5 Diskussion

5.1 Melatonin

Die vorliegende Studie ermöglichte neue Einsichten in das neuroprotektive Potential von Melatonin. Die Ergebnisse bestätigen die neuroprotektive Potenz von Melatonin in Modellen der neuronalen Nekrose, die mit einer Akkumulation von freien Radikalen verbunden sind. In Übereinstimmung mit früheren Beobachtungen (Cazevieille et al., 1997) wurde der Zelltod kortikaler Neurone durch OGD zumindestens teilweise durch Melatonin verhindert. Im Gegensatz dazu fand sich kein Hinweis für schützende Eigenschaften von Melatonin im Falle der Apoptose. Das konnte in drei unterschiedlichen Modellen der neuronalen Apoptose gezeigt werden. Alle drei Modelle waren von der Aktivierung von Caspasen abhängig (Gottron et al., 1997; siehe eigene Ergebnisse), unterschieden sich aber im Mechanismus und im Zeitverlauf, der zur Apoptose führte. Bei der neuronalen Apoptose, ausgelöst durch Gabe von AF64A oder Staurosporin, war Melatonin nicht neuroprotektiv wirksam. Des Weiteren fehlte der Schutz durch Melatonin auch in Bezug auf die apoptotische Komponente der OGD. Der neuronale Zelltod durch Ischämie wurde traditionell der Nekrose zugeordnet. Immer mehr Hinweise deuten aber auch auf eine Beteiligung der Apoptose bei der Schädigung des Gehirns durch Ischämie und in vitro lässt sich dieser Apoptoseanteil mit Glutamatantagonisten demaskieren (Gottron et al., 1997 und Copin et al., 1998). Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass Melatonin nicht mehr neuroprotektiv gegen die OGD war, wenn der exzitotoxische, durch NMDA-Rezeptoren vermittelte hypoxische Schaden durch den Glutamatantagonisten MK-801 verhindert [Seite 75↓]wurde und folglich der apoptotische Zelltod dominierte. Der begrenzte Effekt von Melatonin in der Hypoxie ohne Blockade der NMDA-Rezeptoren ist vielleicht dadurch zu erklären, dass sich die Wirksamkeit von Melatonin nur auf die nekrotischen Zelltodanteile bei der OGD beschränkt. Diese Ergebnisse stimmen mit der Beobachtung überein, dass Trolox, ein antioxidatives Analog zu Vitamin E, die Nekrose durch Sauerstoffentzug in kortikalen Neuronen verhindern konnte, aber die Apoptose demaskierte (Copin et al., 1998). Die limitierte Wirksamkeit von Melatonin geht auch aus früheren Untersuchungen hervor. Melatonin schützte bei exzitotoxischer Schädigung durch NMDA Kleinhirnneurone nicht vor dem Schaden (Guisti et al., 1995) und erwies sich bei Schädigung durch 3-Hydroxyglutarat, das über den NMDA-Rezeptor exzitotoxisch wirkt, in kortikalen Neuronenkulturen aus Hühnerembryonen als weniger wirksam als Vitamin E bzw. α-Tocopherol (Kölker et al., 2001). Das erklärt auch die bessere Wirksamkeit von MK801 gegenüber Melatonin bei der Reduktion der LDH-Freisetzung 24 h nach 120-minütiger OGD (40,6 ± 4,0 % versus 78,2 ± 7,9 % Reduktion der LDH-Aktivität; siehe auch Tabelle 7).

Die Ergebnisse dieser Untersuchung weisen auf die unterschiedliche neuroprotektive Effektivität von Melatonin, abhängig von der Art des Zelltodes, hin. Erst durch die Anwendung einer Vielzahl von Modellen war es möglich, ein besseres Verständnis über das neuroprotektive Potential dieser endogenen Substanz zu bekommen. Aus diesem Grunde wählten wir drei verschiedene Modelle für eine vorwiegend apoptotische Zelldegeneration aus, die sich im Zeitverlauf der Apoptoseinduktion deutlich unterscheiden. Die Besonderheit im AF64A-Modell der Apoptoseauslösung ist die langsam innerhalb von 72 h fortschreitende Zelldegeneration. Innerhalb der ersten 24 h sind keine morphologischen Veränderungen oder ein LDH-Anstieg im Medium zu beobachten. Im Gegensatz dazu ist die neuronale Apoptose bei Staurosporin nach 24 h voll ausgeprägt. Auch nach OGD ist der Anteil der apoptotischen Zellschädigung nach 24 h schon voll entwickelt (siehe Abb. 17).

