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4  Ergebnisse

4.1 Charakterisierung des AF64A-Schadensmodells

4.1.1 Selektiver Zelltod cholinerger Neurone in septalen Kulturen bei niedriger AF64A-Dosis

In septalen neuronalen Kulturen konnte bei niedriger Dosierung die selektive Toxizität von AF64A auf cholinerge Neurone gezeigt werden (Abb. 5). AF64A wird durch die höhere Affinität des cholinergen Transportsystems in den cholinergen Neuronen des Septums schon in sehr niedrigen Konzentrationen (5 μM) aufgenommen und ist daher für diese Neurone besonders toxisch. In höheren Konzentrationen werden andere Neurone gleichermaßen geschädigt. Diese generelle neurotoxische Wirkung von AF64A in den höheren Dosen läßt sich am besten durch Interaktion mit dem niedrig-affinen Cholinaufnahmesystem erklären, das virtuell in allen Zellen vorhanden ist, da Cholin beispielsweise essentieller Baustein von Membranen ist (Hanin 1996; Lautenschlager et al., 2000).

Die schädigende Wirkung betrifft also nur in den niedrigen Dosisbereichen relativ spezifisch cholinerge Neurone, die mit Immunzytochemie gegen die Cholinacetyl-Transferase (ChAT) dargestellt werden können. In Abb. 5 erkennt man ChAT-positive Neurone in einer Primärkultur des Rattenseptums, die nach einem Zeitverlauf von 72 h nach AF64A-Gabe (5 μM) eine retrograde Degeneration der Dendriten und die beginnende Desintegration des Perikarions mit Ausstülpungen des Zytoplasmas erkennen lassen. Diese morphologischen Veränderungen zeigten sich bei benachbarten ChAT-negativen Neuronen nicht.

In höheren Dosen werden nicht-cholinerge Neurone ebenfalls geschädigt. In den in dieser Arbeit verwendeten Dosen von AF64A (5 – 80 μM) werden Astrozyten nicht betroffen, wie nach immunzytochemischer Darstellung mit Antikörpern gegen GFAP (glial acid fibrillary protein) als Astrozytenmarker gezeigt wurde (Lautenschlager et al., 2000). Der genaue Mechanismus der Apoptoseauslösung durch AF64A ist jedoch nicht geklärt (Lautenschlager et al., 2000).


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Abb. 5: ChAT-Immunzytochemie zur Darstellung cholinerger Neurone in septalen Zellkulturen. 5 μM AF64A wurde den Zellen am 18. DIV zugegeben und die Zellen nach 72 h fixiert und die ChAT-Immunzytochemie durchgeführt. A: Die ChAT-positiven Neurone zeigen eine retrograde Degeneration der Dendriten und den Beginn der Desintegrität des Perikarions (siehe Pfeil). ChAT-negative Neurone scheinen bei dieser Dosierung morphologisch nicht verändert. B: Kontrollkulturen zeigen intakte ChAT-positive Neurone mit verschiedenen weit ausgedehnten Fortsätzen. Zahlreiche kleine, sogenannte „dendritic spines“ sind am Ausläufer sichtbar. Vergrößerung x500.

4.1.2 Kinetik des LDH-Anstiegs und der Reduktion des MTT-Metabolismus nach AF64A-Behandlung

Primäre neuronale Zellkulturen reagierten auf AF64A mit einem verzögerten Ablauf der Zellschädigung, gemessen an der LDH-Freisetzung und der Reduktion des MTT-Metabolismus. Der Zeitverlauf und die Dosisabhängigkeit dieser Veränderungen ist in Abb. 6 dargestellt. Der MTT-Umsatz war anfänglich in der niedrigsten Dosis von AF64A (5 μM) gesteigert. Diese Steigerung ist möglicherweise auf einen erhöhten [Seite 40↓]Stoffwechselumsatz in Astrozyten zurückzuführen, da mikroskopisch bei dieser Dosierung eine stärkere Färbung der Astrozyten mit Formazan, dem Endprodukt des MTT-Assays erkennbar war (nicht veröffentlichter Befund). In den höheren Dosen war diese Metabolismussteigerung in Astrozyten auch nicht mehr erkennbar.

Abb. 6: Zeit- und dosisabhängige Veränderungen in kortikalen Neuronen nach AF64A-Exposition (5 – 80 μM AF64A). Die LDH-Aktivität ist hier als prozentuale Zunahme gegenüber den Vehikel-behandelten Kontrollkulturen dargestellt, um einen besseren Vergleich mit der Reduktion des MTT-Metabolismus zu ermöglichen. LDH-Freisetzung: n = 12; MTT-Assay: n = 5 pro Zeitpunkt und Zustand. Nach 24 h war im gesamten Dosisbereich von AF64A keine bis geringfügige LDH-Ausschüttung in das Medium detektierbar. Die LDH-Aktivität stieg nach 48 h bei den höheren Dosen markant an und war maximal erhöht nach 72 h. Bei der Dosierung von 40 und 80 μM fiel der MTT-Umsatz kontinuierlich bis 72 h ab, während in der niedrigsten Dosis von AF64A (5 μM) der MTT-Umsatz anfänglich anstieg.

4.1.3 Phasenkontrastmikroskopie AF64A-behandelter Kulturen im Zeitverlauf

In Abb. 7 ist der Zusammenhang zwischen LDH-Freisetzung und morphologischen Veränderungen in kortikalen Neuronenkulturen nach 40 μM AF64A dargestellt. Morphologische Veränderungen, charakteristisch für Apoptose (siehe 4.2.1.) und LDH-Anstieg im Medium waren erst 48 h nach AF64A-Behandlung erkennbar. Dieser Dosisbereich wurde für alle weiteren Versuche mit AF64A ausgewählt.


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Abb. 7: A: Zusammenhang zwichen LDH-Freisetzung und morphologischer Veränderungen in kortikalen Neuronenkulturen nach 40 μM AF64A. A: Nach 24 h war noch kein signifikanter LDH-Anstieg detektierbar, nach 48 h und 72 h zeigte sich eine kontinuierliche Zunahme der LDH-Freisetzung; n = 12 - 16. * p < 0,05 versus Vehikel-behandelte Kontrollen.. B: In diesen Versuchen wurden parallel Photographien von mikroskopischen Beobachtungen mit der Phasenkontrast-Mikroskopie angefertigt (Vehikel von AF64A; AF64A-Behandlung (40 μM) nach 24, 48 und 72 h). Nach 24 h zeigten sich in den kortikalen Neuronen morphologisch noch keine Unterschiede im Vergleich zu den Kontrollkulturen, während nach 48 – 72 h die neuronalen Zellen zunehmend morphologische Charakteristika der apoptotischen Degeneration aufwiesen (siehe 4.2.1.). Der Balken entspricht 10 μm.
Abb. 7

4.1.4 Oligonukleosomale DNS-Fragmentierung nach AF64A-Behandlung

Die enzymatische Fragmentierung der DNS während der Apoptose durch AF64A wurde erst nach 48 h beobachtet. Die charakterischen 180 Basenpaare großen Banden traten als charakteristisches Merkmal bei 40 und 80 µM AF64A-Behandlung in kortikalen Zellen auf (Abb. 8):


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Abb. 8: DNS-Fragmentierung in kortikalen Kulturen nach 48-stündiger Behandlung mit AF64A (40 and 80 µM) im Vergleich zu Vehikel-behandelten Schwesterkulturen. Für jeden Zustand wurden 2 Proben von unterschiedlichen Zellkulturen benutzt. Als Standard wurde eine 100 bp Leiter aufgetragen.

4.1.5 AF64A-Toxizität und der unspezifische Caspase-Inhibitor Z-VAD-FMK

Abb. 9: Caspase-Hemmung durch Z-VAD-FMK schützte kortikale Neurone vor der AF64A-Toxizität. Die Kulturen wurden mit 100 µM Z-VAD-FMK 1 h vor und 24 h und 48 h nach Applikation von 40 µM AF64A behandelt. Der Zelltod wurde durch den Anstieg der LDH-Aktivität im Medium dokumentiert (24, 48 und 72 h). In der Gruppe der Behandlung mit Z-FAD-FMK + AF64A blieb die LDH-Aktivität auf Kontrollniveau. n = 4 – 6 für jede Gruppe; * p < 0,01 vs. Vehikel; + p = 0,001 vs. AF64A. cVehikel, g AF64A, g AF64A + Z-VAD-FMK.

