[Seite 17↓]

2  Material und Methoden

2.1 Materialien

2.1.1 Geräte

Beschreibung

Firma

Herkunftsort

Typenbezeichnung

Autoclav

H+P Labortechnik

München

Varioclav Typ 500

Brutschrank

Heraeus Instruments

Berlin

UT 20

Elektron. Pipette

Biohit

Köln

Proline

Elektrophoresekammern

Boehringer

Ingelheim

Blue Marin 200

 

Biometra

Göttingen

Multigel long G 47

 

GIBCO Brl

Eggenstein

Horizon 58

Geldokumentations-anlage

Biometra

Göttingen

TI3, Bio doc II TM , Bio doc CCD-Camera

Laborwaagen

Sartorius

Göttingen

1712004

Magnetrührer

Heidolph

München

MR 3001 K

Mikrowelle

AEG

Berlin

Micromat EEH 8733

PCR-Gerät

Perkin Elmer

Weiterstadt

Gene Amp PCR System, 9600

Photometer

Pharmacia Biotech

Cambridge, England

Ultrospec 2000

Pipetten

Eppendorf

Köln

Diverse

 

Gilson

Bad Camberg

Diverse

Schüttelinkubator

 

Burgwedel

GFL 3033

Schüttler

Edmund Bühler

Tübingen

SM 25

Sequenzierer

Perkin Elmer

Weiterstadt

ABI Prism TM 377

Spannungsgeräte

Pharmacia Biotech

Freiburg

EPS 200

Sterile Werkbank

Heraeus Instruments

Berlin

Lamin Air HBB 2448

Thermoblock

Eppendorf

Hamburg

Thermomixer 5436

Vakuumtrockner

H.Hölzel GmBH

Deutschland

Dry Star

Vortex Mixer

Heidolph

München

REAX 2000

Wasserbad

Memmert

Schwabach

WB 7

Zentrifugen

Eppendorf

Hamburg

Centrifuge 5417R

 

Heraeus Instruments

Berlin

Megafuge 1.0 R


[Seite 18↓]

2.1.2  Chemikalien

Firma

Herkunftsort

Produkte

Amresco

Ohio, USA

Acryl-40-Solution, Bis-2-Solution

Biozym

Hameln

Agarose Universal

Boehringer

Mannheim

DNA Molecular Weight Marker VI, Molecular Weight Marker XIII

Braun

Melsungen

Aqua ad injactabilia

Gibco BRL

Eggenstein

LB Agar, Taq -DNA-Polymerase, 100 Bp-DNA-Ladder, PBS "ohne" Dulbecco´s (w/o calcium and magnesium, w/o sodium bicarbonat), 5 X First Strand Buffer, TRIzol TM Reagenz, DTT (Ditthiotreitol), Random Primers, dNTP´s, SOC Medium, SuperScript TM II

Invitek

Berlin

OptiPerform TM Buffer III, OptiZyme TM Enhancer

MBI Fermentas

Vilnius

Taq I, Eco 1471, Stu I, Buffer R, BSA, Rnase-Inhibitor

Merck

Darmstadt

Borsäure, Gelatine, Natriumcarbonat, Silbernitrat, Titriplex III (Ethylendinitrolotetraessigsäure, Dinatriumsalz-Dihydrat), Tris-base (Trishydroxymethyl-aminomethan), Ethanol, Essigsäure, Salpetersäure

Serva

Heidelberg

Ethidiumbromid, Temed

Sigma

Deisenhofen

Dimethylsulfoxid (DMSO), Formaldehyd, Formamid, Ammoniumacetat, Ampicillin, APS (Ammoniumpersulfat), Diethylpyrocarbonat, Harnstoff, SDS (Sodium Dodecyl Sulfat)

2.1.3 Komplette Kits

Anwendung

Bezeichnung

Firma

Klonierung

Sure Clone Ligation Kit

Pharmacia Biotech, Freiburg

 

TOPO TA Cloning Kit Version C

Invitrogen, Leek, Niederlande

Sequenzierung

Dye Terminator Cycle Sequencing

ABI Prism, Weiterstadt

 

PRISM Sequenase Terminator

ABI, Weiterstadt

Promoter- Klonierung

Human Genome Walker Kit

Clontech, Palo Alto, USA

 

Advantage Genomic PCR Kit

Clontach, Palo Alto, USA

DNA- und Plasmid- Aufreinigung

QIAquick PCR Purification Kit, QIAgen Plasmid Mini Kit

Quiagen, Hilden

Luciferaseassay

pCMV β-Gal-Vektor von Stratagene

Stratagene

 

Luciferase assay system

Promega, Mannheim

 

pGL3-Luciferase-Reporter-Vektor-Kit

 


[Seite 19↓]

2.1.4  Patientenkollektiv für das Mutationsscreening in der kodierenden Region und im Promotor

Für den ersten Teil der hier vorliegenden Arbeit wurden 64 unverwandte Patienten mit einer Dilatativen Kardiomyopathie (DCM), 53 unverwandte Patienten mit Hypertropher Kardiomyopathie (HCM) und 100 anonyme Kontrollpersonen (Blutspender) untersucht. Die DCM und HCM gehören zu den häufigsten Formen familiärer Kardiomyopathien und sollen daher in dieser Arbeit untersucht werden. Die Verteilungen von Alter und Geschlecht sind aus der Tabelle 3 zu entnehmen. Zusätzlich dazu wurden für das Fragment "ct1gap6" weitere 137 DCM-Patienten und 117 Kontrollen in diese Gruppe eingeschlossen.

Die Diagnostik beinhaltete die internistische Anamnese, nicht-invasive (EKG, Echokardiogramm) sowie invasive kardiologische Untersuchungsmethoden gemäß der allgemein geltenden Richtlinien. Die Diagnosestellung erfolgte anschließend entsprechend der WHO-Kriterien nach Ausschluß anderer Ursachen für das klinische Erscheinungsbild.

Tab. 3: Patientenkollektiv fürdie Mutationssuche in der codierenden und 5´- untranslatierten Region. Alle Angaben in Mittelwert (MW) ± Standardabweichung (SD)

Diagnosen

Anzahl

Geschlecht

Durchschnittsalter

 

 

weiblich

männlich

 

     

Dilatative Kardiomyopathie

64

13 (20,3%)

51 (79,7%)

50,3 ±7,1 Jahre

     

Hypertrophe Kardiomyopathie

53

17 (32,1%)

36 (67,9%)

55,0 ±9,2 Jahre

     

Kontrollgruppe

100

37 (37%)

63 (63%)

34,7 ±10,0 Jahre

     

Tab. 4: Erweitertes Patientenkollektiv für das Fragment "ct1gap6". (MW±SD)

Diagnosen

Anzahl

Geschlecht

Durchschnittsalter

 

 

weiblich

männlich

 

     

Dilatative Kardiomyopathie

201

39

162

48,9 ± 8,1 Jahre

  

(19,4%)

(80,6%)

 
     

Hypertrophe Kardiomyopathie

53

17 (32,1%)

36 (67,9%)

55,0 ± 9,2 Jahre

     

Kontrollgruppe

217

67

150

33,4 ± 8,8 Jahre

  

(69,1%)

(30,9%)

 


[Seite 20↓]

Vor derBlutabnahme wurden alle untersuchten Patienten über die geplanten molekulargenetischen Untersuchungen informiert und um ihr mündliches und schriftliches Einverständnis dafür gebeten.

Die Studie wurde von der zuständigen Ethikkommisson genehmigt.

2.1.5 Patientenkollektiv für die Quantifizierung der Cardiotrophin-1 mRNA

Zur Quantifizierung wurde RNA aus Myokardbiopsien des rechten Ventrikels von 6 Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz (LVEF < 40%), 3 Kontrollpatienten mit normaler bzw. leicht eingeschränkter LV-Funktion und 5 Patienten nach orthotoper Herztransplantation isoliert. Alle Personen stellten sich im Deutschen Herzzentrum Berlin (DHZB) zur Diagnoseklärung, beziehungsweise zur Kontrolluntersuchung, zur invasiven kardiologischen Diagnostik vor. Zum Zeitpunkt der Durchführung dieser Untersuchungen stand nur dieser geringe Umfang an Biopsiematerial zur Verfügung und konnte aufgrund des invasiven Eingriffes nicht weiter vergrößert werden. Allgemeine Angaben bezüglich Geschlechts- und Altersverteilung und klinischer Parameter sind in der Tabelle 5 aufgeführt.