Verschiedene Mechanismen der neuroprotektiven Strategien von Melatonin wurden diskutiert (siehe Einleitung). Keiner dieser Mechanismen war in der Lage, mit dem Ablauf der langsamen Caspase-abhängigen Apoptose in Wechselwirkung zu treten und den neuronalen Zelltod in den drei angewandten Apoptosemodellen zu verhindern. Das bezieht sich auch auf die antioxidativen Eigenschaften von Melatonin. Obwohl der Anstieg von Malondialdehyd in den ersten 24 h nach Gabe von AF64A durch Melatonin blockiert wurde, führte diese Blockade nicht zu einer Redu[Seite 76↓]zierung des apoptotischen Zellverlusts. Darum scheint der oxidative Stress im AF64A-Modell, der in vitro in der vorliegenden Studie durch Anstieg der Malondialdehyd-Konzentration gezeigt wurde (siehe Abb. 14) und auch in vivo nach intrazerebroventrikulärer Injektion von AF64A beobachtet wurde (Gulyaeva et al., 1996), den Ablauf des programmierten Zelltods weder zu initiieren noch in diesem spezifischen Modell zu unterstützen. Das konnte auch für die Apoptose durch Staurosporin gezeigt werden und bezieht sich möglicherweise auch auf die apoptotische Komponente bei der OGD. Die geringe Beteiligung freier Radikale in diesen Modellen wird auch dadurch bestätigt, dass die Antioxidantien PBN und DMTU im AF64A- und Staurosporinmodell zwar den Anstieg von Malondialdehyd antagonisierten, aber keineswegs den neuronalen Zelltod verhinderten. Bei exzitotoxischer Schädigung konnte Melatonin sowohl die Bildung von Lipidperoxidationsprodukten als auch den neuronalen Schaden nach Injektion von Quinolinsäure verhindern (Behan et al., 1999).

Frühere Erfahrungen zeigen, dass Melatonin die neuronale Apoptose im Falle der Zellschädigung durch 6-Hydroxydopamin (6-OHDA), β-Amyloid und Kainat in vitro und in vivo abschwächen konnte. Für die neuroprotektive Wirkung von Melatonin in diesen Modellen können folgende Mechanismen verantwortlich sein: Beim 6-OHDA-Modell ist die Art des Zelltodes dosisabhängig. 6-OHDA löst in niedrigen Dosen Apoptose innerhalb von 18 – 24 h aus, wie dies in kultivierten dopaminergen Neuronen, zerebellären Körnerzellen und PC12-Zellen gezeigt werden konnte (Lotharius et al., 1999; Dodel et al., 1999; Mayo et al., 1999). In höheren Dosen jedoch sterben die Zellen bei Schädigung durch 6-OHDA aber innerhalb von 6 h durch Nekrose (Dodel et al., 1999). Der Mechanismus der Zellschädigung durch 6-OHDA schließt in beiden Fällen die Bildung von Hydrogenperoxiden, Superoxiden und freien Radikalen ein (Cohen und Heikkila, 1974), die Melatonin detoxifizieren kann. Die zelltoxischen Eigenschaften von β-Amyloid werden mit freien Sauerstoffradikalen und einer erhöhten Empfindlichkeit gegenüber Exzitotoxizität, die Melatonin detoxifizieren kann, in Zusammenhang gebracht. Für die durch β-Amyloid induzierte Zellschädigung wurden je nach Zelltyp sowohl Nekrose als auch Apoptose beschrieben (Behl et al., 1994; Copani et al., 1995; Gschwind und Huber, 1995). Die zellschützenden Eigenschaften von Melatonin gegen β-Amyloid können auch durch die Fähigkeit von Melatonin in vitro erklärt werden, die Sekundärstruktur von β-Amyloid zu verändern und die Bildung der für die Toxizität verantwortlichen Amyloidfibrillen zu verhindern (Pappolla et al., 1998). Für die Beurteilung der Wirksamkeit von Melatonin im Kainat-[Seite 77↓]Modell sind folgende Punkte zu beachten: Es liegen in vivo Beweise dafür vor, dass Melatonin gegen DNS-Schädigung schützt, die 48 und 72 h nach intraperitonealer Gabe von Kainat im Hippokampus von Ratten beobachtet werden konnte (Uz et al., 1996). Der verzögerte Beginn der apoptotischen Zellschädigung nach Kainatgabe schließt eine direkte neurotoxische Wirkung von Kainat aus und somit auch eine direkte antiapoptotische Wirkung von Melatonin. Viel wahrscheinlicher läßt sich der schützende Effekt des Melatonins gegen die verzögerte Apoptose als Reaktion auf die Kainatgabe durch die Verminderung der epileptischen Aktivität bei Melatoninbehandlung erklären (Giusti et al., 1996; Tan et al., 1998 und Lapin et al., 1998). Der apoptotische Zelluntergang in hippokampalen Neuronen nach Kainatgabe konnte auch verhindert werden, wenn die epileptische Aktivität durch Diazepam blockiert wurde (Pollard et al., 1994). Es wird angenommen, dass der neuroprotektive Effekt von Melatonin gegen zerebrale Schädigung durch Kainat mit der Fähigkeit Sauerstoffradikale wegzufangen und der antiepileptischen Eigenschaften durch Regulation des GABA-Rezeptors zusammenhängt (Tan et al., 1998). Außerdem reduzierte Melatonin die Apoptoserate nach intrastriataler Injektion von Kainat nur im angrenzenden Kortex, nicht jedoch im Striatum, ein weiterer Befund, der eine direkte antiapoptotische Wirkung von Melatonin ausschließt (Chen und Chuang, 1999). Die Hochregulation des Glutathionsystems als antioxidatives Verteidigungssystem durch Melatonin wurde als weiterer Mechanismus für die Reduktion des exzitotoxischen neuronalen Zelltodes und die Verhinderung der Ausbreitung des Schadens auf angrenzende Hirnregionen diskutiert (Floreani et al., 1997; Chen und Chuang, 1999).

