sigma, Deisenhofen

MTT (Thiazolylblau)

Sigma, Deisenhofen

β-NADH, reduzierte Form

Sigma, Deisenhofen

Natriumdodekylsulfat (SDS)

Sigma, Deisenhofen

Neurobasales Medium (NBM)

Life Technologies/BRL, Eggenstein

Penicillin / Streptomycin

Biochrom, Berlin

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)

Biochrom, Berlin

Proteinase Inhibitor Cocktail

Boehringer Mannheim, Mannheim

Pyruvat

Sigma, Deisenhofen

Röntgenfilme

Kodak, Deutschland

Sigma Enzyme control 2-E

Sigma, Deisenhofen

Staurosporin

Sigma, Deisenhofen

Tamoxifen

Sigma, Deisenhofen

Tris

Sigma, Deisenhofen

Tris-HCl

Sigma, Deisenhofen

Trockenmilch, non-fat

Sigma, Deisenhofen

Trypanblau

Biochrom, Berlin

Trypsin/EDTA

Biochrom, Berlin

β-Tubulin-Antikörper (Maus), monoklonal

Boehringer Mannheim, Mannheim

Wistarratten

Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin, Berlin

Zellkulturplatten: 24 / 6 Vertiefungen

Falcon, Heidelberg

Anti-Maus-IgG-Immunglobulin-Antikörper (Ziege), Texas-rot-gekoppelt

Molecular Probes, Leiden, Holland

Anti-Maus-IgG-Immunglobulin-Antikörper (Ziege), Meerrettichperoxidase-gekoppelt (horseradish)

Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA

Z-VAD-FMK

Calbiochem / Novabiochem, Bad Soden


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
18.04.2005