Tab. 5: Charakteristika des Patientenkollektivs für die mRNA-Quantifizierung. (MW±SD)

Charakteristika

Chronische Herzinsuffizienz
(= CHI)

Patienten nach Herztransplantation (=TX)

Kontrollen (=KO)

    

Gesamtanzahl

6

5

3

    

Geschlechtsverteilung

   

weiblich (in%)

0 (0)

1 (20)

2 (66,7)

männlich (in%)

6 (100)

4 (80)

1 (33,3)

    

Durchschnittsalter

48,8 ± 11,2 Jahre

51,2 ± 13,6 Jahre

37,3 ± 15,3 Jahre

    

LVEF im Durchschnitt in %

35 ± 4

62 ± 11

73 ± 10

    


[Seite 21↓]

Tab. 6: Ergebnisse der RNA-Extraktion. (CHI=Chronische Herzinsuffizienz, KO=Kontrollen, TX=Transplantat)

Probe

RNA (µg / µl)

Volumen ( µl )

Gesamt-RNA ( µg )

RNA-Ausbeute
(
μ g/mg FG)

     

CHI 1

0,21

25

5,3

0,53

CHI 2

0,27

25

6,63

0,46

CHI 3

0,17

25

4,36

0,74

CHI 4

0,13

25

3,28

0,60

CHI 5

0,32

25

7,96

0,46

CHI 6

0,23

25

5,66

0,44

     

KO 1

0,07

25

1,78

0,56

KO 2

0,31

25

7,73

0,60

KO 3

0,1

25

2,6

0,43

     

TX 1

0,1

25

2,57

0,48

TX 2

0,13

20

2,57

0,31

TX 3

0,11

25

2,73

0,48

TX 4

0,22

25

5,51

0,44

TX 5

0,09

25

2,33

0,54

     

Die folgenden Tabellen 7 bis 11 geben das Alter, die Krankheitsursachen, wichtige kardiale Funktionsparameter und die medikamentöse Therapie für jeden Patienten wieder.


[Seite 22↓]

Tab. 7: Klinische Daten der Patienten mit eingeschränkter linksventrikulärer Ejektionsfraktion (LVEF). ACEI= ACE-Hemmer, COLD=Chronisch Obstruktive Lungenerkrankung, CHI=Chronische Herzinsuffizienz, DCM=Dilatative Cardiomyopathie

Probe

Geschlecht

Alter (1995)

Diagnose

LVEF (%)

ACEI

Diuretika

b-Blocker

Glykoside

Ca-Antag.

Nitrate

           

CHI 1

m

64

DCM

33

ja

ja

nein

ja

nein

ja

CHI 2

m

52

DCM

39

nein

nein

ja

nein

nein

nein

CHI 3

m

37

Myokardinfarkt bei V.a. Marfan-Syndrom

35

ja

ja

nein

ja

nein

nein

CHI 4

m

60

DCM

28

ja

ja

nein

nein

nein

nein

CHI 5

m

33

DCM

39

ja

nein

nein

ja

nein

nein

CHI 6

m

47

DCM

37

ja

ja

nein

ja

nein

nein

           

Tab. 8: Klinische Daten der Patienten aus den beiden Kontrollgruppen. KO=Kontrollen, TX=Transplantat

Probe

Geschlecht

Alter (1995)

Diagnose

LVEF (%)

ACEI

Diuretika

b-Blocker

Glykoside

Ca-Antag.

Nitrate

           

KO 1

w

59

V.a. HCM

82

nein

nein

ja

nein

nein

nein

KO 2

w

27

rezidivierende Sinustachykardien

78

nein

nein

ja

nein

nein

nein

KO 3

m

26

Z.n. Myokardinfarkt

60

nein

nein

nein

nein

ja

nein

           

TX 1

m

29

HOCM

80

nein

nein

nein

nein

nein

ja

TX 2

m

61

DCM

58

ja

ja

nein

nein

nein

nein

TX 3

w

43

DCM

63

ja

ja

nein

nein

ja

nein

TX 4

m

56

terminale ischämische Kardiomyopathie

66

ja

nein

nein

nein

nein

nein

TX 5

m

67

DCM

45

ja

ja

nein

ja

nein

nein


[Seite 23↓]

Tab. 9: Daten der links- und rechtsventrikulären Katheterisierung der Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz. EDV=Enddiastolisches Volumen, ESV= Endsystolisches, Volumen, EDMD= Enddiastolische Muskeldicke, LVMI= Linksventrikulärer Masseindex, SVI= Schlagvolumenindex, RVEF= Rechtsventrikuläre Ejektionsfraktion.

Probe

EDV li (ml/qm)

ESV li (ml/qm)

EDMD li (cm)

LVMI (g/qm)

LVEF (%)

EDV re (ml/qm)

ESV re (ml/qm)

SVInd. (ml/qm)

RVEF (%)

          

CHI 1

244

164

0,5

89

33

99

46

54

54

CHI 2

127

77

1

144

39

42

22

20

48

CHI 3

378

246

0,9

218

35

150

68

82

55

CHI 4

103

74

1,2

151

28

37

22

15

40

CHI 5

176

108

1,1

194

39

144

75

68

48

CHI 6

189

119

1

162

37

116

64

52

45

          

Tab. 10: Daten der links- und rechtsventrikulären Katheterisierung der Kontrollgruppen. KO=Kontrollen, TX= Patienten nach Herztransplantation, EDV=Enddiastolisches Volumen, ESV= Endsystolisches, Volumen, EDMD= Enddiastolische Muskeldicke, LVMI= Linksventrikulärer Masseindex, SVI= Schlagvolumenindex, RVEF= Rechtsventrikuläre Ejektionsfraktion.

Probe

EDV li (ml/qm)

ESV li (ml/qm)

EDMD li (cm)

LVMI (g/qm)

LVEF (%)

EDV re (ml/qm)

ESV re (ml/qm)

SVInd. (ml/qm)

RVEF (%)

          

KO 1

90

16

1,2

141

82

53

14

39

73

KO 2

70

15

0,7

67

78

48

8

41

84

KO 3

136

55

1

150

60

136

53

83

61

          

TX 1

46

9

1,1

91

80

31

9

22

71

TX 2

37

16

0,1

3

58

29

9

20

70

TX 3

71

26

0,7

64

63

72

23

49

68

TX 4

72

24

0,8

83

66

30

14

17

55

TX 5

81

23

1

102

45

48

16

32

67

          


[Seite 24↓]

Tab. 11: Immunsuppressive Behandlung der Patienten nach Herztransplantation

Probe

Ciclosporin A

Azathioprin

Cortisonpräparat

    

TX 1

ja

ja

ja

TX 2

ja

nein

ja

TX 3

ja

ja

ja

TX 4

ja

ja

ja

TX 5

ja

ja

ja

    

2.1.6 Synthetische Oligonukleotide ( Primer )

Alle in der Studie verwendeten Primer wurden mit Hilfe des Computerprogramms „Primer“, Version 5.0 für den kodierenden Bereich aus der von Pennica et al [Pennica, 1996b] veröffentlichten Sequenz der CT-1 DNA und aus der im Rahmen dieser Arbeit ermittelten Sequenz für die 5´-untranslatierte Region ausgewählt. Die Synthese erfolgte durch die Firmen Applied Biosystems (Weiterstadt) und Invitek GmbH (Berlin).

Die Tabellen 12 bis 18 im Kapitel 2.2.4.1 "Polymerase-Ketten-Reaktion" enthalten die Charakteristika der Primer, die Fragmentlängen der Produkte, die Annealingtemperaturen und weitere Reaktionsbedingungen.


[Seite 25↓]

2.2  Methoden

2.2.1 Überblick

Da die Sequenz der 5´-untranslatierten Region zum Zeitpunkt der Analyse noch nicht vorlag, wurde ausgehend vom Exon 1, ein ca. 1100 bp großes Fragment mit dem GenomeWalker Kit (Clontech, Heidelberg, Germany) amplifiziert, anschließend kloniert und sequenziert.

Zur Funktionsanalyse dieser Region erfolgte die Fusion von sechs 5´-terminalen Deletions-Mutanten (-1091/+39 bis -218/+39) mit einem Luciferase-Reportergen und die Transfektion in COS-7 Zellen. Anschließend konnte die Aktivität in einem Luciferaseassay gemessen werden.

Die kodierende und 5´-untranslatierte Region des humanen Cardiotrophin-1-Gens wurde systematisch bei insgesamt 217 Personen auf mögliche Varianten untersucht. Diese Gruppe setzte sich aus 64 Personen mit Dilatativer Kardiomyopathie und 53 Personen mit Hypertropher Kardiomyopathie zusammen. Als Kontrollgruppe dienten 100 anonyme Kontrollpersonen.

Die kodierende Region wurde einschließlich der Exon-Intron-Übergänge bei allen Probanden auf DNA-Ebene mit 6 PCR-Fragmenten (ct1exon 1, ct1exon 2, ct1exon 3.1., ct1exon 3.2., ct1exon 3.3., ct1exon 3.4.), von denen sich die Fragmente des Exon 3 überlappen, amplifiziert. Die Variantensuche in der 5´-untranslatierten Region erfolgte mit 7 sich überlappenden PCR-Fragmenten (ct1Prom1F/ct1prb, ct1 rep, ct1gap2, ct1gap3, ct1gap4, ct1gap5, ct1gap6).