In der vorliegenden Studie konnten Hinweise gewonnen werden, dass Melatonin den neuronalen Zelltod in Kulturen sowohl unter basalen Bedingungen als auch nach neuronaler Schädigung verstärken kann. Bei Behandlung von nativen primären neuronalen Zellkulturen mit Melatonin konnte ein signifikanter Anstieg der LDH-Freisetzung innerhalb von 72 h demonstriert werden. Dieser schädigende Effekt von Melatonin wurde bisher noch nicht dokumentiert. In den relevanten Studien wurden entweder keine LDH-Werte für Kontrollkulturen angegeben oder der Beobachtungszeitraum war 24 h oder kürzer. Zu diesem Zeitpunkt war eine Veränderung der Lebensfähigkeit der Zellen in unseren Zellkulturen noch nicht erkennbar. Dieser zytotoxische Effekt war bei den anderen von uns untersuchten Antioxidantien jedoch nicht nachweisbar. Bei der Behandlung mit PBN oder DMTU trat auch nach 72 h keine Veränderung der LDH-Freisetzung auf. Die beobachtete Zytotoxizität von Melatonin [Seite 78↓]könnte auf das Vorhandensein pro-oxidativer Aktivitäten des Antioxidants Melatonin hindeuten. Dieses Phänomen wurde für Melatonin und andere antioxidative Substanzen wie Estrogene oder Vitamin C beschrieben (Ianas et al.,1991; Nathan und Chaudhuri, 1998; Medina-Navarro et al., 1999; Paolini et al., 1999). Der Anstieg von Malondialdehyd durch Melatonin in nativen Kulturen unterstreicht das pro-oxidative Potential von Melatonin. Basierend auf Untersuchungen von Reiter wird angenommen, dass die Wirkung von Melatonin auf einer Entgiftung von Hydroxylradikalen (iOH) über Abgabe von Elektronen beruht (Reiter, 1998). Während dieser Reaktion wird Melatonin selbst zum Radikal, dem Indolylkation-Radikal. Es wurde gezeigt, dass radikale Indolkationen mit Sauerstoff reagieren, so dass bei der Entstehung von Indoxylen peroxyradikale Intermediärprodukte entstehen. Die Bildung des radikalen Melatoninkations wurde zum Beispiel für die Verstärkung des Vitamin E-Verbrauchs nach oxidativem Stress in roten Blutkörperchen verantwortlich gemacht (Barsacchi et al., 1998). Medina-Navarro und Mitarbeiter (1999) schlugen außerdem die Bildung von oxidativen Sekundärprodukten als einen möglichen Mechanismus der pro-oxidativen Eigenschaften von Melatonin vor. Eine pro-oxidative Aktivität würde auch unsere Befunde erklären, dass Melatonin die LDH-Freisetzung nach AF64A- oder Staurosporingabe noch verstärkte und der protektive Effekt gegen OGD in den höheren Melatonindosen schwächer war. Eine Potenzierung neuronaler Schädigung durch Melatonin wurde auch bei der Neurotoxizität von Metamphetamin in Ratten beobachtet (Gibb et al., 1997). Diese Ergebnisse zeigen, dass die therapeutische Anwendung von Melatonin in höheren Dosen mit möglichen Risiken behaftet ist. Der Bericht über einen prokonvulsiven Effekt von Melatonin bei neurologisch erkrankten Kindern unterstreicht die klinische Relevanz dieses Befundes (Sheldon, 1999).