Der durch AF64A ausgelöste LDH-Anstieg im Medium von kortikalen Neuronen-kulturen konnte durch Behandlung mit dem Caspase-Inhibitor Z-VAD-FMK, der ver[Seite 43↓]schiedene Caspasen hemmt, verhindert werden. Dieser protektive Effekt war über den gesamten Beobachtungszeitraum bis 72 h nachweisbar, wenn Z-VAD-FMK 1 h vor, 24 h und 48 h nach 40µM AF64A gegeben wurde (siehe Abb. 9).

4.2 Unterscheidung von apoptotischem und nekrotischem Zelltod

Um zwischen den verschiedenen Zelltodesarten in den verschiedenen Zellschädigungsmodellen zu unterscheiden, haben wir neben der DNS-Fragmentierung noch weitere Methoden der Zelltod-Differenzierung in den vorwiegend langsam-degenerierenden Zelltodesarten mit charakteristischen Apoptoseereignissen (AF64A und Staurosporin) und den überwiegend exzitotoxischen Schadenskaskaden mit Anteilen der Nekrose (OGD + Glutamat) eingesetzt.

4.2.1 Morphologische Charakterisierung mit Phasenkontrastmikroskopie: Vergleich von Apoptose und Nekrose

Die morphologische Differenzierung der beiden Zelluntergangsformen erfolgte unter anderem mit Hilfe der Phasenkontrastmikrokopie. Es zeigten sich nach der Gabe von 40 μM AF64A nach circa 48 h die typischen morphologischen Korrelate des langsamen, programmierten Zelltods, die nach 72 h maximal ausgeprägt waren. Es kam zum Auftreten der charakteristischen Zeichen der Apoptose mit Neuritendegeneration, Schrumpfung des Zellkörpers und Ansammlung kondensierter Partikel. Die Nekrose geht mit einer Schwellung des Zellkörpers und des Zellkerns einher und ließ sich bereits 24 h nach 120-minütiger OGD darstellen (siehe Abb. 10).


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Abb. 10: Phasenkontrastmikrospie kortikaler Neurone, die mit Vehikel behandelt, 48 h mit AF64A behandelt oder 120 min der OGD ausgesetzt wurden (Vergrößerung 250 x). A: Die Vehikel-behandelten Kontrollkulturen zeigten gesunde Neurone mit einem dichten Netzwerk von Neuriten. B: 24 h nach der OGD (120 min) zeigte sich eine Schwellung der Zellköper- und kerne (siehe Pfeile) als Zeichen des vorwiegend nekrotischen Zelluntergangs (D: Ausschnittsvergrösserung). C: 72 h nach AF64-Gabe (40 μM) erschienen in einer Schwesterkultur die typischen morphologischen Charakteristika der Apoptose. Die Neuriten degenerierten, die Zellkörper schrumpften und kondensierte Partikel sammelten sich im Zellkern (siehe Pfeile). E: Ausschnittsvergrösserung.

4.2.2 TUNEL-Färbung

Die DNS-Strangbrüche, die durch Endonukleaseaktivität in apoptotischen Zellen entstehen, lassen sich mit der TUNEL-Färbung darstellen. Die Zahl TUNEL-positiver kortikaler Neurone stieg signifikant bei Apoptose-Induktion mit Staurosporin oder AF64A an. Es zeigten sich in der Färbung jedoch keine signifikanten Unterschiede in den exzitotoxisch-nekrotischen Modellen wie OGD oder Glutamat gegenüber den Kontrollkulturen. In den Kontrollkulturen finden sich auch immer wieder TUNEL-[Seite 45↓]positive Zellen, da ein Teil der Zellen in dieser Art Primärkulturen physiologischerweise apoptotisch wird.

Abb. 11: TUNEL-positive Zellen in den unterschiedlichen Schadensmodellen. Die kortikalen Kulturen wurden entweder mit 100 µM Glutamat für 30 Minuten (Färbung nach 24 h), OGD (Färbung nach 24 h), 300 nM Staurosporin (Färbung nach 24 h) oder 40 µM AF64A (Färbung nach 48 h) behandelt. 20 hochauflösende Felder wurden verblindet ausgezählt (400 x Vergrößerung). Zwei unabhängige Experimente mit jeweils drei Glasplättchen pro Experiment wurden gefärbt. * p < 0,05 versus Kontrolle.

4.2.3 Analyse der α-Fodrinspaltprodukte

Das Auftreten von α-Fodrinspaltprodukten wurde als ein Marker für Caspase- oder Calpainaktvierung in den verschiedenen Schadensmodellen untersucht. Ein 150 kDa-Fragment entsteht bei Proteolyse sowohl durch Calpain- als auch durch Caspaseaktivierung. Die Unterscheidung von Apoptose und Nekrose erfolgt durch das apoptosespezifische 120 kDa-Fragment, das im Rahmen der Apoptose durch Caspase-3 abgespalten wird, nicht aber bei der Nekrose nachweisbar ist (Nath et al., 1996; Wang, 2000). Ein bemerkenswerter Anstieg der 120 kDa-Bande wurde bei Staurosporin (300 nM) schon nach 24 h beobachtet. Zeitabhängig stieg die Bandenintensität auch bei AF64A nach 48 und 72 h. Ein wesentlicher Anstieg der apoptose-spezifischen 120 kDa-Bande liess sich bei den vorwiegend exzitotoxischen Modellen (Glutamat und OGD) nicht beobachten (siehe Abb.12):


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Abb. 12: Das Muster der α-Fodrinspaltprodukte als Marker für Calpain- und Caspaseaktivierung in den unterschiedlichen Schadensmodellen. Die Zellen wurden für den Western-blot nach 24, 48 und 72 h geerntet. A: Western-blot-Darstellung von α-Fodrin und seiner Spaltprodukte p150 und p120. Die Spalten entsprechen: 1: Vehikel-behandelte Kontrollkulturen; 2: Glutamat (100 μM), 24 h nach Behandlung); 3: OGD (circa 135 Min.), 24 h nach Behandlung; 4: Staurosporin (300 nM), 24 h nach Behandlung; 5: Staurosporin (300 nM), 48 h nach Behandlung; 6: AF64A (40 μM), 24 h nach Behandlung; 7: AF64A (40 μM), 48 h nach Behandlung; 8: AF64A (40 μM), 72 h nach Behandlung. B: Die semiquantitative Analyse der 120 kDa-Bande (p120) mit Densitometrie erfolgte von drei separaten Experimenten.

4.3 Effekte von Melatonin in den unterschiedlichen Schadens-modellen

4.3.1 Eigenwirkung von Melatonin in nativen, neuronalen Primärkulturen

Die Einmalgabe von Melatonin (0,01 – 0,5 mM) in kortikalen Kulturen am 10. – 14. DIV verursachte einen signifikanten Anstieg der LDH-Aktivität im Medium nach 72 h verglichen mit Vehikel-behandelten Kulturen. Dieser Anstieg der LDH-Aktivität war [Seite 47↓]nach 24 h nicht vorhanden, begann nach 48 h und erreichte sein Maximum nach 72 h (Tabelle 2).

Tabelle 2: Veränderung der LDH-Freisetzung nach 24, 48 und 72 h in nativen, kortikalen Primärkulturen nach einmaliger Melatoningabe (10 – 500 μM). n = 4 – 16, * p < 0,05 versus Vehikel-behandelte Kulturen; one-way ANOVA gefolgt von Tuckey´s posthoc-Test. LDH-Aktivitäten in Units / ml Medium.

Zeit nach

Melatoningabe

Vehikel

Melatonin

10 µM

50 µM

100 µM

500 µM

24 h

48 h

72 h

27,0 + 2,3

35,7 + 3,5

33,5 + 2,7

20,8 + 2,2

29,0 + 2,2

39,4 + 2,1

28,6 + 2,1

32,0 + 3,4

44,2 + 1,4*

28,0 + 1,6

39,1 + 5,8

34,6 + 2,3

28,6 + 2,0

41,6 + 3,7

56,0 + 1,8*

Die Schädigung der Zellmembranintegrität als Ursache des LDH-Anstiegs läßt sich nicht auf die Zugabe kleiner Mengen von Alkohol zurückführen, da die vehikel-behandelten Zellen mit gleichen Mengen von Alkohol behandelt wurden (0,01% Ethanol im Medium). Ein weiterer Hinweis für diese Schädigung war ein dosisabhängiger Anstieg der Malondialdehyd-Konzentration nach Melatoningaben von 0,5 – 2,0 mM. Dieser Marker für abgelaufene Lipidperoxidationen war nach 24 h erhöht (Abb. 13). Zum Vergleich wurden zwei weitere Antioxidantien (DMTU und PBN) untersucht. Im Gegensatz zu Melatonin führten weder DMTU noch PBN zu einem Anstieg der LDH-Freisetzung ins Medium (Tabelle 3).


