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4  Diskussion

Für das Zytokin Cardiotrophin-1 konnten Wirkungen auf Hypertrophie und Apoptose von Kardiomyozyten nachgewiesen werden. Da Kardiomyopathien durch eine gesteigerte Hypertrophie und Apoptose gekennzeichnet sind, könnten Varianten in regulatorischen und kodierenden DNA-Sequenzen des CT-1 Gens sowie Expressionsveränderungen der mRNA im Myokard an der Entwicklung dieser Erkrankungen beteiligt sein. Die Untersuchung dieser Hypothese erforderte einerseits die Aufklärung der Struktur und regulatorischen Funktion der 5´-untranslatierten Region (UTR), die Variantensuche in diesem Bereich sowie im Gen in unterschiedlichen Kohorten sowie die Messung der Expression der mRNA im menschlichen Myokard. Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit konnten die 5´-UTR als Promotor des CT-1 Gens identifiziert und Transskriptionsfaktorbindungsstellen nachgewiesen werden. Darüberhinaus fand sich eine Variante, die aufgrund eines Aminosäureaustausches funktionell relevant sein könnte sowie einen seltenen Polymorphismus, dessen pathogenetische Funktion noch unklar ist. Im Myokardgewebe herzinsuffizienter Patienten zeigten sich darüberhinaus mRNA Expressionsunterschiede, die mit klinischen Parametern korrelierten.

4.1 Die 5´-untranslatierte Region des humanen Cardiotrophin-1-Gens

4.1.1 Sequenzanalyse: Konsensussequenzen für Transkriptionsfaktoren

Mit Hilfe des Genome Walker Kits (Clontech) konnten 1.1 kb der 5´-flankierenden Region des menschlichen CT-1-Gens kloniert und sequenziert werden. Der CT-1-Promotor weist einige Merkmale der Promotoren von sogenannten „housekeeping-genen“ auf, z.B. fehlt eine TATA-Box (siehe unten). Zusätzlich weist er sehr viele GC-Basenpaare auf. Promotoren der sogenannten "housekeeping-genes" besitzen viele CpG-Inseln, die unmethyliert sind. Der Methylierungsgrad der CpG-Dinukleotide bestimmt die Zugänglichkeit der Konsensussequenzen für die Transkriptionsfaktoren und somit die Aktivität des Promotors. So sind die entsprechenden Stellen in den Promotoren inaktiver Gene methyliert [Knippers, 1990].

In den meisten der bisher analysierten Fälle erfolgt der Transkriptionsstart eukaryoter Gene an der sogenannten TATA-Box nach Bindung verschiedener Faktoren inklusive der Polymerase II. Diese TATA-Box weist eine relativ konservierte räumliche Lokalisation 25-30 bp stromaufwärts [Seite 70↓]des Startkodons auf [Lewin, 2000]. Die in dieser Arbeit identifizierte Promotorregion enthält kein TATA-ähnliches Element und gehört damit zu den sogenannten "TATA-losen" Promotoren. Zu dieser Gruppe gehören nur wenige Gene, die z.B. für die normalen Zellfunktionen zuständig sind (Housekeeping Gene). Die Mechanismen, die in diesen Fällen zum Transkriptionsstart führen, sind noch ungeklärt. Es scheinen mehrere Startpunkte und zusätzliche Faktoren dabei involviert zu sein.

Unabhängig davon konnten im CT-1-Promotor verschiedene Bindungsstellen für ubiquitär vorkommende Transkriptionsfaktoren identifiziert werden. So befinden sich an den Positionen -1043 und -976 zwei CAAT-Elemente. Diese Konsensussequenzen wirken in unterschiedlichen Entfernungen zum Startpunkt und in 5´→ 3´- sowie 3´→ 5´- Orientierung. Sie scheinen eher die Effizienz des Promotors zu erhöhen und die Initiationsfrequenzen zu beeinflussen, als die Spezifität zu bestimmen [Lewin, 2000]. Es werden zwei Typen unterschieden, die CCAAT- und die GCAAT-Boxen, die von verschiedenen strukturell unterschiedlichen Transkriptionsfaktoren erkannt werden. Zum Beispiel bindet ACF (ATP-dependent chromatin assembly and remodelling factor) bevorzugt an CCAAT-Sequenzen und C/EBP (CAAT/Enhancer binding protein) an GCAAT-Sequenzen. Letzterer Faktor ist ein weit verbreiteter Aktivator der Transkription in vitro und in vivo und kann unter anderem die IL-6-Expression stimulieren [Akira, 1990]. Darüber hinaus wurde in embryonalem Gewebe ein weiteres Protein identifiziert, das an CAAT-Elemente bindet. Dieses wird als CDP für "CAAT-displacement protein" bezeichnet und verhindert das Erkennen der CAAT-Box durch die Transkriptionsfaktoren [Lewin, 2000]. Im CT-1- Promotor befindet sich an der Position -1043 eine CCAAT- und an Position -976 eine GCAAT-Box.

Für die Effizienz eines Promotors sind vermutlich ein oder mehrere CAAT- und sogenannte GC-Boxen notwendig. Letztere werden, im Gegensatz zu ersteren, nur von einem Faktor, dem SP1-Protein erkannt. Häufig finden sich mehrere Kopien in beiden Orientierungen. Der CT-1-Promotor weist nur an der Position -580 eine GC-Box mit der Sequenz "GGGCGG" auf. SP1 bindet an einen DNA-Strang in einer 20 bp langen Region, die mindesten eine 6bp GC-Box enthält. Normalerweise kann dieser Faktor die Transkription nur stimulieren, wenn er nahe des Startpunktes bindet. Courey et al. [Courey, 1989] konnten aber zeigen, daß distal und proximal gebundene SP1-Proteine synergistisch die Transkription positiv beeinflussen. In TATA-losen Promotoren hilft SP1 dabei, den Faktor TFII-D (Iniationskomplex) an der richtigen Stelle im Bereich des Transkriptionsstarts zu platzieren [Knippers, 1990].

An der Position -984 beginnt die Konsensussequenz "TTNCNNNAA", die von STAT-Proteinen erkannt wird [Fukuzawa, 2000]. Diese cytoplasmatischen Proteine fungieren als [Seite 71↓]Signaltransduktoren und Transkriptionsaktivatoren (signal transducer and activator of transcription=STAT), die anschließend an die Rezeptorbindung verschiedener Liganden, darunter auch der IL-6-Zytokine, aktiviert werden, homo-bzw. heterodimerisieren und im Zellkern an die entsprechenden DNA-Sequenzen binden [Horvath, 1997]. STATs sind, wie bereits im Kapitel 1.2.3. beschrieben, auch an der CT-1-induzierten Signaltransduktion beteiligt. Das Vorhandensein einer STAT-Bindungsstelle im Promotor von CT-1 weist auf eine mögliche Aktivierung von CT-1 durch z.B. andere IL-6-Mitglieder oder einen eventuell vorhandenen Rückkopplungsmechanismus hin.

