Aus dem Deutschen Herzzentrum Berlin
Abteilung für Kardiologie
Stiftung des Bürgerlichen Rechts

DISSERTATION

Rolle von Cardiotrophin-1 für die Pathogenese von Kardiomyopathien: Genetische Variabilität und Regulation der Expression im menschlichen Myokard

Zur Erlangung des akademischen Grades
Dr. medicinae (Dr. med.)

Vorgelegt der Medizinische Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

Von
Sabine Haßfeld

Dekan: Prof. Dr. Joachim W. Dudenhausen

Gutachter:
1. Prof. Dr. med. V. Regitz-Zagrosek
2. Prof. Dr. med. J. Holtz
3. PD Dr. med. G. Nickenig

eingereicht: 04.07.2003

Datum der Promotion: 23.04.2004

Abstrakt

Cardiotrophin-1 ist ein Zytokin der Familie Interleukin-6-Familie, zu der auch IL-11, CNTF, OSM und LIF gehören. Diese Substanzen wirken über die gemeinsame Rezeptoruntereinheit gp130.

CT-1 induziert die Hypertrophie von Kardiomyozyten und inhibiert die Apoptose kardialer und Zellen. In verschiedenen Tiermodellen der Herzinsuffizienz konnte eine gesteigerte myokardiale CT-1 Expression beobachtet werden.

Kardiomyopathien sind wiederum kardiale Erkrankungen, die mit einer Hypertrophie und Apoptose einhergehen und zu einer Herzinsuffizienz führen können. Man geht davon aus, dass 25-50 Prozent der familiär sind. Hierbei handelt es sich um eine monogenetische Erkrankung, die überwiegend autosomal-dominant vererbt werden. Daneben konnten aber auch modifizierende Polymorphismen in neurohumoralen Faktoren identifiziert werden.

Basierend auf diesen Ergebnissen war das Ziel dieser Arbeit die Analyse der möglichen Beteiligung genetischer Varianten der kodierenden sowie der regulatorischen Region an der Pathogenese der Hypertrophen bzw. Dilatativen Kardiomyopathie. Zusätzlich sollte die mRNA-Expression von CT-1 in Myokardbiopsien von Patienten mit Herzinsuffizienz quantifiziert werden.

Hierfür musste zunächst die Sequenzen der 5´-flankierenden Region identifiziert und bezüglich ihrer regulatorischen Eigenschaften analysiert werden. Es konnten 1,1 kb der 5´-flankierenden Region sequenziert werden. Die anschließende Luciferase-Reportergen-Analyse wies regulatorische Aktivitäten für den gesamten Bereich nach. Diese Region enthält zahlreiche cis-aktive DANN-Sequenzen aber keine TATA-Box.

Für die Mutationssuche wurden 64 Patienten mit DCM, 53 Patienten mit HCM sowie 100 Kontrollpersonen mittels PCR-SSCP-Analyse untersucht. Es konnte eine kodierende Variante A92T bei jeweils einem DCM- bzw. HCM-Patienten identifiziert werden. Diese Substitution liegt in einem Bereich, der zwischen verschiedenen Spezies (Ratte, Maus, Mensch) konserviert ist. Diese Mutation könnte eine Veränderung der Sekundärstruktur bewirken und liegt in einem möglichen funktionellen Bereich.

Die Promotorregion wies eine Basenpaarsubstitution bei -130 (G/T) sowie eine Deletion der Basen CTTT zwischen -992 und -995 auf. Der Polymorphismus an Position -130 fand sich tendenziell häufiger bei Patienten mit Dilatativer Kardiomyopathie. Die CTTT-Deletion konnte nur bei einer Patientin mit HCM nachgewiesen werden.

Für die Quantifizierung der CT-1 mRNA wurden rechtsventrikuläre Endomyokardbiopsien von 6 Patienten mit eingeschränkter LVEF (CHI), 5 Patienten nach Herztransplantation (TX) sowie 3 Kontrollpatienten (KO) eingesetzt. Es konnte ein relativer Anstieg der CT-1 Expression um 82% bei den Patienten mit eingeschränkter LVEF festgestellt werden. Interessanterweise besteht eine enge Korrelation zur Schwere der eingeschränkten Herzfunktion sowie zur Zunahme der Hypertrophie.

