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1  Einleitung

Kardiomyopathien sind primäre Myokarderkrankungen, die sich nicht als Folge koronarer Herzerkrankungen, Herzklappenvitien, pulmonaler bzw. systemischer Hypertonie oder Perikarderkrankungen entwickeln. Mit einer Mortalität von 5-15 % pro Jahr gehören Kardiomyopathien zu den prognostisch ungünstigen Herzerkrankungen. Dabei stellen die schwere Herzinsuffizienz und der plötzliche Herztod die Haupttodesursachen dar. Therapeutisch stehen nur die Mittel zur Behandlung von Herzinsuffizienz und Herzrhythmusstörungen und als ultima ratio die Herztransplantation zur Verfügung. Trotz einer relativ niedrigen Prävalenz von bis zu 36 Fällen pro 100.000 Einwohner zählt die Dilatative Kardiomyopathien zu den häufigsten Indikationen für eine Herztransplantation.

Für die beiden häufigsten Formen, die Dilatative (DCM) und die Hypertrophe (HCM) Kardiomyopathie wird eine genetische Beteiligung in ca. 20-30 % bzw. circa 100 % angenommen. Bisher konnte nur ein Teil der genetischen Ursachen aufgeklärt werden.

Dem Nachweis krankheitsverursachender Gene stehen die Kopplungs- und Kandidatengenuntersuchungen zur Verfügung. Mit Hilfe der Kopplungsanalyse wird in geeigneten Stammbäumen nach einer gemeinsamen Vererbung eines genetischen Markers und eines Krankheitsphänotyps gesucht. Als Marker dient ein genetischer Polymorphismus, dessen chromosomale Lokalisation bekannt ist. Ein positiver Kopplungsbefund gibt Aufschluß über die chromosomale Lage eines Krankheitsgens. Dieser Bereich muß anschließend durch Feinkartierung weiter eingegrenzt werden. Für diese Methode sind allerdings genügend große Familien mit mehreren betroffenen Patienten zur genetischen und klinischen Analyse erforderlich. Dies ist aufgrund früher Todesfälle, sporadischer Fälle und kleiner Familien häufig nicht möglich. Alternativ steht die Methode des Kandidatengenansatzes zur Verfügung. Für diese Untersuchungen wählt man Gene, die anhand bestehender Hypothesen an der Krankheitsentwicklung beteiligt sein könnten. Diese werden mit verschiedenen Methoden auf Sequenzvarianten hin untersucht, die aufgrund ihrer Häufigkeit, Veränderungen in der Proteinsequenz und funktioneller Domänen sowie der Kosegregation innerhalb betroffener Familien an der Verursachung der Erkrankung beteiligt sein könnten. Mutationsanalysen in Kandidatengenen haben die Klonierung und Sequenzierung dieser Gene und die Identifizierung der genetischen Variabilität zur Voraussetzung. Für Ersteres leistete das "Humane-Genom-Projekt" einen wesentlichen Beitrag. Letzteres läßt sich für große Patientenkollektive mittels effizienter Methoden wie der SSCP-Analyse durchführen.


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Für die Kardiomyopathien wären geeignete Kandidatengene solche, die einerseits für Proteine des Sarkomers und des Cytoskeletts, wie z.B Dystrophin, β-Myosin, Troponin T und weitere kodieren. Andererseits wird eine Beteiligung von autokrinen und parakrinen Faktoren, wie z.B. das Renin-Angiotensin-System, Endothelin und Zytokinkaskaden (TNF-α, Interleukine, NO), an der Ätiologie und Pathogenese angenommen. Somit sind auch Gene, die für diese Faktoren sowie deren Rezeptoren kodieren, geeignete Kandidatengene. Zusätzlich sind auch die dazugehörigen Promotor- und Enhancer-Sequenzen von Interesse, da Sequenzänderungen in diesen Bereichen zu einer geänderten Expression führen können.

Unabhängig von möglichen genetisch determinierten Expressionsunterschieden sind Hormone und proinflammatorische Zytokine an der Entwicklung der Herzinsuffizienz beteiligt [Levine, 1990 Matsumori, 1994]. In diesem Zusammenhang erscheinen die Mitglieder der Interleukin-6-Familie, speziell das kürzlich entdeckte Cardiotrophin-1 [Pennica, 1995a] als besonders interessant, da es sowohl eine hypertrophe als auch eine antiapoptotische Wirkung auf Kardiomyozyten aufweist.

1.1 Kardiomyopathien

1.1.1 WHO/ISFC-Klassifikation

Nach der 1995 aktualisierten und 1996 veröffentlichten WHO/ISFC-Klassifikation [Richardson, 1996] werden als Kardiomyopathien alle Erkrankungen des Herzmuskels bezeichnet, die mit einer objektivierbaren kardialen Funktionsstörung einhergehen.

Danach unterscheidet man die folgenden fünf Formen:

1.) Dilatative Kardiomyopathie (DCM)

2.) Hypertrophe Kardiomyopathie (HCM)

3.) Restriktive Kardiomyopathie (RCM)

4.) Arrhythmogene Rechtsventrikuläre Kardiomyopathie (ARVC)

5.) Nichtklassifizierbare Kardiomyopathien (NKCM)

Für die Zuordnung zu den Formen 1.-4. gelten primär hämodynamische Kriterien. Die überwiegende Beteiligung des linken Ventrikels bei der dilatativen, hypertrophen und restriktiven Kardiomyopathie und der eher rechtsventrikuläre Befall bei der ARVC werden ebenfalls berücksichtigt.