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Abb. 13: Anstieg der Malondialdehyd-Konzentration durch Melatonin in nativen, kortikalen Zellkulturen. Am 10. DIV wurden die Zellen mit Vehikel oder 0,5, 1,0 oder 2,0 mM Melatonin behandelt. Die Zellen wurden nach 24 h Melatoninexposition geerntet. n = 4 – 6 für jede Konzentration, * p = 0,004, ** p < 0,001 versus Vehikel-behandelte Zellen.

Tabelle 3: Unveränderte LDH-Freisetzung nach 24, 48 und 72 h in nativen, kortikalen Kulturen durch die einmalige Behandlung mit DMTU oder PBN. n = 4 – 16.

Zeit nach

DMTU-Gabe

 

DMTU

Vehikel

1 mM

10 mM

24 h

29,3 ± 4,6

31,9 ± 9,1

32,5 ± 1,3

48 h

37,1 ± 3,2

35,6 ± 3,8

43,4 ± 2,8

72 h

39,2 ± 7,5

33,6 ± 9,5

39,5 ± 6,9

Zeit nach

PBN-Gabe

 

PBN

Vehikel

0,1 mM

1,0 mM

24 h

34,2 ± 3,2

37,6 ± 6,6

38,9 ± 3,1

48 h

34,3 ± 5,8

37,6 ± 6,6

42,1 ± 2,9

72 h

40,3 ± 4,0

38,8 ± 1,3

48,0 ± 5,7


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4.3.2  AF64A und Melatonin

Der durch AF64A ausgelöste LDH-Anstieg konnte durch die Behandlung mit Melatonin (0,1 und 0,5 mM) nicht verhindert werden. Die durch AF64A ausgelöste LDH-Ausschüttung wurde durch Melatonin unerwartet verstärkt. Dies war schon in der niedrigsten Dosis von AF64A erkennbar (Abb. 14). Zusätzlich bestätigte sich, dass Melatonin in der Konzentration von 0,5 mM in den Vehikel-behandelten Schwesterkulturen selbst eine zellschädigende Wirkung ausübte.

Abb. 14: Wirkung von Melatonin auf die LDH-Ausschüttung durch AF64A in kortikalen Kulturen. Am 10. DIV wurden die Zellen 2 h vor der AF64A-Exposition mit 0,1 und 0,5 mM Melatonin vorbehandelt. Die AF64A (10, 40, 80 µM)- und Vehikel-Behandlung erfolgte dann für 5 h mit anschließendem Auswaschen mit PBS und Wiedergabe des konditionierten Mediums, das Melatonin oder das Vehikel enthielt. Die LDH-Aktivität im Überstand wurde nach 72 h gemessen. Dargestellt ist hier im Diagramm die Differenz zu den vehikel-behandelten Schwesterkulturen (Kontrollen), die im Mittelwert eine LDH-Aktivität von 61,2 + 4,7 Units / ml Medium besaßen. n = 4 – 11 für jede Gruppe, erhoben in 2 unterschiedlichen Experimenten; * p < 0,001 versus Vehikel-behandelte Kontrollkulturen; +p < 0.,005 versus AF64A. c Vehikel des Melatonins, g 0,1 mM Melatonin, g 0,5 mM Melatonin.

Auch der Abfall des MTT-Umsatzes als Marker des mitochondrialen Stoffwechsels wurde durch Melatonin nicht verhindert. Der MTT-Assay wurde 72 h nach AF64A-Gabe durchgeführt (Abb. 15).


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Abb. 15: Melatonineffekt auf den AF64A-induzierten Verlust des MTT-Stoffwechselumsatzes in kortikalen Zellen. Am 10. DIV wurden die Zellen mit 0,1 oder 0,5 mM Melatonin für 2 h vorbehandelt und dann der AF64A-Exposition (10, 40 oder 80 μM) oder dem entsprechenden Vehikel für 5 h ausgesetzt, anschließend mit PBS gewaschen und mit den konditionierten Medien mit den unterschiedlichen Melatonindosen oder dem Vehikel versorgt. Der MTT-Stoffwechselumsatz wurde nach 72 h nach der Gabe von AF64A gemessen. Die Daten sind als relativer Prozentanteil der vehikel-behandelten Kontrollen dargestellt (100% Stoffwechselaktivität). Es wurden die Daten aus 2 unterschiedlichen Experimenten gepoolt. n = 4 – 11 für jede Gruppe; * p < 0,001 versus Vehikel-behandelte Kontrollen. c Vehikel des Melatonins, g 0,1 mM Melatonin, g 0,5 mM Melatonin.

Wir wollten nun herausfinden, ob AF64A eine Form von Zelltod induziert, bei der oxidativer Stress eine entscheidende Rolle spielt, und, wenn das so ist, testen, ob Melatonin in der Lage ist, diese freien Radikale wegzufangen. Zur Quantifizierung des oxidativen Stresses wurde Malondialdehyd, das Hydrolyseprodukt der Lipidperoxide, gemessen. Die Malondialdehyd-Konzentration gibt indirekt Hinweise auf freie Radikale, da die Lipidperoxidation die Folge oxidativer Schädigung ist.

Die Malondialdehyd-Konzentration stieg 10 h nach Zugabe von AF64A von 0,175 ±0,004 μM auf 0,195 ± 0,023 μM an, war am höchsten nach 24 h mit 0,245 ± 0,010 μM und nach 48 h mit 0,212 ± 0,013 μM nicht mehr signifikant unterschiedlich im Vergleich zu den Schwesterkulturen. Die Zugabe von Melatonin (0,1 mM) 1h vor der AF64A-Exposition reduzierte den nach 24 h auftretenden Anstieg der Malondialdehyd-Konzentration signifikant (siehe Abb. 16).


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Abb. 16: Melatonin verhinderte den Anstieg der Malondialdehyd-Konzentration durch AF64A in neuronalen Primärkulturen der Ratte. Am 10. – 14. DIV wurden die Zellen 1 h vor 40 µM AF64A-Gabe mit 0,1 mM Melatonin vorbehandelt. Nach 24 h wurden die Zellen geerntet und die Malondialdehyd-Konzentration bestimmt. n = 6 –13 für jede Kombination, erhoben aus 2 unterschiedlichen Experimenten; *p < 0,001 versus Vehikel-behandelte Zellen; + p < 0,001 versus AF64A-behandelte Zellen.

i) AF64A und andere antioxidative Substanzen

Um weitere Informationen über die Beteiligung von freien Radikalen bei der Schädigung durch AF64A zu erhalten, haben wir andere antioxidative Substanzen eingesetzt: DMTU und PBN. Im Gegensatz zu Melatonin änderte die alleinige Gabe von DMTU oder PBN die LDH-Aktivität im Medium nicht (siehe oben, Tabelle 3).

Beide Antioxidantien schützten nicht vor dem Zelltod durch AF64A, konnten aber die Bildung von Malondialdehyd wirksam auf das Niveau der Vehikel-behandelten Kulturen reduzieren (Tabelle 4).


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Tabelle 4: Auswirkungen der Antioxidantien Dimethylthiourea (DMTU) und N-tert-Butyl-α-Phenylnitron (PBN) auf die LDH-Aktivität (gemessen nach 72 h) und die Bildung von Malondialdehyd (gemessen nach 24 h) in kortikalen Neuronen nach Behandlung mit 40 µM AF64A. n = 6 – 8; 3 unabhängige Experimente; * p < 0,001 versus Vehikel.