Eigene Schlagworte: Cardiotrophin-1, CT-1, Interleukin-6, IL-6, IL-11, LIF, CNTF, OSM, gp130, Hypertrophie, Apoptose, Herzinsuffizienz, Hypertrophe Kardiomyopathie, HCM, Dilatative Kardiomyopathie, DCM, Promotor, Muatation, mRNA-Expression, PCR, SSCP, Luciferase Reportergen Analyse, HPLC

Abstract

Cardiotrophin-1 is a cytokine, which belongs to the interleukin-6 family, which includes IL-11, CNTF, OSM and LIF. These factors act via the receptor subunit gp130.

CT-1 induces the hypertrophy of cardiomyocytes and inhibits the apoptosis of cardiac cells. Studies in animal models of congestive heart failure showed an enhanced expression of CT-1 in the myocardium.

Cardiomyopathies are cardiac diesorders, which are charakterized by hypertrophy and apoptosis and which can terminate with congestive heart failure. About 25-50 percent of all cases are familial. It is a monogenetic mendelian disorder with an autosomal-dominant inheritance in most cases. Beside this, modifying polymorphisms in neurohunoral factors could be identified.

Based on these facts, the aim of this study was to identify genetic variants within the coding and regulatory region of the CT-1 gene, which could influence the pathogenesis of hypertrophic or dilated cardiomyopathy. Additionally, the mRNA-expression of CT-1 in myocardial biopsies of heart failure patients should be quantified.

First, it was necessary to sequence the 5´-untranslated region and to analyse its regulatory function. We could sequence 1.1 kb of the 5´-UTR. The luciferase reportergene assay showed a significant promoter activity for the whole region. The region contains various cis-active DNA sequences but no TATA-box.The TRANSFAC-analysis identified different binding sites for transcription factors but no TATA-box.

The genetic material of 64 DCM and 53 HCM patients and 100 controls was screened for mutaions by using a PCR-based SSCP-analysis. A coding variant A92T could be identified for a patient with DCM and for an HCM patient. This mutation lies within a region which is conserved between different species (rat, mouse, human). This variant could disturb the secondary structure and lies in a probable functional region.

Within the promoter we could identify a basepair substitution at position -130 (G/T) and a 4-basepair deletion between -992 and -995 (CTTTdel). The polymorphism at –130 showed a tendency for a higher occurrence in DCM patients. One HCM patient was heterozygous for the CTTT-deletion.

To quantify the CT-1 mRNA we used endomyocardial biopsies of 6 patients with reduced LVEF (CHI), 5 patients after heart transplantation (TX) and 3 controls (KO). We performed a semiquantitative analysis by using HPLC and an external standard (PDH mRNA). We found an increased expression of CT-1 by 82% for patients with heart failure. Interestingly, we saw a tight correlation with to the reduction in LV function and to the degree of hypertrophy.

Keywords: cardiotrophin-1, CT-1, interleukin-6, IL-6, IL-11, LIF, CNTF, OSM, gp130, hypertrophy, apoptosis, heart failure, hypertrophic cardiomyopathy, HCM, dilated cardiomyopathy, DCM, promoter, muatation, mRNA-expression, PCR, SSCP, luciferase reportergene assay, HPLC

Publikationen:

Erdmann, J., S. Hassfeld, et al. (2000). ”Genetic variants in the promoter (g983G>T) and coding region (A92T) of the human cardiotrophin-1 gene (CTF1) in patients with dilated cardiomyopathy.” Hum Mut 16 (5): 448

Erdmann, J.,Hassfeld, S. et al. (1998).”Cloning and characterization of the 5´-flanking region of the human Cardiotrophin-1 gene.” Biochem and Biophys Res Comm 244: 494-497.