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Eine der wesentlichen Erneuerungen dieser Klassifikation ist, daß der Begriff der Kardiomyopathien nicht mehr nur auf die ätiologisch nicht erklärbaren (=idiopathischen) Myokarderkrankungen beschränkt wird. Vielmehr werden jetzt auch sekundäre Formen einbezogen.

Die beiden häufigsten Formen sind die Dilatative und die Hypertrophe Kardiomyopathie. Da nur aus diesen beiden Gruppen die Patienten für die vorliegende Arbeit rekrutiert wurden, werden nachfolgend nur diese beiden Formen vorgestellt.

1.1.2 Dilatative Kardiomyopathie

Die Dilatative Kardiomyopathie ist durch eine biventrikuläre Dilatation mit einer Verminderung der linksventrikulären Funktion sowie einer Erhöhung des enddiastolischen Volumens gekennzeichnet. Männer sind bevorzugt betroffen (ca 2:1). Die Prävalenz liegt bei circa 36 pro 100.000 Einwohnern [Codd, 1989]. Die DCM gehört neben der Ischämischen Herzerkrankung zu den wichtigsten Ursachen einer Herzinsuffizienz [Kaye, 1992].

Klinisch ist die Erkrankung im Wesentlichen durch eine fortschreitende Linksherzinsuffizienz, Herzrhythmusstörungen sowie thromboembolische Komplikationen gekennzeichnet.

Die Diagnose ist häufig eine Ausschlußdiagnose und beinhaltet auch invasive Methoden zur Abgrenzung gegenüber der Koronaren Herzerkrankung (KHK). Da die diagnostische Aussagekraft einer Myokardbiopsie unterschiedlich bewertet wird, gehört diese nicht zum Standard. Die Histologie ist unspezifisch und umfaßt Hypertrophie, interstitielle Fibrose sowie Endokardverdickungen. Hilfreich ist eine Biopsie bei Verdacht auf postmyokarditische Prozesse sowie zur Abklärung einer Amyloidose und anderer Speicherkrankheiten [Braunwald, 1997]. Patienten mit DCM haben eine schlechte Prognose, die umso ungünstiger wird, je beeinträchtigter die linksventrikuläre Ejektionsfraktion zum Zeitpunkt der Diagnose ist. Neuere Studien [Sugrue, 1992] berichten über eine Mortalität von etwa 20% innerhalb von 5 Jahren.

Die Ätiologie ist in etwa der Hälfte der Fälle unbekannt. Man geht bei ca. 20-30 % von einer familiären Genese und bei circa einem Drittel der Fälle von einer Myokarditis durch Enteroviren aus. Weitere, seltenere Formen entwickeln sich im Rahmen von alkohol- und medikamententoxischen Schäden, Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises, Stoffwechsel- und endokrinen Erkrankungen, hyperergen Störungen, neuromuskulären Erkrankungen sowie Neoplasien.


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Der Einfluß genetischer Faktoren auf die Ätiologie der DCM wird je nach Wahl des Patientenkollektivs unterschiedlich bewertet. Bei alleiniger systematischer Familienanamnese ergeben sich in 5-10 % der Fälle Hinweise auf einen genetischen Einfluß [Mestroni, 1990]. Studien, die alle verfügbaren Familienmitglieder eines Indexpatienten systematisch klinisch, elektro- und echokardiographisch untersuchten, konnten einen Anteil von 20-35 % an familiären Formen nachweisen [Grunig, 1998; Michels, 1992]. Baig et al [Baig, 1998] gingen sogar von bis zu 48 % aus, wenn auch Familienmitglieder mit vergrößertem linken Ventrikel aber ohne eingeschränkte Ejektionsfraktion eingeschlossen werden.

In der Mehrzahl der Fälle liegt ein autosomal-dominanter Erbgang vor [Michels, 1992]. Hierfür wurden bisher insgesamt sechszehn Genloci identifiziert. Diese, sowie die bisher identifizierten dazugehörigen Gene, sind in der Tabelle 1 dargestellt. Neben autosomal-dominanten sind auch X-chromosomal dominante Erbgänge sowie seltenere X-chromosomal-rezessive Fälle beschrieben. Sehr viel seltener lassen sich autosomal-rezessive Formen [Kelly, 1994] oder ein Zusammenhang mit Mutationen im mitochondrialen Genom [Suomalainen, 1992] finden. Erstere können durch Mutationen in verschiedenen Genen der Fettsäureoxidation verursacht werden. Am bekanntesten sind hierbei Carnitinstoffwechselstörungen. Autosomal-rezessive und mitochondrial bedingte Kardiomyopathien manifestieren sich bevorzugt schon im Kindesalter.