 

Antioxidant

Vehikel

AF64A +

Vehikel

AF64A +

Antioxidant (niedrige Dosis)

AF64A +

Antioxidant (hohe Dosis)

LDH-

Freisetzung

(U/ml

Medium)

PBN

(0,1/1,0 mM)

40,3 ± 4,0

84,4 ± 5,4 *

84,8 ± 3,8 *

85,1 ± 5,4 *

DMTU

(1,0/10,0 mM)

39,2 ± 7,5

77,0 ± 5,0 *

76,3 ± 2,7 *

81,7 ± 5,4 *

Malon-dialdehyd (nM)

PBN

(0,1/1,0 mM)

170 ± 11

237 ± 14 *

161 ± 6

156 ± 15

DMTU

(1,0/10,0 mM)

170 ± 11

237 ± 14 *

140 ± 12

174 ± 9

4.3.3 Staurosporin und Melatonin

Die einstündige Vorbehandlung mit 0,1 oder 0,5 mM Melatonin konnte die Zellschädigung durch Staurosporin (100 oder 300 nM) zu keinem der untersuchten Zeitpunkte verhindern (siehe Tabelle 5). Dies konnte sowohl durch den Anstieg der LDH-Freisetzung als auch durch den Abfall des MTT-Umsatzes demonstriert werden. Ähnlich wie beim AF64A-Modell ergaben sich Hinweise für die Potenzierung der neurotoxischen Wirkung von Staurosporin durch Melatonin. So wurde die LDH-Freisetzung nach 24 h Behandlungsdauer mit 100 nM Staurosporin durch die Zugabe von 0,5 mM Melatonin von 85,9 ± 5,4 auf 103,4 ± 2,9 signifikant verstärkt.


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Tabelle 5: Einfluss von Melatonin auf die durch Staurosporin induzierte Apoptose. Stau = Staurosporin; Mel = Melatonin. Die Ergebnisse aus 2 – 3 unabhängigen Experimenten wurden zusammengefasst. n = 8 – 16 für die LDH-Werte und n = 8 für den MTT-Umsatz. * p < 0,001 versus Vehikel; + p < 0,05 versus 100 nM Staurosporin + Vehikel.

LDH-Freisetzung

(U / ml Medium)

MTT-Umsatz

(% Vehikel)

Zeit nach

Behandlung

24 h

48 h

72 h

72 h

Vehikel

60,8 ± 3,3

53,6 ± 3,3

73,0 ± 7,6

100 ± 13,0

100 nM Stau

+ Vehikel

85,9 ± 5,4 *

103,8 ± 6,0 *

107,2 ± 3,0 *

80,2 ± 15,1

100 nM Stau

+ 100 µM Mel

92,1 ± 4,8 *

109,9 ± 8,2 *

113,7 ± 8,6 *

79,9 ± 11,6

100 nM Stau

+ 500 µM Mel

103,4 ± 2,9 * +

117,1 ± 4,2 *

120,2 ± 8,4 *

79,5 ± 11,7

300 nM Stau

+ Vehikel

122,7 ± 5,0 *

166,8 ± 9,5 *

198,7 ± 11,9 *

44,7 ± 9,8 *

300 nM Stau

+ 100 µM Mel

123,8 ± 3,9 *

159,8 ± 8,1 *

190,4 ± 16,7 *

40,1 ± 8,4 *

300 nM Stau

+ 500 µM Mel

140,1 ± 9,4 *

188,4 ± 13,6 *

218,0 ± 14,9 *

36,7 ± 9,4 *

i) Staurosporin und andere antioxidative Substanzen

Die Zellschädigung durch Staurosporin in kortikalen Zellkulturen führte bereits nach 24 h zu einem signifikanten LDH-Anstieg und erreichte nach 48 h ein Maximum (siehe Tabelle 5). Zum Zeitpunkt der maximalen Schädigung wurde der Einfluss der Antioxidantien PBN und DMTU auf die Staurosporin-induzierte LDH-Freisetzung untersucht (Tabelle 6).


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Tabelle 6: Auswirkung der Antioxidantien Dimethylthiourea (DMTU) und N-tert-Butyl-α-Phenylnitron (PBN) auf die LDH-Aktivität und die Bildung von Malondialdehyd in kortikalen Neuronen nach Behandlung mit 300 nM Staurosporin. Malondialdehyd wurde nach 5 h, die LDH-Aktivität 48 h nach Behandlungsbeginn gemessen; n = 8 – 10; * p < 0,001 versus Vehikel.

 

Antioxidant

Vehikel

Staurosporin

+

Vehikel

Staurosporin

+

Antioxidant (niedrige Dosis)

Staurosporin +

Antioxidant (hohe Dosis)

LDH-Frei-

setzung

(U / ml

Medium)

PBN

(0,1/1,0 mM)

68,4 ± 4,4

137,8 ± 5,2 *

130,8 ± 5,3 *

146,5 ± 5,1 *

DMTU

(1,0/10,0 mM)

67.5 ± 3.9

119,0 ± 3,5 *

123,2 ± 4,8 *

127,5 ± 2,8 *

Malon-

dialdehyd (nM)

PBN

(0,1/1,0 mM)

98 ± 6

227 ± 7 *

91 ± 5

91 ± 5

DMTU

(1,0/10,0 mM)

98 ± 6

227 ± 7 *

101 ± 6

95 ± 7

Auch hier zeigt sich, dass die Antioxidantien die neuronale Zellschädigung durch Staurosporin nicht verhindern konnten. Hingegen waren beide Antioxidantien in der Lage, den 5 h nach Staurosporingabe auftretenden Anstieg von Malondialdehyd zu blockieren.

4.3.4 OGD und Melatonin

Eine zweistündige OGD führte in unseren kortikalen Kulturen zu einer LDH-Freisetzung, die annähernd vergleichbar war mit der vollständigen Zellschädigung, die nach einer exzessiven Glutamatdosis (5 mM, „totaler Zelltod“) zu beobachten war. Aus Abbildung 16 wird ersichtlich, dass 0,5 mM Melatonin diese Zellschädigung signifikant reduzieren konnte, während dieser protektive Effekt in den höheren Dosen nicht mehr nachweisbar war.


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Abb. 16: Abschwächung des durch OGD ausgelösten neuronalen Zelltodes durch Melatonin. Am 14. DIV wurden die Zellen 140 min der OGD ausgesetzt. Melatonin wurde im Konzentrationsbereich von 0,1 – 2 mM den Kulturen über den gesamten Zeitraum zugegeben. Die LDH-Aktivität wurde 24 h nach dem Beginn der OGD gemessen. Der totale Zelltod repräsentiert die freigesetzte LDH-Menge nach kompletter Destruktion der Zellen durch 5 mM Glutamatexposition über 24 h. Die Daten werden als Zunahme der LDH-Aktivität im Vergleich zu den Vehikel-behandelten Schwesterkulturen präsentiert. Diese Zellen wurden mit Puffer mit Glukose über 140 Minuten im Brutschrank mit dem Vehikel von Melatonin behandelt und hatten nach 24 h eine LDH-Aktivität von 61,8 + 1,7 Units / ml Medium. n = 12 – 19 für jede Kondition. Es wurden die Daten aus 2 unterschiedlichen Experimenten zusammengefaßt. * p < 0,05 versus OGD + Vehikel.

4.3.5 OGD mit MK-801 und Melatonin

Um zu differenzieren, ob die neuroprotektive Wirkung von Melatonin im OGD-Modell auf den exzitotoxisch-nekrotischen oder den apoptotischen Anteil zurückzuführen ist, wurden die neuronalen Zellkulturen zur Ausschaltung des nekrotischen Anteils mit MK-801, einem Glutamatantagonisten des N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptors (NMDA-Rezeptor), behandelt. Der NMDA-Rezeptor spielt bei der Vermittlung der exzitotoxischen Anteile des Zelltodes bei der OGD eine entscheidende Rolle (Gottron et al., 1997).


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Tabelle 7: Wirksamkeit von MK-801 (10 μM) oder Melatonin (0,5 mM) auf die LDH-Freisetzung (Units / ml Medium), 24 h und 48 h nach 120-minütiger OGD. n = 5-8; * p < 0,05 versus OGD + Vehikel.

 

Vehikel

OGD +

Vehikel

OGD +

500 µM Melatonin

OGD +

10 µM MK-801

24 h

53,5 ± 3,4

225,2 ± 6,0

187,7 ± 4,1 *

123,3 ± 6,9 *

48 h

65,0 ± 7,6

270,8 ± 6,6

220,7 ± 4,2 *

175,3 ± 7,6 *

MK-801 reduzierte in einer 120 minütigen Hypoxie die LDH-Freisetzung auf 40,6 ± 4,0 % und 53,6 ± 3,7 % 24 h und 48 h nach der Hypoxie. Melatonin (0,5 mM) konnte die LDH-Freisetzung nach 24 h und 48 h hingegen nur auf 78,2 ± 7,9 % und 75,7 ± 2,0 % reduzieren (siehe Tabelle 7).