Zusammenfassend stützen die Daten die These, dass die Neuroprotektivität von Melatonin von der Ursache des neuronalen Zelltods abhängt. An drei unterschiedlichen Modellen der neuronalen Caspase-abhängigen Apoptose konnte der Ablauf des neuronalen apoptischen Zelluntergangs durch Melatonin nicht gehemmt werden, ganz im Gegensatz zur Wirksamkeit bei exzitotoxisch-nekrotischem Zelltod. Wenn die Entstehung von freien Radikalen oder ein Exzess von Exzitotoxinen die Hauptursachen für die Auslösung des Zelltodprogrammes sind, könnte Melatonin schützend wirksam sein. Zusätzlich zu diesen vorteilhaften Eigenschaften von Melatonin konnten jedoch auch Hinweise für die Verstärkung des neuronalen Schadens durch Melatonin gewonnen werden. Melatonin könnte als endogener, protektiver [Seite 79↓]Faktor nützlich für die pharmakologische Behandlung der Neurodegeneration durch Glutamatexzitotoxizität und / oder oxidativen Stress wie Ischämie des Gehirns oder Epilepsie sein. Eine potentielle therapeutische Anwendung von Melatonin in neurodegenerativen Prozessen, die hauptsächlich mit dem apoptotischen Typ des neuronalen Zelltods assoziiert sind, ist fraglich.

5.2 17 β-Estradiol

Im zweiten Teil der Studie konnte gezeigt werden, dass in vitro an der neuroprotektiven Wirksamkeit von 17 β-Estradiol unterschiedliche Mechanismen beteiligt sind, je nachdem ob das verwendete Schadensmodell hauptsächlich den apoptotischen oder den exzitotoxisch-nekrotischen Typ des neuronalen Zelltods induziert. Außerdem konnten hirnregionsspezifische Unterschiede in der neuroprotektiven Wirkung von 17 β-Estradiol beobachtet werden. Wenn Apoptose durch AF64A ausgelöst wurde, konnte eine Wirksamkeit durch 17 β-Estradiol nur durch die sogenannte Langzeitbehandlung (20 h-Gabe) im Dosisbereich von 0,1 μM in septalen und hippokampalen, jedoch nicht in kortikalen Kulturen erzielt werden. Der neuroprotektive Effekt konnte durch den Estrogenrezeptorantagonisten ICI 182,780 und Tamoxifen oder durch Hemmung der Proteinsynthese aufgehoben werden. Diese Befunde deuten darauf hin, dass die Verhinderung des apoptotischen, neuronalen Zelltods durch 17 β-Estradiol in diesem Modell möglicherweise über eine Regulation auf Transkriptionsebene über Aktivierung von Estrogenrezeptoren vermittelt wird. Ähnliche Hinweise wurden bei der Neuroprotektivität durch 17 β-Estradiol gegen β-Amyloid-Toxizität in hippokampalen Neuronenkulturen gefunden (Pike, 1999). Kurzzeitige Estrogenrezeptor-unabhängige Mechanismen spielten keine Rolle im AF64A-Modell der apoptotischen, neuronalen Schädigung.

