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3  Ergebnisse

3.1 Charakterisierung der 5´-untranslatierten Region des humanen Cardiotrophin-1 Gens

3.1.1 Sequenz des 1113 bp langen 5´-flankierenden Bereichs des humanen CT-1 Gens und mögliche Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen

Nach dem im Kapitel 2.2.2 dargestellen Prinzip konnte aus der mit Ssp I geschnittenen DNA-Bibliothek ein PCR-Fragment von circa 1.1 kb isoliert werden.

Die Länge von etwa 1100 bp überschritt die Lesekapazitäten des DNA-Sequenziergerätes. Nach der Sequenzierung des Fragmentes in beide Richtungen blieb die Basenpaarfolge eines ca. 400 bp langen zentralen Fragmentes unbekannt. Aus diesem Grunde wurde anhand der bereits erhaltenen Sequenzdaten ein Primerpaar generiert, mit dessen Hilfe sich dieser Abschnitt amplifizieren und die Sequenz vervollständigen ließ.

Tab. 23: Primerpaar für die Amplifikation und Sequenzierung des zentralen Segmentes der 1.1 kb langen
5´-UTR des humanen Cardiotrophin-1 Gens

Primer

Sequenz

Nukleotidposition

Fragmentlänge

Annealingtemp.

     

Gap F

5´-TCATTCACAAACCCCATTAGC-3´

-771→ -751

  
     

Gap R

3´-GCATCCCAATGTTCTGCC-5´

-267→ -284

505 bp

58 °C

     

Nach mehrmaliger Sequenzierung und Vergleich aller erhaltener Daten konnte die in Abbildung 3.4. dargestellte Sequenz für die ca. 1.1 kb lange 5´-flankierende Region des humanen Cardiotrophin-1 Gens ermittelt werden.

Mit Hilfe der Transkriptionsfaktor-Datenbank TRANSFAC (Heidelberg) ist es möglich, DNA-Sequenzen bezüglich möglicher Erkennungssequenzen für Transkriptionsfaktoren anhand der bereits bekannten und bestätigten Konsensussequenzen zu untersuchen [Wingender, 1997]. Die Analyse ergab für die in dieser Arbeit ermittelte Sequenz mehrere potentielle cis-aktive Elemente.


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Innerhalb des 5´-flankierenden Bereichs des CT-1 Gens befinden sich zwei CAAT-Boxen an den Positionen -1043 und -1076, wobei die letztere gleichzeitig eine C/EBPbeta-Bindungsstelle darstellt. An der Position -984 besteht eine potentielle STAT-Bindungsstelle. Außerdem ergab der Vergleich mit den Datenbanken eine mögliche SP1-Erkennungssequenz an der Position -582. Zusätzlich dazu konnten insgesamt 9 AP-2-Bindungsstellen identifiziert werden, die sich an den Positionen -716, -438, -266, -251, -248, -207, -181, -73 und -72 befinden. Ebenfalls vorhanden ist ein sogenanntes "cAMP responsives Element" (CRE), das an der Position -639 lokalisiert ist. Die Position -484 stellt außerdem eine Bindungsstelle für GATA-bindende Faktoren dar. An Position -619 befindet sich eine mögliche AP-1-Bindungsstelle.Die hier identifizierte Sequenz des mutmaßlichen CT-1-Promotors enthält keine TATA-Box, die sich in den meisten eukarioten Genen ca. 25 bp stromaufwärts des Startcodons befindet.Alle erwähnten Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen sind in der Abbildung 8 gekennzeichnet.


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Abb. 8: Sequenz der 5´-untranslatierten Region des humanen Cardiotrophin-Gens. Unterstrichen sind die zur Herstellung der Deletionsfragmente eingesetzten Primer (CT1F-CT6F und CT1ex1R). Die Numerierung erfolgte ausgehend vom ATG-Startcodon im Exon 1. Konsensussequenzen für Transkriptionsfaktorbindungsstellen (entsprechend der TRANSFAC-Analyse) sind durch den jeweiligen Faktor markiert. Die Sequenz wurde in der EMBL-Datenbank mit der Zugangsnummer AJ002743 registriert.


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3.2  Promotor-Aktivität der 5´-untranslatierten Region des humanen Cardiotrophin-1 Gens

Für den Nachweis einer möglichen Promotoraktivität der hier sequenzierten 1.1 kb langen 5´-flankierenden Sequenz wurden sechs 5´-terminal deletierte Fragmente mit den in der Tab. 24 dargestellten Positionen und Längen konstruiert.

Tab. 24: 5´-terminal deletierte Fragmente für die Funktionsanalyse der 5´-UTR des humanen CT-1 Gens

Fragment

Positionen

Länge

   

CT 1

-1091 → +39

1173 bp

CT 2

-947 → +39

1029 bp

CT 3

-739 → +39

821 bp

CT 4

-557 → +39

639 bp

CT 5

-377 → +39

459 bp

CT 6

-218 → +39

300 bp

   

Im Vergleich zum promotorlosen Kontrollvektor pGL3-Basic wiesen alle untersuchten Konstrukte eine signifikante Promotoraktivität in COS-7-Zellen auf (n=3, p<0,05). Hierbei zeigten der Abschnitt von +39 bis -218 (=CT6) sowie von +39 bis –739 (CT3) die höchste Aktivität.