An die Amplifikation mittels PCR schloß sich die SSCP-Analyse aller Fragmente bei Raumtemperatur und 4°C an. Bei gesicherten Veränderungen im Laufmuster erfolgte die Klonierung des entsprechenden Fragmentes in einen E.coli-Vektor und die anschließende Sequenzierung.

Die nachfolgende Bestätigung der Sequenzveränderungen und die Überprüfung des Patienten- und Kontrollkollektivs erfolgte mittels Restriktions-Fragmentlängen-Polymorphismus (RFLP)-Analyse. Teilweise war hierfür ein Amplification-Created-Restriction-Site-(ACRS)-Assay notwendig.

Für die Untersuchung des Expressionsverhaltens wurde die mRNA aus Myokardbiopsien von insgesamt 14 Probanden, darunter 6 Patienten mit verminderter Linksventrikulärer Ejektionsfraktion (LVEF), 5 Patienten nach Herztransplantation und 3 Kontrollen mit normaler LVEF isoliert und mittels RT (Reverse Transkriptions)-PCR amplifiziert. Daran schloß sich die [Seite 26↓]semiquantitative Analyse mittels HPLC an. Für die externe Standardisierung diente die PDH-mRNA.

2.2.2 Klonierung und Sequenzierung der 5´-untranslatierten Region

Unter Verwendung des Genome Walker Kits (Clontech, Heidelberg ) konnten 1,1 kb des 5´-flankierenden Bereiches des humanen Cardiotrophin-1 Gens kloniert und sequenziert werden.

Dieses Kit besteht aus 5 "Bibliotheken" spezies-spezifischer genomischer DNA. Hierfür wurde die DNA mit 5 verschiedenen Restriktionsenzymen (EcoR V, Sca I, Dra I, Pvu II, Ssp I) geschnitten und mit einer Adaptorsequenz ligiert. Die "Bibliotheken" dienten als Matritze in einer "nested"-PCR mit Gen-spezifischen Primern (GSP) und im Kit enthaltenen Adapter-Primern (AP) [Tabelle 12]

Tab. 12: Oligonukleotidsequenzen für die Klonierung der 5´-flankierenden Region

 

Adapterspezifisch (forward)

3´-Ende des Exon 1 (reverse)

   

1. PCR

5´-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3´

3´-TTAGGGAGACTGAGGACGC-5´

   

2. PCR

5´-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3´

3´-ACTGAGGACGCGGGGAGTCGC-5´

   

Dabei dienten die Produkte der 1. PCR als Ausgangsmatritze für die anschließende "nested"-PCR. Beide Reaktionen wurden mit dem Advantage Genomic PCR Kit (Clontech, Heidelberg) ausgeführt. Dieses ist insbesondere für die Amplifikation langer Fragmente geeignet. Die dabei verwendete Polymerase ist zusätzlich in der Lage, Fehler zu erkennen und zu korrigieren.

Als Endprodukt entstand ein 1,1 kb-Fragment. Dieses wurde wie unter 2.2.3. beschrieben kloniert und sequenziert.

2.2.3 Funktionsanalyse der 5´-untranslatierten Region

Dieser Teil der Arbeit hatte das Ziel, die erhaltene Sequenz der 5´-untranslatierten Region hinsichtlich ihrer regulatorischen Eigenschaften auf die Genexpression mit Hilfe der Reportergen-Analyse zu untersuchen. Hierfür wird die zu untersuchende Sequenz in einen Vektor kloniert, der stromabwärts der Klonierungsstelle ein Reportergen enthält. Dieser Vektor [Seite 27↓]wird dann in geeignete Zellen, die das Reportergen nicht enthalten, eingeschleust (Transfektion), in denen die Expression erfolgt.

Das in dieser Arbeit verwendete Expressionssystem bestand aus COS-7-Zellen (SV40-transformierte Nieren-Zell-Linie Afrikanischer Grüner Meerkatzen) und dem Luciferase-Gen (Leuchtkäfer (Photinus pyralis)). Luciferase katalysiert die Oxidation des Luciferins, wobei gelb-grünes Licht emittiert wird, das bereits in geringer Stärke nachweisbar ist (10-20 M Luciferase= 0,001pg). Dieses System ist sehr sensitiv, effektiv und unabhängig von posttranslationalen Modifikationen. Dadurch besteht die Reportergen-Funktion sofort nach der Translation und ist direkt von der regulatorischen Stärke der zu untersuchenden Sequenz abhängig.

Verwendet wurde der pGL3-Basic-Vektor, der weder Promotor- noch Enhancer-Sequenzen besitzt (pGL3-Luciferase-Reporter-Vektor-Kit, Promega). Die Expression des Luciferase-Gens ist somit vollständig vom eingefügten PCR-Konstrukt abhängig. Als externe Kontrolle diente der pGL3-Control-Vektor, der die SV40 (Semian Virus 40)-Promotor- und Enhancer-Sequenzen enthält. Zur internen Kontrolle wurde ein Vektor verwendet, der das ß-Galaktosidase-Gen als Reportergen enthält (ß-Galaktosidase Enzyme Assay System, Promega). Dieser Vektor wird zusammen mit dem Luciferase-Vektor in die Zellen kotransfiziert und dient als Maß für die Menge des in die Zelle aufgenommen Plasmids.

2.2.3.1 Herstellung und Klonierung der 5´-Deletions-Fragmente

Für die Analyse der funktionellen Aktivität einzelner Bereiche der 5´-flankierenden Region wurden Fragmente synthetisiert, die unterschiedlich weit in die interessierende Sequenz hineinreichen. Hierfür wurde jeweils der Primer "exon 1 Reverse" (5´-AATCCCTCTGACTCCTGCG-3´) mit einem der Vorwärts-Primer kombiniert, die auch zur Variantensuche eingesetzt wurden (Tab. 13).

Nach dem im Kapitel 2.2.4.1 beschriebenem Standardprotokoll erfolgte die Amplifikation dieser Fragmente. Die Reaktionsbedingungen waren für alle Primerpaare einheitlich ( Primermenge: 10 pmol, DNA-Menge: 60 ng, keine PCR-Zusätze, Annealingtemperatur: 60 °C).


[Seite 28↓]

Tab. 13: Vorwärtsprimer für die Amplifizierung der Promotorkonstrukte. Zur Lage der Primer siehe Tabelle 16 im Kapitel 2.2.4.1.

Bezeichnung

Vorwärts-Primer

Sequenz des Vorwärts-Primers

Fragmentlänge

    

gap 1

ct1gap 1 F

5´-GCCCGGGCTGGTATTTAC-3´

1173 bp

gap 2

ct1gap 2 F

5´-CACTCACACGAACACACGC-3´

1029 bp

gap 3

ct1gap 3 F

5´-TGGGCTTCCTCGACAGAC-3´

821 bp

gap 4

ct1gap 4 F

5´-GCCTGCTAAGAAGAGGAGAGC-3´

639 bp

gap 5

ct1gap 5 F

5´-ATTCCTGTCCTGCCAGTCC-3´

459 bp

gap 6

ct1gap 6 F

5´-CAACTTGCCTTCCCCCTC-3´

300 bp

    

Für die Klonierung der PCR-Fragmente in den Luciferase-Vektor, wurden die Enden so modifiziert, daß sie zu den überhängenden Enden des Vektors komplementär sind. Dies erfolgte durch die vorherige Klonierung in den pCR®-TOPO-Vektor (TOPO TA Cloning® Kit). Nach der Bestätigung der Insertion des Fragmentes mittels PCR sowie der korrekten Orientierung durch Sequenzierung der positiven Klone wurde das Insert durch die Restriktionsenzyme Kpn I und Xho I aus dem Vektor herausgeschnitten und für die weitere Klonierung aufbereitet. Der pGL3-Basic-Luciferase Reporter Vektor wurde ebenfalls mit diesen beiden Enzymen vorbereitet. Das Einfügen der Konstrukte in den Vektor erfolgte unter Verwendung des TA Cloning Kits der Firma Clontech entsprechend den Herstellerangaben. Anschließend wurden 10 Kolonien je Fragment ausgewählt und mittels Insert-spezifischer PCR überprüft. Um eventuelle Fehler in den Sequenzen der Fragmente auszuschließen, wurden alle positiven Klone sequenziert.

