Diskussion

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Bisher war die Rolle der NQO1 im Prozess des neuronalen Zelltodes ungeklärt. Ein Anstieg der glialen Expression des Enzyms wurde in primären embryonalen zerebellären und kortikalen Kulturen als Reaktion auf Alterung und Behandlung mit Glutamat beschrieben. Dies lässt vermuten, dass die NQO1 das Überleben der Zellen in Kultur beeinflusst. Eine Heraufregulation der NQO1 im Hirn zeigte sich in senilen Plaques, neurofibrillären Tangles und in hippokampalen Kulturen bei Patienten mit der Alzheimer´schen Erkrankung 26,27 sowie in der Penumbra nach fokaler zerebraler Ischämie bei Ratten 28. Dieser Anstieg der Enzymaktivität der NQO1 wurde als ein Teil des neuroprotektiven Systems nach Auftreten neuronaler Degeneration, wie bei der Alzheimer’schen Erkrankung und als ein limitierender Faktor des ischämischen Schadens angesehen.

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Überraschenderweise liefern unsere Daten deutliche Hinweise darauf, dass eine gesteigerte Aktivität der NQO1 eher schädigend als schützend in den verschiedenen Modellen der Neurodegeneration sowohl in vitro als auch in vivo wirkt. Bisher wurde die NQO1 als ein antioxidatives Enzym beurteilt, das in Modellen, die oxidativen Stress induzieren, wie die Behandlung mit Glutamat, H2O2 oder Dopamin, neuroprotektive Eigenschaften besitzt. Bei den von uns verwendeten Modellen steht jedoch der oxidative Stress nicht im Vordergrund. Eine signifikante Rolle von freien Radikalen im AF64A-Modell wurde in früheren Arbeiten ausgeschlossen 29. Auch bei der OGD ist neben dem exzitotoxischen (nekrotischen) Zelltod ein apoptotischer Typ des Zelltodes, bei dem oxidativer Stress eine untergeordnete Rolle spielt, beteiligt 23,30. In unseren Untersuchungen kam es sowohl unter der OGD als auch unter AF64A zu einer Heraufregulierung der Enzymaktivität der NQO1. Eine spezifische Hemmung dieser Enzymaktivität durch niedrige Dosen drei verschiedener Hemmstoffen der NQO1 hatte eine Abschwächung des neuronalen Zelltodes in vitro und in vivo zur Folge, während die chemische Induktion der NQO1 mit TBHQ eine Exazerbation des Schadens in vitro verursachte. Daher sprechen unsere Daten für eine Assoziation von neuronalem Schaden mit einem Anstieg der Enzymaktivität.

In Vehikel-behandelten Kulturen war die NQO1-Aktivität vor allem in Astrozyten, jedoch nicht in neuronalen Zellen nachweisbar. Diese Befunde stimmen mit früheren Ergebnissen überein 21,28. Im Kontrast dazu steht, dass sich die Enzymaktivität nach Exposition mit AF64A nicht nur in Astrozyten sondern auch in Neuronen detektieren ließ. Ähnliches ist im Zusammenhang mit einer krankheitsassoziierten Expression des Proteins und der Enzymaktivität von NQO1 bei hippokampalen pyramidalen Zellen in Hirnen von Alzheimer-Patienten beobachtet worden 27. Der Anstieg der Enzymaktivität trat 24 h nach Applikation des Toxins auf, zu einem Zeitpunkt, bei dem typische Marker der Apoptose und morphologische Zeichen des Zelltodes noch nicht in Erscheinung treten 23.

Da der Anstieg der Aktivität durch Proteinsynthesehemmung aufgehoben werden konnte, ist davon auszugehen, dass es sich um eine de novo Synthese handelt, zumindest im AF64A-Modell. Die Ursache der vermehrten Enzymexpression ist unklar und könnte mit der Genexpression des sogenannten antioxidativen/elektrophilen Elementes (ARE/EpRE) in Zusammenhang stehen. ARE/EpRE ist auch in Astrozyten beschrieben worden 30. Eine AP-1-artige Struktur enthaltendes ARE/EpRE wurde im NQO1 Gen entdeckt und ist verantwortlich für die basale Aktivität und die Induzierbarkeit 31-33. Eine große Zahl verschiedener chemischer Verbindungen, von denen mehrere elektrophil sind, können in vielen peripheren Geweben durch die Aktivierung von ARE die Transkription des NQO1-Gens induzieren. ARE wird als elektrophile Gegenwehr zum Schutz vor Neoplasien und Toxizität angesehen 34-36. Eine Rolle anderer von ARE/EpRE regulierter Gene, wie Glutathion-S-Transferase, γ-Glutamylcysteinsynthetase, Thioredoxinreduktase oder Metallothionein-1 und -2 37-40, kann in unseren Modellen jedoch nicht ausgeschlossen werden.