Die Konstrukte CT5 und CT1 weisen verminderte Aktivitäten auf. Dies legt die Vermutung nahe, daß die Bereiche zwischen –1091 bis –739 sowie zwischen –739 und –218 die CT-1 Expression supprimieren könnten (Tab. 25, Abb. 9).


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Tab. 25: Ergebnisse der Luciferase-Aktivitätsmessung (n=3) nach der Normalisierung mit den entsprechenden ß-Galaktosidase-aktivitäten

Kon
strukt

Versuch Nr: 1

Versuch Nr: 2

Versuch Nr: 3

Mittelwert

Standard
abweichung

in Prozent

p

        

CT 1

17,7

22,5

29,0

23,1

4,6

20

0.02

CT 2

17,1

29,3

28,7

25,0

5,6

22

0,03

CT 3

29,0

32,1

36,0

32,4

2,9

9

0,01

CT 4

22,0

29,0

26,0

25,7

2,9

11

0,01

CT 5

21,4

25,5

24,6

23,8

1,8

7

0,01

CT 6

29,6

37,0

35,3

34,0

3,2

9

0,01

        

pGL3

1,0

1,0

1,0

1,0

0

0

 
        

Abb. 9: Basale Promotoraktivität der sechs 5´-terminalen Deletionsfragmente. COS-7-Zellen wurden mit Konstrukten transfiziert, die Fragmente der 5´-flankierenden Region des humanen CT-1-Gens (quergestreifte Boxen) enthielten. Diese wurden in die „upstream“-Region des Luciferase-Gens (offene Box) integriert. Die mittlere relative Luciferaseaktivität (Balkendiagramm rechts) wurde durch mindestens drei Transfektionen bestimmt und im Vergleich zur β-Galaktosidaseaktivität normalisiert. Alle Daten werden in Relation zum pGL3basic-Vektor (Aktivität =1) dargestellt.


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3.3  Varianten in der kodierenden Region des humanen Cardiotrophin-1 Gens

Insgesamt wurden 898 bp der kodierenden Region des humanen Cardiotrophin-1 Gens einschließlich der Exon-Intron-Übergänge mittels PCR-/SSCP-Analyse untersucht. Dazu wurde dieser Genbereich in 6 Fragmente unterteilt, von denen die Fragmente "ct1exon1" und "ct1exon2" jeweils das gesamte Exon 1 respektive Exon 2 umschließen. Bei den übrigen 4 Fragmenten handelt es sich um überlappende Bereiche des Exon 3 einschließlich der Exon-Intron-Übergänge (Abb. 10). Durch diese Analyse ließ sich eine seltene Variante identifizieren.

Nachfolgend wird diese bezüglich ihrer Lage, der Veränderung der Gensequenz, der Verfahrensweise bei der Genotypisierung und der Häufigkeit ihres Auftretens im untersuchten Patientenkollektiv beschrieben.

Abb. 10: Aufbau des humanen Cardiotrophin-1-Gens. Es handelt sich um eine nicht-maßstabgerechte Darstellung. Die Größe der Introns ist unbekannt. Schematisch dargestellt ist außerdem die ungefähre Lage der PCR-Fragmente.

3.3.1 Variante an der Position +274 im Codon 92

Die SSCP-Analyse des Fragmentes "ct1exon 3.2." wies ein variantes Laufverhalten bei Raumtemperatur und 4°C auf, das insgesamt bei zwei Patienten nachweisbar war. Die Charakterisierung dieser Variante ergab einen Einzelbasenaustausch G→ A an der Position +274. Da diese Veränderung der DNA-Sequenz weder eine bestehende Erkennungssequenz eines Restriktionsenzyms zerstört noch eine neue bildet, wurde für den weiteren Nachweis und die Genotypisierung aller untersuchten Patienten ein ACRS-Assay (Amplification Created Restriction Site-Assay) notwendig. Hierfür wurde mit Hilfe des "mismatch"-Primers "ct1modF" (Tab. 20 bis 22) an der Position +271 eine zusätzliche Variante (G→T) so eingefügt, daß bei Vorhandensein der Mutation eine Restriktionsstelle für die Endonuklease TaqI gebildet wird. Als [Seite 54↓]Rückwärts-Primer diente der neu synthetisierte Primer "ct1 mod R". Dadurch entstand ein PCR-Fragment von 171 bp Länge.

Das Wildtyp-Allel wird vom Enzym nicht geschnitten. Im Polyacrylamid-Gel stellt sich daher nur eine Bande von 171 bp dar. Beim Vorliegen des mutierten Allels wird das PCR-Produkt in zwei Fragmente von 156 bp und 15 bp geschnitten. Aufgrund der Kürze des letzteren Fragmentes und der daraus resultierenden geringen DNA-Menge läßt sich dieses nicht in der Gelelektrophorese darstellen. Daraus folgt, daß Patienten, die heterozygot für die Mutation sind, zwei Banden von 171 bzw. 156 bp aufweisen. Homozygote Patienten würden nur eine Bande von 156 bp besitzen.