Tab. 1: Bekannte genetische Ursachen der Dilatativen Kardiomyopathie

Genlocus

Zusätzlicher Phänotyp

Krankheitsgen

Erstbeschreibungen

    

1q32

keiner

Kardiales Troponin T

[Durand, 1995]

2q11-q22

keiner

unbekannt

[Jung, 1999]

2q31

keiner

Titin

[Siu, 1999]; [Gerull, 2002]

5q33-q34

keiner

δ-Sarcoglycan

[Tsubata, 2000]

6q12-q15

keiner

unbekannt

[Sylvius, 2001]

9q13-q22

keiner

unbekannt

[Krajinovic, 1995]

14q11

keiner

Kardiales β-MHC

[Kamisago, 2000]

15q14

keiner

Kardiales Aktin

[Olson, 1998]

15q2

keiner

α-Tropomyosin

[Olson, 2001]

10q21-q23

Mitralklappenprolaps

unbekannt

[Bowles, 1996]

1q1-q21

Leitungsstörungen

Lamin A/C

[Kass, 1994]; [Fatkin, 1999]

3q22-p25

Leitungsstörungen

unbekannt

[Olson, 1996]

19q13.2

Leitungsstörungen

unbekannt

[de Meeus, 1995]

2q35

Skelettmyopathie

Desmin

[Li, 1999]

6q23

Skelettmyopathie

unbekannt

[Messina, 1997]

6q23-24

Sensorineuraler Hörverlust

EYA4 (Transkriptionsfaktor)

[Schonberger, 2000]

Xp21

Skelettmuskelmyopathie

Dystrophin

[Franz, 1995]

Xq28

Minderwuchs, Neutropenie

Tafazzin

[D´Adamo, 1997]

    


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1.1.3  Hypertrophe Kardiomyopathie

Bei der Hypertrophen Kardiomyopathie handelt es sich hämodynamisch überwiegend um eine gestörte Compliance der stark hypertrophierten Kammerwände, einhergehend mit erhöhten linksventrikulären Füllungsdrücken. Die WHO-Klassifikation unterscheidet eine nichtobstruktive (HNCM) und eine obstruktive (HOCM) Form. Letztere ist durch eine asymmetrische Septumhypertrophie mit einer Obstruktion des linksventrikulären Ausflusstraktes gekennzeichnet. Ungefähr dreiviertel der Fälle weisen die nichtobstruktive Form auf. Mit einer Prävalenz von 19,7 je 100.000 Einwohnern ist die HCM insgesamt seltener als die DCM. Auch diese Form der Kardiomyopathie betrifft bevorzugt Männer (ca. 2:1) [Maron, 1995].

Die Patienten sind häufig beschwerdefrei oder klagen über Dyspnoe, Angina pectoris-Anfälle, Synkopen und Herzrhythmusstörungen. Letztere stellen eine besondere Gefahr dar, da sie zum plötzlichen Herztod führen können. Bei einer frühzeitigen Diagnosestellung und Risikoevaluierung kann ein Implantierbarer Cardioverter Defibrillator (ICD) diese Komplikation verhindern. Die Diagnose läßt sich überwiegend echokardiographisch stellen.

Histologisch zeigen sich eine Hypertrophie mit einem Strukturverlust von Myozyten und Myofibrillen mit Vermehrung der Mitochondrien, eine interstitielle Fibrose, ein Verlust der Zytoplasmabrücken zwischen den Zellen sowie Intimaverdickungen intramuraler Koronararterien. [Braunwald, 1997].

Da sich in der Familienanamnese häufig Hinweise auf ähnliche Herzerkrankungen oder Symptome finden lassen, geht man davon aus, daß fast 100% der Erkrankungen genetisch bedingt sind. Bisher ließen sich Mutationen in 11 Genen nachweisen, die vermutlich für circa 50% der Fälle verantwortlich sind (siehe Tab 2.). Die Vererbung erfolgt autosomal-dominant. Allerdings ist die Penetranz, das heißt die Tendenz zur Ausprägung der Erkrankung, insbesondere bei Kindern unvollständig. Bei Erwachsenen ist sie deutlich höher und kann in einigen Familien 100 % betragen. Daneben wurden aber auch asymptomatische Patienten mit sicherem Überträgerstatus identifiziert. Die Ursachen dafür könnten in Umweltfaktoren aber auch in modifizierenden genetischen Komponenten, wie z.B. Polymorphismen in weiteren Genen, zu finden sein [Vosberg, 1998].Nach dem heutigen Kenntnisstand geht man am ehesten von einer dominant negativen Wirkung der veränderten Proteine aus. Hierbei besteht der Kontraktionsapparat aus normalen sowie dysfunktionalen Proteinen. Die mutierten Proteine verursachen in diesem Fall eine Fehlfunktion des gesamten Proteinkomplexes. Bei Verwendung rekombinanter mutierter und normaler Myosinfragmente wurden in Motilitätsversuchen zum Beispiel veränderte Kontraktions- und Motilitätseigenschaften beobachtet [Lankford, 1995].

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Tab. 2: Bekannte Gene und Genorte der Hypertrophen Kardiomypathie

Chromosomale Lokalisation

Gen

Anteil an bekannten Loci

Identifizierte Mutationen

    

1q3

Troponin T

15-20 %

> 20

2q31

Titin

?

?

3p21.2-3p21.3

Essentielle Myosin-Leichtkette (ELC)

< 1 %

2

7q3

Gamma(2)-Untereinheit der AMP-aktivierten Protein-Kinase

?