Bei einer Hypoxiezeit von 180 Minuten war MK-801 weniger wirksam (Verringerung der LDH-Freisetzung auf 79,5 ± 4,1 %, jeweils nach 24 h und 48 h gemessen). Eine zusätzliche Gabe von Melatonin (0,1 und 0,5 mM) brachte keine weitere Neuroprotektion. Im Gegensatz dazu konnten wir mit dem Caspase-Inhibitor Z-VAD-FMK eine weitere Reduktion der LDH-Freisetzung auf 63,7 ± 3,1 % und 64,0 ± 1,9 % erzielen (Abb. 17).


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Abb. 17: Melatonin zeigte keine Wirkung auf die apoptotische Komponente der OGD, die durch den Glutamatantagonisten MK-801 demaskiert wurde. Am 10. DIV wurden die Zellen 180 min der OGD ausgesetzt. Melatonin (0,1 und 0,5 mM) und MK-801 (10 μM) wurden 60 und 30 min vor Beginn der OGD zugegeben. Die OGD wurde von 120 auf 180 min verlängert um einen neuronalen Zelltod in Anwesenheit des Glutamatantagonisten MK-801 zu erreichen, der ungefähr vergleichbar zu der Zellschädigung bei 120-minütiger OGD ohne Glutamatantagonisten war. Z-VAD-FMK wurde zu Beginn der Reoxygenierungsphase und 24 h später zugegeben. Die LDH-Aktivität wurde 24 und 48 h nach der OGD gemessen. Die Daten wurden als Zunahme der LDH-Aktivität im Vergleich zu vehikel-behandelten Kontrollkulturen angegeben. Die Aktivität der LDH in den Kontrollkulturen war 53,5 + 3,4 und 65,5 + 7,6 Units / ml Medium nach 24 und 48 h. n = 5 – 8 für jede Kondition; * p < 0,05 versus OGD + Vehikel; + p < 0,05 versus OGD + MK-801.

4.4 Effekt von 17 β-Estradiol in den unterschiedlichen Schadensmodellen

4.4.1 AF64A und 17 β-Estradiol

Die Langzeitvorbehandlung für 20 h mit einer Einzeldosis 17 β-Estradiol vor der AF64A-Behandlung war mit einer markanten LDH-Abnahme nach 72 h in hippokampalen und septalen Kulturen verbunden (Abb. 18).


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Abb. 18: Wirkung von 17 β-Estradiol auf die LDH-Freisetzung nach AF64A in hippokampalen und septalen Kulturen. Am 10. DIV wurden die Zellen mit 0,1 oder 1,0 μM 17 β-Estradiol 20 h vorbehandelt. Nach dieser Zeit erfolgte die Gabe von AF64A oder korrespondierendem Vehikel. Die LDH-Freisetzung wurde im Medium 72 h nach Behandlung mit AF64A gemessen. Hier werden die Daten als Zunahme der LDH-Aktivität gegenüber den Vehikel-behandelten Kontrollkulturen gezeigt. Die LDH-Aktivität der hippokampalen Kontrollen betrug 38,5 + 3,7, die der septalen Kontrollen 34,1 + 2,4 Units /ml Medium. Es wurden Werte aus drei unterschiedlichen Experimenten gepoolt, n = 5 – 10 für jede Kondition; * p < 0,004 versus vehikel-behandelte Kulturen; + p < 0,05 versus AF64A.

Die neuroprotektive Wirksamkeit von 17 β-Estradiol wurde in den septalen und hippokampalen Neuronen nur in der niedrigeren Dosis von 0,1 µM erreicht, erschien aber nicht in der höheren Dosis von 1,0 µM. Wir beobachteten auch keine Neuroprotektion in kortikalen Kulturen. So veränderte sich der AF64A-verursachte Anstieg der LDH-Aktivität in kortikalen Neuronen (90,4 ± 9,3 U / ml) weder nach der Vorbehandlung mit 0,1 µM (80,8 ± 11,9) noch mit 1,0 µM 17 β-Estradiol (96,9 ± 8,8). Die Kurz[Seite 59↓]zeitbehandlung mit verschiedenen Estradioldosen 1 h vor der AF64A-Gabe führte nicht zu einer signifikanten Reduktion der LDH-Freisetzung nach 72 h Toxinexposition. Ein neuroprotektive Effekt der Kurzzeitbehandlung war in den Kulturen aus allen drei Regionen Septum, Hippokampus und Kortex nicht nachweisbar (Tabelle 8):

Tabelle 8: Fehlender Einfluss der Kurzzeitbehandlung (1 h) mit 17 β-Estradiol auf die LDH-Freisetzung (Δ U / ml Medium) in hippokampalen, septalen und kortikalen primären, neuronalen Kulturen nach 72 h Behandlung mit AF64A (40 µM). n = 9 – 12; Die LDH-Freisetzung in den Kontrollkulturen war 56,3 ± 3,4 in hippokampalen, 27,0 ± 2,5 in septalen und 55,5 ± 5,8 U / ml Medium in kortikalen Kulturen; * p < 0,01 versus korrespondierende Kontrollkulturen.

Neuronale Primär- kulturen

AF64A

+

Vehikel

AF64A

+

0,1 µM Estradiol

AF64A

+

1,0 µM Estradiol

Hippokampus

140,0 ± 8,8 *

148,7 ± 11,6 *

151,3 ± 5,7 *

Septum

29,8 ± 3,6 *

27,0 ± 4,5 *

21,1 ± 3,6 *

Kortex

93,1 ± 10,9 *

91,0 ± 10,5 *

102,4 ± 10,0 *

In Abb. 19 a-c sind repräsentative Phasenkontrastaufnahmen primärer neuronaler Kulturen aus Hippokampus unter Kontrollbedingungen und nach AF64A-Behandlung mit und ohne Langzeitbehandlung mit 17 β-Estradiol dargestellt. AF64A führte zu den morphologischen Zeichen der Apoptose, wie Degeneration der Neuriten, Schrumpfung der Zellkörper und Aufsplitterung in kondensierte Partikel, die teilweise durch 17 β-Estradiol verhindert werden konnten.


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Abb. 19: Phasenkontrast-Mikroskopiebilder primärer neuronaler Zellkulturen nach den verschieden Schädigungsmodellen mit und ohne Vorbehandlung mit 17 β-Estradiol (Vergrößerung x250). a-c: Effekt der Langzeitvorbehandlung (20 h) mit 17 β-Estradiol auf das morphologische Bild hippokampaler Kulturen 72 h nach AF64A-Behandlung. a: Vehikel-behandelte Kontrollen; b: AF64A-behandelte Kulturen (40μM); c: AF64A-behandelte Kulturen mit 20-stündiger Vorbehandlung mit 0,1 μM 17 β-Estradiol. d-i: Effekt der Kurzzeitbehandlung (1 h) mit 17 β-Estradiol auf das morphologische Bild des neuronalen Zelltods 24 h nach Schädigung durch das Glutamat- oder OGD-Modell in kortikalen Neuronen. d: Vehikel-behandelte Kontrollkulturen; e: Kortikale Kulturen nach Glutamatexposition (100μM); f: Glutamatbehandlung 1 h nach der Vorbehandlung mit 10,0 μM 17 β-Estradiol; g: Kortikale Kulturen 24 h nach OGD-Behandlung; h: OGD-Exposition nach 1 h Vorbehandlung mit 0,1 μM 17 β-Estradiol; i: OGD-Exposition nach 1 h Vorbehandlung mit 0,5 μM 17 β-Estradiol.


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4.4.2  Staurosporin und 17 β-Estradiol

Bei der durch Staurosporin initiierten Apoptose waren weder die Kurz- (1 h) noch die Langzeitvorbehandlung (20 h) mit 0,1 und 1,0 µM Estradiol in der Lage, die Zellschädigung wirksam zu verhindern. Das Ausbleiben der Neuroprotektion trat in septalen, hippokampalen und kortikalen Kulturen gleichermaßen auf. In Tabelle 9 sind beispielhaft die LDH-Daten für Hippokampus und Kortex aufgelistet:

Tabelle 9: Auswirkung von Kurz- und Langzeitvorbehandlung (1 h und 20 h) mit 17 β-Estradiol in hippokampalen und kortikalen Kulturen 48 h nach der Gabe von Staurosporin (300 nM). * p < 0,05 versus Vehikel-behandelte Schwesterkulturen.