Durch die Genotypisierung aller Patienten konnte die Mutation bei jeweils einem Patienten mit Dilatativer Kardiomyopathie respektive Hypertropher Kardiomyopathie bestätigt werden. Bei beiden Personen lag die heterozygote Form vor. Keine der Kontrollpersonen wies diese Variante auf.

Durch die Basenpaarsubstitution im Codon 92 kommt es zu einer Veränderung des Triplettcodes durch die im transkribierten Protein ein Aminosäureaustausch von Alanin zu Threonin erfolgt.

Abb. 11: A) Darstellung des aberranten Laufverhaltens des HCM-Patienten mit der G274A-Mutation im Codon 92 in der SSCP bei 4°C. Es zeigten sich zwei zusätzliche Banden (Pfeile). Spur 1: Marker, Spuren 2-11: Patienten mit gleichem Laufverhalten (Wildtyp), Spur 12: HCM-Patient mit abweichendem Muster B) RFLP mit Taq I.Spur 1: DCM-Patient mit Mutation, Spur 2: HCM-Patient mit Mutation, Spuren 3-7: Patienten mit Wildtyp, Spuren 8+9: Marker. Zu erkennen sind zwei Banden (entsprechend 171 und 156 bp, Pfeile) bei beiden Mutationsträgern (heterozygot). Alle übrigen Patienten weisen wie erwartet nur eine Bande bei 171 bp auf.


[Seite 55↓]

Tab. 26: Klinische und funktionelle Parameter der Patienten mit der G274A-Mutation im Codon 92 des humanen CT-1-Gens

 

Patient 1

Patient 2

   

Geschlecht

männlich

männlich

 

  

Alter (Jahre)

52

67

 

  

Hauptdiagnose

DCM

HOCM

 

  

Nebendiagnosen

Nierenarterienstenose li., Adipositas, Hyperurikämie, Hyperlipoproteinämie

Hyperlipoproteinämie, kompensierte Niereninsuffizienz

 

  

Klinik/Verlauf

Rhythmusstörungen LOWN V, rezidivierende Dekompensationen, NYHA III-IV

Vorhofflimmern, Z.n. Septalastembolisation, intraventrikulärer Gradient von 100 mmHg, AV-Block I°, NYHA II-III

 

  

Familienanamnese

negativ

negativ (Kinder untersucht)

 

  

LVEF

20-40 % (rezidiv. Dekomp.)

65 %

 

  

Septumdicke (mm)

12

21

 

  

LVEDD (mm)

83-55 (rezidiv. Dekomp.)

45

 

  

3.4 Varianten innerhalb der 5´-flankierenden Region des humanen Cardiotrophin-1 Gens

Die im Rahmen dieser Arbeit mit Hilfe des Genome Walker Kits ermittelte Sequenz für den 5´-flankierenden Bereich des humanen Cardiotrophin-1 Gens diente als Grundlage für die systematische PCR-SSCP-Analyse dieser Region hinsichtlich möglicher Varianten. Dazu wurden 1071 bp mittels 7 überlappender PCR-Fragmente (ct1Prom1, ct1rep, ct1gap2, ct1gap3, ct1gap4, ct1gap5, ct1gap6) untersucht.

Es konnte ein Polymorphismus detektiert werden, der nachfolgend bezüglich seiner Charakteristika beschrieben wird.


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3.4.1  Polymorphismus an der Position -130

Die SSCP-Analyse ergab für das Fragment "ct1gap6" ein abweichendes Laufverhalten bei 4°C. Durch die anschließende Sequenzierung konnte ein Basenaustausch von G→ T an der Position -130 bestätigt werden. Auch hier war die Anwendung eines ACRS-Assays notwendig. Dazu wurde ein Vorwärts-Primer "ctaMnlI" (Tab. 20) synthetisiert, durch den zwischen den Positionen -132 und -133 ein zusätzliches G inseriert wird. Im komplementären Strang resultiert daraus ein C, wodurch eine dritte Schnittstelle für das Restriktionsenzym Mnl I (5´-CCTC(N)7 ...3´) vervollständigt wird. Bei Vorliegen der Mutation ist diese Erkennungssequenz zerstört, da durch die Substitution G→T das zweite C durch ein A ersetzt wird. Daraus resultiert, daß die Wildtyp-DNA in 4 Fragmente von 15, 29, 37 und 104 bp geschnitten wird, wobei nur das Längste im Gel sichtbar ist. Das mutierte Allel wiederum besitzt nur zwei Schnittstellen, so daß nach dem Restriktionsverdau Fragmente mit den Längen 29, 37 und 119 bp vorliegen. Heterozygote Patienten weisen demzufolge zwei Banden der Längen 104 und 119 bp auf.