1

11p11

Myosin-Bindungsprotein C

15-20 %

> 15

12q23-q24.3

Regulatorische Myosin-Leichtkette (RLC)

< 1 %

2

14q1

β-Myosin-Schwerkette (MHC)

35-50 %

> 50

15q11

kardiales Aktin

?

?

15q2

Tropomyosin

< 5 %

3

19q13

Troponin I

< 1 %

3

    

Bisher konnten zwar einige Ursachen der HCM sowie der DCM aber nicht die weitergehenden pathogenetischen Mechanismen, die die Ausbildung des Phänotyps steuern, identifiziert werden. Schwere Beeinträchtigungen des Kontraktionsapparates würden eine frühere Krankheitsmanifestation erwarten lassen. Deshalb ist es wahrscheinlicher, daß leichtere Störungen des Kontraktionsablaufes nach einem längeren Zeitraum zu sekundären Veränderungen führen, durch die die symptomatischen Funktionseinschränkungen bedingt werden. Hierbei sind vermutlich die gestörte Anordnung der kontraktilen Filamente und der Zellen selbst primär pathogenetisch relevant, da davon die Koordination der Kontraktion und die Erregungsausbreitung betroffen sein könnten. In diesem Prozeß stellt die Hypertrophie eher einen Kompensationsmechanismus zum Ausgleich von Funktionsdefiziten dar. Hierbei ist neben den primären krankheitsverursachenden Mutationen eine Beteiligung von genetisch determinierten Varianten von Faktoren pathogenetisch relevanter Stoffwechselwege denkbar. Diese könnten die Ausprägung des Phänotyps beeinflussen beziehungsweise das Risiko der Manifestation der Erkrankung erhöhen. Kandidaten für diese modifizierenden Faktoren (sogenannte „modifier genes“) sind Gene, die für Proteine aller hypertrophie-assoziierten Stoffwechselwege kodieren. So führte z.B. die ventrikelspezifische Inaktivierung der gemeinsamen Rezeptoruntereinheit gp130 der IL-6-Zytokinfamilie zur Entwicklung einer Ventrikeldilatation bei Druckbelastung. Kontrollherzen zeigten dagegen eine kompensatorische Hypertrophie [Hirota, 1999].


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Wir stellten daher die Hypothese auf, daß Varianten im humanen Cardiotrophin-1 (CT-1) Gen, einem Zytokin der IL-6 Familie, die Manifestation von Kardiomyopathien beeinflussen, da CT-1 an der Regulation des myokardialen Wachstums beteiligt ist.

1.2 Cardiotrophin-1 und die Interleukin-6-Familie

1.2.1 Protein- und Genstruktur, Chromosomenlokalisation und Einordnung von Cardiotrophin-1

Pluripotente embryonale Stammzellen der Maus differenzieren unter bestimmten Bedingungen in mehrzellige zystische embryonale Körper, die kardiale Marker aufweisen und spontan anfangen, zu schlagen. Aus diesem Grunde wurden sie auf ihre Fähigkeit hin untersucht, als Quelle für neue hypertrophie-induzierende Faktoren zu dienen. In der Tat führt das konditionierte Medium dieses Ansatzes zur Hypertrophie neonataler Kardiomyozyten. Mit Hilfe dieses Assays isolierten Pennica et al. das Gen eines neuen Proteins, das sie Cardiotrophin-1 nannten [Pennica, 1995a].

Abb. 1: Prinzip der Expressions-Klonierung, das zur Identifizierung von Cardiotrophin-1 führte , ICM= innere Zellmasse, ES-cells= Embryonale Stammzellen, MLC-2v/a= ventrikuläre/atriale Myosin-Leichtkette-2, ANF= Atrialer natriuretischer Faktor, NRVM= neonatale Ratten Ventrikelkardiomyozyten [Wollert, 1997]


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Das menschliche Cardiotrophin-1-Gen besteht aus drei Exons, deren kodierende Sequenzen insgesamt 606 bp umfassen. Durch Fluoreszenz-in situ-Hybridisation konnte es auf dem kurzen Arm des Chromosom 16 in der Region 16p11-q13 lokalisiert werden. Das entsprechende 201 Aminosäuren (AS) lange Protein besitzt ein Molekulargewicht von ca. 21 kDa und ist zu 80% identisch zum entsprechenden Protein der Maus. Menschliches CT-1 enthält einen Zysteinrest und eine potentielle N-Glykosylierungsstelle, besitzt aber keine hydrophoben N-terminalen Sequenzen, die als Sekretionssignal dienen könnten [Pennica, 1996b]. Dieses Phänomen konnte schon bei verschiedenen sezernierten Proteinen beobachtet werden. Einige benutzen interne hydrophobe Sequenzen, bei anderen wird ein alternativer Sezernierungsweg angenommen [Muesch, 1990].

Sequenzvergleiche wiesen Homologien zu den Zytokinen der Interleukin-6-Familie auf. Zu dieser Gruppe gehören Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-11 (IL-11), Leukemie Inhibitionsfaktor (LIF), Oncostatin M (OSM) und Ciliarer Neurotropher Faktor (CNTF). CT-1 ähnelt LIF und CNTF zu circa 24% respektive 19%. Obwohl auch die anderen Mitglieder der IL-6-Familie nur 15-20%ige Sequenzhomologien aufweisen, werden sie aufgrund ihrer ähnlichen Tertiärstruktur als eine Gruppe zusammengefaßt. Dabei geht man von einer Struktur aus, die vier amphipathische Helices enthält. Diese Struktur kann auch für CT-1 vorausgesagt werden [Pεnnicα, 1995α].