Im Falle der apoptotischen Zellschädigung durch den breitwirksamen Proteinkinaseinhibitor Staurosporin konnten septale, hippokampale und kortikale Neuronenkulturen weder durch die Kurz- noch durch die Langzeitbehandlung mit
17 β-Estradiol vor dem apoptotischen Zelluntergang bewahrt werden. Das Versagen von 17 β-Estradiol, im Staurosporin-Modell der apoptotischen Neurodegeneration entgegenzuwirken, erklärt sich zumindest teilweise durch die folgenden Befunde. Es konnte in der vorliegenden Studie gezeigt werden, dass Staurosporin den durch die [Seite 80↓]Langzeitbehandlung mit 17 β-Estradiol induzierten Anstieg der Expression von Bcl-2 verhinderte. Des Weiteren könnte die Hemmung der Proteinkinasen durch Staurosporin zur Ineffektivität von 17 β-Estradiol beitragen. Die Rolle der durch die Mitogen-aktivierte Proteinkinase initiierten Signalkaskade in der Neuroprotektivität von Estrogenen wurde bei Glutamat-induzierter Exzitotoxizität in primären, kortikalen Neuronenkulturen diskutiert (Singer et al., 1999).

Wurde die neuronale Schädigung durch Exzitotoxizität oder OGD ausgelöst, war nur die Kurzzeitbehandlung mit höheren Dosen von 17 β-Estradiol (0,5 – 1,0 μM) wirksam. Dieser Effekt konnte durch Estrogenrezeptorblockade nicht verhindert werden. Diese Befunde stimmen mit bereits bekannten Ergebnissen aus kortikalen, hippokampalen und mesencephalen dopaminergen Neuronenkulturen überein (Goodman et al., 1996; Behl et al., 1997; Regan und Guo, 1997; Sawada et al., 1998). Die Unabhängigkeit der Neuroprotektivität von Estrogenen von rezeptor-vermittelten Wegen oder Proteinsynthese bei Exzitotoxizität oder OGD konnten von verschiedenen Gruppen gezeigt werden (Sawada et al., 1998; Moosmann und Behl, 1999; Zaulyanov et al.,1999). Diese Ergebnisse und die unmittelbare Effektivität von höheren Dosen von 17 β-Estradiol weisen daraufhin, dass Mechanismen unabhängig von transkriptioneller Regulation involviert sind. Das könnten zum Beispiel antioxidative Fähigkeiten von Estrogenen, direkte Hemmung von NMDA-Rezeptoren (Weaver et al., 1997), die schnelle Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern (Beyer und Raab, 1998), die Stimulation der Guanylatcyclaseaktivität (Chen et al., 1998), Blockade des Calciumeinstroms über Calciumkanäle vom L-Typ (Mermelstein et al., 1996) und Stabilisierung der Mitochondrienfunktion (Mattson et al., 1997) sein. Zusätzlich wird die Beteiligung möglicher Membranbindungsstellen auf Neuronen für verschiedene Steroide, Estrogene eingeschlossen, diskutiert (Übersichtsarbeit von Behl und Holsboer, 1999). Unsere Ergebnisse der Ineffektivität von 17 β-Estradiol (0,1 – 5,0 μM) nach Langzeitbehandlung im Glutamat- oder OGD-Modell stehen jedoch im Gegensatz zur signifikanten Protektion gegen Exzitotoxizität in hippokampalen Neuronenkulturen oder hippokampalen Slicekulturen, denen niedrige Dosen von 17 β-Estradiol (1 – 50 nM) 24 h vor den Exzitotoxinen zugegeben wurden (Singer et al., 1996; Bi et al., 2000). Dabei ist aber zu beachten, dass eine vergleichbare Wirkung in den hippokampalen Slicekulturen erzielt wurde, unabhängig davon, ob das Steroid 24 h oder zehn Minuten vor den Exzitotoxinen zugegeben wurde (Bi et al., [Seite 81↓]2000). Die Diskrepanzen zwischen diesen Studien und der vorliegenden Arbeit könnten mit der kürzeren Expositionsperiode (Singer et al., 1996) oder der niedrigeren Dosis von Exzitotoxinen in völlig verschiedenen Kultursystemen (Bi et al., 2000) in Verbindung gebracht werden.

Die Ineffektivität der Kurzzeitbehandlung mit 17 β-Estradiol im AF64A- und Staurosporinmodell der apoptotischen Neurodegeneration stimmt sehr gut mit den Ergebnissen überein, die zeigen, dass in den gleichen Modellen mit verschiedenen Antioxidantien wie Melatonin, PBN oder DMTU keine schützende Wirkung erzielt werden konnte. In beiden Modellen verhinderten die antioxidativen Substanzen den initialen Anstieg von Malondialdehyd, das die Akkumulation von freien Radikalen anzeigt, konnten aber nicht die Induktion der Apoptose verhindern (siehe Tabelle 4 – 6 und Abb. 14 – 16 oder Seite 1818 – 1819 bei Harms et al., 2000).