Zusätzlich befindet sich an der Position -639 ein cAMP-responsives Element (CRE), das die Transkription unterschiedlich reguliert. Ursprünglich wurde es als Enhancer solcher Gene identifiziert, die infolge erhöhter intrazellulärer cAMP-Spiegel transkribiert werden. CRE´s finden sich in verschiedenen Genen des Zellwachstums, wie z.B. "cFOS". Erkannt wird diese Konsensusequenz durch CRE-bindende Proteine (CREB), die als Homo- bzw. Heterodimere zusammen mit anderen Mitgliedern der CREB/ATF und AP1-Familie an die DNA binden. In den meisten Zellen wird CREB ständig exprimiert. Die Transkriptionsaktivität wird über die Phosphorylierung eines Serinrestes in der Transaktivierungsdomäne reguliert. Die Aktivierung erfolgt durch die Proteinkinase A, die Kalzium-Kalmodulin-abhängigen Kinasen II und IV und durch MAP-Kinasen. Unphosphoryliert kann CREB zwar an die DNA binden, bleibt dabei aber inaktiv. Nach der Aktivierung können weitere Co-Aktivatoren binden, durch die die Transkription verstärkt wird [Wegner, 2000]. Darüberhinaus kann als Splicevariante das Protein CREM (CRE-Modulierungsprotein) entstehen, durch das das CRE-Element blockiert wird. CREB ist ein wichtiger Regulatur der Genexpression in Kardiomyozyten. Fenske et al. [Fentzke, 1998] zeigten im transgenen Tiermodell, daß Mäuse mit einer dominant-negativen CREB-Form eine dilatative Kardiomyopathie entwickelten, die der menschlichen Form ähnelte und durch atrophische sowie hypertrophische Fasern und eine interstitielle Fibrose gekennzeichnet war. Diese Ergebnisse unterstreichen auch die kardiale Bedeutung von Cardiotrophin-1.

Die CT-1-Promotorsequenz weist an der Position -484 ein GATA-Motiv auf. Dieses wird durch eine Gruppe strukturell ähnlicher Proteine erkannt, den GATA-Bindungsfaktoren, die jeweils ein oder mehrere Zink-Finger-Motive der Form "CXNCX(17)CXNCX" enthalten [Evans, 1988]. GATA-Faktoren sind an der Differenzierung und Genexpression zahlreicher Zelltypen beteiligt. Darunter befinden sich auch solche Gene, die für die myokardiale Differenzierung und Funktion wichtig sind, wie zum Beispiel Troponin C, die schwere Kette des kardialen alpha-Myosin und BNP (braintype natriuretic factor) [Huang, 1997; Grepin, 1994; Ip, 1994]. Die GATA-Faktoren werden in 2 Subgruppen unterteilt. Danach werden die Faktoren GATA-1 bis 3 hauptsächlich in [Seite 72↓]Zellen der Hämatopoese und des ektodermalen Gewebes und die Faktoren 4 bis 6 im Herz und in endodermalen Geweben exprimiert. Laverriere et al [Laverriere, 1994] zeigten eine frühe Expression von GATA-4 bis 6 in der Organentwicklung insbesondere des Herzens. Kuo et al [Kuo, 1997] inaktivierten GATA-4 im Mausmodell. Dies resultierte in einer Unfähigkeit der Promyokardiozyten zur ventralen Mittellinie zu migrieren. In Folge dessen war die weitere kardiale Entwicklung erheblich gestört; die Tiere waren nicht lebensfähig. Zusammengefaßt weisen diese Ergebnisse auch auf die mögliche Beteiligung von Cardiotrophin-1 an der Kardiogenese hin.

Insgesamt befinden sich neun AP-2-ähnliche Bindungsstellen an den Positionen -716, -438, -266, -251, -248, -207, -181, -73 und -72. Das Aktivator-Protein 2 (AP 2) ist ein Kernprotein, das initial aufgrund seiner Wechselwirkungen mit regulatorischen DNA-Sequenzen des Semian-Virus 40 (SV 40) identifiziert wurde. Während der Embryogenese ist es unter anderem in neuronalen Vorläuferzellen und in den frühen Extremitätenanlagen exprimiert [Solway, 1998]. Auch CT-1 konnte in diesen Geweben in frühen embryonalen Entwicklungsstadien nachgewiesen werden. Desweiteren wird für AP 2 angenommen, daß es ein intermediäres Signalprotein der c-AMP-vermittelten Signaltransduktion darstellt [Walton, 1990].

An der Position -619 konnte eine AP1 (Aktivator protein)-Bindungsstelle identifiziert werden. AP1 besteht aus den Untereinheiten FOS und JUN, zwei Proteine, deren Gene zu den "immediate early genes" gehören und z. B. im Rahmen einer Myokardhypertrophie vermehrt exprimiert werden. Diese Proteine weisen eine basische, Lysin- und Arginin-reiche Region sowie einen sogenannten Leuzin-Zipper auf. Letzterer enthält einen Leuzin-Rest an jeder 7. Stelle und ist für die DNA-Bindung verantwortlich. Durch die Bindung von AP1 wird die DNA gebeugt. Dadurch nähert sich dieser Komplex wahrscheinlich an den Initiationskomplex an und ist demzufolge womöglich am Aufbau oder der Aktivierung dieses Komplexes beteiligt [Knippers, 1990]. Die verschiedenen Proteine der JUN- und FOS-Familien können durch eine Vielzahl an Stimuli exprimiert werden. Ihnen wird eine Rolle in der Regulation der Proliferation und der Differenzierung von Zellen sowie bei Reaktionen auf Zellschädigungen und auch bei der Apoptose zugeschrieben [Wegner, 2000].

Nach der Veröffentlichung der in dieser Arbeit ermittelten Promotorsequenz des humanen CT-1-Gens klonierten und charakterisierten Funamoto et al. [Funamoto, 2000b] 2.2kb der 5´-flankierenden Sequenz des CT-1-Gens der Maus. Auch dieser Bereich besitzt Promotoraktivität. Interessanterweise finden sich die oben beschriebenen Konsensussequenzen auch im Promotor der Maus wieder, der eine 55%ige Sequenzhomologie zu dem des Menschen aufweist. [Seite 73↓]Zusätzlich konnten weitere Transkriptionsfaktorbindungsstellen für Nkx2.5, GATA, MyoD, NF-IL6, CREB, AP3, P53 und HIF-1 identifiziert werden.

Der Vergleich mit dem Promotor des IL-6-Gens zeigt, daß sich die CT-1-Regulation wesentlich von der des IL-6-Gens unterscheidet. IL-6 besitzt eine TATA-Box sowie Bindungsstellen für NF-κB und NF-IL6. Letztere sind an der Expression von IL-6 bei Hypoxie beteiligt [Matsui, 1999]. Obwohl CT-1 zur gleichen Zytokinfamilie gehört, fanden sich in den bisher analysierten CT-1-Promotorsequenzen weder TATA-Box noch NF-κB-Elemente. Diese Tatsache legt die Vermutung nahe, daß CT-1 im Gegensatz zu IL-6, zu den Haushaltsgenen gehört, die ständig exprimiert werden und deren Kennzeichen unter anderem TATA-lose Promotoren sind.

Eine Untersuchung der Promotorregion des menschlichen Pro-α1-Kollagen Gens [Vergeer, 2000] zeigte, daß einige Transkriptionsfaktoren wie SP1 und Ap2 nicht an alle potentielle Bindungsstellen binden. Demgegenüber deckte die Transmissions-Elektronen-Mikroskopie die Bindung obiger Faktoren an DNA-stellen auf, die vorher nicht als potentielle regulatorische Regionen identifiziert wurden. Die alleinige Analyse einer Promotorsequenz ist also nicht ausreichend, um regulatorische Elemente eines Gens zu identifizieren. Dafür sind zusätzliche in vitro und in vivo Funktionsanalysen notwendig.

4.1.2 Die regulatorische Funktion des Promotors des humanen CT-1-Gens

Für die gesamte 1,1 kb große 5´-flankierende Region des CT-1-Gens konnte eine signifikante Promotoraktivität nachgewiesen werden. Der Vergleich der Aktivitäten wies dabei darauf hin, daß der gesamte Bereich zwischen den Positionen –1091 und –218 die Expression des Cardiotrophin-1 Promotors negativ beeinflusst. Hierbei könnte sich zwischen den Positionen –1091 und –739 ein Suppressorelement befinden. In der Tat liegen in diesem Bereich sowohl eine CCAAT- als auch eine GCAAT-Box. Für diese cis-aktiven Elemente konnte eine Expressionsuppression durch das sogenannte „CAAT-displacement-Protein“ (CDP) beschrieben werden [Lewin, 2000]. Der Bereich zwischen –739 und –218 könnte ebenfalls ein Suppressorelement enthalten, da die Aktivität nach der Deletion dieses Bereiches anstieg. Durch die TRANSFAC-Analyse konnte ein cAMP-Responsives Element (CREB) und ein GATA-Motivs in dieser Region identifizieren. Transkriptionsfaktorbindungsstellen können von verschiedenen trans-aktiven Faktoren erkannt werden, die die Expression des regulierten Genes [Seite 74↓]negativ oder positiv beeinflussen können [Lewin, 2000]. Ein ähnlicher Mechanismus ist auch für den CT-1 Promotor denkbar.