Innerhalb des ursprünglichen Patientenkollektivs zeigte sich eine Tendenz zu einem höheren Vorkommen innerhalb der DCM-Gruppe. Daher wurde die Gruppe der Patienten mit Dilatativer Kardiomyopathie auf 201 und die der Kontrollpersonen auf 217 erhöht. Insgesamt zeigte die Genotypisierung das Vorliegen dieser Variante in 10 DCM-Patienten (Allelfrequenz: 2,5 %), 1 HCM-Patient (0,9 %, n=53) und 3 Kontrollpersonen (0,7 %). Bei jedem dieser Patienten lag die heterozygote Form vor (Tab. 27). Es konnten somit keine homozygoten Patienten identifiziert werden. Dies könnte einerseits an dem insgesamt seltenen Auftreten der Variante (1,49 % im Gesamtkollektiv) oder andererseits an einem Ungleichgewicht der Genotypfrequenzen liegen. Ursache hierfür könnte eine erhöhte Letalität homozygoter Merkmalsträger sein. Diese Theorie läßt sich mit dem Hardy-Weinberggesetz überprüfen. Bei Vorliegen zweier Allele A und B mit den Allelfrequenzen p und q in einer idealen Population (freie Partnerwahl; keine Selektion oder Migration) gilt:

p+q=1 (100%)

Hardy und Weinberg beschrieben 1908 unabhängig voneinander eine feste Beziehung zwischen zwischen den Allel- und Genotypfrequenzen als:

p2+2pq+q2=1 (Hardy-Weinberg-Gesetz).


[Seite 57↓]

Die in dieser Arbeit beobachteten Genotyphäufigkeiten innerhalb der einzelnen Patientengruppen zeigten keine signifikanten Abweichungen zu den erwarteten Frequenzen (Tab. 27). Das insgesamt seltene Vorkommen der Variante ist somit die Ursache für die fehlende Identifizierung homozygoter Patienten. Es müßten insgesamt 4505 Personen genetisch untersucht werden, um eine Person zu finden, die homozygot für den beschriebenen Polymorphismus ist.

Ein Vergleich der Allelfrequenzen zeigt eine Tendenz zum häufigeren Auftreten des Polymorphismus in der Gruppe der DCM-Patienten. Die statistische Analyse nach dem Chi-Quadrat-Test für alle drei Gruppen gemeinsam ergab, daß dieser Unterschied nicht auf dem Niveau von p=0,05 signifikant ist. Der direkte Vergleich der DCM-Patienten mit den Kontrollen zeigte ebenfalls keinen signifikanten Unterschied (Tabellen 28, 29).

Tab. 27: Gegenüberstellung der nach dem Hardy-Weinberg-Gesetz erwarteten und in dieser Arbeit beobachteten Genotypfrequenzen für den identifizierten Polymorphismus (G->T). GG=Wildtyp, GT=Heterozygot, TT=Homozygot für Variante. Der Chi-Quadrat-Test zeigt keinen signifikanten Unterschied.

 

GG

GT

TT

Χ 2

p

 

erwartet

beobachtet

erwartet

beobachtet

erwartet

beobachtet

  
         

DCM

191,08

191

9,8

10

0.13

0

0,005

0,94

 

        

HCM

52

52

0,98

1

0,005

0

0,001

0,97

 

        

Kontrollen

213,97

214

3,02

3

0,01

0

0,002

0,97

         

Tab. 28: Chi-Quadrat-Test des Unterschieds der Allelfrequenzen aller drei Gruppen (DCM, HCM und Kontrollen) für die Basenpaarsubstitution G zu T an Position –130 der 5´-UTR (2 Freiheitsgrade).

 

DCM

Kontrollen

HCM

    

Allel 1 (-130G)

392 (97,5)

431 (99,3)

105 (99,1)

 

   

Allel 2 (-130T)

10 (2,5)

3 (0,7)

1 (0,9)

 

   

CHI-Quadrat

  

4,8

p

  

0,09

(in Klammern: Angaben in Prozent).


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Tab. 29: Chi-Quadrat-Test zum Vergleich der Allelfrequenzen der DCM-Patienten und Kontrollen
(1 Freiheitsgrad, Yates-Korrektur).

 

DCM

Kontrollen

   

Allel 1 (-130G)

392 (97,5)

431 (99,3)

 

  

Allel 2 (-130T)

10 (2,5)

3 (0,7)

 

  

CHI-Quadrat

 

3,3

p

 

0,07

Abb. 12: A) SSCP-Gel mit Darstellung des aberranten Laufmusters bei drei Patienten (Spuren 3, 6 und 8) mit dem G zu T-Austausch an der Position –130 im Promotorfragment „ct1gap6“, Spur 1: Marker, Spuren 2,4,5,7,9,10: Patienten mit Wildtyp. B) Restriktionsverdau mit MnlI. Es zeigen sich zwei Banden (entsprechend 104und 119 bp) bei einem heterozygoten Patienten mit dem Polymorphismus (Spur 4). Im Vergleich dazu weisen Patienten mit dem Wildtyp nur eine Bande mit 119 bp auf (Spuren 1,2,5,6)

In den folgenden Tabellen sind klinische Daten der Patienten dargestellt, die den Polymorphismus im Promotor des humanen CT-1-Gens aufweisen. Die Symptome, echokardiographischen Parameter sowie die erhobenen histologischen Charakteristika entsprechen im Wesentlichen dem typischen Verlauf dieser Erkrankungen. Auffällig ist allerdings, daß es sich bei allen DCM-Patienten vermutlich um eine sekundäre Form der Erkrankung handelt: 4 Patienten haben in der Anamnese einen Hinweis auf eine Myokarditis, von 3 Patienten wird ein Alkoholmißbrauch berichtet und bei den übrigen drei Patienten konnten Antikörper gegen den β-1-Rezeptor nachgewiesen werden. Der Patient mit der Hypertrophen Kardiomyopathie weist zusätzlich eine Insertion von 2 Basenpaaren im Myosin-Bindungsprotein auf, die zu einem vorzeitigen Abbruch der Proteinsynthese führt.