Tab. 14: Charakteristika der zur Klonierung eingesetzten Restriktionsenzyme

Enzym

Isolationsquelle

Erkennungssequenz

Temperatur

Zusatz zum Verdau

     

Kpn I

Klebsiella pneumoniae OK8

5´...GGTACC...3´

37 °C

BSA

  

3´...CCATGG...3´

  
     

Xho I

Xanthomonas holcicola

5´...CTCGA G...3´

37 °C

BSA

  

3´...G AGCTC...5´

  
     


[Seite 29↓]

2.2.3.2  Transfektion der COS-7 Zellen

Die wie oben beschrieben vorbereiteten Luciferase-Reportergen-Konstrukte wurden anschließend in COS-7-Zellen eingebracht. Dafür wurden die Zellen nach entsprechender Vorbereitung einer Elektroporation unterworfen. Durch diesen rein physikalischen Vorgang kommt es zur kurzfristigen Permeabilitätserhöhung der Zellmembranen durch Pulse eines elektrischen Feldes ausreichender Stärke. Der zugrundeliegende Mechanismus, "Reversible Elektrical Breakdown" (REB, Reversibler elektrischer Zusammenbruch) genannt, tritt bei Erreichen eines Membranpotentials von 0,5-1,5V auf und wird von einer kurzfristigen Porenbildung gefolgt, was wiederum das Eindringen der Plasmide erleichtert [Neumann, 1982].

Die hier verwendeten COS-7-Zellen wurden durch Trypsin aus ihrer Zellkultur gelöst und in Vollmedium (500 ml DMEM mit 4,5 g Glucose/l, 10 % FKS "inaktiv" (fötales Kälberserum), 2,5 ml Gentamycin) suspendiert. Anschließend wurde die Zelldichte unter einem Mikroskop bestimmt, die 1 x 107/ml betragen sollte.

Dann wurde der DNA-Ansatz vorbereitet, der sich wie folgt zusammensetzte:

CT1-Promoter-Luciferase-Reportergen-Konstrukt

10 µg

pCMV-β-Gal-Vektor (Kontrolle der Transfektionseffizienz)

5 µg

pBSSK (Carrier-DNA, pBluescriptSK+,Stratagene)

15 µg

steriler TE-Puffer (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA)

ad 50 ml

Zusätzlich dazu wurde mindestens ein Ansatz mit dem pGL3-Control-Vektor als Positiv-Kontrolle (enthält SV40 Promoter- und Enhancersequenzen) in die Untersuchung mit aufgenommen.

Für die Elektroporation wurden dann genau 300 µl COS-7-Zellen (=3x106 Zellen) je Ansatz in Küvetten vorgelegt, mit dem DNA-Ansatz vermischt und anschließend bei 250 V und 1200µF elektroporiert. Danach wurden sie sofort in die 6-Loch-Platten überführt.


[Seite 30↓]

2.2.3.3  Luciferase-Assay und β-Galaktosidase-Assay

48 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen erneut mit Trypsin aus der Kultur gelöst und im Medium suspendiert. Für das eigentliche Assay wurden die Zellen anschließend lysiert. Anschließend wurden 50 µl des gereinigten Lysats mit 50 µl Luciferase-Assay-Reagenz (20mM Tricin, 0.07mM(MgCO3)4Mg(OH)2 .5H2O, 2.67mM MgSO4, 0.1mM EDTA, 33.3mM DTT, 270µM Coenzym A, 470µM Luciferin, 530µM ATP; pH 7.8 ) versetzt und die Intensität der entstehenden Lichtsignale sofort im Luminometer gemessen.

Die Intensität des Lichtes bleibt für etwa 20 sec. konstant und fällt danach langsam mit einer Halbwertszeit von 5 min ab.

Zur Überprüfung der Transfektionseffizienz wurde in dieser Arbeit das für die β-Galaktosidase kodierende Reportergen eingesetzt, von dem bekannt ist, daß es bei einer Ko-Transfektion proportional zum pGL3-Vektor in die Zellen aufgenommen wird (pCMV β-Gal-Vektor, Stratagene; enthält den Promotor des Cytomegalie-Virus).

Die β-Galaktosidase hydrolisiert die Substanz o-Nitrophenyl-β-D-Galaktopyranosid (ONPG) zu o-Nitrophenol und Galaktose. O-Nitrophenol hat eine gelbe Farbe, deren Intensität sich bei einer Wellenlänge von 420 nm (Optimum) in einem Spektrometer messen läßt.

Um die Aktivität dieses Enzyms zu bestimmen, werden 20 µl des Zelllysats in 96-Loch-Platten nach folgendem Schema vorgelegt:

Blank, nur 1x Zellysispuffer

1. β-Gal-Verdünnung 1:10 in Lysispuffer

2. 1:20

3. 1:40

usw. bis 1:1280

Anschließend werden 20 µl der Beta-Gal-Reagenz (120mM Na2HPO4, 80mM NaH2PO4, 2mM MgCl2, 100mM β-Mercaptoethenol, 1.33mg/ml ONPG) hinzugegeben. Sobald sich das Gemisch gelb verfärbt, wird die Reaktion gestoppt, indem 40 µl einer Natriumbicarbonat-Stopplösung hinzupipettiert werden. Dies sollte mit der gleichen Geschwindigkeit erfolgen, mit der die Reagenz hinzugegeben wurde.

Danach muß die Intensität sofort bei 450 bzw. 630 nm (Referenz) gemessen werden.


[Seite 31↓]

2.2.4  Variantensuche in der kodierenden und 5´-untranslatierten Region des humanen Cardiotrophin-1 Gens

2.2.4.1 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR, polymerase chain reaction )

Durch diese von Mullis und Saiki et al. erstmals 1986 [Saiki, 1986] beschriebene Methode, lassen sich in vitro einzelne Sequenzen aus genomischer DNA mit dem Enzym TaqDNA-Polymerase exponentiell vervielfältigen, um ausreichend Material für weitergehende Untersuchungen wie z.B. die SSCP-Analyse zur Verfügung zu stellen. Im ersten Schritt und zu Beginn eines jeden weiteren Zyklus erfolgt die Hitzedenaturierung der DNA. Die dabei entstehenden Einzelstränge stellen die Matritze für die Synthese der komplementären Stränge durch die TaqDNA-Polymerase dar. Für diesen Schritt werden zwei sequenzspezifische Oligonukleotide (Primer) benötigt, die sich unter geeigneten Bedingungen komplementär zur Sequenz am 5´-Ende (Vorwärtsprimer,"F") und am 3´-Ende (Rückwärtsprimer,"R") anlagern. Daran anschließend erfolgt die Elongation der Stränge. [Rolfs, 1992; Passarge, 1994].

Die Exone 1 und 2 der kodierenden Sequenz konnten einschließlich der Exon-/Intron-Übergänge mit jeweils einem Primerpaar amplifiziert werden. Für alle übrigen Bereiche wurden überlappende Fragmente generiert.

Die folgenden Tabellen stellen eine Übersicht über die Sequenzen und Charakteristika der eingesetzten Oligonukleotide dar.


[Seite 32↓]

Tab. 15: Charakteristika der Primerpaare für den kodierenden Bereich des humanen CT-1 Gens.

Primer

Sequenz

Nukleotidposition

Fragmentgröße

    

ct1 exon1 F

5´-GTGAAGGGAGCCGGGATC-3´

-32→ -15

115 bp

ct1 exon1 R

3´-AATCCCTCTGACTCCTGCG-5´

+59→ +41

 

ct1 exon2 F

5´-TCATTCCTCCCCCCTTTC-3´

-27→ -10

163 bp

ct1 exon2 R

3´-CACCCCCATTCCCACTCA-5´

+19→ +2

 

ct1 exon3.1. F

5´-CCGGCCGTGTCTCCGCA-3´

-18→ -2

201 bp

ct1 exon3.1. R

3´-GGCCTGGCGGCGACACA-5´

+327→ +311

 

ct1 exon3.2. F

5´-GGGCTGCCAGTGCACGAGC-3´

+238→ +256

186 bp

ct1 exon3.2. R

3´-GGCCAGCAAGGCCTCCACG-5´

+426→ +406

 

ct1 exon3.3. F

5´-CTGCGCCGCCTGGAGGAC-3´

+355→ +372

234 bp

ct1 exon3.3. R

3´-CAGCAGCTGGCCCAGGTCG-5´

  

ct1 exon3.4. F

5´-CTACCGCGAGTGGCTGAG-3´

+540→ +557

207 bp

ct1 exon3.4. R

3´-CACAAAAAGCAAAGAAGGCC-5´

+140→ +121

 
    

Die Bezeichnung der Positionen erfolgte anhand der von Pennica et al. (1996) veröffentlichten cDNA-Sequenz. Das Startcodon (ATG) wurde als Position +1 definiert. Für die Primer "ct1exon 1R", "ct1exon 2R" und "ct1 exon 3.4.R" bezieht sich die Position +1 auf die jeweils erste Base des nachfolgenden Introns. Die Primerpaare "ct1exon 1 F/R" und "ct1exon 2 F/R" amplifizieren das vollständige Exon 1 respektive Exon 2 inklusive der Exon-Intron-Übergänge.

Tab. 16: Charakteristika der Primerpaare für die 5´-untranslatierte Region des humanen CT-1 Gens.