Das Konstrukt CT4 weist im Vergleich mit CT5 nur eine geringfügig höhere Promotoraktivität auf. Dies kann daran liegen, daß das hier liegende GATA-Element nur zellspezifisch aktiviert wird oder nur im Zusammenhang mit weiter stromaufwärts liegenden Faktoren die Transkription beeinflusst.

Der Bereich zwischen -577 und -739 scheint ebenfalls einen Enhancerbereich zu besitzen, da das entsprechende Konstrukt (CT3) nach CT6 die höchste Aktivität aufweist. In der Tat lassen sich hier mehrere Transkriptionsfaktorbindungsstellen nachweisen. Dies sind die SP1-site an Position -582, das AP1-Element bei -619, das cAMP-responsive Element (CRE) bei -639 und ein weiteres AP2-Element an Position -716. AP1 und SP1 sind unter anderem an der Aktivierung des Initiationskomplexes beteiligt. AP1 konnte als Bestandteil einiger Enhancer gefunden werden, wie z.B. des Virus SV40 [Evans, 1988]. CREB wirkt als Enhancer und AP-2 vermutlich als Vermittler in Genen, die durch einen erhöhten cAMP-Spiegel vermehrt transkribiert werden. Somit könnte auch die CT-1-Expression unter anderem einer cAMP-abhängigen Regulation unterliegen.

Generell ist die Aktivität vieler Enhancer-Elemente wesentlich vom jeweiligen Zelltyp und vom Bedarf des exprimierten Proteins abhängig. Auch die CT-1-Expression wird durch verschiedene Stimuli verstärkt, wie z.B. Hypoxie oder Angiotensin II (siehe Kapitel 1). Funamoto et al. [Funamoto, 2000b] identifizierten und analysierten den CT-1-Promotor der Maus und konnten zeigen, daß dieser über den hier vorgestellten Bereich des humanen Gens hinausgeht und weitere Elemente enthält. Auch für den humanen Cardiotrophin-1-Promotor sind weitere stromaufwärts liegende regulatorische Elemente vorstellbar. Durch zusätzliche Studien müssen diese identifiziert und die Bedeutung aller Elemente in unterschiedlichen Zelltypen, in Abhängigkeit von verschiedenen Stimuli sowie der räumlichen Lage zueinander analysiert werden. Daraus könnten sich wichtige Aufschlüsse über die Regulation von CT-1 und dessen Bedeutung in vivo ergeben.


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4.2  Genetische Variabilität im kodierenden und regulatorischen Bereich des humanen Cardiotrophin-1-Gens und ihre mögliche Bedeutung in der Ätiologie von Kardiomyopathien

Die beiden häufigsten Formen der Kardiomyopathien, die DCM sowie die HCM, werden in bis zu 30% respektive 50% der Fälle mit monogenen Mutationen in Zusammenhang gebracht. Diese betreffen hauptsächlich Proteine des Sarkomers und des Zytoskeletts. Es wird angenommen, daß Mutationen in Proteinen, die die Kraftentwicklung des Sarkomers beeinflussen, zur HCM führen. Andererseits scheint sich eine DCM zu entwickeln, wenn Proteine, die für die Stabilität der Zellmembran bzw. die Kraftübertragung verantwortlich sind, verändert werden [Chen, 1999]. Neuere Untersuchungen von Kamisago et al [Kamisago, 2000] zeigten, daß auch Mutationen in Sarkomerproteinen, sprich β-MHC und Troponin-T, zur Entwicklung einer DCM führen können. Dies verschärft die Unklarheit über die Pathogenese der Kardiomyopathien. Selbst bei identischen Mutationen innerhalb der gleichen oder bei verschiedenen Familien finden sich eine unterschiedliche Penetranz und teilweise voneinander abweichende Phänotypen. Außerdem zeigte ein Hamstermodell, daß eine Deletion im δ-Sarkoglykangen, einem Protein des Dystrophin-Glykoproteinkomplexes, sowohl eine DCM als auch eine HCM verursachen kann. Dies hing vom jeweiligen genetischen Hintergrund ab [Sakamoto, 1997]. Beim Menschen kann eine Mutation im α-Aktin-Gen je nach Lokalisation zur Entwicklung einer DCM oder HCM führen [Olson, 1998; Mogensen, 1999]. Darüberhinaus ist im Tiermodell sowie bei einzelnen Patienten ein Übergang von einer Hypertrophen in eine Dilatative Kardiomyopathieform beschrieben worden [Freeman, 2001]. Kürzlich konnten Mogensen et al. zeigen, daß eine Mutation im Troponin I innerhalb einer Familie sowohl zur Restriktiven als auch zur Hypertrophen Kardiomyopathie führt [Mogensen, 2003]. Für die Ausprägung des Phänotyps scheinen also eine Variabilät in weiteren Genen und/oder verschiedene Umweltfaktoren von Bedeutung zu sein.

Transgene Tiermodelle konnten zum Beispiel zeigen, daß die Inaktivierung bzw. Überexpression von Proteinen der Signaltransduktion zur Entwicklung von Kardiomyopathien führt. So wiesen Mäuse mit einem dominant-negativen CREB-Gen (Transkriptionsfaktor) kardiale Veränderungen auf, die auch für die menschliche DCM charakteristisch sind [Fentzke, 1998]. Auch die ventrikelspezifische gp130-Inaktivierung führt zur Ausprägung einer DCM bei akuter [Seite 76↓]Druckbelastung [Hirota, 1999]. Die Überexpression des ras-Proteins (MAPK-Kaskade) resultiert in einer Hypertrophie mit gestörter Anordnung der Myofibrillen und beeinträchtigter diastolischer Funktion [Hunter, 1995]. Kürzlich konnten Mathur et al [Mathur, 1999] nachweisen, daß Mutationen in einem Enzym des kardialen Energiestoffwechsels zur Kardiomyopathie im Kindesalter führen. Desweiteren konnten Mutationen in einem Transkriptionsfaktor (EYA) sowie einer Proteinkinase in Familien mit DCM bzw. HCM nachgewiesen werden [Schonberger, 2000; Blair, 2001].

Diese Ergebnisse zeigen, daß nicht nur Proteine des Zytoskeletts an der Ätiologie von Kardiomyopathien beteiligt sind. Daher haben wir das CT-1 Gen auf die Möglichkeit hin untersucht, ebenfalls an der Entwicklung der DCM oder HCM beteiligt zu sein. Hierfür gibt es zwei mögliche Pathomechanismen. Im Falle einer monogenetischen Ursache wären Mutationen bei einzelnen Patienten zu erwarten, die bei einem Auftreten mehrerer Fälle in der entsprechenden Familie mit der Erkrankung kosegregieren würden. Darüberhinaus könnten Varianten im CT-1 Gen modifizierend auf die Penetranz der Erkrankung oder die Ausprägung des Phänotyps Einfluß nehmen. In diesem Fall wären Polymorphismen zu identifizieren, die aufgrund ihres häufigeren Auftretens in Patientenkollektiven mit Kardiomyopathien mit dem Phänotyp assoziert sind. Häufige Polymorphismen, die in mehr als 5 % der Population auftreten, lassen sich mit 95 %iger Sicherheit detektieren, wenn das genetische Material von 92 gesunden Probanden analysiert wird. Daher wählten wir für diese Arbeit ein Kontrollkollektiv von 100 Personen. Der Vergleich der Häufigkeiten des hier identifizierten Polymorphismus im DCM- und HCM-Kollektiv bzw. bei den Kontrollen wies auf eine mögliche Assoziation mit der DCM hin. Zur Untersuchungs dieses Trends erhöhten wir aus statistischen Gründen die untersuchte Patientenzahl.