Darüber hinaus binden alle IL-6-Zytokine unter anderem an die gleiche Rezeptoruntereinheit, das Glykoprotein 130 (gp130). Daraus ergeben sich überlappende Funktionen in verschiedenen Geweben.

1.2.2 Expressionsmuster von Cardiotrophin-1

CT-1 wird in zahlreichen menschlichen Geweben in unterschiedlichem Ausmaß exprimiert. Besonders hohe mRNA-Spiegel wurden in Herz, Skelettmuskulatur, Prostata und Ovarien nachgewiesen. Gewebe von Lungen, Nieren, Pankreas, Thymus, Testis und Dünndarm zeigten eine geringere CT-1-Expression. In Gehirn, Plazenta, Leber, Milz, Colon und zirkulierenden Leukozyten konnten keine oder nur geringe mRNA-Mengen detektiert worden. Fetales Lungen- und Nierengewebe wies eine starke CT-1-Expression auf ( Abb.2 ) [Pennica, 1996b].


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Abb. 2: mRNA-Expressionsmuster von CT-1 in verschiedenen humanen Geweben. A: Hybridisierung mit CT-1-Probe, B: Rehybridisierung derselben Blots mit einer Aktin-Probe (aus Pennica, 1996b)

Während der Embryogenese der Maus zeigt Cardiotrophin ein zeitlich variierendes Expressionsverhalten in Abhängigkeit vom Entwicklungsstadium wichtiger Organsysteme. Es ist zuerst hauptsächlich im sich entwickelnden Herz nachweisbar, das auch während der weiteren Embryogenese einer der wichtigsten Expressionsorte bleibt [Sheng, 1996]. Später finden sich auch hohe mRNA-Spiegel in anderen Organanlagen, wie z.B. den Extremitäten und dem Skelett [Pennica, 1996a]. Cardiotrophin scheint daher an der Entwicklung verschiedener Gewebe insbesondere des kardialen beteiligt zu sein. Da das Herz bis ins Erwachsenenstadium einer der Hauptbildungsorte für dieses Zytokin bleibt, scheint es auch postnatal für dessen Funktion von Bedeutung zu sein. Kürzlich konnten Asai et al. zeigen, daß das menschliche Herz Cardiotrophin über den Koronarsinus in die periphere Zirkulation sezerniert [Asai, 2000].

1.2.3 Rezeptorsysteme und Signaltransduktionswege der Interleukin-6-Familie

Zytokine der IL-6 Familie binden an Komplexe aus verschiedenen Rezeptoruntereinheiten. Diese gehören zu den Zytokinrezeptoren der Klasse I. Die gemeinsame Untereinheit ist das Glykoprotein 130 (gp130), das auch hauptsächlich an der Signaltransduktion beteiligt ist [Taga, 1997]. Mehrere Studien mit monoklonalen Antikörpern gegen verschiedene Epitope von gp130 zeigten das Vorhandensein spezifischer Bindungsstellen für einzelne Mitglieder der IL-6-Familie mit agonistischen und antagonistischen Eigenschaften [Wijdenes, 1995; Chevalier, 1996; Liautard, 1997; Timmermann, 2000].

Neben gp130 sind zusätzliche zytokinspezifische Untereinheiten an der Bildung des Rezeptorkomplexes beteiligt. Interleukin-6 und IL-11 binden an den IL-6- respektive IL-11-[Seite 10↓]Rezeptor (IL-6R, IL-11R) und induzieren dadurch die Homodimerisation zweier gp130-Moleküle.

Die übrigen Familienmitglieder LIF, CNTF, OSM und CT-1 verursachen die Heterodimerisation von gp130 mit dem LIF-Rezeptor. Für OSM konnte inzwischen ein zweiter Rezeptor kloniert werden [Mosley, 1996]. Je nach Gewebe bindet OSM entweder an den Rezeptor Typ I (gp130/LIF-R) oder Typ II (gp130/OSM-R). Für CT-1 wurde von Robledo et al. ebenfalls die Existenz einer zusätzlichen Rezeptoruntereinheit beschrieben, bei der es sich um ein stark glykosyliertes Protein von 80 kDa Molekulargewicht handelt (gp80). Diese Untereinheit scheint aber nicht für die Bildung des hochaffinen Rezeptors notwendig zu sein, da sie sich erst nach der Heterodimerisation von gp130 und LIF-R an den Komplex anlagert. Es wird vermutet, daß gp80 die Zellspezifität und -sensitivität für CT-1 reguliert. Die Tatsache, daß sich gp80 nicht in allen Geweben, die LIF-R exprimieren, nachweisen läßt, unterstützt diese Hypothese [Robledo, 1997]. (Abb.3)

Die Rezeptoruntereinheit gp130 besitzt keine eigenständige Tyrosinkinaseaktivät und ist daher mit cytoplasmatischen Tyrosinkinasen, hier hauptsächlich der Familie der Januskinasen (JAK), assoziiert. Die einzelnen Mitglieder JAK1, JAK2 und Tyk2 werden jeweils zell- und zytokinspezifisch aktiviert und phosphorylieren ihrerseits die sogenannten STAT-Proteine (Signal Transducers and Activators of Transcription). Bisher konnte nur die Beteiligung von STAT1 und STAT3 an der Signaltransduktion der IL-6-Familie nachgewiesen werden. Die aktivierten Proteine werden in den Zellkern transloziert und induzieren dort als Hetero- oder Homodimere die Transkription sensitiver Gene [Wollert, 1997].