Primer

Sequenz

Nukleotidposition

Fragmentgröße

    

ct1 prom1 F

5´-ACACATGTGATTGTGGGCC-3´

-1065→-1047

139 bp

ct1 prb

3´-GCGTGTGTTCGTGTGAGTG-5´

-928→ -946

 

ct1 rep F

5´-TCCAGCAATTGTCTGCTCAC-3´

-981→ -962

298 bp

ct1 rep R

3´-TCCATACTTGGTTTCTGGCC-5´

-684→ -703

 

ct1 gap2 F

5´-CACTCACACGAACACACGC-3´

-946→ -928

263 bp

ct1 gap2 R

3´-TCCATACTTGGTTTCTGGCC-5´

-684→ -703

 

ct1 gap3 F

5´-TGGGCTTCCTCGACAGAC-3´

-738→ -721

241 bp

ct1 gap3 R

3´-CTCATTGTCACACCCACC-5´

-498→ -517

 

ct1 gap4 F

5´-GCCTGCTAAGAAGAGGAGAGC-3´

-556→ -536

266 bp

ct1 gap4 R

3´-TCAGGCTTGGACCTGAGG-5´

-291→ -308

 

ct1 gap5 F

5´-ATTCCTGTCCTGCCAGTCC-3´

-376→ -358

266 bp

ct1 gap5 R

3´-AACATTTCATCCTACCCCCC-5´

-111→ -131

 

ct1 gap6 F

5´-CAACTTGCCTTCCCCCTC-3´

-217→ -200

247 bp

ct1 gap6 R

3´-CTTACCCAGACTTCCCTCCC-5´

+30→ +11

 
    

Die Bezeichnung der Positionen erfolgte anhand der im Rahmen dieser Arbeit ermittelten Sequenz für die 5´-UTR. Die Position -1 bezieht sich auf die erste Base in 5´-Richtung vom Startcodon (ATG) des Exon 1.

Aufgrund des hohen GC-Gehalts und einer vermehrten Sekundärstrukturbildung der Einzelstränge war für einige Fragmente der Zusatz von deionisiertem Formamid bzw. DMSO [Seite 33↓]zum PCR-Ansatz notwendig. Beide Zusätze verhindern ein Reannealing der Einzelstränge und das Auftreten von Sekundärstrukturen [Rolfs, 1992]. Das Fragment "ct1Prom1F/ct1prb" ließ sich auch nach Zugabe der oben erwähnten Chemikalien nicht optimal amplifizieren. Bessere Ergebnisse waren erst durch den Einsatz eines speziellen Puffers und enzymatischen "Enhancers", zwei Reaktionsbestandteilen des "CombiPol™DNA Polymerase Mix" von InViTek (Berlin), zu erreichen.

Tab. 17: Reaktionsbedingungen der Primerpaare für die Mutationssuche im kodierenden Bereich sowie der 5´-UTR.

Primer

Annealing
temperatur

PCR-Zusatz

Primermenge

DNA-Menge

     

ct1 exon 1

54 °C

5 % Formamid *

10 pmol

80 ng

ct1 exon 2

60 °C

keine Zusätze

10 pmol

60 ng

ct1 exon 3.1.

62 °C

12 % DMSO

5 pmol

60 ng

ct1 exon 3.2.

62 °C

12 % DMSO

5 pmol

60 ng

ct1 exon 3.3.

62 °C

12 % DMSO

10 pmol

60 ng

ct1 exon 3.4.

46 °C

16 % DMSO

10 pmol

60 ng

     

ct1prom1F/ct1prb

56 °C

CombiPol-Puffer und Enhancer

10 pmol

80 ng

übrige Primer

    

ct1 rep - ct1 gap6

60 °C

keine Zusätze

10 pmol

60 ng

     

*Die Prozentangaben beziehen sich auf 25 μl des gesamten PCR-Ansatzes


[Seite 34↓]

Die PCR-Reaktionen wurden standardisiert nach folgendem Programm mit dem Thermocycler PE 9600 (Perkin Elmer) durchgeführt (exklusive Fragment "ct1Prom1F/ct1prb") Für das Fragment "ct1Prom1F/ct1prb" war die Anwendung eines Zyklusprofils mit verlängerten Zeiten notwendig (Angaben in Klammern):

A

initiale Denaturierung

94 °C

5 min

 
     
 

Denaturierung

94 °C

20 sec (45 sec)

 

B

Primer-Annealing

siehe Tabelle

20 sec (30 sec)

35 Zyklen

 

Primer-Elongation

72 °C

20 sec (30 sec)

 
     

C

finale Elongation

72 °C

10 min

 
     

Ein PCR-Standardansatz (exklusive "ct1Prom1F/ct1prb) bestand aus:

PCR-Puffer

2,5 µl (1M KCl, 1M Tris-HCl, 1M MgCl2, 0,5g Gelatine)

dNTP´s

4,0 µl (200 µM jedes Nukleotids/µl)

TaqDNA-Polymerase

0,2 µl (5U/µl)

Primer

5 bzw. 10 pmol (0,5-1,0µl) (siehe Tab. 15, 16)

DNA

3 bzw. 4 µl (20 ng/µl ) (siehe Tab. 17)

Formamid bzw. DMSO

in unterschiedlichen Konzentrationen ( siehe Tab. 17)

PCR-H2O

bis zu einem Gesamtvolumen von 25 µl

Wie bereits oben erwähnt, wurde ein abweichender PCR-Ansatz für das Fragment "ct1Prom1F/ct1prb" verwendet, der sich durch den Einsatz des OptiPerformBuffer III (10X), von 1,0 μl MgCl (50mM) sowie von 2,0 μl OptiZymeEnhancer (5X) vom Standardansatz unterschied (siehe auch Tab. 17).


[Seite 35↓]

2.2.4.2  Einzelstrang-Konformationsanalyse (Single-strand-conformation-polymorphism-(SSCP)-analysis)

Die SSCP-Analyse [Orita, 1989] ist eine einfache, sensitive, kostengünstige und häufig gebrauchte Methode zum Auffinden von Sequenzvarianten. Dazu werden die doppelsträngigen PCR-Amplifikate durch Hitzedenaturierung voneinander getrennt und diese Einzelstränge dann in einem nicht-denaturierendem Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Hierbei kommt es in Abhängigkeit von der Primärsequenz zur Ausbildung von dreidimensionalen Strukturen. Sequenzunterschiede zwischen Wildtyp und mutierter DNA können zu einer veränderten Sekundärstruktur und damit zu einem unterschiedlichen Laufverhalten eines oder beider Stränge führen, was sich wiederum in einem veränderten Bandenmuster niederschlägt [Orita, 1989; Condie, 1993; Glavac, 1993].

Durch dieses Verfahren ist es nach Grompe [Grompe, 1993] möglich, 70-97 % der Varianten in PCR-Fragmenten von bis zu 200 bp Länge zu detektieren. Mit zunehmender Größe der PCR-Produkte reduziert sich die Sensitivität auf z.B. weniger als 50 % bei Fragmenten größer als 400 bp. Die Sensitivität läßt sich durch die Wahl der Elektrophoresebedingungen (Temperaturen, Gelzusammensetzung) erhöhen. Durch die Wahl zweier verschiedener Laufbedingungen läßt sich die Sensitivität auf bis zu 98 % erhöhen. Da sich anhand des Bandenmusters keine Rückschlüsse auf Art und Lokalisation der Mutationen ziehen lassen, ist eine anschließende Sequenzierung abweichender PCR-Produkte notwendig.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden 10 %ige Polyacrylamid-Gele (Acrylamid : Bisacrylamid 49:1) angefertigt. Die Herstellung erfolgte unter Verwendung eines speziellen Glasplattensystems (Elektrophoresekammer Multigel-Long Typ G 47, Größe 110x120x1 mm, Biometra). Als Gel- und Elektrophoreselaufpuffer diente 0,5 facher TBE-Puffer.

Da das Laufverhalten temperaturabhängig ist, wurde jedes PCR-Fragment bei Raumtemperatur (RT) und bei 4°C analysiert, um eine möglichst hohe Sensitivität zu erreichen.

Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte dann bei 60 V (RT) bzw. 70 V (4°C) für 16-18 Stunden je nach Fragmentlänge.

Die anschließende Sichtbarmachung der DNA ist durch die Silbernitratfärbung nach Budowle et al. [Budowle, 1991] auch nicht-radioaktiv möglich. Damit lassen sich Fragmente ab einer Länge von 50 bp anfärben. Kürzere DNA-Fragmente sind aufgrund der zu geringen DNA-Menge nicht mehr eindeutig darstellbar.


[Seite 36↓]

Die Silberfärbung wurde nach folgendem Standardprotokoll durchgeführt:

1.) Fixierung der DNA im Gel mit 10%igem Ethanol (ETOH) für mindestens 10 Minuten

2.) pH-Wert-Einstellung mit 1%iger HNO3-Lösung für mindestens 2 Minuten

3.) Färbung der Gele in 200 ml 2%iger AgNO3-Lösung unter Zugabe von 200 µl Formaldehyd für 20-30 Minuten (Anlagerung der Silberionen an die DNA)

4.) dreimaliges Waschen in Aqua dest. zum Entfernen der unspezifisch gebundenen Silberionen

5.) Entwicklung in insgesamt 600 ml 30%iger NaCO3-Lösung unter Zugabe von 300 µl Formaldehyd durch dreimaliges Wechseln der Lösung

6.) Fixierung der Gele in 10%iger Essigsäure für mindestens 10 Minuten

Anschließend wurden die Gele auf Whatman-Filterpapier aufgezogen und in einem Vakuumtrockner bei 80°C für 1,5 Stunden getrocknet, um sie für Dokumentationszwecke haltbar zu machen.