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Aus der Beobachtung der NQO1-Aktivitätsveränderungen in vivo und in vitro kann noch nicht abgeleitet werden, ob die Induktion als ein Teil des antioxidativen Abwehrsystems in Antwort auf eine neuronale Schädigung zu sehen ist oder zum neuronalen Schaden führt. Viele Befunde werden dahingehend interpretiert, dass NQO1 durch die Katalysierung der Zwei-Elektronen-Reduktion verschiedener Quinone zum Hydroquinon Zellen gegen zerstörerisches Redoxrecycling der Quinone schützt und der Erschöpfung von Glutathion und der Entwicklung von Neoplasien entgegenwirkt 33. Im Gegensatz dazu sprechen unsere Befunde für eine Exazerbation der neuronalen Apoptose durch die Aktivierung der NQO1 in den Modellen der Ischämie und Neurodegeneration in vitro und in vivo. Erstens wurde durch spezifische Hemmung der NQO1 mittels Dicumarol, Cibacron-Blau oder Chrysin eine Protektion erreicht. Zweitens wurde in vitro durch eine chemische Induktion der NQO1 eine durch Dicumarol antagonisierbare Exazerbation des Schadens nach OGD und AF64A hervorgerufen. Ein direkter antioxidativer Prozess von Dicumarol konnte ausgeschlossen werden 41. Verschiedene Mechanismen, über welche die Aktivierung der NQO1 zur Verstärkung der Apoptose führt, werden diskutiert. Erstens reduziert die NQO1 in Karzinom-Zelllinien nicht-toxische Quinone wie zum Beispiel ε-Lapachone zu zelltoxischen Verbindungen 42. Zweitens kann die NQO1 auf dem Weg der Apoptose, welcher über den Tumornekrosefaktor vermittelt wird, einwirken. Dies wurde an humanen Brustadenokarzinom-Zelllinien (MCF-7), die NQO1 überexprimieren, demonstriert 43. Drittens könnte in unserem AF64A-Modell der neuronalen Apoptose die Aktivierung des Aziridiniumrings der Verbindung durch die NQO1 eine Verstärkung der AF64A-Toxizität erklären. Die NQO1 kann die Alkylierungsfähigkeit von Aziridiniumverbindungen durch Öffnung des Aziridiniumrings regenerieren 5. Viertens, spielt die NQO1 in Kolonkarzinomzellen bei der Regulation des p53 durch dessen Abbauhemmung eine bedeutende Rolle und unterstützt somit die p53-abhängige Apoptose. Im Gegensatz dazu führte der verstärkte Abbau von p53 unter Dicumarol durch Inhibition der NQO1 in γ-bestrahlten Thymozyten zur Suppression der p53-abhängigen Apoptose 7. Der gleiche Mechanismus könnte bei neuronalen Zellen eine Rolle spielen. Obgleich beim AF64A-induzierten Zelltod eine Abhängigkeit von p53 noch nicht bewiesen ist, so ist die Beteiligung von p53 bei der OGD und zerebralen Ischämie bereits gut belegt 44-46. Ob die Neuroprotektion, die durch Hemmung der NQO1 erzielt werden kann, mit einem beschleunigtem Abbau von p53, einem Absinken der toxischen Quinonderivate in der Zelle oder einer Herabsetzung der Wirkung des Tumornekrosefaktors in Zusammenhang steht, muss in zukünftigen Studien abgeklärt werden.

Als weitere neuroprotektive Mechanismen, die bereits endogen verfügbar sind, spielen 17 ß-Estradiol und Gelsolin eine wichtige Rolle. Der in vitro beobachtete, rezeptorabhängige, neuroprotektive Effekt von 17 β-Estradiol im apoptotischen Schadensmodell differierte in den unterschiedlichen Hirnregionen. Eine Protektion konnte nur in Regionen mit ausgeprägter Expression des Estrogenrezeptor-α, wie im Septum und Hippokampus jedoch nicht in dem vorwiegend Estrogenrezeptor-β exprimierenden Kortex erzielt werden. Diese Befunde sprechen für eine Involvierung des Estrogenrezeptor-α in die Vermittlung der Neuroprotektion. Auch in anderen Arbeiten finden sich Hinweise auf eine dominante Rolle des Estrogenrezeptors-α. In α-Estrogenrezeptor-Knockout-Mäusen schütze Estradiol nicht gegen ischämischen Schaden. Die neuroprotektive Wirkung blieb hingegen in β- Estrogenrezeptor-Knockout-Mäusen erhalten 47. Kahlert et al. (2000) konnte zeigen, dass die Aktivierung des IGF-1-Rezeptorwegs, der im Verlauf die Blockade von proapoptotischen Faktoren wie BAD und Caspase 9 bedingt, über den Estrogenrezeptors-α nicht aber über Estrogenrezeptor-β erfolgt 48. Die Bedeutung der PI-3-Kinase als wichtiger Schritt in der IGF-1-Kaskade und möglicher Mechanismus der schützenden Wirkung von Estradiol konnte auch in unserer Studie bestätigt werden. Die Mechanismen der Neuroprotektion durch Estrogene sind aber nicht nur auf Rezeptorebene zu sehen. Estrogene schützen kortikale Strukturen im exzitotoxischen Schadensmodell (Behandlung mit Glutamat). Diese Wirkung konnte jedoch durch Rezeptorblockade nicht aufgehoben werden 23.