Ein zweiter wichtiger Transduktionsweg involviert die Serin-/Threonin-kinasen Ras, Raf, MAPK (mitogen-activated protein kinase) sowie ERK1 und ERK2 (Extracellular Receptor activated Kinases) [Taga, 1997].

Zwischen beiden Systemen scheinen Querverbindungen zu existieren, die vermutlich von spezifischen Zytokinen und Geweben abhängig sind [Sheng, 1997].

Zusätzlich konnte die Beteiligung weiterer Signaltransduktionskaskaden, wie z.B. über die Phosphatidylinositol-3-Kinase aufgezeigt werden [Kuwahara, 2000]. (Abb. 4)


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Abb. 3: Rezeptorkomplexe der IL-6-Familie. Die gp130-Untereinheit wird von allen Familienmitgliedern benutzt. CT-1, CNTF, LIF und OSM bilden Heterodimere aus gp130 und dem LIF-Rezeptor [aus Hibi, 1996].

Abb. 4: Vereinfachtes Schema der intrazellulären Signaltransduktion nach CT-1-Stimulation. Bisherige Studien weisen auf eine Beteiligung von STAT3 bei der Hypertrophie und von STAT1 sowie dem MAPK-Signalweg bei der Apoptose hin. Darüberhinaus existieren vermutlich weitere Signalwege sowie Querverbindungen. [aus Wollert, 1997]

Die zytokinvermittelten Zellreaktionen werden ebenfalls über unterschiedliche Mechanismen, wie z.B. Dephosphorylierung und proteolytischer Abbau der STAT-Proteine, Internalisierung und endolysosomaler Abbau der Rezeptorkomplexe sowie Expression verschiedener Suppressorproteine (CIS, cytokine-induced Src homology 2 containing protein) und [Seite 12↓]Inhibitorproteine (SOCS= suppressor of cytokine signaling; JAB= JAK-binding protein; SSI= STAT-induced STAT-inhibitor) antagonisiert [Aman, 1997].

1.2.4 Kardiale Wirkungen von Cardiotrophin-1

Cardiotrophin-1 induziert die Hypertrophie kultivierter Kardiomyozyten und ist hierbei wesentlich potenter als Angiotensin, Endothelin oder die übrigen IL-6-Mitglieder [Pεnnicα, 1995α]. Hierbei kommt es durch die Anordnung neuer Sarkomeruntereinheiten in Reihe zu einer Zunahme der Zelllänge. Dies führt zu einer exzentrischen Hypertrophie und Kammerdilatation. Damit unterscheidet sich das Muster der durch CT-1 induzierten Hypertrophie von der α-adrenerg stimulierten und spiegelt die Anpassungsvorgänge bei einer chronischen Volumenbelastung wider. Zusätzlich zeigten sich Unterschiede in der Induktion fetaler Gene wie z.B. dem ANF- und dem skeletalen α-Aktin-Gen [Wollert, 1996].

Verschiedene Studien zeigten eine gegenseitige Beeinflussung von CT-1 und weiteren Hypertrophiemediatoren. Sano et al wiesen eine vermehrte Expression der mRNA von CT-1, IL-6 und LIF in kardialen Fibroblasten nach Angiotensin-II-Stimulation nach. Das konditionierte Medium dieser Fibroblastenkulturen bewirkte eine gp130/STAT-Aktivierung und die Hypertrophie von Myokardzellen [Sano, 2000]. Kardiale Fibroblasten produzieren den größten Anteil an CT-1 im Myokard [Kuwahara, 1999]. Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß ein Teil der durch Angiotensin-II induzierten Hypertrophie durch CT-1 aus kardialen Fibroblasten vermittelt wird. Im Myokardgewebe genetisch hypertensiver Ratten ist der mRNA-Spiegel für CT-1 erhöht. Dies kann schon vor dem Auftreten der konsekutiven Hypertrophie beobachtet werden [Ishikawa, 1999].

Die systemische CT-1-Administration bei Mäusen bewirkte neben einem Wachstum verschiedener Organe eine dosisabhängige Zunahme des Herzgewichts bei unbeeinflußtem Körpergewicht. Veränderungen in den Mitochondrien wiesen dabei auf eine beeinträchtigte Energiegewinnung hin [Jin, 1996]. Zusätzlich konnte eine dosisabhängige Abnahme des mittleren Arteriendrucks und des totalen peripheren Widerstandes sowie ein Anstieg der Herzfrequenz beobachtet werden. Ein Einfluß auf die Inotropie zeigte sich dagegen nicht. Aufgrund der Inhibition dieser Effekte durch einen NO-Synthase-Hemmer wurde eine Beteiligung von Stickstoffmonoxid (NO) vermutet [Jin, 1998]. Hamanaka et al wiesen tatsächlich eine vermehrte Expression der induzierbaren NO-synthetase (iNOS) im Gewebe von Lunge und Aorta aber nicht im Herz nach [Hamanaka, 2000]. Die beobachteten Wirkungen sind [Seite 13↓]damit eher direkt vaskulär statt myokardial bedingt. CT-1 könnte demzufolge bei der Senkung der Nachlast in verschiedenen pathophysiologischen Situationen eine Rolle spielen.