Gen-Varianten können über eine veränderte Regulation hypertrophie-induzierender Gene eine Bedeutung bei erworbenen sekundären Kardiomyopathien sowie bei der Krankheitsprogression der familiären Formen haben [Chen, 1999]. Daher stellen diese Gene sowie deren regulatorische Sequenzen geeignete Kanditatengene für eine Mutationsanalyse dar. Hierzu zählt auch Cardiotrophin-1 aufgrund seiner Beteiligung an der Hypertrophie und der Apoptosehemmung von Myokardgewebe. So könnten Mutationen z.B. zur Synthese eines funktionslosen Proteins führen. Oder es entstehen Proteine, die aufgrund von Veränderungen bestimmter Erkennungssequenzen bzw. der Konformation, eine veränderte Rezeptorbindung aufweisen. Zusätzlich könnten Varianten auch die Stabilität und somit die Degradation der mRNA bzw des Proteins beeinflussen. Führen diese Veränderungen zu einer gesteigerten oder verminderten [Seite 77↓]Funktion, wären eine Hypertrophie respektive vermehrte Apoptose zu erwarten. Prinzipiell besteht aber auch die Möglichkeit, daß Funktionsausfälle durch andere IL-6-Zytokine, hauptsächlich LIF oder IL-6 kompensiert werden.

Varianten in der Promotorsequenz können ein verändertes Expressionsverhalten verursachen. Eine Zerstörung von Transkriptionsfaktorbindungsstellen würde je nach Beteiligung von Suppressor- oder Enhancersequenzen zu einer Herauf- bzw. Herabregulation führen. Aber auch mutierte Sequenzen, die nicht unmittelbar an der Erkennung durch Transkriptionsfaktoren beteiligt sind, könnten durch eine Beeinflussung der Sekundärstruktur ein verändertes Bindungsverhalten hervorrufen.

Für TNF, einem proinflammatorischem Zytokin, das an der Genese kardialer Erkrankungen, z.B. Myokarditis, beteiligt ist, konnten stabile interindividuelle Unterschiede in der Produktion des Proteins gezeigt werden, die vermutlich auf Vererbung beruhen [Molvig, 1988]. Westendorp [Westendorp, 1997] zeigte, daß bis zu 60 % dieser Variabilität genetisch determiniert sind. Als eine mögliche Ursache wird eine Einzelbasensubstitution im TNF-Promotor (TNF-308A) angenommen. Dieser Polymorphismus konnte mit einer erhöhten Anfälligkeit gegenüber Malaria, Leischmaniose sowie anderen Infektionskrankheiten assoziiert werden [Knight, 1999]. Patel et al zeigten, daß ein TNF-Polymorphismus (306 G/A), der zu einer vermehrten TNF-Expression führt, bei Patienten mit HCM mit einem höheren linksventrikulären Masseindex und einer Erstmanifestation der Erkrankung in jüngerem Alter assoziiert ist [Patel, 2000].

Die Untersuchung der genetischen Variabilität verschiedener kardial exprimierter Gene und deren Beteiligung an komplex vererbten kardiovaskulären Erkrankungen leistet einen wesentlichen Beitrag bei der Aufklärung von Ätiologie und Pathogenese dieser Krankheiten. Zusätzlich könnten sich dadurch Möglichkeiten für kausale Therapiestrategien ergeben. Vorstellbar wären hier zum Beispiel der Einsatz synthetischer Oligonukleotide oder von Rezeptorenblockern zur Verminderung eines schädlichen Einflusses einer Proteinüberexpression. Ein absoluter beziehungsweise relativer Mangel ließe sich durch die Entwicklung synthetischer Proteine ausgleichen.

4.2.1 Die mögliche funktionelle Bedeutung des Aminosäureaustausches im Codon 92

Die Analyse der kodierenden Sequenzen einschließlich der Exon/Intron-Übergänge des CT-1-Gens bei 100 Kontrollpersonen sowie 64 DCM- und 53 HCM-Patienten ergab eine kodierende [Seite 78↓]Variante bei jeweils einem DCM- respektive HCM-Patienten. Beide Patienten waren heterozygot für diese Mutation.

Diese stellt einen Einzelbasenaustausch G→A an der Position +274 dar, der zu einer Substitution von Alanin durch Threonin führt. Dies erfolgt in einer Region, die zwischen den CT-1-Proteinen von Mensch, Maus und Ratte hoch konserviert ist (Abb.16).

Abb. 16: Schematische Darstellung der Aminosäuresequenzhomologien im Bereich von Codon 87 bis 100 zwischen den CT-1-Proteinen von Mensch, Maus und Ratte. Der Pfeil markiert die Aminosäure 92, die durch eine Mutation (G→A) durch Threonin ersetzt wird.

Die Konservierung dieser Aminosäuren weist auf deren mögliche wichtige funktionelle Bedeutung hin. Darüber hinaus ist Alanin eine unpolare, hydrophile Aminosäure. Threonin stellt dagegen eine neutrale, polare und hydrophile Aminosäure dar.

Cardiotrophin-1 gehört aufgrund seiner Sequenz- und Strukturhomologien zur IL-6-Familie. Hierbei geht man von einem Molekül aus, das aus vier antiparallel angeordneten α-Helices mit dazwischen liegenden langen (AB, CD) und kurzen (BC) Aminosäureketten besteht. Robinson et al [Robinson, 1994] analysierten die möglichen Beziehungen zwischen der Struktur von LIF, einem weiteren Protein der IL-6-Familie, und dessen Bindung an die Rezeptoruntereinheiten LIFR sowie gp130. Als Vergleich dienten IL-6 und die Wachstumsfaktoren (GH), deren Struktur-Funktionsbeziehungen bereits analysiert wurden. Besonders letztere gelten als Prototypen für diese Struktur-Funktions-Beziehungen. Alle diese Faktoren besitzen zwei bzw. drei funktionelle Bereiche, die für die Bindung der Signaltransduktionseinheiten verantwortlich gemacht werden (site I, II, III). Es wird postuliert, daß IL-6 über die site I an den IL-6-Rezeptor und über die anderen beiden Regionen an jeweils ein gp130-Molekül bindet [Ciapponi, 1995]. LIF reagiert wahrscheinlich über die entsprechenden Bezirke der sites I und III mit einem einzigen LIF-Rezeptor und über site II mit gp130. Dabei gehören die AS 161-180 am C-terminalen Ende der D-Helix zur site I, Regionen um Ser36 in Helix A und um Ala117 in Helix C zur site II sowie das C-terminale Ende der CD-Verbindungsschleife zur site III [Robinson, 1994; Simpson, 1997].


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Abb. 17: Vergleich der IL-6- und LIF-Struktur der Proteine der Maus. Gezeigt sind die Regionen, deren Beteiligung an der Rezeptorbindung der Proteine der Maus sowie des Menschen angenommen wird. Diese werden als Site I (hellgrau), Site II (dunkelgrau) und Site III (schwarz) bezeichnet. (entnommen aus Simpson, 1997)

Neben diesen funktionell wichtigen Domänen gibt es noch eine Vielzahl weiterer bedeutender Aminosäuren, die an der Speziesspezifität, der Konformation sowie der Rezeptorbindung beteiligt sind. So beeinflussen die AS 1-98 die Aktivität der Bindungsstelle I (site I). [Robinson, 1994]. Ein Vergleich zwischen der LIF- und CT-1-Sequenz zeigt, daß der oben erwähnte konservierte Bereich um Codon 92 am Anfang der B-Helix liegt. (Abb. 18).