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Tab. 30: Anamnestische und klinische Daten aller Patienten, bei denen der Polymorphismus im Promotor nachgewiesen werden konnte.

DNA-Nummer

Alter (Jahre)

Geschlecht

Diagnose

NYHA

mögliche Ursachen

FA

Nebendiagnosen

Biopsie

117

56

M

DCM, EF 22%, VF seit ´93, Z.n. Kardioversion, ICD 2/2000

II

Beta1-AK, keine KHE, kein C2-Abusus

negativ

Z.n. Apoplex ´94, Schlaf-Apnoe

95: kein Myokarditishinweis, mäßige Hypertrophie, keine Fibrose 2000: starke Hypertrophie, starke Fibrose, Z.n. Myokarditis mit schweren myokardialen Folgeschäden

240

48

M

DCM,(ED 93), EF 21%, rezidivierende HRST bis Lown IVb, pHT, rezidivierende Dekompesationen

k.A.

Z.n. Myokarditis 1990

k.A.

aHTN, NI komp. Ret., Hyperurikämie, Chondrodysplasie li. Arm, steroidind. Osteoporose

 k.A.

354

50

M

DCM (ED 82), EF 13 %, keine HRST, pHT, chronische Lungenstauung, rezidivierende Dekompensationen

III bis IV

chron. C2-Abusus, 27 J Uranabbau, kein KHE

k.A.

aHTN, NI kompensierte Retention, HLP, Hyperurikämie, Adipositas per magna

 k.A.

359

55

M

DCM (ED Mitte 80), EF <30%, TAA bei VF, VT, ICD 5/94, rezidvierende Dekompensationen

II bis III

Z.n. Myokarditis , kein C2-Abusus

negativ

aHTN, pHT,

87:mäßige Hypertrophie, deutliche Fibrose, Lymphozyteninfiltrat, Z.n. Myokarditis mit geringer Restaktivität

376

66

W

DCM (ED 93), EF 32 %, Lown IVa, 2/2000 DDD-SM bei AVB 3°

III

ev. Myokarditis, keine KHE

k.A.

pHT, Colitis ulcerosa 4/90

93: leichte bis mittlere Hypertrophie., geringe Fibrose, vermehrt freie Zellen

391

59

M

DCM (ED 90), EF ca.20%, Lown IVb

II bis III

beta1-AK

k.A.

Scharlach als Kind, schwere Grippe 86, Adipositas per magna, Hyperurikämie

 k.A.

448

49

M

DCM (ED 96), EF ca. 15%, progrediente Dyspnoe seit 90, LSB

II

Z.n. Myokarditis 1973, beta1-AK

k.A.

Hyperurikämie, Diabetes mellitus II

 k.A.

543

49

M

DCM (ED 91), EF 20 %, AVB °, inkompletter RSB/LSB, Z.n. Dekompensationen, 97: biventrikuläres Assist-Device, Tod 12/97

II bis III

C2-Abusus

negativ

pHT

Obduktion 97: Myozyten fleckförmig, unregelmäßige bizarre Kerne, feinnetzige Fibrose, C2-toxische DCM

916

46

M

DCM (ED 96), EF 20%, rezidivierende Dekompensationen, Tod 6/98 akute Dekompensation

III

C2-Abusus

negativ

Diabetes mellitus, pHT, persistierendes Foramen ovale, Hyperurikämie

 k.A.

953

58

M

DCM (ED 92), EF 20 %

III

beta-1-AK,

k.A.

aHTN, Nephrolithiasis, NI kompensierte Retention, IDDM, Z.n. Autonomen Adenom 92, Z.n. Apoplex 94, TVT 60

explantiertes Herz: hyper-, atrophe Myozyten, vergrößerte und pathologische Kerne, diffuse Fibrose, teilweise Narben, kein Infiltrat, keine Nekrose, Wand li. 11mm, re. 3mm

314

64

M

HOCM (ED 86), VF, Lown IVb, ICD 4/98

II

2bp Insertion an Position +3126 im Myosin-Bindungsprotein C (Heterozygot)

k.A.

KHE 2G, Z.n. PTCA + Stent, aHTN, AS I°, MI I°, seit 86 chronischer Perikarderguß unklarer Genese, Z.n. TIA bei Carotisstenose beidseits 98, Adipositas per magna

 k.A.