2.2.4.3 Klonierung von PCR-Fragmenten

Das in dieser Arbeit eingesetzte Sequenzierungsverfahren machte das Vorliegen des mutierten Allels im homozygoten Zustand notwendig. Hierfür wurden die zu sequenzierenden PCR-Fragmente in geeignete Vektoren kloniert. Zum Einsatz kam das TA TOPO Cloning Kit von Invitrogen (Niederlande). Dieses System macht sich die Eigenschaft der Taq-Polymerase zunutze, an das 3´-Ende des PCR-Produktes Desoxyadenoside (A) anzufügen. Der eingesetzte Vektor besitzt am 5´-Ende überhängende Desoxythymidine (T). Dadurch erfolgt die Ligation ohne weitere Enzyme bei Raumtemperatur [Shuman, 1994].

Als Vektor dient hierbei der "pCR 2.1-TOPO-Vektor". Die Klonierungsreaktion erfolgte analog den Herstellerangaben. Der Klonierungserfolg wurde anschließend mittels Insert-spezifischer PCR überprüft. Zusätzlich wurden unter Verwendung eines Polyacrylamidgels (Heteroduplex-Analyse) diejenigen Kolonien identifiziert, die jeweils nur das mutierte bzw. Wildtypallel enthielten.

Für die nachfolgenden Schritte wurde die Plasmid-DNA mit dem Quiagen Plasmid Mini Kit (Quiagen) isoliert. Dieses Verfahren basiert auf der Alkalischen Lyse-Methode von Birnboim und Doly [Birnboim, 1979], gefolgt durch die Bindung der Plasmid-DNA an den Anionenaustauscher Resin bei geeigneten niedrigen Salz- und pH-Bedingungen. Die Isolation [Seite 37↓]erfolgte nach Herstellerprotokoll. Anschließend wurden die Konzentrationen der Plasmid-DNA bei 260 und 280 nm photometrisch bestimmt.

2.2.4.4 Sequenzierung der DNA

Die DNA-Sequenzanalyse erfolgte analog dem Kettenabbruchverfahren nach Sanger et al. [Sanger, 1977] auf einem automatischen DNA-Sequenziergerät von Perkin Elmer (ABI Prism TM 377 DNA-Sequenzer). Bei dieser Methode werden als Sequenzier-Primer Oligonukleotide eingesetzt, die zu einem Bereich der Plasmid-DNA komplementär sind. In dieser Arbeit wurden der M13-Forwardprimer und T7-Reverseprimer (Tabelle 18) verwendet. Zusätzlich zu den Desoxyribonukleotiden (dNTP´s) werden auch Didesoxyribonukleotide (ddNTP´s) eingefügt, die nach ihrem Einbau durch die Polymerase zu einem Abbruch der Kettenverlängerung führen, da sie an Position 3 des Zuckerrestes ein H-Atom anstatt der üblichen OH-Gruppe besitzen. Dadurch ist eine Verlängerung des DNA-Stranges von Position 3 zum nächsten Nukleotid nicht mehr möglich. Zur späteren Unterscheidung der einzelnen Didesoxyribonukleotide sind diese durch unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe mit voneinander differierenden Emissions- und Absorptionsspektren markiert. Das Endprodukt dieser Sequenzierungs-PCR stellt somit eine Serie von Polynukleotiden dar, die der Summe aller möglichen Fragmente eines DNA-Segmentes entsprechen. Das 3´-Ende jedes Polynukleotids trägt dabei eine farbstoffmarkierte Base. Die Durchführung der Sequenzierungsreaktion erfolgte mittels "PRISM TM DNA Sequencing Kit Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction TM" nach Herstellerangaben im Thermocycler Perkin Elmer Gene Amp 9600.

Tab. 18: Spezifische Sequenzierungsprimer für den pCR 2.1-TOPO-Vektor

Primer

Primersequenz

Nukleotidposition

Annealingtemperatur

    

M 13F

5´-CAGGAAACAGCTATGAC-3´

205 -> 221

50 °C

    

T 7R

5´-TAATACGACTCACTATAGGG-3´

383 -> 364

50 °C

    


[Seite 38↓]

Der PCR-Ansatz setzte sich wie folgt zusammen:

Terminator Premix

4,0 µl (ddNTP´s, dNTP´s, Ampli Taq DNA-Polymerase mit temperaturstabiler Pyrophosphatase, MgCl2, Tris-HCl, pH 9.0)

Plasmid-DNA

600 ng

Sequenzierungsprimer

1,6 µl (3,2 pmol)

Aqua ad inject

bis zu einem Gesamtvolumen von 10 µl

Für den Plus- und den Minus-Strang des PCR-Produktes wurde jeweils ein getrennter Ansatz mit dem Vorwärts- respektive Rückwärtsprimer angefertigt.

Die Sequenzierungs-PCR erfolgte nach folgendem Standardprofil:

Denaturierung

96 °C

10 sec

 

Primer-Annealing

50 °C

10 sec

25 Zyklen

Primer-Elongation

60 °C

4 min

 

Nach der Sequenzierungs-PCR ist es notwendig, überschüssige ddNTP´s zu entfernen, die aufgrund ihrer floureszierenden Eigenschaft die automatische Sequenzanalyse verfälschen würden. Hierfür dienten Sephadex G50-Säulen (Pharmacia), die nach Herstellerangaben vorbereitet wurden.

Die in der PCR entstandenen Fragmente wurden auf einem mit 6 M Harnstoff versetztem 4,5 % denaturierendem Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt.

Zeitversetzt zur Auftrennung der Fragmente regt ein Laser die floureszenzmarkierten Basen zur Sekundärstrahlung an. Ein Photomultiplier verstärkt die entstehenden Lichtsignale und wandelt sie in ein elektrisches, digitales Signal um.

2.2.4.5 Direkte Sequenzierung des PCR-Produktes

Im Verlauf der Arbeit etablierte die beteiligte Arbeitsgruppe ein neues Verfahren zur Bestimmung der Nukleotidsequenz eines DNA-Fragmentes. Dies ermöglicht den direkten Einsatz des PCR-Produktes ohne vorherige Klonierung. Neben den fluoreszenzmarkierten


[Seite 39↓]

Didesoxynukleotiden (Dye Terminator-Methode) kommen hier sequenzspezifische Primer zur Anwendung. Dies ist mit einer erheblichen Zeit- und Kostenersparnis verbunden. Darüber hinaus ist die Erfolgsrate höher, da diese Methode unabhängig von klonierungsbedingten Störungen ist, wie z.B. fehlendem oder falschem Einbau in das Plasmid oder Verlust des Fragmentes während der Plasmidpräparation. Da die Vorteile überwiegen, wurden nach der Optimierung und Überprüfung der Methode mit bekannten Sequenzen und dem Vergleich zwischen altem und neuem Verfahren, einzelne Fragmente der 5`-UTR nach dieser neuen Methode sequenziert.

Hierfür wurde zunächst das PCR-Produkt mit Hilfe des QIAquick PCR Purification Kit (Quiagen) aufgereinigt, um störende Reaktionskomponenten wie z.B. dNTP`s und Primer, zu entfernen. Nach dieser Aufreinigung wurden 1-2 µl in die Sequenzierungs-PCR eingesetzt. Der weitere Ablauf erfolgt wie bereits unter 2.2.4.4. beschrieben.

2.2.4.6 Restriktionsfragment-Längen-Polymorphismus (RFLP)-Analyse

Eine sichere und schnelle Methode zur Genotypisierung einer bereits identifizierten Sequenzvariante ist die Restriktionsfragment-Längen-Polymorphismus(RFLP)-Analyse [Cooper, 1984]. Dieses Verfahren macht sich die Fähigkeit bestimmter bakterieller Enzyme zunutze, doppelsträngige DNA an spezifischen Erkennungssequenzen aus meist vier bis sechs Nukleotiden zu schneiden. Diese Sequenzen werden häufig durch eine Mutation zerstört oder neu gebildet. Je nach Vorhandensein der Mutation entstehen unterschiedliche Fragmentmuster.

Geeignete Restriktionsenzyme wurden mit dem Computerprogramm "Husar" des Deutschen Krebsforschungszentrums Heidelberg (DKFZ) über das Computernetzwerk "Internet" ausgewählt.