Estradiol- behandlung

Neuronale Primärkulturen

Vehikel

Staurosporin

+

Vehikel

Staurosporin

+

0,1 µM Estradiol

Staurosporin

+

1,0 µM Estradiol

1 h

vorher

Hippokampus

77,2 ± 5,2

128,6 ± 8,2 *

138,7 ± 3,0 *

132,8 ± 6,0 *

Kortex

66,5 ± 6,8

119,2 ± 5,1 *

121,9 ± 7,3 *

116,2 ± 11,3 *

20 h

vorher

Hippokampus

77,2 ± 5,2

128,6 ± 8,2 *

136,2 ± 11,8 *

153,9 ± 7,9 *

Kortex

66,5 ± 6,8

119,2 ± 5,1 *

130,6 ± 9,6 *

126,3 ± 6,7 *

4.4.3 Glutamat und 17 β-Estradiol

Die Behandlung kortikaler Neurone mit 100 µM Glutamat für 30 Minuten führte zu massiver Zellschädigung, die mit einer markanten LDH-Freisetzung nach 24 h verbunden war. Die Kurzzeitvorbehandlung mit verschiedenen Estradioldosen 1 h vor der Glutamatgabe verminderte die LDH-Freisetzung. Die Neuroprotektion war signifikant mit 0,1 und 1,0 µM, wurde aber schwächer bei noch höheren Dosen.

In den Phasenkontrastaufnahmen war der neuroprotektive Effekt klar sichtbar (Abbildung 19, e-f). Keine Neuroprotektion wurde mit der Langzeitbehandlung (20 h) mit
17 β-Estradiol erreicht, während im gleichen Versuch in kurzzeitbehandelten Schwesterkulturen der LDH-Anstieg signifikant verringert wurde (Tabelle 10).


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Abb. 20: Wirkung von 17 β-Estradiol auf die neuronale Schädigung durch Glutamat in kortikalen Kulturen. Am 10. DIV wurden die Zellen mit 0,1 – 10 μM 17 β-Estradiol für 1 h vorbehandelt und dann Glutamat (100 μM) oder das korrespondierende Vehikel zugegeben. Die LDH-Freisetzung in das Medium wurde nach 24 h untersucht. Die Daten werden als Zunahme der LDH-Aktivität gegenüber den Kontrollkulturen (63,8 + 1,2) gezeigt. n = 6 – 8, zusammengefaßt aus zwei unabhängigen Experimenten; * p < 0,001 versus Vehikel-behandelte Kontrollkulturen; + p < 0,005 versus Glutamat.


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Tabelle 10: Effekt der Kurzzeit- und Langzeitbehandlung (1 h und 20 h vorher) mit 17 β-Estradiol auf die LDH-Freisetzung (Δ in U / ml Medium) in kortikalen und hippokampalen Kulturen 24 h nach der Glutamatgabe (100 µM). n = 4 – 24; Die LDH-Freisetzung in vehikel-behandelten Schwesterkulturen war 61,5 ± 5,0 (1 h) und 54,8 ± 4,9 U / ml Medium (20 h); * p < 0,001 versus Vehikel-behandelte Kulturen; + p < 0,05 versus Glutamat + Vehikel; n.d. = nicht durchgeführt.

Estradiol-

Behandlung

Neuronale

Primärkultur

Glutamat

+

Vehikel

Glutamat

+

0,1 µM Estradiol

Glutamat

+

1,0 µM Estradiol

Glutamat

+

1,0 µMEstradiol

+

1,0 µM Tamoxifen

Glutamat

+

1,0 µM

Tamoxifen

1 h

Kortex

76,1 ± 2,9 *

45,4 ± 2,8 *+

43,7 ± 5,2 *+

48,6 ± 7,1 *+

66,0 ± 5,5 *

20 h

Kortex

74,2 ± 4,3 *

67,8 ± 5,4 *

68,1 ± 3,7 *

n.d.

n.d.

Hippokampus

50,7 ± 2,7 *

42,0 ± 4,9 *

45,8 ± 2,7 *

n.d.

n.d.


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4.4.4  OGD und 17 β-Estradiol

Die neuroprotektive Wirksamkeit von Estradiol gegen die Schädigung durch die OGD war nur bei der Kurzzeitvorbehandlung (1 h) nachweisbar und vergleichbar mit dem Schutz gegen Glutamattoxizität. Der beste Effekt trat im Dosisbereich von 0,5 –
1,0 µM Estradiol auf (siehe Abbildung 21).

Abb. 21: Effekt von 17 β-Estradiol auf die LDH-Freisetzung nach OGD in kortikalen Neuronen. Es wurde 1 h vor der OGD mit 0,1, 0,5, 1,0 oder 5,0 μM 17 β-Estradiol am 10. DIV vorbehandelt und die LDH-Aktivität nach 24 h gemessen. Es werden die Zunahme der LDH-Aktivitäten gegenüber den Kontrollkulturen (63,8 + 1,2) gezeigt. n = 9 – 24 für jede Kondition, gepoolt aus zwei verschiedenen Experimenten; * p < 0,001 versus Vehikel-behandelte Kontrollkulturen; + p < 0,05 versus OGD + Vehikel.

In den Phasenkontrastaufnahmen schienen die Neuronen bei der Gabe von 0,5 µM 17 β-Estradiol gegen die Hypoxie resistent zu sein und zeigten morphologisch im nativen Bild kaum Zeichen der Zellschädigung (Abbildung 19, g – i). Bei der Konzentration von 0,1 µM 17 β-Estradiol wurde der LDH-Anstieg im Überstand nicht abgeschwächt, obwohl diese Dosis im Modell für die apoptotische Degeneration sehr effektiv war. Bei der Langzeitvorbehandlung mit Estradiol war kein Schutz gegen OGD zu erzielen. Der durch die OGD ausgelöste Anstieg der LDH-Aktivität in kortikalen Neuronen von 59,7 + 7,0 U / ml Medium wurde durch die Langzeitvorbehandlung mit 0,1 µM (56,1 + 3,7), 0,5 µM (64,5 + 7,5) oder 1,0 µM
17 β-Estradiol (60,5 + 4,8) nicht beeinflusst.


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4.5  Rezeptor-abhängige und unabhängige neuroprotektive Wirkungen von 17 β-Estradiol

Zum Nachweis eines rezeptorabhängigen, transkriptions-regulierten Mechanismus der neuroprotektiven Wirkung von 17 β-Estradiol bei Langzeitvorbehandlung wurden die Kulturen zusätzlich mit dem Estrogenrezeptor-Antagonisten Tamoxifen und
ICI 182,780, bzw. dem Proteinsynthesehemmer Cycloheximid behandelt. Die neuroprotektive Wirkung von 17 β-Estradiol auf den durch AF64A ausgelösten apoptotischen Zelltod wurde sowohl durch die Rezeptorblockade als auch durch Proteinsynthesehemmung antagonisiert. Die Ergebnisse der LDH-Messung zu diesem Experiment sind in Tabelle 11 zusammengefasst.

Tabelle 11: Verlust der neuroprotektiven Wirkung von 17 β-Estradiol auf den Zelltod durch 40μM AF64A in hippokampalen und septalen Zellen nach Vorbehandlung mit Tamoxifen, ICI 182,780 Cycloheximid (LDH-Anstieg in Δ Units / ml Medium, 48 h post). Die basale LDH-Ausschüttung in den korrespondierenden Kontrollkulturen war 43,3 ± 4,9 für die hippokampalen Zellen und 41,7 ± 3,2 Units/ml medium für die Zellkulturen aus dem Septum. n = 4 – 9. a p < 0,05 und b p < 0,001 versus AF64A + Vehikel; c p < 0,05 und d p < 0,001 versus AF64A + Estradiol.