EF=Ejektionsfraktion, VF=Vorhofflimmern, Z.n.=Zustand nach, ICD=Implantierbarer Cardioverter-Defibrillator, NYHA=New York Heart Association (Schweregrad der Herzinsuffizienz), FA=Familienanamnese, beta1-AK=Antikörper gegen den Beta-1-Rezeptor, KHE=Koronare Herzerkrankung (2GE=2-Gefäßerkrankung), k.A.=keine Angaben, ED=Erstdiagnose, HRST=Herzrhythmusstörungen, pHT=pulmonale Hypertonie, aHTN=arterielle Hypertonie, NI=Niereninsuffizienz, HLP=Hyperlipoproteinämie, TAA=Tachyarhythmia absoluta, VT=Ventrikuläre Tachykardien, SM=Schrittmacher, AVB=AV-Block, LSB=Linksschenkelblock, RSB=Rechtsschenkelblock, IDDM=Insulinabhängiger Diabetes mellitus, TVT=Tiefe Venenthrombose, PTCA=Percutane Transluminale Coronar-Angioplastie, AS=Aortenstenose, MI=Mitralinsuffizienz,


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Tab. 31: Echoparameter der Patienten mit dem Promotorpolymorphismus

DNA-Nummer

IVS (ed)

HW (ed)

LV-EDD

LV-ESD

LV-EF

LV-FS

LA

RV-EDD

RV-EF

 

117

8 mm

10 mm

80 mm

64 mm

k.A.

2%

46 mm

k.A.

k.A.

 

240

k.A.

k.A.

k.A.

k.A.

21%

k.A.

k.A.

k.A.

k.A.

 

354

7 mm

11 mm

110 mm

99 mm

15%

6%

56 mm

15 mm

30%

 

359

10 mm

8 mm

73 mm

63 mm

32%

14%

k.A.

23 mm

k.A.

 

376

10 mm

10 mm

53 mm

29 mm

32%

45%

k.A.

normal

k.A.

 

391

11 mm

10 mm

77 mm

69 mm

22%

11%

k.A.

30 mm

55%

 

448

k.A.

k.A.

76 mm

67 mm

15%

k.A.

k.A.

k.A.

k.A.

 

543

8 mm

7 mm

88 mm

80 mm

20%

10%

51 mm

36 mm

40%

 

916

11 mm

10 mm

70 mm

69 mm

20%

11%

k.A.

34 mm

30%

 

953

k.A.

k.A.

71 mm

61 mm

15%

12%

50 mm

k.A.

25%

 

314

20 mm

8 mm

50 mm

k.A.

k.A.

k.A.

k.A.

normal

k.A.

Druckgrad. max. 49 mm HG

IVS=Interventrikuläres Septum, HW=Hinterwand, ed=enddiastolisch, LV-EDD=Linksventrikulärer Enddiastolischer Durchmesser, LV-ESD=Linksventrikulärer Endsystolischer Durchmesser, LV-EF=Linksventrikuläre Ejektionsfraktion, LV-FS=Linksventrikuläre Verkürzungsfraktion, LA=Linker Vorhof (Durchmesser), RV-EDD=Rechtsventrikulärer Enddiastolischer Durchmesser, RV-EF=Rechtsventrikuläre Ejektionsfraktion, k.A.=keine Angaben; Für Pat. Nr. 240 waren keine Echodaten verfügbar.

Tab. 32: Katheterdaten für Patient Nr. 240

DNA-Nummer

LVEDVI (ml/m 2 )

LVESVI (ml/m 2 )

SVI (ml/m 2 )

LVEF (%)

240

74

20

54

74

LVEDVI=Linksventrikulärer Enddiastolischer Volumenindex, LVESVI=LV-Endsystolischer Volumenindex, SVI=Schlagvolumenindex, LVEF=LV-Ejektionsfraktion


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3.4.2  Variante an den Positionen -992 bis -995

Die Analyse des Fragmentes "ct1Prom1F/ct1prb" zeigte ein aberrantes Laufverhalten im SSCP-Gel bei 4 °C und bei Raumtemperatur für einen Patienten. Die Sequenzierung ergab eine Deletion von vier Basen an den Positionen -992 bis -995 (CTTT). Die weitere Verifizierung dieser Variante und das Screening aller Patienten erfolgte anschließend mittels RFLP-Fragmentlängen-Polymorphismus unter Verwendung des Enzyms "Ear I". Dessen spezifische Erkennungssequenz (5´..CTCTTC(N)1 ..3´) wurde durch die Deletion gebildet. Demzufolge blieb das Wildtyp-Allel unverändert (131 bp), während das mutierte Allel in zwei Fragmente mit den Längen von 75 und 59 bp geschnitten wurde. Heterozygote Patienten wiesen deshalb im Polyacrylamidgel drei Banden der Längen 131, 75 und 59 bp auf.

Die RFLP-Analyse aller Patienten wies diese Mutation bei nur einer Patientin mit HCM nach. Nähere klinische Daten waren retrospektiv nicht zu erheben, da die DNA der Patientin aus einer externen Klinik zur genetischen Analyse zugeschickt wurde. Die Patientin selbst stellte sich nicht im Deutschen Herzzentrum Berlin vor. Interessant ist allerdings, daß bei der gleichen Patientin zusätzlich eine stumme Mutation im Gen des Myosin-Bindungsprotein C identifiziert werden konnte.

Durch die hier gefundene Deletion wird keine der bisher identifizierten Transkriptionsfaktorbindungsstellen zerstört.