In den Untersuchungen zu Gelsolin demonstrierten wir, dass das Aktinfilament-depolymerisierende Protein Gelsolin Neuronen vor Apoptose schützen kann. Die Befunde der Verstärkung der Caspase-3-Aktivierung in gsn / Neuronen bei gleichzeitiger Exazerbation der Schädigung im Vergleich zu gsn+/+ legen die Vermutung nahe, dass der protektive Effekt von Gelsolin über eine Hemmung der Caspase-3-Aktivierung erfolgt. Diese Vermutung wird durch Befunde unserer Untersuchung bestätigt, die zeigen, dass die Behandlung der Kulturen mit dem depolymerisierenden Cytochalasin D zur Verminderung der Caspase-3-Aktivierung und gleichzeitig der Schädigung nach AF64A in gsn / und gsn+/+ führt. Gegenteiliges fand sich bei Gabe des zytoskelettstabilisierenden Jasplakinolide in gsn / Neuronen. Obgleich gsn ein Substrat von Caspase-3 ist und so ein Glied in der apoptotischen Kaskade darstellen könnte 49, ist in anderen Gruppen gezeigt worden, dass gsn Apoptosewege blockieren kann, in die Caspase-3 und Mitochondrien involviert sind 50,51. Der im AF64A-Modell auftretende Verlust des mitochondriellen Membranpotential war in gsn / Neuronen stärker ausgeprägt. Die pharmakologische Stabilisierung des Membranpotential der Mitochondrien durch Permeabilitätsminderung der Membranporen führte zu einer geringeren Caspase-3-Aktivierung und Verminderung der Schädigung nach AF64A in gsn / und gsn+/+. Daraus kann geschlossen werden, dass gsn seinen neuroprotektiven Effekt in der Apoptose-Kaskade durch die Reduzierung der Permeabilität von Membranporen der Mitochondrien vor dem Schritt der Caspase-3-Aktivierung entfaltet. Mit diesen Daten konnten wir zum ersten Mal zeigen, dass endogenes Gelsolin antiapoptotische Effekte in kortikalen Neuronen zeigt [Referenz # 25].

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In den vorliegenden Studien haben wir die Bedeutung von drei sehr unterschiedlichen Schutzmechanismen für neuronale Zellen oder für neuronales Gewebe in verschiedenen Schadensmodellen in vitro und in vivo detaillierter definiert. Die Ergebnisse dienen möglicherweise als Basis für das bessere Verständnis bei der Entwicklung therapeutischer Ansatzpunkte zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen. Die Behandlung der Alzheimer’schen Erkrankung mit Estrogenen erscheint nach unserer Datenlage nicht sinnvoll, da ein protektiver Effekt auf kortikale Strukturen wegen der geringen Expression des α- Estrogenrezeptors nicht zu erwarten ist.

Die Neuroprotektion durch Hemmstoffe der NQO1 sowohl in vitro als auch in einem ischämischen Schlaganfallmodell in vivo ist von klinischer Relevanz. Ungefähr 80% der klinisch diagnostizierten Schlaganfälle sind ischämischer Art. Die Prävention von Patienten mit prädisponierenden Faktoren schließt normalerweise die pharmakologische Beeinflussung von Gerinnungsparametern ein. Cumarin-Derivate, welche die Viatmin-K abhängige γ-Carboxylierung verschiedener Gerinnungsfaktoren hemmen, finden weitverbreitete Anwendung bezüglich dieser Indikation. Auf der Basis unserer Ergebnisse könnte die Applikation von Cumarin-Derivaten durch die neuroprotektive Wirkung der Enzymhemmung der NQO1 einen zusätzlichen Nutzen sowohl bei der Prävention als auch bei der akuten Therapie des ischämischen Schlaganfalls bringen.


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27.03.2006