Mäuse ohne gp130 starben noch in utero. Besonders auffällig war hierbei ein stark hypoplastischer Ventrikel [Yoshida, 1996]. Die postnatale gp130-Inaktivierung führte ebenfalls zu einer Abnahme der links- und rechtsventrikulären Wanddicke [Betz, 1998]. Im Gegensatz dazu zeigten Tiere mit einer ventrikelspezifischen gp130-Inaktivierung eine normale Herzstruktur und –funktion aber eine gestörte Adaptation an eine akute Druckbelastung (Aortenbändelung). Die Tiere entwickelten eine schwere Dilatative Kardiomyopathie und wiesen eine gesteigerte Apoptose auf. Kontrolltiere dagegen entwickelten eine kompensatorische Hypertrophie [Hirota, 1999].

Neben der hypertrophen Wirkung von CT-1 konnte ein positiver Einfluß auf den Erhalt verschiedener Zelllinien, wie z.B. Nervenzellen nachgewiesen werden [Pennica, 1996a]. Die Zugabe von CT-1 zu serumfreien Kardiomyozytenkulturen wirkte ebenfalls protektiv. Für diesen Effekt konnte die Abhängigkeit vom MAPK-assoziierten Signalweg [Sheng, 1997] sowie von der Phosphatidylinositol-kinase (PI3K) nachgewiesen werden [Kuwahara, 2000]. Es konnte auch gezeigt werden, daß NF-κB, ein wichtiger Mediator apoptosehemmender Signalwege, für den maximalen kardioprotektiven Effekt notwendig ist [Craig, 2001].

Abb. 5: Vereinfachte Darstellung der möglichen Signaltransduktionswege über die CT-1 die Faktoren p38, Akt, ERK aktivieren könnte, und wie diese möglicherweise gemeinsam in eine NF-κB-Aktivierung münden. Verschiedene Studien weisen auf die zentrale Rolle dieses Faktors bei der Zytoprotektion hin. Nicht dargestellt sind die NF-κB-unabhängigen Wege über Akt, ERK und p38 die ebenfalls an der Antiapoptose beteiligt sind. [aus Craig, 2001]


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Cardiotrophin-1 hemmt die Produktion von Tumor-Nekrose-Faktor α (TNF) nach Injektion von Lipopolysaccharid (LPS) [Benigni, 1996]. Hishinuma et al konnten eine starke CT-1 mRNA-Expression im Herzgewebe der Maus nach LPS-Injektion beobachten [Hishinuma, 1999] . Somit scheint CT-1 beim Selbstschutz des Herzens vor schädigenden Einflüssen durch z.B. proinflammatorische Zytokine von Bedeutung zu sein. Diese Annahme wird durch die Induktion der Hitzeschockproteine Hsp70 und Hsp90 durch CT-1 in Ratten-Myokardzellen unterstützt. Beide Proteine sind am Schutz von Geweben vor ischämischen und thermischen Schädigungen beteiligt. In der Tat konnte CT-1 in Myozytenkulturen das Apoptoseausmaß nach Ischämie bzw. Hitzeschock reduzieren [Stephanou, 1998]. So konnte zum Beispiel in den Randzonen eines Myokardinfarktes eine Aktivierung des JAK/STAT-Transduktionsweges sowie eine Vergrößerung der Nekrosezone durch eine Hemmung der Januskinasen beobachtet werden [Negoro, 2000]. Ishikawa et al fanden erhöhte CT-1 mRNA-Spiegel im Myokard von Herzinfarktpatienten [Ishikawa, 1999]. Die herzspezifische Überexpression von STAT3 mit einer begleitenden erhöhten CT-1-Expression bewirkte den Schutz vor einer Doxorubicin-induzierten Herzinsuffizienz. [Kunisada, 2000].

Darüber hinaus ergaben mehrere Studien Hinweise auf eine Beteiligung von Cardiotrophin-1 an der Pathogenese der Herzinsuffizienz unterschiedlicher Genese. In verschiedenen Tiermodellen konnte eine gesteigerte CT-1 und gp130 mRNA-Expression im insuffizienten Myokard im Zusammenhang mit einer erhöhten Synthese von Apoptose-induzierenden Faktoren [Chandrasekar, 1996, Chandrasekar, 1998, Jougasaki, 2000] beziehungsweise einer vermehrten Hypertrophie detektiert werden.