Die hirnregionsspezifischen Unterschiede in der neuroprotektiven Wirkung von 17 β-Estradiol im Falle apoptotischer Schädigung sind von besonderem Interesse. Wir konnten beobachten, dass die Langzeitbehandlung mit 17 β-Estradiol nur in hippokampalen und septalen Neuronenkulturen schützend gegen AF64A-induzierte Apoptose wirkte, den Zelluntergang in kortikalen Kulturen jedoch nicht abschwächte. Im Gegensatz dazu waren kortikale Neurone, die mit 17 β-Estradiol 1 h vorbehandelt wurden, weniger vulnerabel gegen Glutamatbehandlung oder OGD, ein Effekt, der durch Tamoxifen nicht antagonisiert wurde. Es werden also rezeptorunabhänige Effekte von 17 β-Estradiol in kortikalen Kulturen wirksam, wohingegen Modulationen der Genaktivierung entweder nicht existieren oder eine Neuroprotektivität gegen AF64A in kortikalen Kulturen nicht vermitteln. Eine mögliche Erklärung für die regionsspezifische Protektivität ist die unterschiedliche Verteilung und Regulation von Estrogenrezeptor-α und Estrogenrezeptor-β im Gehirn (Shughrue et al., 1997; Laflamme et al., 1998). Es ist auch immer noch offen, welcher Rezeptorsubtyp die neuroprotektive Wirkung von Estrogenen vermittelt. Laut Sawada und Mitarbeitern (2000) wird die neuroprotektive Wirkung von Estradiol in dopaminergen Neuronen der Substantia nigra durch die Supprimierung proapoptotischer Gentranskription über die AP-1-Seite über Aktivierung des β-Estrogenrezeptors vermittelt. Andererseits wurde der Hirnschaden in experimentellen Schlaganfallmodellen in α-Estrogenrezeptor-defizienten weiblichen Mäusen nicht verstärkt, ein Befund der beinhalten könnte, dass Estrogene den Hirnschaden unabhängig von einer Aktivie[Seite 82↓]rung von α-Estrogenrezeptoren entfalten können (Sampei et al., 2000). Auf der anderen Seite unterstützen viele Studien die Beteiligung vom α-Estrogenrezeptor. Hinweise für einen Zusammenhang von Estrogenrezeptor-α, erhöhter Bcl-xL–Expression und Neuroprotektion zeigten sich in hippokampalen Kulturen (Pike, 1999). Außerdem schützte Estradiol in α-Estrogenrezeptor-Knockout-Mäusen nicht gegen ischämischen Schaden, während die neuroprotektive Wirkung in β-Estrogenrezeptor knockout Mäusen voll erhalten blieb (Dubal et al., 2001). Diese Befunde weisen eindeutig auf eine Abhängigkeit der Neuroprotektion durch Estradiol vom α-Estrogenrezeptor hin, die wir in unserer Studie bestätigen konnten. Zwei Ergebnisse der vorliegenden Arbeit sprechen für die dominante Rolle des α-Estrogenrezeptors: 1. Die niedrigste Intensität der Immunfluoreszenz für α-Estrogenrezeptor und die höchste Intensität für den β-Estrogenrezeptor fanden sich in kortikalen Kulturen im Vergleich zu hippokampalen und septalen Kulturen. Das stimmt mit in vivo-Studien in der adulten Ratte überein (Shughrue et al., 1997 und Laflamme et al., 1998) und bestärkt neuere Ergebnisse, die besagen, dass der α-Estrogenrezeptor immunzytochemisch in kultivierten Neuronen des embryonalen Kortex der Ratte (E14) kaum detektierbar war (Zhang et al., 2000). 2. Die Neuroprotektion durch 17 β-Estradiol konnte bei gleichzeitiger Behandlung mit dem Phospoinositol-3-Kinase-(PI3-Kinase)-Hemmer LY294002 nicht mehr nachgewiesen werden. Eine Antagonisierung des 17 β-Estradiols durch LY294002 wurde auch durch Honda gezeigt (Honda et al., 2000). Dieser Befund weist einerseits auf die Rolle der PI3-Kinase in der Estradiol-vermittelten Neuroprotektion und eine mögliche Beteiligung des IGF-1-Rezeptorweges hin. Kahlert et al. (2000) konnten kürzlich zeigen, dass diese Kaskade über den α-Estrogenrezeptor nicht aber über den β-Rezeptor aktiviert wird. In Abbildung 27 ist diese Kaskade schematisch dargestellt.