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Abb. 13: A) Ausschnitt aus einem SSCP-Gel bei Raumtemperatur für das Promotorfragment „ct1Prom1F/ct1prb“. Es sind bei einer Patientin (Spur 4) zwei zusätzliche Banden zu erkennen. Spur 1: Marker, Spuren 2-3 + 5-6: Patienten mit Wildtyp. B) Restriktionsverdau mit EarI. Bei der Patientin mit der CTTT-Deletion (Spur 9) sind deutlich drei Banden (entsprechend 131, 75 und 59 bp, Pfeile) zu erkennen. Alle übrigen Patienten (Spuren 2-8) weisen wie erwartet nur eine Bande mit ca. 131 bp auf. Spur 1: Marker

3.5 CT-1 mRNA-Expression in menschlichem Myokardgewebe

3.5.1 CT-1 mRNA Quantifizierung

Nach erfolgter RNA-Isolierung und reverser Transkription wurde das Material jeder Probe als Doppelansatz in die PCR eingesetzt. Gleichzeitig erfolgte die Amplifikation des PDH-Gens in jeweils einem Ansatz für jede Probe. Alle Amplifikate wurden anschließend auf der gleichen Chromatographiesäule unter identischen Bedingungen quantifiziert. Für den anschließenden Vergleich der Daten untereinander wählten wir die maximale Höhe der Extinktionskurven. Dabei ergaben sich die in den folgenden Tabellen wiedergegebenen Werte.


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Tab. 33: Ergebnisse der HPLC-Analyse der Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz (LVEF<40%).

Probe

CT 1 ( Peakhöhen )

Mittelwert CT1

PDH

Quotient
CT 1/PDH

Mittelwert Quotient

      

CHI 1

5469

  

0,75

 
 

7267

6368

7297

1,00

0,87

      

CHI 2

4415

  

0,58

 
 

6428

5422

7604

0,85

0,71

      

CHI 3

7867

  

1,06

 
 

9629

8748

7454

1,29

1,17

      

CHI 4

7869

  

1,15

 
 

8466

8168

6859

1,23

1,19

      

CHI 5

8107

  

1,29

 
 

5615

6861

6297

0,89

1,09

      

CHI 6

6501

  

1,12

 
 

7419

6960

5822

1,27

1,20

      

Die Quantifizierung der CT-1-mRNA erfolgte im Doppelansatz, die der PDH-mRNA als Einzelansatz je Probe. In die Auswertung ging jeweils nur die Höhe der HPLC-Peaks ein.

Tab. 34: Ergebnisse der HPLC-Analyse der Patienten mit normaler LVEF.

Probe

CT 1 ( Peakhöhe )

Mittelwert CT1

PDH

Quotient
CT1/PDH

Mittelwert Quotient

      

KO 1

6012

  

0,82

 
 

5344

5678

7329

0,73

0,77

      

KO 2

3763

  

0,56

 
 

4613

4188

6715

0,69

0,62

      

KO 3

1220

  

0,21

 
 

2020

1620

5683

0,36

0,29

      

Die Quantifizierung der CT-1-mRNA erfolgte im Doppelansatz, die der PDH-mRNA als Einzelansatz je Probe. In die Auswertung ging jeweils nur die Höhe der HPLC-Peaks ein. KO=Kontrolle


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Tab. 35: Ergebnisse der HPLC-Analyse der Patienten nach Transplantation (LVEF>45%).

Probe

CT 1 ( Peakhöhe )

Mittelwert CT1

PDH

Quotient
CT 1/PDH

Mittelwert Quotient

      

TX 1

1394

  

0,24

 
 

2650

2022

5886

0,45

0,34

      

TX 2

6300

  

0,90

 
 

358

3329

7002

0,05

0,48

      

TX 3

4288

  

0,70

 
 

2800

3544

6105

0,46

0,58

      

TX 4

4370

  

0,51

 
 

5944

5157

8638

0,69

0,60

      

TX 5

4459

  

0,70

 
 

6788

5624

6363

1,07

0,88

      

Die Quantifizierung der CT-1-mRNA erfolgte im Doppelansatz, die der PDH-mRNA als Einzelansatz je Probe. In die Auswertung ging jeweils nur die Höhe der HPLC-Peaks ein. TX=Transplantat

Die Höhen der HPLC-Kurven für CT-1 lagen im Mittel bei 7088 ± 1398 für die Patienten mit reduzierter LVEF, bei 3829 ± 1720 für die Kontrollgruppe mit normaler LVEF und bei 3935 ± 2014 für die Gruppe der TX-Patienten. Dies entspricht einem relativen Anstieg der CT-1 mRNA um 85% (KO) bzw. 80% (TX).

Die Zusammenfassung der Daten beider Kontrollgruppen (KO und TX) resultiert in einem Mittelwert für die HPLC-höhe für CT-1 von 3895 ± 1910. Daraus ergibt sich eine um 82 % höhere CT-1 Expression in der Gruppe mit chronischer Herzinsuffizienz (CHI).

Die 95 %-Konfidenzintervalle liegen zwischen 2571 und 5219 in der Kontrollgruppe (KO+TX) sowie zwischen 5969 und 8207 in der Gruppe der Herzinsuffizienzpatienten (CHI).