Abb. 18: Ausschnitt, entsprechend der Helix B, aus Alignment der humanen CT-1 und LIF-Sequenzen aus (Pennica, 1996b). Konservierte AS zwischen den unterschiedlichen Proteinen CT-1, LIF und CNTF sind gesondert gekennzeichnet (Box). Das Alanin an Position 92 wird durch die hier beschriebene Mutation durch Threonin ersetzt und ist durch einen Kreis und einen Pfeil gekennzeichnet.

Die Sekundärstrukturen von Proteinen lassen sich anhand der Eigenschaften der Aminosäuresequenz vorhersagen. Eine häufig angewandte Methode ist die von Garnier und Osguthorpe [Garnier, 1978]. Der Vergleich zwischen der Wildtyp und der mutierten Sequenz des Cardiotrophins zeigt, daß der hier identifizierte Aminosäureaustausch die korrekte Ausbildung der alpha-Helix stören könnte (siehe Abb. 19).


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Abb. 19: Ausschnitt aus dem Modell der Sekundärstrukturen des Wildtyp (WT) und mutierten Cardiotrophins nach der Methode von Garnier und Osguthorpe . Zu erkennen ist gestörte Ausbildung der alpha-Helix durch die Mutation. H=Helix, E=Faltblattstruktur

Die mögliche Veränderung der Molekülstruktur und die Lage innerhalb eines konservierten Bereiches sowie in einer Region, die die Bindungsaktivität von LIF über bisher noch ungeklärte Mechanismen beeinflusst, weist auf eine mögliche Veränderung der Rezeptoraffinität des im Codon 92 mutierten CT-1 hin.Bindungsstudien in Kulturen kardialer Fibroblasten und Myozyten mit dem mutierten Protein könnten Aufschluß darüber geben, ob diese Variante die Rezeptorbindung tatsächlich verändert. Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit konnte dieser Frage nicht nachgegangen werden.

Die Frage, ob der identifizierte AS-Austausch an der Ausprägung des Phänotyps der Erkrankung in beiden Patienten beteiligt ist, konnte durch diese Arbeit nicht geklärt werden, da es in den Familien beider Patienten anamnestisch keine weiteren Betroffenen gab. Aufgrund der zeitlichen Limitation und des Umfangs der Arbeit wurden die Familienangehörigen nicht rekrutiert und eingehend untersucht. Eine weitergehende Phäno- und Genotypisierung beider Familien ist zur Klärung dieser Frage notwendig. Neben CT-1 könnten auch Mutationen in Sarkomerproteinen die Krankheitsursache bei beiden Patienten darstellen. Das Screening des Troponin-T, β-MHC sowie des Myosin-Bindungsprotein Gens, in denen bisher die häufigsten Varianten beschrieben wurden, konnte keine entsprechenden Varianten bei diesen Patienten nachweisen. Im Rahmen der Hypothese, daß CT-1 als ein modifizierendes Gen fungieren könnte, ist eine Beteiligung an der Krankheitsentwicklung nicht vollständig ausgeschlossen. Falls die Veränderung des Proteins zu einer gesteigerten Rezeptorbindung führt, könnte dies zur Hypertrophie bei beiden Patienten beitragen. Der gegenteilige Effekt könnte über eine verringerte Apoptosehemmung die Progression einer Herzinsuffizienz beeinflußen. Die klinischen Daten beider Patienten lassen zum jetzigen Zeitpunkt allerdings keine Rückschlüsse zu (siehe Tabelle 26).


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4.2.2  Polymorphismus im Promotor an der Position -130

Die SSCP-Analyse der in dieser Arbeit ermittelten Promotorregion des Cardiotrophin-1-Gens ergab einen Einzelbasenaustausch von G → T an der Position -130. Diese Variante fand sich häufiger im DCM-Kollektiv mit 10 von 201 Patienten, wohingegen nur 1 von 53 HCM-Patienten und 3 Kontrollpersonen (n=217) die Substitution aufwiesen. Daraus ergeben sich folgende Allelfrequenzen: DCM 2,5 %, HCM 0,9 % und Kontrollen 0,7 %. In allen Fällen lag die heterozygote Form vor. Die statistische Auswertung ergab, daß der Unterschied zwischen den Häufigkeiten nicht auf dem Niveau von p=0,05 signifikant ist. Es zeigt sich aber ein Trend zu einem häufigeren Auftreten bei Patienten mit DCM. Aufgrund der insgesamt niedrigen Allelfrequenz wäre hier die Untersuchung eines größeren Patientenkollektivs notwendig.

Bei der hier identifizierten Variante handelt es sich um einen Polymorphismus. Polymorphismen finden sich häufiger in nicht-kodierenden Sequenzen, wie z.B. in Promotoren und Intronbereichen. Sie werden oft für Kopplungsstudien eingesetzt. Darüberhinaus können sie aber auch krankheitsätiologisch relevant werden. Durch eine Veränderung von Splice-Acceptor- oder Donor-sites innerhalb von Intronsequenzen können verschiedene mRNA-Splicevarianten entstehen. Varianten im Promotorbereich können je nach Lage spezifische Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren zerstören oder räumlich beeinflussen.

Der im Rahmen dieser Arbeit identifizierte Polymorphismus an Position -130 zerstört keine der bekannten Konsensussequenzen für Transkriptionsfaktoren. Sie liegt aber in einem Abschnitt, der im Luciferase-Reportergen-Assay die höchste Aktivität aufwies. Mit dem Computerprogramm TRANSFAC konnten im Gegensatz dazu nur zwei AP1-Bindungsstellen in dieser Region identifiziert werden. Insgesamt liegt also die Vermutung nahe, daß innerhalb der ersten 200 bp eine Enhancerregion liegen könnte, deren Konsensussequenzen bisher noch unbekannt sind.

Um einen möglichen Einfluß der Variante auf die Transkription des CT-1-Gens zu überprüfen, wurde in der Arbeitsgruppe ein Gelshift (electrophoretic mobility shift assay) durchgeführt. Mit diesem Test wird die Verdrängung radioaktiv markierter Oligonukleotidsonden im mutierten Bereich durch Transkriptionsfaktoren der jeweils verwendeten Zellen analysiert. Für die in dieser Arbeit interessierende Promotorvariante konnte kein verändertes Bindungsverhalten nachgewiesen werden. Dadurch wird ein Einfluß aber nicht endgültig ausgeschlossen, da einige Enhancer und Promotoren nur gewebespezifisch aktiviert werden [Lewin, 2000]. Im Falle des CT-1-Gens müßte also das Bindungsverhalten in menschlichen Kardiomyozyten respektive [Seite 82↓]kardialen Fibroblasten getestet werden. Es wurden hier aber Huvec-Zellen (humane Gefäßendothelzellen aus Nabelschnurgefäßen) eingesetzt. Eine weitere Methode zur Überprüfung des Einflusses des Basenaustausches auf die Transkription wäre der Einsatz des mutierten Allels in ein Luciferase-Reportergen-System. Aber auch dieses Verfahren ist vom jeweiligen Zellkontext abhängig. Da hier hauptsächlich die Bedeutung für die Entwicklung von Kardiomyopathien von Interesse ist, wäre nur die Transfektion in menschliche Kardiomyozyten sinnvoll, um auch das Problem der Gewebespezifität zu berücksichtigen. Menschliche Myokardzellen, insbesondere bereits ausdifferenzierte Zellen, sind aber nur schwer zu gewinnen und in Kultur zu halten. Abgesehen von einer geringen Transfektionseffizienz in solchen Kulturen finden Veränderungen in kultivierten Zellen statt, durch die die Expression spezifischer Gene, unter anderem auch von Transkriptionsfaktoren, verändert wird [Hefti, 1997].