 

Zellkultur

AF64A +

Vehikel

AF64A +

Antagonist oder Inhibitor

AF64A +

Estradiol

0.1 µM

AF64A +

Estradiol +

Antagonist oder Inhibitor

Tamoxifen

1 µM

Hippokampus

41,9 ± 4,7

36,5 ± 4,1

21,0 ± 3,3 a

44,8 ± 6,2 c

ICI 182,780

1 µM

Hippokampus

65,5 ± 4,8

66,6 ± 3,8

31,8 ± 3,0 b

68,7 ± 3,5 d

Septum

49,4 ± 5,5

43,9 ± 1,9

24,9 ± 3,4 a

50,7 ± 2,6 d

Cycloheximid

500 ng / ml

Hippokampus

53,6 ± 4,2

54,5 ± 5,2

31,4 ± 3,4 a

52,5 ± 4,2 c

Tamoxifen, das eine vergleichbare Affinität für Estrogenrezeptor-α und Estrogenrezeptor-β aufweist (7 versus 6; siehe Kuiper et al., 1997) war jedoch bei einer durch Glutamat ausgelösten Zellschädigung nicht in der Lage, die


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Neuroprotektion durch eine Kurzzeitbehandlung mit 17 β-Estradiol zu antagonisieren (Tabelle 11).

4.6 Modulation der Expression von Bcl-2, Bcl-xL und Bax durch 17 β-Estradiol in hippokampalen und kortikalen Kulturen

In den hippokampalen Kulturen führte die Behandlung mit 30 und 100 nM 17 β-Estradiol zu einer Steigerung der Bcl-2-Level nach 24 und 48 h.

Abb. 22: Die Auswirkung von 17 β-Estradiol (0,03 und 0,10 μM) auf die Expression von Bcl-2 in hippokampalen und kortikalen Kulturen. Die neuronalen Zellen wurden mindestens 10 Tage in vitro kultiviert bevor sie 24 – 48 h mit 17 β-Estradiol (30 oder 100 nM) behandelt wurden und mit Western-blots untersucht wurden. 1, Vehikel-behandelte Kulturen; 2, 24 h-Behandlung mit 100 nM 17 β-Estradiol; 3, 48 h-Behandlung mit 100nM 17 β-Estradiol 4, 48 h-Behandlung mit 30nM 17 β-Estradiol.

Diese erhöhten Bcl-2-Spiegel persistierten bis zu 68 h nach Einmalgabe von 17 β-Estradiol (siehe Abb. 23).


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Abb. 23: Der Einfluss von 17 β-Estradiol (100 nM) auf die Expressionsmuster von Bcl-2, Bcl-xL, Bax und β-Tubulin in Kulturen aus Hippokampus und Kortex. Die Zellen wurden mit Vehikel oder 17 β-Estradiol behandelt und 20 h später Vehikel oder AF64A appliziert. 48 h nach Gabe von AF64A (also 68 h nach 17 β-Estradiol-Behandlung) wurden die Zellen in Western-blots analysiert. Es wurden immer mindestens drei Experimente durchgeführt und ausgewertet. 1, Vehikel / Vehikel-behandelte Kulturen; 2, 17 β-Estradiol / Vehikel-behandelte Kulturen; 3, Vehikel / AF64A-behandelte Kulturen; 4, 17 β-Estradiol / AF64A-behandelte Kulturen. Die semiquantitative Auswertung der Western-blots durch Bandendichte-Bestimmung wird hier von drei separaten Experimenten als Mittelwert der Bandendichten gezeigt.

Zu diesem späten Zeitpunkt haben wir auch erhöhte Bcl-xL-Proteinkonzentration beobachtet. In kortikalen Kulturen änderte sich im Gegensatz dazu die Expression von Bcl-2 und Bcl-xL durch die Behandlung mit 17 β-Estradiol zu keinem Zeitpunkt.

Ein Anstieg der Bcl-2-Expression trat auch nach 48-stündiger Exposition gegenüber AF64A (40 μM) in den hippokampalen Kulturen auf. Die Vorbehandlung mit 17 β-Estradiol führte zu einer weiteren synergistischen Zunahme der Bcl-2-Spiegel (siehe Abb. 23). Die Expressionsmuster von Bcl-xL und Bax wurden durch eine 48-stündige Exposition mit AF64A (40 μM) nicht beeinflusst. Staurosporin führte nicht zu einer synergistischen Zunahme der Bcl-2-Expression in hippokampalen Neuronen (siehe Abb. 24).


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Abb. 24: Wirkung von 17 β-Estradiol (100 nM) und Staurosporin (300 nM) auf die Bcl-2-Level in hippokampalen und kortikalen Kulturen. Die Kulturen aus den beiden Regionen wurden mindestens 10 DIV vor dem Experiment kultiviert. Zunächst wurden die Zellen mit Vehikel oder 17 β-Estradiol behandelt und im nächsten Schritt 20 h später Vehikel oder Staurosporin zugegeben. 1, Vehikel / Vehikel-behandelte Kulturen; 2, 17 β-Estradiol / Vehikel-behandelte Kulturen; 3, Vehikel / Staurosporin-behandelte Kulturen; 4, 17 β-Estradiol / Staurosporin-behandelte Kulturen. Die semiquantitative Auswertung der Western-blots durch Bandendichte-Bestimmung wird hier von 4 separaten Experimenten gezeigt.

Die gesteigerte Expression von Bcl-2 und Bcl-xL, die nach der 48-stündigen Behandlung mit 17 β-Estradiol beobachtet werden konnte, wurde sowohl durch Tamoxifen als auch durch Cycloheximid reduziert (siehe Abb. 25).

Abb. 25:Antagonismus der Wirkung von 17 β-Estradiol auf die BCL-2- und BCL-xL-Spiegel in hippokampalen Kulturen durch Cycloheximid und Tamoxifen. Am 10. DIV wurden die Kulturen für 48 h behandelt und dann für Western-blots geerntet. a: Vehikel-behandelte Kulturen, b: Cycloheximid (500 ng/ml Medium), c: Tamoxifen (1,0 µM), d: 17 β-Estradiol (0,1 µM) / Cycloheximid (500 ng/ml Medium), e: 17 β-Estradiol (0,1 µM) / Tamoxifen (1,0 µM), f: 17 β-Estradiol (0,1 µM), g: 17 β-Estradiol (1,0 µM).

4.7 Expression von Estrogenrezeptor-α und -β in septalen, hippokampalen und kortikalen Kulturen


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Um herauszufinden, ob die neuroprotektive Wirksamkeit von 17 β-Estradiol gegen AF64A-induzierte Apoptose und der Anstieg der Bcl-Expression von der Präsenz eines spezifischen Estrogenrezeptors abhängt, haben wir die Expression von Estrogenrezeptor-α und Estrogenrezeptor-β in septalen, hippokampalen und kortikalen, neuronalen Kulturen mit immunzytochemischen Techniken untersucht.

4.7.1 Immunzytochemischer Nachweis von Estrogenrezeptor-α

Die immunzytochemische Färbung von Estrogenrezeptor-α war in den kortikalen Kulturen vergleichsweise schwächer als in den hippokampalen und septalen neuronalen Zellkulturen (Abb. 26 A).

Die Intensität der Immunreaktion wurde mittels konfokaler Mikroskopie aus 139 Neuronen der jeweiligen Zellkulturen in randomisierter und verblindeter Weise quantifiziert. Die mittlere Pixel-Intensität war in den septalen Neuronen (13,06 ± 0,57) und hippokampalen Neuronen (11,37 ± 0,57) signifikant höher im Vergleich zu den kortikalen Neuronen (7,62 ± 0,47; p < 0,05, one-way ANOVA on ranks mit nachfolgendem Tuckey´s post hoc test).

Als weiteres Kriterium zur Differenzierung der Fluoreszenzintensität der Neurone aus den drei Hirnregionen wurde der Median der Pixel-Intensität aller gezählten Zellen (8,9) als Grenze zwischen Zellen „niedriger“ und „hoher“ Intensität gewählt.

In kortikalen Neuronen überwiegten die Zellen niedriger Intensität (100 von 139 Zellen). Eine gegensätzliche Verteilung fand sich in septalen und hippokampalen Nervenzellen (Abb. 26 C).

4.7.2 Immunzytochemischer Nachweis von Estrogenrezeptor-β

Die Immunfärbung gegen Estrogenrezeptor-β war im Unterschied zur Verteilung des α-Estrogenrezeptors in den kortikalen Neuronen wesentlich intensiver als in den septalen und hippokampalen Zellen (Abb. 26 B).

Die Intensität der Immunreaktion wurde wiederum mittels konfokaler Mikroskopie aus 140 Neuronen der jeweiligen Zellkulturen in randomisierter und verblindeter Weise quantifiziert. Die mittlere Pixel-Intensität war in den septalen Neuronen (7,85 ± 0,31) [Seite 70↓]und hippokampalen Neuronen (8,61 ± 0,44) signifikant niedriger im Vergleich zu den kortikalen Neuronen (10,86 ± 0,39; p < 0,05, one-way ANOVA on ranks mit nachfolgendem Tuckey´s post hoc test).

