Methodik

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Primäre neuronale Zellkultur:Die Kulturen wurden aus dem zerebralen Kortex, Hippokampus und Septum von Wistarratten-Embryonen und kortikale Kulturen von gsn+ / +-und gsn / - Mausembryonen 129/SVxBALB/C 13 (Embryonaltag E17) nach der Methode von Brewer (1995) modifiziert nach Harms et al. (2000) präpariert 14,15. Die Zellen wurden in beschichtete Zellkulturplatten in serumfreies Medium ausgesät.

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in vitro- Schadensmodelle: Die Behandlung der primären neuronalen Kulturen erfolgte zwischen dem 10. und 15. Tag in vitro (DIV). Das Apoptose-induzierende cholinerge Toxin AF64A (End-konzentration 40 µM) oder die entsprechende Kontrollsubstanz (Vehikel) wurde den Zellkulturen zugegeben. Das Ischämiemodell basiert auf dem Sauerstoff-Glukose-Entzug (OGD). Die Kulturen wurden in einer deoxygenierten Phosphat-gepufferten Salzlösung (PBS) ohne Glukose in der Hypoxiekammer bei 36,5°C für 120 min belassen. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Behandlung wurde der Zellrasen vom Boden der Vertiefungen gelöst, nach sofortiger Zentrifugation das Sediment in Flüssigstickstoff überführt und bei –80°C aufbewahrt. Die auf Glasplättchen ausgesäten Zellen wurden für immunhistochemische Untersuchungen mit Paraformaldehyd behandelt.

Pharmakologische Substanzen: Zur Inhibition der NQO1-Enzymaktivität wurden die Kulturen mit niedrigen Dosen (1-100 nM) von Dicumarol, Cibacron-Blau oder Chrysin oder dem entsprechenden Vehikel 1h vor AF64A oder der OGD (120 min) vorbehandelt. Die Induktion der NQO1 in kortikalen Kulturen erzeugten wir durch Gabe von TBHQ (5 µM), nach Murphy et al., (1991) 16 für 24 h vor Behandlung der Kulturen mit AF64A bzw. Durchführung einer OGD.

Cycloheximid, welches die Proteinbiosynthese auf Ebene der Ribosomen hemmt, wurde den Zellen 1h vor der AF64A-Gabe verabreicht. Desweiteren erfolgte eine Vorbehandlung der Zellkulturen mit dem Aktin-depolymerisierenden Pilztoxin Cytochalasin D (Cyto D) 17, also in seiner Wirkung dem Gelsolin ähnlich oder dem aktinstabilisierenden Jasplakinolide (Jaspla) 18. Das 17 β-Estradiol (30 nM-10 µM) wurde den Zellen 20 h vor Schadenssetzung zugegeben.

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Quantitative Messung des Zelltodes:Der neuronale Zelltod wurde mittels Lichtabsorbtionsmessung der zytosolischen Laktatdehydrogenase (LDH) aus Mediumproben zu verschiedenen Zeitpunkten nach Gabe von AF64A und OGD quantitativ bestimmt 19. Morphologisch wurde der Zustand der Zellen unter dem Phasenkontrastmikroskop beurteilt und fotographisch dokumentiert.

Enzymaktivitätsmessung:Die Enzymaktivität der NQO1 wurde zu verschiedenen Zeitpunkten nach Ende der OGD oder Gabe von AF64A ermittelt. Nach Lysieren des tiefgefrorenen Zellsediments und Proteinmengenbestimmung erfolgte die Enzymaktivitätsbestimmung nach Prochaska und Santamaria (1988) 20.

Enzym- und Immunhistochemie:Die histochemische Darstellung der Enzymaktivität erfolgte nach Murphy et al. (1998) 21. Durch astroglial (GFAP)- bzw. neuronal (MAP-2)-spezifische Marker wurde die Aktivität der NQO1 fluoreszenzmikroskopisch lokalisiert. Die Estrogenrezeptoren wurden mittels monoklonaler bzw. polyklonalen Antikörper gegen Estrogenrezeptoren und einem Zweit-Antikörper (gekoppelt mit Texas-Rot) mit dem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht.

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Bestimmung der Caspase-3-Aktivität: Die Zellen wurden mit einem spezifischen fluoreszierenden Caspase-3-Substrat inkubiert. Die Fluoreszenz repräsentierte die Caspase-3-Aktivität, welche mit einem Fluoreszenz-Multiplatten-Reader gemessen wurde.

In vivo Modell der fokalen cerebralen Ischämie und Verabreichen der Substanz:Unter Narkose wurde den Mäusen intrazerebroventrikulär 2 µl einer Dicumarollösung (30 nM) verabreicht. Nach 10 min wurde mittels eines silikonummantelten Filaments, welches in die Arteria carotis interna vorgeschoben wurde, eine passagere Unterbrechung der Blutzufuhr für 1 h im Bereich der Arteria cerebri media erzeugt. Die Bestimmung der Infarktgröße erfolgtean, mit dem Kryostaten gefertigten, Hirnschnitten. Sie wurden mittels SigmaScan Pro image analysis Software an Hämatoxylin gefärbten 20µm dicken Schnitten quantifiziert. Das indirekte Infarktvolumen wurde nach der Methode von Swanson et al. (1990) bestimmt 22.

Statistik:Die statistischen Analysen der erhobenen Daten in vitro erfolgten mit one-way ANOVA und Tukey’s post-hoc Test. Die Daten wurden aus zwei oder drei repräsentativen Experimenten zusammengefasst. Das Infarktvolumen der verschiedenen Behandlungsgruppen wurde unter Verwendung des unpaired Student’s t-Test verglichen.


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27.03.2006