Die Zugänglichkeit trans-aktiver Faktoren zu den entsprechenden Elementen in regulatorischen Genbereichen ist wesentlich von der Verpackung der DNA in Chromatinstrukturen abhängig. Diese wird über Nukleosomen reguliert. Die Aktivierung eines Gens ist somit von der korrekten Formation der Nukleosomen in der Promotorregion abhängig. Die Bindung der Nukleosomen benötigt lange DNA-Abschnitte von ca. 200 bp Länge. Dabei bestimmt die DNA-Sequenz die exakte Position [Wallrath; 1994]. Der hier identifizierte Austausch einer Purinbase (Guanin) durch ein Pyrimidin (Thymin) innerhalb einer Serie von 11 Purinen (A4G7) kann möglicherweisedie korrekte Nukleosomenposition negativ beeinflussen.

Die Apoptose von Kardiomyozyten stellt einen kritischen Faktor beim Übergang der kompensierten Herzinsuffizienz in die dekompensierte Form dar [Narula, 1996; Olivetti, 1997]. Sie ist auch an der Entwicklung der DCM beteiligt. CT-1 wiederum wirkt antiapoptotisch in Myozytenkulturen [Sheng, 1997]. Die kammerspezifische Inaktivierung von gp130, der Signaltransduktionseinheit des CT-1-Rezeptors führte zur Entwicklung eines DCM-ähnlichen Phänotyps bei akuter Druckbelastung aufgrund einer gesteigerten Apoptose der Kardiomyozyten [Hirota, 1999]. Eine verminderte Expression von CT-1, ausgelöst durch eine genetische Variante im Enhancerbereich könnte also in einem verringerten antiapoptotischen Effekt des Zytokins resultieren.

Aufgrund der ungleichmäßigen Verteilung in den drei untersuchten Personengruppen und dem häufigeren Auftreten der Variante bei DCM-Patienten, ist eine pathogenetische Bedeutung im Rahmen des genetischen Hintergrundes vorstellbar. So fällt bei der Betrachtung der klinischen Daten der Patienten auf, daß alle DCM-Patienten vermutlich eine sekundäre Form der Erkrankung aufweisen. Darüberhinaus konnte bei dem HCM-Patienten zusätzlich eine [Seite 83↓]Frameshift-Mutation im Myosin-Bindungsprotein C (MyBPC) identifiziert werden, die zu einem vorzeitigen Stopcodon führt. Bisher ist die Rolle des MyBPC noch ungeklärt. Es ist vermutlich an der Entstehung der dicken Filamente und der Stabilität des Myofilaments beteiligt. Mutationen in diesem Gen gelten allgemein als eher gutartig. Bei unserem Patienten wurde die Erkrankung im Alter von 56 Jahren diagnostiziert. Herzrhythmusstörungen machten die Implantation eines ICD (Implantierbarer Cardioverter Defibrillator) 13 Jahre nach Diagnosestellung notwendig. Unter der Hypothese, daß Cardiotrophin als sogenanntes „modifier-gene“ die Entwicklung oder Ausprägung der Kardiomyopathien beeinflußt, ist es vorstellbar, daß der hier nachgewiesene Promotorpolymorphismus zu einer gestörten CT-1-Expression und damit zu gestörten myokardialen Adaptionsprozessen führt.

Letztendlich bedarf es weitergehender Studien, um eine mögliche funktionelle Bedeutung der hier identifizierten Variante im CT-1-Promotor zu untersuchen. Für die Feststellung einer eventuellen Assoziation mit der Dilatativen Kardiomyopathie ist es notwendig, die Häufigkeit dieser Variante in einem größeren Patienten- und Kontrollkollektiv zu untersuchen. Die hierfür benötigten Fallzahlen liegen je nach Allelfrequenz zwischen 200-2000 Personen [Risch, 1996].

4.2.3 Deletion an den Positionen -992 bis -995 der Promotorregion

Bei einer Patientin, die an der hypertrophen Form der Kardiomyopathie erkrankt war, fand sich eine Deletion der vier Basen CTTT zwischen den Positionen -992 und -995. Die Patientin ist heterozygot für diese Mutation, die bei keiner weiteren Person nachgewiesen wurde.

Durch diese Variante wird keine Konsensussequenz für Transkriptionsfaktoren unmittelbar zerstört. Sie liegt aber nur 9 bp stromaufwärts einer STAT-Bindungsstelle (Position -984). Transkriptionsfaktoren binden an Sequenzen, die über die eigentlichen Konsensussequenzen hinausgehen. Die meisten Faktoren binden an ca. 20 bp, wohingegen die entprechende Konsensussequenz nur bis zu 10 bp einnimmt [Lewin, 2000]. Zusäzlich rückt die CAAT-Box an Position -1045 als Folge der Deletion räumlich näher an die STAT-Bindungsstelle heran. Dies kann zu einer Beeinflussung der Protein-Protein-Interaktionen zwischen den Transkriptionsfaktoren führen. Insgesamt besteht also die Möglichkeit, daß die CT-1-Transkription durch diese Deletion beeinträchtigt wird. Zur Klärung dieser Frage wären, analog zum oben beschriebenen Polymorphismus, ebenfalls weitergehende Studien, idealerweise in menschlichen Myokardzellen, notwendig.


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Interessanterweise besitzt die betroffene Patientin zusätzlich eine stumme Mutation im Gen des kardialen Myosinbindungsprotein C. Da von dieser Patientin keine klinischen oder anamnestischen Daten zu erhalten waren, lassen sich keine näheren Aussagen treffen. Vorstellbar ist aber auch hier eine Kombination aus genetischen Varianten in verschiedenen Genen, die letztendlich zur Ausbildung der Kardiomyopathie geführt hat oder deren Ausprägung und Verlauf beeinflußt.


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4.3  Veränderung des CT-1 mRNA Gehaltes im menschlichen Myokard bei Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz

4.3.1 Nutzung von PDH als Referenzgen

Unter Verwendung einer extern standardisierten RT-PCR-Technik wurde der CT-1 mRNA-Gehalt in menschlichen, rechtsventrikulären Endomyokardbiopsien semiquantitativ bestimmt. Dabei zeigte sich ein signifikanter Anstieg um 82 % bei Patienten mit Herzinsuffizienz.

Aufgrund der variierenden Effizienz des PCR-Verfahrens und des exponentiellen Anstiegs der Kopienzahl führen schon geringfügige Abweichungen zu Schwankungen der Menge des PCR-Produkts, die die exakte Quantifizierung erschweren. Schon geringe Temperaturdifferenzen, Pipettierabweichungen oder verschiedene Mengen an DNA-Polymerase-Inhibitoren im Probengut resultieren in Abweichungen des Produktes zwischen den einzelnen Proben (sample-to-sample) und einzelnen Reaktionsgefäßen (tube-to-tube). Um diese Fehlerquellen zu berücksichtigen und auszugleichen, wurden verschiedene Standardisierungsverfahren eingeführt. Man unterscheidet interne, kompetitive oder nichtkompetitive, sowie externe Standards. Eine einfache und für die semiquantitative Analyse relativ sichere Methode stellt die Wahl einer unverändert exprimierten mRNA dar, die zur Ziel-RNA in Relation gesetzt wird (externe Standardisierung).

Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte die Quantifizierung in Relation zur mRNA der Pyrovat-Dehydrogenase (PDH). Diese stellt einen mitochondrialen Multienzymkomplex dar, der die irreversible Decarboxylierung von Pyrovat zu Acetyl-CoA in Säugern katalysiert. Dadurch werden die Kohlenstoffatome der Kohlenhydrate und Aminosäuren der Oxidation im Zitratzyklus oder der Lipidsynthese zugeführt [Reed, 1974]. Die mRNA dieses Enzyms ist pseudogen-frei und zeigte bereits ein unverändertes Expressionsverhalten in insuffizienten Herzen [Ungerer, 1993]. Dadurch stellt sie einen geeigneten Standard dar.