Kongressbeiträge:

47^th Annual Meeting of the American Society of Human Genetics, 1997, Baltimore, “Identification of a coding variant (Ala92Thr) in the human cardiotrophin-1 gene and cloning of the promoter” Am J Hum Genet, 1997, 61 (4), A332, Abstract (Nr. 1944)

10. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Humangenetik, 1998, Jena, „“Cloning and charakterization of the 5´flanking region of the human Cardiotrophin-1 gene (CT-1)“ Medizinische Genetik, 1998, 10 (1), Abstract P6C-5

64. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Kardiologie, 1998, Mannheim, „Identifizierung und Charakterisierung von Varianten in der kodierenden Region und im Promotor des humanen Cardiotrophin-1 Gens“ sowie „ Klonierung und Charakterisierung des Promotors des humanen Cardiotrophin-1 Gens“ Zeitschr Kardiol, 1998, 87 (I), 199, Abstract (Nr. 778) und 266, Abstract (Nr. 989)

American Heart Association 71^th Scientific Session, 1998, Dallas “Cloning and characterization of the promoter of the human cardiotrophin-1 (CT-1) and identification of genetic variants in 208 patients with dilated cardiomyopathy” Circ, 1998, Nov (Suppl.), I-245, Abstract (Nr. 1274)

20^th Congress of the European Society of Cardiology, 1998, Wien, “Identification and characterization of variants within the coding and the promoter region of the human cardiotrophin-1 gene” sowie “Cloning and characterization of the 5´flanking region of the human cardiotrophin-1 gene” Eur Heart J, 1998, 19 (Suppl.), 37, Abstract (Nr. P422) und 483 (Nr. 2754)