Ungeachtet einer vergleichbaren Affinität der beiden Estrogenrezeptor-subtypen für 17 β-Estradiol (Kuiper et al., 1997), spiegeln die beiden Formen der Rezeptoren unterschiedliche Affinitäten für natürlicherweise vorkommende Hormonantwort-Elemente wieder, so dass unterschiedliche Genexpressionsmuster durch die Aktivierung der beiden Subtypen ausgelöst werden (Hyder et al., 1999). Das bezieht sich nicht nur auf die Aktivierung des IGF-1-Rezeptorweges, sondern auch auf die Aktivierung der Transkription an den AP-1-Bindungsstellen (Paech et al., 1997; Kahlert et al., 2000).


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Abb. 27: Interaktion zwischen Estrogenrezeptor-α und dem IGF-1-Rezeptorweg (modifiziert nach einem Vorschlag von Kahlert et al., 2000).

Einer der Mechanismen, die an der neuroprotektiven Wirkung von 17 β-Estradiol beteiligt sein könnten, ist die Fähigkeit von 17 β-Estradiol, die Expression von Proteinen der Bcl-Familie zu modulieren. Dieser Effekt wurde erstmals in peripheren, nicht-neuronalen Geweben gezeigt (humane Brustkrebszellen, Endometrium während der proliferativen Phase des Menstruationszyklus; siehe Bhargava et al., 1994; Otsuki et al., 1994; Teixeira et al., 1995). Im Gehirn wurde eine Hochregulation von Bcl-2 durch Estradiol in hypothalamischen Neuronen weiblicher Ratten in vivo gefunden (Garcia-Segura et al., 1998). Estradiol verhinderte die durch ischämische Hirnschädigung ausgelöste Herabregulation der Bcl-2-Expression in zerebralen Kortex von ovariektomierten weiblichen Ratten (Dubal et al., 1999). Außerdem führte 17 β-Estradiol zu einer signifikanten Steigerung der Bcl-xL-Spiegel in hippokampalen Neuronenkulturen (Pike, 1999). In der vorliegenden Studie fanden wir einen Anstieg der Bcl-2- und Bcl-xL-Spiegel in kultivierten hippokampalen und septalen Neuronen bis zu 68 h nach17 β-Estradiol-Behandlung (30 – 100 nM), wohingegen die gleiche Behandlung in kortikalen Kulturen keine Veränderung der Bcl-2- und Bcl-xL-Spiegel brachte. 17 β-[Seite 84↓]Estradiol intensivierte auch den nach der Gabe von AF64A beobachteten Anstieg der Bcl-2-Expression in hippokampalen Kulturen.

Obwohl der Dosisbereich von 17 β-Estradiol in den vorliegenden Experimenten vergleichbar mit den meisten anderen Studien in vitro (Lee & McEwen, 2001) über dem physiologischen Bereich (Konzentration um 10-9) liegt, könnten diese Daten in gewissem Maße hilfreich sein, klinische Befunde zu erklären. Die erste, kontrollierte, prospektive klinische Studie mit adäquater Dauer, die die Wirksamkeit von Estrogenen in der Behandlung der Alzheimerschen Erkrankung untersuchte, ergab keine Hinweise auf eine therapeutische Bedeutung der Estrogene für die Behandlung dieser Erkrankung (Mulnard et al., 2000). Bei der Alzheimer’schen Erkrankung ist zu berücksichtigen, dass auch der zerebrale Kortex betroffen ist. Das Fehlen eines Effektes von 17 β-Estradiol in kortikalen Neuronen zum einen auf die Bcl-2- und Bcl-xL-Expression und zum anderen der fehlende Schutz gegen die AF64A-induzierte Apoptose in kortikalen Neuronen könnten eine experimentelle Basis für das Verständnis bieten, warum die kürzlich veröffentlichte Studie keinen Einfluss der Estrogenbehandlung (0,625 – 1,25 mg / d) auf die Progression der Erkrankung bei Frauen mit milder bis moderater Alzheimer’scher Erkrankung zeigen konnte.


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18.04.2005