CT-1 könnte also den Verlust mokardialer Zellen verhindern, der in eine kardiale Dysfunktion münden würde. Es ist aber auch zusätzlich eine kompensatorische Hypertrophie denkbar. Im Plasma herzinsuffizienter Patienten konnte ebenfalls ein erhöhter CT-1-Spiegel nachgewiesen werden, der eine Korrelation zu echokardiographischen Parametern einer reduzierten linksventrikulären Funktion aufwies [Talwar, 2000]. Nach Beendigung der in der vorliegenden Dissertation dargestellten experimentellen Arbeiten wiesen Zolk et al. im Myokard terminal herzinsuffizienter Patienten eine gesteigerte CT-1 und gp130 mRNA-Expression sowie CT-1-Proteinsynthese bei gleichzeitig vermindertem Gehalt des Proteins der gp130-Rezeptoruntereinheit nach. Das Verhältnis von aktivierten zu totalen STAT3-proteinen blieb dabei unverändert. Dies weist darauf hin, daß in Endstadien der Herzinsuffizienz die Herabregulation des Rezeptors eine gesteigerte Aktivierung des Signalweges verhindert. Denkbar ist hierbei eine Degradation von gp130, der teilweise durch eine vermehrte mRNA-Expression entgegengesteuert wird [Zolk, 2002].


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Cardiotrophin-1 zeigte zusätzlich auch eine STAT3-abhängige verstärkte Expression von VEGF mRNA (vascular endothelial growth factor) und Protein in Zellkulturen. Die Ergebnisse implizieren zusätzlich eine Beteiligung von CT-1 an der Kontrolle des Gefäßwachstums während des kardialen Remodelling [Funamoto, 2000a].

1.2.5 Wirkungen auf extrakardiale Gewebe

Aufgrund der weit verbreiteten Expression der Rezeptoruntereinheiten gp130 und LIFRβ ist CT-1 auch in Geweben der Hämatopoese, der Leber, des Nervengewebes und der Knochen wirksam. Die Funktionen in diesen Organen überlappen sich teilweise mit denen der übrigen IL-6-Mitglieder. CT-1 inhibiert das Wachstum der myeloischen Leukämie M1 Zellen der Maus und die Differenzierung embryonaler Stammzellen [Pennica, 1995b], induziert die Bildung von Akut-Phase-Proteinen in Leberzelllinien [Peters, 1995; Richards, 1996], moduliert den Transmitter-Phänotyp sympathischer Nervenfasern, fördert das Überleben dopaminerger und spinaler Motoneuronen [Pεnnicα, 1995β] und ist an der Aktivierung von Osteoklasten beteiligt [Richards, 2000].

Es ist noch unklar, ob CT-1 diese Wirkungen auch in vivo zeigt, da die Gewebsspezifität eines Zytokins von der jeweiligen Expression der Rezeptoruntereinheiten und der nachfolgenden Aktivierung der Signaltransduktionswege abhängt.


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1.3  Zielstellung der Arbeit

Das Ziel der vorliegenden Dissertation war die Untersuchung der Rolle von Cardiotrophin-1 für die Pathogenese von Kardiomyopathien. Dies sollte durch die Identifizierung und Charakterisierung von Varianten im kodierenden und regulatorischen Bereich des humanen Cardiotrophin-1-Gens sowie durch Expressionsanalysen im menschlichen Myokard erreicht werden. Zu diesem Zweck wurden zunächst die noch unbekannte Sequenz des Promotors unter Verwendung spezifischer PCR-Methoden sequenziert und die regulatorischen Funktionen mithilfe eines Luciferaseassays analysiert. Durch den Vergleich mit vorhandenen Datenbanken wurden Konsensussequenzen für Transkriptionsfaktoren identifiziert. Für die Mutationsanalyse untersuchten wir genomische DNA mit Hilfe der SSCP-Analyse (single strand conformation polymorphism) systematisch auf Sequenzvarianten in der regulatorischen und kodierenden Region. Anschließend wurden die identifizierten Mutationen durch DNA-Sequenzierung und durch den Einsatz geeigneter Restriktionsendonukleasen weiter charakterisiert. Das Kollektiv der untersuchten Patienten setzte sich dabei neben 100 gesunden Kontrollpersonen aus Patienten mit Dilatativer sowie Hypertropher Kardiomyopathie zusammen, da durch die phänotypische Variabilität die Wahrscheinlichkeit zum Auffinden von Promotor- bzw. Proteinvarianten erhöht sein müßte, wenn diese tatsächlich an der Entstehung der untersuchten Erkrankungen beteiligt sind. Möglich, aber unwahrscheinlich sind einerseits krankheitsverursachende Mutationen, die nur bei einzelnen Patienten, aber nicht im Kontrollkollektiv zu detektieren wären. Wahrscheinlicher ist das Auffinden von Polymorphismen, die aufgrund von Veränderungen der Funktion oder Expression von Cardiotrophin die Ausprägung des Phänotyps begünstigen. Unabhängig von möglichen krankheitsbeeinflussenden Mutationen wurde weiterhin das Expressionsverhalten der CT-1 mRNA im Myokardgewebe eines kleinen Patientenkollektivs mit eingeschränkter und normaler linksventrikulärer Ejektionsfraktion sowie von gesunden Spenderherzen nach Transplantation mittels RT-PCR und HPLC-Analyse (High-pressure liquid chromatography) untersucht. Leider war es zum damaligen frühen Zeitpunkt (1997) nicht möglich, gezielt Myokardgewebe von Patienten mit Varianten in der regulatorischen Sequenz zu untersuchen.


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03.06.2004