Inhaltsverzeichnis

• 1  Einleitung
  • 1.1 Kardiomyopathien
    • 1.1.1 WHO/ISFC-Klassifikation
    • 1.1.2 Dilatative Kardiomyopathie
    • 1.1.3  Hypertrophe Kardiomyopathie
  • 1.2 Cardiotrophin-1 und die Interleukin-6-Familie
    • 1.2.1 Protein- und Genstruktur, Chromosomenlokalisation und Einordnung von Cardiotrophin-1
    • 1.2.2 Expressionsmuster von Cardiotrophin-1
    • 1.2.3 Rezeptorsysteme und Signaltransduktionswege der Interleukin-6-Familie
    • 1.2.4 Kardiale Wirkungen von Cardiotrophin-1
    • 1.2.5 Wirkungen auf extrakardiale Gewebe
  • 1.3  Zielstellung der Arbeit
• 2  Material und Methoden
  • 2.1 Materialien
    • 2.1.1 Geräte
    • 2.1.2  Chemikalien
    • 2.1.3 Komplette Kits
    • 2.1.4  Patientenkollektiv für das Mutationsscreening in der kodierenden Region und im Promotor
    • 2.1.5 Patientenkollektiv für die Quantifizierung der Cardiotrophin-1 mRNA
    • 2.1.6 Synthetische Oligonukleotide ( Primer )
  • 2.2  Methoden
    • 2.2.1 Überblick
    • 2.2.2 Klonierung und Sequenzierung der 5´-untranslatierten Region
    • 2.2.3 Funktionsanalyse der 5´-untranslatierten Region
      • 2.2.3.1 Herstellung und Klonierung der 5´-Deletions-Fragmente
      • 2.2.3.2  Transfektion der COS-7 Zellen
      • 2.2.3.3  Luciferase-Assay und β-Galaktosidase-Assay
    • 2.2.4  Variantensuche in der kodierenden und 5´-untranslatierten Region des humanen Cardiotrophin-1 Gens
      • 2.2.4.1 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR, polymerase chain reaction )
      • 2.2.4.2  Einzelstrang-Konformationsanalyse (Single-strand-conformation-polymorphism-(SSCP)-analysis)
      • 2.2.4.3 Klonierung von PCR-Fragmenten
      • 2.2.4.4 Sequenzierung der DNA
      • 2.2.4.5 Direkte Sequenzierung des PCR-Produktes
      • 2.2.4.6 Restriktionsfragment-Längen-Polymorphismus (RFLP)-Analyse
      • 2.2.4.7 Amplification created Restriction Site-(ACRS-)Assay
    • 2.2.5  Quantifizierung der mRNA des humanen CT-1- Gens in Myokardbiopsien
      • 2.2.5.1  RNA-Isolierung aus Myokardbiopsien
      • 2.2.5.2 Reverse Transkription (RT)
      • 2.2.5.3 Polymerase Kettenreaktion der cDNA
      • 2.2.5.4 High-Pressure-Liquid-Chromatography (HPLC, Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie)
      • 2.2.5.5 Statistik
• 3  Ergebnisse
  • 3.1 Charakterisierung der 5´-untranslatierten Region des humanen Cardiotrophin-1 Gens
    • 3.1.1 Sequenz des 1113 bp langen 5´-flankierenden Bereichs des humanen CT-1 Gens und mögliche Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen
  • 3.2  Promotor-Aktivität der 5´-untranslatierten Region des humanen Cardiotrophin-1 Gens
  • 3.3  Varianten in der kodierenden Region des humanen Cardiotrophin-1 Gens
    • 3.3.1 Variante an der Position +274 im Codon 92
  • 3.4 Varianten innerhalb der 5´-flankierenden Region des humanen Cardiotrophin-1 Gens
    • 3.4.1  Polymorphismus an der Position -130
    • 3.4.2  Variante an den Positionen -992 bis -995
  • 3.5 CT-1 mRNA-Expression in menschlichem Myokardgewebe
    • 3.5.1 CT-1 mRNA Quantifizierung
    • 3.5.2 Korrelation der CT-1 mRNA Expression mit der linksventrikulären Funktion
• 4  Diskussion
  • 4.1 Die 5´-untranslatierte Region des humanen Cardiotrophin-1-Gens
    • 4.1.1 Sequenzanalyse: Konsensussequenzen für Transkriptionsfaktoren
    • 4.1.2 Die regulatorische Funktion des Promotors des humanen CT-1-Gens
  • 4.2  Genetische Variabilität im kodierenden und regulatorischen Bereich des humanen Cardiotrophin-1-Gens und ihre mögliche Bedeutung in der Ätiologie von Kardiomyopathien
    • 4.2.1 Die mögliche funktionelle Bedeutung des Aminosäureaustausches im Codon 92
    • 4.2.2  Polymorphismus im Promotor an der Position -130
    • 4.2.3 Deletion an den Positionen -992 bis -995 der Promotorregion
  • 4.3  Veränderung des CT-1 mRNA Gehaltes im menschlichen Myokard bei Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz
    • 4.3.1 Nutzung von PDH als Referenzgen
    • 4.3.2  Mögliche Bedeutung der CT-1-Induktion im insuffizienten Myokard
    • 4.3.3 Limitationen der Untersuchung
• 5  Zusammenfassung
• Abkürzungen
• Literaturverzeichnis
• Eidesstattliche Erklärung