Auch hier wurde als weiteres Kriterium zur Differenzierung der Fluoreszenzintensität der Neurone aus den drei Hirnregionen der Median der Pixel-Intensität aller gezählten Zellen (8,3) als Grenze zwischen Zellen „niedriger“ und „hoher“ Intensität gewählt.

In kortikalen Neuronen überwiegten die Zellen hoher Intensität (91 von 140 Zellen). Eine gegensätzliche Verteilung fand sich in septalen und hippokampalen Nervenzellen (Abb. 26 C).


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Abb. 26 A – C: Immunzytochemische Analyse der Lokalisation von Estrogenrezeptor-α (A) und Estrogenrezeptor-β (B) in kortikalen, hippokampalen und septalen Neuronen. Zellkulturen aus den drei Regionen wurden 12 DIV kultiviert und dann mit 4 % Formaldehyd für 15 Minuten bei Raumtemperatur fixiert. Die Immunzytochemie wurde, wie in den Materialien (Kap. 3.7.2.) beschrieben, durchgeführt. Die Kulturen wurden dann auf Objektträgern mit ImmunFluor Mounting Medium montiert und in der konfokalen Mikroskopie bei einer 630x-Vergrößerung digitalisiert. C: Verteilung von Estrogenrezeptor-α und Estrogenrezeptor-β-immunoreaktiven Neuronen anhand der Intensität der Fluoreszenz in kortikalen, hippokampalen und septalen Neuronen. Die quantitative Analyse wird in Kapitel 3.7.4. ausführlich beschrieben und erfolgte anhand der ermittelten mittleren Pixelintensitäten aus 139 bzw. 140 Neuronen je Region und Rezeptor. Diese Neuronen wurden in randomisierter und verblindeter Weise durch eine zweite Person ausgewählt. Die mediane Pixelintensität aller gezählten Neurone wurde als Grenze für die Zuordnung der Neurone zu Zellen mit niedriger oder hoher Intensität gewählt (8,9 für Estrogenrezeptor-α und 8,3 für Estrogenrezeptor-β).


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4.8  Beteiligung der Phospho-Inositol-3-Kinase (PI-3-Kinase)-Kaskade an der zellschützenden Wirkung von 17 β-Estradiol

Um einen weiteren Hinweis für die Beteiligung von Estrogenrezeptor-α an der Neuroprotektivität von 17 β-Estradiol im AF64A-Modell der Zellschädigung zu erhalten, haben wir den Einfluss von LY294002 getestet. Diese Substanz ist ein Hemmer der PI-3-Kinase. Die Aktivierung dieser Kinase ist ein wichtiger Schritt im IGF-1-Rezeptorweg. Es konnte kürzlich gezeigt werden, das 17 β-Estradiol eine Aktivierung dieses Rezeptorweges nur über die Stimulation von Estrogenrezeptor-α, nicht aber über Estrogenrezeptor-β bewirken konnte (Kahlert et al., 2000). Bei Gabe von 5 µM LY294002 zusammen mit 17 β-Estradiol konnte der protektive Effekt komplett aufgehoben werden (Tabelle 12).

Tabelle 12: Verlust der neuroprotektiven Wirkung von 17 β-Estradiol auf den Zelltod durch 40μM AF64A in hippokampalen und septalen Zellen nach Vorbehandlung mit LY 294002 (LDH-Anstieg in Δ Units / ml Medium, 48 h post). Die basale LDH-Ausschüttung in den korrespondierenden Kontrollkulturen war 43,3 ± 4,9 für die hippokampalen Zellen und 41,7 ± 3,2 Units/ml medium für die Zellkulturen aus dem Septum. n = 4 – 9. a p < 0,05 und b p < 0,001 versus AF64A + Vehikel; c p < 0,05 und d p < 0,001 versus AF64A + Estradiol.

 

Zellkultur

AF64A +

Vehikel

AF64A +

LY294002

AF64A +

Estradiol

0,1 µM

AF64A +

Estradiol +

LY 294002

LY 294002

5 µM

Hippokampus

65,5 ± 4,8

61,3 ± 2,5

31,8 ± 3,0 b

57,1 ± 5,1 d

Septum

49,4 ± 5,5

49,2 ± 4,3

24,9 ± 3,4 a

46,5 ± 6,1 c

4.9 Zusammenfassende Darstellung der Ergebnisse in Bezug auf die Arbeits-hypothesen bzw. Fragestellungen

Die in der Herleitung der Aufgabenstellung angeführten Fragestellungen können wie folgt zusammenfassend beantwortet werden:

ad 1) Melatonin war bei apoptotisch-degenerativem Zelluntergang durch AF64A oder Staurosporin nicht neuroprotektiv wirksam. Es liessen sich in Bezug auf die apoptotische Komponente der OGD keine protektiven Effekte durch Melatonin [Seite 73↓]nachweisen. Hingegen konnte eine neuroprotektive Wirkung gegen exzitotoxisch-nekrotischen Schaden durch Melatonin nachgewiesen werden.
17 β-Estradiol wirkte im AF64A-Modell für die Auslösung neuronaler Apoptose protektiv, wenn eine Vorbehandlung von 20 h erfolgte und hippokampale oder septale Zellen verwendet wurden. An kortikalen Neuronen liess sich dieser Effekt nicht nachweisen, so dass hier ein grundlegender Unterschied zwischen den drei untersuchten Regionen auftrat. Eine Kurzzeitbehandlung von 1 h versagte ebenfalls. Dagegen konnte bei exzitotoxisch-nekrotischem Schaden durch Glutamat oder der OGD nach Kurzzeitbehandlung ein Schutz der Neurone gezeigt werden.

ad 2) Melatonin ist als potenter Radikalfänger in den verwendeten Modellen nicht in der Lage gewesen antiapoptotische Wirkung zu entfalten. Es zeigte sich zwar, dass die Lipidperoxidation (gemessen durch die Entstehung von Malondialdehyd), die nach AF64A oder Staurosporin nachweisbar war, durch Melatonin sehr effektiv verhindert werden konnte. Dies hatte jedoch keinerlei Auswirkungen auf den Zelltod. Auch weitere getestete Radikalfänger hatten keinerlei Auswirkung auf den Untergang der Neurone.

ad 3) Die antiapoptotische Wirkung durch die 20-stündige Vorbehandlung mit 17 β-Estradiol liess sich durch Proteinsynthesehemmung mit Cycloheximid und durch die Rezeptorantagonisten Tamoxifen und ICI182,780 blockieren. Auch die induzierten höheren Expressionslevel der antiapoptotischen Proteine Bcl-2 und Bcl-xL nach Behandlung mit 17 β-Estradiol traten bei gleichzeitiger Gabe der Antagonisten nicht auf. Bei exzitotoxisch-induziertem Zellschaden konnte durch Tamoxifen die Schutzwirkung des 17 β-Estradiol bei Kurzzeitbehandlung nicht aufgehoben werden, so dass hier ein Rezeptor-unabhängiger Mechanismus wahrscheinlich ist.

ad 4) 17 β-Estradiol wirkte nur in septalen und hippokampalen Kulturen bei apopto-tischer Degeneration neuroprotektiv. Dieser Rezeptor-abhängige Effekt (siehe 3) könnte auf mögliche Unterschiede in der Expression der beiden Estrogenrezeptoren beruhen, die wir immunzytochemisch nachgewiesen haben. Es zeigte sich eine im Vergleich zum Kortex höhere Expression von Estrogenrezeptor-α im Hippokampus und Septum, während im Kortex die Intensität des Estrogenrezeptor-β dominierte. Der neuroprotektive Effekt im Septum und Hippokampus [Seite 74↓]ist nach unserer Hypothese über den Estrogenrezeptor-α vermittelt. Untermauert wird diese These durch die unterschiedlichen intrazellulären Signalkaskaden und Genexpressionsmuster nach Stimulation der beiden Rezeptoren. Der Estrogenrezeptor-α ist mit der PI-3-Kinase verbunden und führt zur Aktivierung des IGF-1-Rezeptorweges. LY294002 hemmt diese Kinase und konnte den protektiven Effekt aufheben. Der antagonistische Effekt von LY294002 kann daher als weiterer Hinweis für die Beteiligung des Estrogenrezeptor-α gewertet werden.


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18.04.2005