Die Ergebnisse der hier vorliegenden Untersuchung bestätigen die unveränderte Expression der PDH-mRNA. So lag die Höhe der HPLC-Kurve in allen drei Gruppen zusammen bei 6790 ± 802 (BS: 6889 ± 644; TX: 6799 ± 993; BK: 6576 ± 679). Es bestand kein signifikanter Unterschied zwischen der Expression in den drei Gruppen.


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4.3.2  Mögliche Bedeutung der CT-1-Induktion im insuffizienten Myokard

Im Verlauf der letzten Jahre konnten mehrere Studien die Beteiligung von CT-1 an der Entstehung einer Herzinsuffizienz aufzeigen. So fanden Talwar et al. [Talwar, 1999] einen erhöhten Plasmaproteinspiegel in einer kleinen Patientengruppe sowie eine Korrelation zu einigen funktionellen Parametern. Die in dieser Arbeit nachgewiesene Induktion der CT-1-Expression im Myokard könnte an dieser gesteigerten Proteinsynthese beteiligt sein. Nach Abschluß der hier beschriebenen experimentellen Arbeit wurde diese Annahme durch Zolk et al bestätigt. Neben einem gesteigerten CT-1 mRNA und Proteingehalt im Myokard terminal herzinsuffizienter Patienten zeigte diese Arbeitsgruppe auch eine vermehrte gp130 mRNA Expression bei gleichzeitig reduziertem gp130-Proteingehalt. Das Verhältnis von aktiviertem STAT3 zum totalen STAT3-Gehalt blieb dabei unverändert. Im Endstadium der Erkrankung scheint also einer exzessiven Aktivierung des Signaltransduktionsweges durch eine Rezeptordegradation entgegengesteuert zu werden [Zolk, 2002]. Auch der Angiotensin-Rezeptor Typ I sowie die β-Katecholaminrezeptoren werden im Stadium der terminalen Herzinsuffizienz vermindert exprimiert [Ungerer, 1993]. Dadurch verringert sich die Sensitivität der Myokardzellen gegenüber positiv inotropen Substanzen. Ebenso könnte die Herabregulation der gp130-Rezeptoruntereinheit zu Funktionsverlusten führen.

Unklar ist bisher allerdings die Rolle, die CT-1 in der Pathogenese der Herzinsuffizienz einnimmt. In der hier untersuchten Patientengruppe konnte eine hochsignifikante Korrelation der CT-1 mRNA zur verminderten links- sowie rechtsventrikulären Ejektionsfraktion (p=0,002 bzw. p=0,003) festgestellt werden. Es bleibt aber ungeklärt, ob eine CT-1-Induktion die Ursache oder die Folge der Funktionsverschlechterung darstellt. Auch die Korrelation zur Zunahme der LV-Volumenindizes als Ausdruck einer zunehmenden Ventrikeldilatation weist auf einen möglichen Zusammenhang mit einer Einschränkung der linksventrikulären Funktion hin. Auch für IL-6, das über die gleiche Rezeptoruntereinheit gp130 wirkt, konnte eine positive Korrelation zur Schwere der Herzinsuffizienz nachgewiesen werden [Munger, 1996]. Auch bei dieser Studie blieb der ursächliche Zusammenhang unklar. Diskutiert werden rezidivierende hypoxische Episoden, die in insuffizienten Herzen nachgewiesen werden konnten und zu einer Rechtsverschiebung der Hämoglobindissoziationskurve führen. Dies resultiert in einem Sauerstoffmangelsystem. IL-6 und CT-1 wiederum werden durch hypoxischen Stress induziert. Eine weitere Möglichkeit ist die Erhöhung im Rahmen einer Akut-Phase-Reaktion bzw. eines chronischen Entzündungsprozesses. Da für beide Zytokine bisher ein unmittelbarer zytotoxischer Effekt nicht [Seite 87↓]gezeigt werden konnte, scheint die Hypothese unwahrscheinlich, daß eine gesteigerte Produktion von CT-1 über eine Myokardschädigung zu einer Funktionsverschlechterung führt. Wahrscheinlicher ist es, daß die Induktion der Transkription eine kompensatorische Folge der stattfindenden Myokardveränderungen darstellt. Aufgrund der Ergebnisse von Zolk et al. ist ein Versagen dieser Kompensationsmechanismen im Verlauf der Herzinsuffizienz anzunehmen. Möglich ist trotzdem auch ein schädigender Einfluß von CT-1 auf das Myokard, dem durch eine Rezeptorreduktion entgegensteuert wird. Interessant wäre daher die Beobachtung der Expression der verschiedenen Faktoren des CT-1 Signaltransduktionsweges im zeitlichen Verlauf ausgehend von frühen Stadien.

In Anbetracht der bekannten Funktionen des Cardiotrophin-1 ist die Beteiligung an myokardialen Adaptationsprozessen auf mehreren Wegen vorstellbar. Am wahrscheinlichsten ist eine Beeinflussung der Herzinsuffizienzentwicklung durch CT-1 über eine Kombination dieser Mechanismen.

A) Die Schädigungen, die zu einer Herzinsuffizienz führen, gehen mit einem Verlust kontraktiler Funktionen einher. Das Myokard reagiert darauf unter anderem mit einer kompensatorischen Hypertrophie der intakten Myozyten. Für CT-1 konnte die Induktion der Kardiomyozytenhypertrophie in vitro und in vivo nachgewiesen werden [Pennica, 1995b; Jin, 1996]. Zusätzlich wurde eine gegenseitige Beeinflussung zwischen CT-1 und Angiotensin II im Rahmen der kardialen Hypertrophie festgestellt [Fukuzawa, 2000; Sano, 2000]. CT-1 führt zu einem typischen Bild der Hypertrophie, das durch eine Addition neuer Sarkomere in Serie gekennzeichnet ist [Wollert, 1996]. Dies würde zu einer Umverteilung der erhöhten Wandbelastung auf einere größere Zahl von Myofibrillen führen. Dieser, anfangs sinnvolle, Kompensationsmechanismus bewirkt im längerfristigen Verlauf aber einen gegenteiligen Effekt. Durch eine Verlängerung der Myozyten wird deren Sarkomerfunktion behindert. Außerdem fördert dies die Gefügedilatation. Schließlich bewirkt die Hypertrophie auch eine Zunahme der Diffusionsstrecke und damit eine Beeinträchtigung des Nährstofftransports [Fuchs, 2000]. Tatsächlich bestand in der hier untersuchten Patientengruppe eine Korrelation zwischen der erhöhten CT-1-mRNA-Menge und dem linksventrikulären Masseindex (LVMI) aber nicht mit der enddiastolischen Muskeldicke (LVEDMD). Im Verlauf der DCM kommt es neben einer Dilatation auch zu einer Hypertrophie. Aufgrund der Dilatation und der damit einhergehenden zunehmenden Wandspannung macht sich die Hypertrophie nicht in einer Zunahme der Wanddicke bemerkbar. Aussagen zur Zunahme der Muskelmasse lassen sich daher besser unter Zuhilfenahme des Masseindex treffen. In dessen Berechnung gehen neben der Septum- und Hinterwanddicke auch der enddiastolische Durchmesser und die Körperoberfläche ein.