Der Restriktionsenzymverdau erfolgte analog den Herstellerangaben für das jeweilige Restriktionsenzym. Ein Ansatz besteht aus 1,5 µl eines Puffers (Zusammensetzung abhängig von Hersteller und Enzym), 5-10 U Enzym, 0,15 µl BSA (je nach Enzym) und Aqua ad inject. bis zu einem Gesamtvolumen von 8 µl. Diesem Gemisch wurden 7 µl PCR-Produkt hinzugegeben. Danach erfolgte der Enzymverdau im Wasserbad bei der jeweils enzymspezifischen Temperatur über Nacht (Tab. 19).

Anschließend wurde das Ergebnis auf einem 10%igen Polyacrylamidgel (49:1 Acrylamid: Bisacrylamid; 0,5x TBE) überprüft (siehe Kapitel 2.2.4.2.) Der Genotyp der untersuchten Personen wurde anhand der Größe der sich darstellenden Banden ausgewertet.


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Tab. 19: Charakteristika der für die RFLP eingesetzten Restriktionsendonuklease

Restriktionsenzym

Isolationsquelle

Erkennungssequenz und Schnittstelle

Temperatur

    

Ear I

Enterobacter aerogenes

5`...CTC T TC(N)1 ...3`

37 °C

  

3`...GAGAAG(N)4 ...5`

 
    

2.2.4.7 Amplification created Restriction Site-(ACRS-)Assay

Nicht jede Variante bildet oder zerstört eine Erkennungssequenz für eine Restriktionsendonuklease. In diesem Fall ist es möglich, durch sogenannte "mismatch"-Primer eine Restriktionsschnittstelle in das PCR-Amplifikat einzufügen [Haliassos, 1989; Eiken, 1991] (Abb.6). Diese künstliche Schnittstelle ist nur im Zusammenhang mit einer Mutation funktionell.

Abb. 6: Prinzip des ACRS-Assay. Darstellung anhand der Variante +274 G→A im Fragment "ct1exon3.2.". Die Sterne markieren die Position des "mismatch"; die Pfeile die Position der Variante.

Beim Design des Primers ist zu beachten, daß er direkt vor der mutierten Base endet und an der dritt- oder viertletzten Stelle vor dem 3´-Ende den "mismatch" enthält. An dieser Position beeinträchtigt die nicht-komplementäre Base die Amplifikation des PCR-Fragmentes in geringerem Umfang als bei der Lage direkt am 3´-Ende.

Die in dieser Arbeit verwendeten Primer sind in Tabelle 20 aufgelistet. Die PCR erfolgte nach den Bedingungen, die in Tabelle 21 dargestellt sind. Das entstandene PCR-Produkt wurde anschließend analog der RFLP-Analyse mit den in Tabelle 22 dargestellten Restriktionsenzymen untersucht.


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Tab. 20: Charakteristika der "mismatch"-Primer für den Artificial-Created-Restriction-Site(ACRS)-Assay.

Primer

Sequenz

Nukleotidposition

Fragmentgröße

Endonuklease

     

ct1 mod F

5´-CGGCTGCGGCTGGACTCG-3´

+256→ +273

171 bp

Taq I

ct1 mod R

3´-CGCGGCCAGCAAGGCCT-5´

+426→ +410

  
     

cta Mnl I

5´-GGGCCAAGGAATCCTGTCTCAAGAG-3´

-154→ -131

185 bp

Mnl I

ct1 gap6 R

3´-CTTACCCAGACTTCCCTCCC-5´

+30→ +11

  
     

Die Bezeichnung der Positionen erfolgte anhand der von Pennica et al. (1996) veröffentlichen Sequenz für die cDNA. und der im Rahmen dieser Arbeit ermittelten Sequenz der 5´-UTR des humanen Cardiotrophin-1 Gen. Als Position "+1" wurde das Startcodon (ATG) im Exon 1 definiert. Die hervorgehobene Base kennzeichnet den "mismatch"

Tab. 21: Reaktionsbedingungen der Primerpaare, die im ACRS-Assay eingesetzt wurden

Primer

Annealingtemperatur

PCR-Zusatz

Primermenge

DNA-Menge

     

ct1 mod F/R

43 °C

16 % DMSO

10 pmol

60 ng

     

ctaMnlI/ct1gap6R

58 °C

keine Zuätze

10 pmol

60 ng

     

Tab. 22: Restriktionsendonukleasen, die beim ACRS-Assay zum Einsatz kamen

Restriktionsenzym

Isolationsquelle

Erkennungssequenz und Schnittstelle

Temperatur

Reaktionszusatz

     

Taq I

Thermus aquaticus

5´...TCG A...3´

65 °C

BSA

  

3´...A GCT...5´

  
     

Mnl I

Moraxella nonliquefaciens

5´...GCTC(N)7 ...3´

37 °C

BSA

  

3´...GGAG(N)6 ...5´

  
     

BSA=Bovines Serumalbumin


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2.2.5  Quantifizierung der mRNA des humanen CT-1- Gens in Myokardbiopsien

Cardiotrophin-1 gehört zu den Genen, die hauptsächlich in der Embryonalphase exprimiert werden. Zur Zeit ist erst wenig darüber bekannt, unter welchen Bedingungen die Expression dieses Gens in späteren Lebensphasen reguliert wird.

Um das Ausmaß der Expression eines Gens zu bestimmen, läßt sich die mRNA aus den zu untersuchenden Geweben isolieren, mittels RT-PCR vervielfältigen und die Endmenge der PCR-Produkte durch geeignete Methoden quantifizieren. In dieser Arbeit wurde eine semiquantitative, nicht-radioaktive Methode angewandt, da zum Zeitpunkt der Untersuchung spezifischere quantitative, intern standardisierte Methoden in der Arbeitsgruppe noch nicht etabliert waren. Bei der hier verwendeten Methode handelt es sich um die High-Pressure-Liquid-Chromatography (HPLC, Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie).

Da die Effektivität der PCR von vielen Faktoren beeinflußt wird, die zu starken Schwankungen der Produktmenge führen können, ist es notwendig, einen Standard einzusetzen. Dazu eignen sich Gene, die in konstanten Mengen unabhängig von äußeren Faktoren exprimiert werden (sogenannte housekeeping-Gene). Etabliert haben sich dafür die Gene der Pyruvat-Dehydrogenase (PDH) und Glycerinaldehyd-3-phosphat (GAPDH). Da von dem letzteren Gen sogenannte Pseudogene (Intron-lose kodierende Sequenzen) bekannt sind, die sich auch auf DNA-Ebene amplifizieren lassen, wurde in dieser Arbeit das PDH-Gen zur externen Standardisierung eingesetzt. Auf eine interne Standardisierung wurde trotz der höheren Genauigkeit verzichtet, da die hier gewünschte semiquantitative Analyse in einer kleinen Patientengruppe den Arbeitsaufwand zur Herstellung eines internen Standards nicht rechtfertigte.

Da die Polymerase-Kettenreaktion einer exponentiellen Funktion folgt, muß vor der Quantifizierung für jedes Gen und jede Probenart bestimmt werden, bei welcher Zykluszahl das Plateau erreicht wird. Die anschließende Quantifizierung erfolgt dann im ansteigenden Bereich, da in dieser Phase eine annähernd lineare Zunahme des PCR-Produktes vorliegt.


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2.2.5.1  RNA-Isolierung aus Myokardbiopsien

Bei dem Umgang mit RNA besteht jederzeit die Gefahr, daß die RNA durch zytoplasmatische, kontaminierende oder ubiquitär vorkommende Ribonukleasen (RNasen) gespalten und abgebaut wird. Aus diesem Grunde wurden alle Arbeitsschritte der RNA-Isolierung auf Eis ausgeführt. Zusätzlich wurden eventuell vorhandene Nukleasen durch Behandlung aller eingesetzten Materialien mit 0,1% DEPC (Diethylpyrocarbonat) inaktiviert.

Die menschliche RNA wurde aus Endomyokardbiopsien des rechten Ventrikels gewonnen, sofort in flüssigen Stickstoff überführt und bis zur Weiterverarbeitung bei -80°C gelagert. Die Isolierung erfolgte mit Trizol-Reagenz nach einem Standardprotokoll.

Für die anschließende Ermittlung der RNA-Konzentration wurde die Optische Dichte (OD) bei 260 und 280 nm Wellenlänge photometrisch bestimmt und die Konzentration mit der folgenden Formel berechnet:

c µg/ml = Extinktion 260 nm x Verdünnung x F (40 für RNA)

Der dabei erhaltene Wert sollte >0,1 bzw. <1,0 sein.

Zusätzlich zur Konzentrationsbestimmung diente die OD-Messung auch zur Beurteilung möglicher Proteinkontaminationen durch die Berechnung des Reinheitskoeffizienten:

E260 : E 280

Dieser sollte zwischen 1,7 und 2,0 liegen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 6 wiedergegeben.