Zur internen Standardisierung diente die gleichzeitige Amplifikation des PDH-Gens. Dessen Menge blieb, wie vorher erwartet, unverändert in allen Probengruppen (p=0,72 für Expressionunterschied zwischen CHI und Kontrollgruppe). Die Werte lagen im Mittel bei 6889 ± 644 für die Patienten mit reduzierter LVEF, bei 6576 ± 679 bzw. 6799 ± 993 für die beiden Kontrollgruppen KO respektive TX.

Durch die Relation von CT-1 zu PDH wird die Differenz der mRNA-Expression zwischen den Patientengruppen bestätigt. Bei einem CT-1/PDH-Quotienten von 1,04 ± 0.22 für die Patienten mit Herzinsuffizienz bzw. von 0,57 ± 0,26 für die Kontrollen ergibt sich ein Anstieg um 82 % [Seite 65↓](p<0,002). Es fand sich kein signifikanter Unterschied innerhalb der beiden Kontrollgruppen (KO: 0,56 ± 0,21; TX: 0,58 ± 0,29, p=0,92).

Abb. 14: Box-and-Whisker-Plot-Diagramme mit Darstellung der HPLC-Daten der mRNA-Quantifizierung für CT-1 und PDH. A): Mittelwertverteilung der HPLC-Peakhöhen für CT-1, B): Mittelwertverteilung der HPLC-Höhen für PDH, C): Verteilung der Quotienten aus CT- 1 und PDH (relative mRNA-Expression). Zu erkennen sind eine höhere CT-1-Expression in der Patientengruppe mit Herzinsuffizienz sowie eine gleiche Expression der PDH-mRNA in beiden Gruppen (CHI vs. KO+TX). CHI: Patienten mit verminderter LVEF; Kontrollen: aufgrund der geringen Patientenzahlen wurden beide Subgruppen der Patienten nach Transplantation (TX) sowie der Patienten mit normaler LVEF (KO) zusammengefasst, Box-Plot: Werte innerhalb der Box liegen zwischen der 25%- und 75%-Quantile, waagerechte Linie in der Box entspricht dem Median, senkrechte Linien mit waagerechter Begrenzung (Whisker) entsprechen 5%- bzw. 95%-Quantile, außerhalb liegende Punkte entsprechen Extremwerten

3.5.2 Korrelation der CT-1 mRNA Expression mit der linksventrikulären Funktion

Die statistische Auswertung zeigte eine signifikante negative Korrelation zwischen der CT-1-Expression (Quotient CT-1/PDH) und der Links- bzw. Rechtsventrikulären Ejektionsfraktion. Darüberhinaus korreliert die CT-1-Expression signifikant mit weiteren linksventrikulären [Seite 66↓]Funktionsparametern. So weisen Patienten mit einem hohen linksventrikulären enddiastolischem sowie endsystolischem Volumenindex (LVEDVI, LVESVI) und einem erhöhten linksventrikulären Masseindex (LVMI) eine signifikant höhere mRNA-Expression auf. Im Gegensatz dazu zeigte sich keine Korrelation zur enddiastolischen Muskeldicke (LVEDMD). Dies weist auf einen möglichen Zusammenhang zwischen der CT-1-Expression und einer Verschlechterung der Pumpfunktion (LVEF, RVEF) sowie einer Zunahme der Ventrikeldilatation (LVEDVI, LVESVI) hin. Da der Masseindex die relative Muskeldicke im Verhältnis zur Ventrikeldilatation darstellt, besteht auch ein Hinweis auf einen Zusammenhang mit der Myokardhypertrophie.

Tab. 36: Korrelation der relativen CT-1-mRNA-Expression zu Funktionsparametern

Funktionsparameter

Korrelationskoeffizient

p-Wert

Z-Wert

    

LVEF

-0,67

0,007

-2,71

RVEF

-0,63

0,014

-2,46

LVEDVI

0,60

0,020

2,33

LVESVI

0,66

0,009

2,60

LVMI

0,63

0,014

2,45

LVEDMD

0,32

0,275

1,09

    

Die statistische Auswertung der Daten erfolgte mit dem Z-Test für Korrelation unter Verwendung des Computerprogramms StatView 4.5, LVEF : Linksventrikuläre Ejektionsfraktion, RVEF : Rechtsventrikuläre Ejektionsfraktion, LVEDVI : Linksventrikulärer enddiastolischer Volumenindex, LVESVI : Linksventrikulärer endsystolischer Volumenindex, LVMI: Linksventrikulärer Masseindex, LVEDMD: Linksventrikuläre enddiastolische Muskeldicke


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Korrelation der CT-1 mRNA mit der kardialen Funktion

Abb. 15: Graphische Darstellung der Korrelation zwischen kardialen Funktionsparametern und der relativen CT-1-Expression (CT-1/PDH). Zu erkennen ist eine negative Korrelation zwischen der links- und rechtsventrikulären Ejektionsfraktion (LVEF, RVEF) sowie eine positive Korrelation mit den enddiastolischen und endsystolischen Volumenindizes (LVEDVI, LVESVI) und dem Masseindex (LVMI).


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03.06.2004