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B) Entgegen früherer Vorstellungen scheint auch ein unterschiedliches Ausmaß der Apoptose (programmierter Zelltod) bei der Pathogenese der Herzinsuffizienz eine Rolle zu spielen. Die Apoptose folgt einem genetisch determiniertem Programm energieabhängiger molekularer und biochemischer Ereignisse. Da diese Prozesse meistens nur in Zellen beobachtet wurden, die am normalen Zellzyklus teilnehmen, ging man davon aus, daß sie nicht in terminal differenzierten Zellen, wie Neuronen und Myokardzellen stattfinden. Inzwischen konnte aber durch zahlreiche in vitro-Studien und Tiermodelle gezeigt werden, daß eine Vielzahl an Stimuli, wie z.B. postischämische Reperfusion, Myokardinfarkt, schnelle ventrikuläre Schrittmacherstimulation, mechanische Dehnung, Druckbelastung oder Hypertension die Apoptose von Kardiomyozyten induzieren [Colucci, 1996]. Unklarheit herrscht allerdings bezüglich des Ausmaßes und der Beteiligung am Krankheitsprozess. Dies liegt zum Teil an methodischen Problemen sowie an der zeitlichen Limitation des Nachweises apoptotischer Zellen (24 Stunden). So berichteten Narula et al. [Narula, 1996] von 5 bis 35,5 % apoptotischer Zellen. Dieses Ergebnis wurde von verschiedenen Autoren angezweifelt, die deutlich niedrigere Zahlen erhielten. Olivetti et al. [Olivetti, 1997] fanden zwar einen 232-fachen Anstieg der Myozytenapoptose, trotzdem lag der Anteil insgesamt unter 1%. Auch Saraste et al. [Saraste, 1997] wiesen mit einer ähnlichen Methode nur einen Anteil apoptotischer Zellen von 0,08 % bei Patienten mit Herzinsuffizienz (Kontrollen 0,01%) nach. Letztere Ergebnisse sind wahrscheinlicher, da das von Narula et al. beschriebene hohe Vorkommen der Apoptose innerhalb weniger Tage zum Tod der Patienten führen würde. Trotz dieser divergierenden Ergebnisse ist man davon überzeugt, daß die Apoptose eine wichtige Rolle in der Pathogenese und vor allem beim Übergang einer kompensierten in eine dekompensierte Form der Herzinsuffizienz spielt. Für die Induktion der Apoptose werden verschiedene Faktoren verantwortlich gemacht. Zum einen könnten dies mechanische Faktoren, wie z.B. Volumenüberlastung und erhöhte enddiastolische Drücke, sein. Zum anderen kommen Neurohormone in Betracht. Kajstura et al. [Kajstura, 1997] zeigten eine Apoptosesteigerung durch Angiotensin II über den AT1-Rezeptor. Auch ANF, das bei kardialer Hypertrophie verstärkt exprimiert wird, erhöhte den Apoptoseindex in Kardiomyozytenkulturen [Wu, 1997]. Ungeklärt ist bisher die Frage, ob die Apoptose eine frühe Ursache oder ein spätes Ereignis im Endstadium der Herzinsuffizienz darstellt. Wie bereits im Kapitel 1 dargestellt, kann CT-1 antiapoptotisch wirken. Dieser Effekt scheint über verschiedene Signalwege vermittelt zu werden. Zum einen können Hitzeschockproteine [Stephanou, 1998] beteiligt sein. Zum anderen wurde die Induktion von NF-κB und Bcl-xl, zwei Transmittern der Antiapoptose, nachgewiesen [Middleton, 2000; Kuwahara, 2000]. Die gesteigerte CT-1 Expression im Myokard [Seite 89↓]herzinsuffizienter Patienten könnte demzufolge eine Gegenregulation gegen eine gesteigerte Apoptose darstellen.

C) Verschiedene Studien zeigten außerdem eine Beteiligung proinflammatorischer Zytokine an der Entwicklung einer Herzinsuffizienz. Dazu gehört auch der Tumor-nekrose-faktor (TNF) α. Dieser bewirkt neben einer negativen Inotropie auch eine direkte Zytotoxizität. Benigni et al. [Benigni, 1996] konnten zeigen, daß CT-1 die TNF-Produktion im Herzen und im Serum von Mäusen nach der Gabe von Lipopolysaccharid (LPS) hemmt. Dies unterstreicht die bereits oben erwähnte mögliche Beteiligung von CT-1 an Kompensationsmechanismen, die der Zerstörung von Myokardgewebe und der Beeinträchtigung der Herzfunktion im Rahmen verschiedener pathologischer Einflüsse auf das kardiovaskuläre System entgegenwirken. Vorstellbar ist in diesem Zusammenhang eine Störung des Gleichgewichts zwischen Schädigung und Reparaturmechanismen, wodurch es zur Verschlechterung der Myokardfunktion kommt.

D) Im Rahmen einer Herzinsuffizienz entwickelt sich häufig eine endotheliale Dysfunktion, die zu einer gestörten Gewebeperfusion führt. Eine beeinträchtigte Mikrozirkulation z.B. des Myokards führt wiederum zur Ischämie, einer weiteren Gewebezerstörung und zur kardialen Dysfunktion [Kiowski, 1998]. Die Durchblutungsstörungen scheinen durch proinflammatorische Zytokine ausgelöst zu werden. So konnten Vanderheyden et al. [Vanderheyden, 1998] einen Zusammenhang zwischen erhöhten Zytokinleveln (TNF) und einer verminderten endothelabhängigen Vasodilatation im Gefäßkreislauf des Unterarms von Herzinsuffizienzpatienten aufdecken. Dies wird wahrscheinlich teilweise durch die Aktivierung des Renin-Angiotensin-Systems andererseits aber auch durch eine gesteigerte Produktion freier Sauerstoffradikale sowie eine gestörte NO-Produktion bewirkt. Schon 1982 berichteten Zelis et al [Zelis, 1982] über einen gesteigerten Vasomotorentonus und eine verminderte Vasodilatation bei körperlicher Anstrengung bei Patienten mit Herzinsuffizienz. Für Cardiotrophin-1 konnte in vivo nachgewiesen werden, daß die intravenöse Gabe zu einer Verminderung des arteriellen Mitteldrucks und damit zur Abnahme des totalen peripheren Widerstands führt [Jin, 1998]. Diese Effekte werden teilweise über die induzierbare NO-Synthase (iNOS) vermittelt [Hamanaka, 2000]. Denkbar ist also, daß CT-1 neben einem direkten Einfluß auf das Myokard auch über eine Senkung der Vorlast und damit Entlastung des Myokards kompensatorisch auf die pathologischen Prozesse bei der Entwicklung einer Herzinsuffizienz wirkt. Dieser Mechanismus muß allerdings kritisch betrachtet werden, da in den meisten physiologischen Zusammenhängen Zytokine lokal auto-, para- bzw. juxtakrin wirken. Die biologische Wirkung ist also nicht nur von den Zielzellen, sondern auch vom intrazellulären Milieu und dem biologischen Kontext der Zytokinaktivierung abhängig. Demzufolge sind die Ergebnise einer [Seite 90↓]systemischen bzw. in vitro Gabe rekombinanter Zytokine vorsichtig zu interpretieren [Nathan, 1991; Kelly, 1997].

4.3.3 Limitationen der Untersuchung

Obwohl die Ergebnisse der mRNA-Quantifizierung mit anderen Studien weitgehend übereinstimmen, müssen einige Faktoren berücksichtigt werden, die die Aussagekraft der gefundenen Resultate negativ beeinflussen.

Die hier untersuchte Patientengruppe ist nicht groß genug, um sichere Aussagen treffen zu können. Der limitierende Faktor für eine weitergehende mRNA-Quantifizierung war hierbei die eingeschränkte Verfügbarkeit des Materials (Biopsien), da dieses nur durch invasive Verfahren gewonnen werden kann. Notwendig wäre auch eine Quantifizierung der CT-1 Proteinmenge sowie der mRNA und Proteinlevel weiterer Faktoren des Rezeptorsystems. Weiterhin müßte neben einem externen auch ein interner Standard eingesetzt werden, um mögliche Fehlerquellen auszugleichen.

Talwar et al. [Talwar, 2000] führten Korrelationsanalysen zwischen der Höhe der Proteinmenge im Plasma und einigen echokardiographischen Daten in einer Gruppe von 15 Patienten und 15 Kontrollen durch. Auch hierbei ergab sich ein statistischer Zusammenhang mit funktionellen Parametern. Bestätigt wurden diese Ergebnisse kürzlich durch die umfangreicheren Analysen von Zolk et al (8 Kontrollen, 23 Patienten) [Zolk, 2002].


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03.06.2004