2.2.5.2 Reverse Transkription (RT)

Da RNA mit der ursprünglichen PCR-Methode nicht amplifizierbar ist, wurde die Methode der Reversen Transkription entwickelt, bei der ausgehend vom RNA-Strang die komplementäre DNA (cDNA) synthetisiert wird, die dann als Ausgangsmaterial für die PCR dient. Hierbei wird die Reverse Transkriptase, ein Enzym aus Retroviren (RNA-Viren), eingesetzt.

Für diese Reaktion wurden 500 ng RNA mit DEPC-H2O auf ein Gesamtvolumen von 10 µl aufgefüllt. Als Primer für die Reverse Transkriptase dienten Oligonukleotid-Hexamere unterschiedlicher Sequenz (Random-Primer, 300ng/µl, Gibco BRL), von denen 2µl eingesetzt wurden. Dieses Gemisch wurde bei 70 °C für 10 Minuten inkubiert (Annealing der Primer). Anschließend erfolgte die sofortige Weiterbearbeitung der Proben bei 50 °C.

Der Mastermix für die weitere Transkription bestand aus 4 µl First-Strand-Buffer ( 250 mM tris-HCl, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2), 2 µl DTT, 1µl 10 mM dNTP´s, 0,2 µl RNAsin, 1 µl Reverse [Seite 44↓]Transkriptase (SuperScriptII, GibcoBRL, 200 U/µl) und DEPC-H2O bis zu einem Gesamtvolumen von 9 µl. Die Herstellung dieses Gemisches erfolgte bei 42 °C.

Nach einer 10minütigen Inkubation wurden 9 µl des Mastermixes zum ersten Ansatz hinzugegeben, dieses Gemisch bei 50 °C für weitere 50 Minuten inkubiert und anschließend das Enzym bei 95 °C für 5 Minuten inaktiviert.

Das Vorwärmen des Mastermixes und das Aufbewahren der Proben bei 50 °C war aufgrund der ausgeprägten Sekundärstrukturbildung der CT-1 mRNA notwendig. Es konnte nachgewiesen werden, daß sich dabei eine höhere Ausbeute an RNA ergab.

Anschließend an die RT erfolgte das Verdünnen der Produkte auf eine Endkonzentration von 5 ng/µl.

2.2.5.3 Polymerase Kettenreaktion der cDNA

Zur mRNA-Quantifizierung sollten Intron-überspannende Primer bevorzugt werden, da dadurch keine Amplifikation möglicher DNA-Kontaminationen erfolgt. Für den Ausschluß einer Amplifikation von Intron-losen Pseudogenen sollten alle Proben nach der RNA-Isolation mit einer DNAse verdaut werden, um mögliche DNA-Kontaminationen abzubauen. Die Ausbeute der in dieser Arbeit analysierten Gewebeproben war zu gering, um dieses Verfahren anzuwenden, bei dem hohe RNA-Verluste auftreten. Um trotzdem eine Amplifikation auf DNA-Ebene auszuschließen, wurde von jeder Probe das Produkt der RNA-Isolation in die PCR eingesetzt, ohne diese vorher revers zu transkribieren.

Die Auswahl des Primer-Paares erfolgte ebenfalls mit dem Computerprogramm "Husar". Das dabei gewählte Primer-Paar beginnt im Exon 1 und endet nach dem Exon 3 innerhalb der 3´-flankierenden Region, die noch in mRNA umgesetzt wird. Es entstand ein Fragment mit einer Länge von 310 bp.

ct1 cDNA Vorwärts-Primer

5´-CCGGAGGGAGGGAAGTCTGGA-3´

Tm=70°C

ct1 cDNA Rückwärts-Primer

3´-ACACACTGCGTCCAGCAGCG-5´

Tm=66°C

PDH-Primer:

Vorwärts

5´-TGCTTGGAGAAGAAGTTGCC-3´

Rückwärts

3´-AGGTCACTGTTACCCCCAGA-5´


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Die Amplifikation der cDNA erfolgte nach der Hot Start Methode, bei der die Primer erst bei 95°C mit dem Template und dem Enzym in Kontakt kommen. Dadurch wird die Synthese unspezifischer Nebenprodukte bereits bei niedrigeren Temperaturen verhindert.

Zuerst wurde das Primergemisches (je 8 pmol) vorgelegt und anschließend mit Wachs überschichtet. Danach erfolgte die Herstellung des Mastermixes, der sich aus 2,5 µl PCR-Puffer, 0,75 µl MgCl2, 4 µl dNTP´s (200 µmol) und 0,2 µl Taq-Polymerase (5U/µl) zusammensetzte und mit Aqua ad inject. auf eine Gesamtmenge von 10 µl je Ansatz aufgefüllt wurde. Aufgrund der bereits erwähnten Sekundärstrukturbildung der CT-1 cDNA wurden außerdem 1,75 µl DMSO (entspricht 7%) jedem Ansatz für die Amplifikation des CT-1-Fragmentes hinzugefügt.

Der Reaktionsansatz (10 µl) wurde dann auf den ausgehärteten Wachs pipettiert. Anschließend erfolgte die Zugabe von 10 µl (=50 ng) cDNA; 10 µl (50 ng) DNA (positiv-Kontrolle) oder 10 µl Aqua ad inject. (negativ-Kontrolle). Die Amplifikation von CT-1 erfolgte für jede Probe im Doppelansatz. Für jede Probe wurde außerdem das PDH-Gen parallel amplifiziert. Zur Kontrolle auf eine mögliche Amplifikation von CT-1 auf DNA-Ebene, wurden 50 ng der nicht-umgeschriebenen RNA je Probe im gleichen Ansatz amplifiziert.

Die PCR erfolgte anschließend nach folgendem Profil:

A

initiale Denaturierung

96 °C

5 min.

 
     
 

Denaturierung

96 °C

45 sec.

 

B

Primer-Annealing

60 °C

60 sec.

34 Zyklen CT-1

 

Elongation

72 °C

45 sec.

30 Zyklen PDH

     

C

terminale Elongation

72 °C

5 min.

 


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Abb. 7: Graphische Darstellung der HPLC-Daten des Plateauversuches für CT-1. Da die Amplifizierung der PCR-Produkte einer exponentiellen Funktion folgt, wurden die Daten logarhythmisch aufgetragen. Es ist zu erkennen, daß bei einer Zyklenzahl von 30 die Vervielfältigung der Proben noch sicher im linear ansteigenden Bereich liegt. Das Plateau beginnt bei einer Zyklenzahl von ca. 36.

2.2.5.4 High-Pressure-Liquid-Chromatography (HPLC, Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie)

Mit dieser Form der Chromatographie lassen sich PCR-Fragmente nicht-radioaktiv quantitativ mit einer hohen Sensitivität bestimmen.

Für die Quantifizierung wurde das verdünnte PCR-Produkt in die HPLC eingepritzt und die DNA an eine DEAE (Diethylaminoethyl)-Säule (Gynotek, 3,5x0,46cm, Perkin Elmer) gebunden. Die Trennung erfolgte dabei nach dem Prinzip der Ionenaustausch-Chromatographie, wobei es sich hier um einen Anionenaustauscher handelt. Die PCR-Fragmente wurden anschließend durch einen mehrstufig ansteigenden Natriumchloridgradienten von der Säule eluiert. Dieser Gradient wird durch eine unterschiedliche Mischung der beiden Eluenten A und B erreicht:

Eluent A : 25 mM (3,03 g/l) Trizma Base pH 9,0

Eluent B : 25 mM (3,03 g/l) Trizma Base, 1 M (58,4 g/l) NaCl pH 9,0

Die Laufbedingungen wurden wie folgt definiert: Flußrate 1ml/min, Gradient von 75% Eluent A+25 % Eluent B zu 100% Eluent B nach 15 min.


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Anschließend erfolgte die photometrische Messung der Amplifikate bei einer Wellenlänge von 260 nm (Spektral-Photometer SP4, Gynotek, Perkin Elmer) und die Integration der Extinktion zu entsprechenden Flächen mittels Integrator-Software (Nelson Analytical Inc., USA).

In die Auswertung können die Flächen bzw. die Höhen der entstehenden Amplituden einbezogen werden. In dieser Arbeit wurde die Höhe verwendet, da bei einem Teil der Proben doppelgipflige Amplituden auftraten. In diesem Falle würde die Verwendung der Flächen zu einer Verfälschung der Werte führen.

2.2.5.5 Statistik

Sofern nicht gesondert gekennzeichnet, sind alle Werte als Mittelwerte (MW) und Standardabweichung (SD) angegeben. Differenzen zwischen Gruppen wurden mit dem Student-t-Test untersucht (Software: MS Excel 9.0/2000 mit ANOVA Statistikfunktion, StatView 4.5 ). Differenzen mit p≤0,05 wurden als statistisch signifikant akzeptiert. Die Ermittlung der Korrelationskoeffizienten erfolgte nach Pearson. Unterschiede zwischen beobachteten Allelfrequenzen wurden unter Verwendung des Chi-Quadrat-Test (mit Yates-Korrektur) analysiert.


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03.06.2004