Tabellen

• Tab. 1: Bekannte genetische Ursachen der Dilatativen Kardiomyopathie
• Tab. 2: Bekannte Gene und Genorte der Hypertrophen Kardiomypathie
• Tab. 3: Patientenkollektiv fürdie Mutationssuche in der codierenden und 5´- untranslatierten Region. Alle Angaben in Mittelwert (MW) ± Standardabweichung (SD)
• Tab. 4: Erweitertes Patientenkollektiv für das Fragment "ct1gap6". (MW±SD)
• Tab. 5: Charakteristika des Patientenkollektivs für die mRNA-Quantifizierung. (MW±SD)
• Tab. 6: Ergebnisse der RNA-Extraktion. (CHI=Chronische Herzinsuffizienz, KO=Kontrollen, TX=Transplantat)
• Tab. 7: Klinische Daten der Patienten mit eingeschränkter linksventrikulärer Ejektionsfraktion (LVEF). ACEI= ACE-Hemmer, COLD=Chronisch Obstruktive Lungenerkrankung, CHI=Chronische Herzinsuffizienz, DCM=Dilatative Cardiomyopathie
• Tab. 8: Klinische Daten der Patienten aus den beiden Kontrollgruppen. KO=Kontrollen, TX=Transplantat
• Tab. 9: Daten der links- und rechtsventrikulären Katheterisierung der Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz. EDV=Enddiastolisches Volumen, ESV= Endsystolisches, Volumen, EDMD= Enddiastolische Muskeldicke, LVMI= Linksventrikulärer Masseindex, SVI= Schlagvolumenindex, RVEF= Rechtsventrikuläre Ejektionsfraktion.
• Tab. 10: Daten der links- und rechtsventrikulären Katheterisierung der Kontrollgruppen. KO=Kontrollen, TX= Patienten nach Herztransplantation, EDV=Enddiastolisches Volumen, ESV= Endsystolisches, Volumen, EDMD= Enddiastolische Muskeldicke, LVMI= Linksventrikulärer Masseindex, SVI= Schlagvolumenindex, RVEF= Rechtsventrikuläre Ejektionsfraktion.
• Tab. 11: Immunsuppressive Behandlung der Patienten nach Herztransplantation
• Tab. 12: Oligonukleotidsequenzen für die Klonierung der 5´-flankierenden Region
• Tab. 13: Vorwärtsprimer für die Amplifizierung der Promotorkonstrukte. Zur Lage der Primer siehe Tabelle 16 im Kapitel 2.2.4.1.
• Tab. 14: Charakteristika der zur Klonierung eingesetzten Restriktionsenzyme
• Tab. 15: Charakteristika der Primerpaare für den kodierenden Bereich des humanen CT-1 Gens.
• Tab. 16: Charakteristika der Primerpaare für die 5´-untranslatierte Region des humanen CT-1 Gens.
• Tab. 17: Reaktionsbedingungen der Primerpaare für die Mutationssuche im kodierenden Bereich sowie der 5´-UTR.
• Tab. 18: Spezifische Sequenzierungsprimer für den pCR 2.1-TOPO-Vektor
• Tab. 19: Charakteristika der für die RFLP eingesetzten Restriktionsendonuklease
• Tab. 20: Charakteristika der "mismatch"-Primer für den Artificial-Created-Restriction-Site(ACRS)-Assay.
• Tab. 21: Reaktionsbedingungen der Primerpaare, die im ACRS-Assay eingesetzt wurden
• Tab. 22: Restriktionsendonukleasen, die beim ACRS-Assay zum Einsatz kamen
• Tab. 23: Primerpaar für die Amplifikation und Sequenzierung des zentralen Segmentes der 1.1 kb langen 5´-UTR des humanen Cardiotrophin-1 Gens
• Tab. 24: 5´-terminal deletierte Fragmente für die Funktionsanalyse der 5´-UTR des humanen CT-1 Gens
• Tab. 25: Ergebnisse der Luciferase-Aktivitätsmessung (n=3) nach der Normalisierung mit den entsprechenden ß-Galaktosidase-aktivitäten
• Tab. 26: Klinische und funktionelle Parameter der Patienten mit der G274A-Mutation im Codon 92 des humanen CT-1-Gens
• Tab. 27: Gegenüberstellung der nach dem Hardy-Weinberg-Gesetz erwarteten und in dieser Arbeit beobachteten Genotypfrequenzen für den identifizierten Polymorphismus (G->T). GG=Wildtyp, GT=Heterozygot, TT=Homozygot für Variante. Der Chi-Quadrat-Test zeigt keinen signifikanten Unterschied.
• Tab. 28: Chi-Quadrat-Test des Unterschieds der Allelfrequenzen aller drei Gruppen (DCM, HCM und Kontrollen) für die Basenpaarsubstitution G zu T an Position –130 der 5´-UTR (2 Freiheitsgrade).
• Tab. 29: Chi-Quadrat-Test zum Vergleich der Allelfrequenzen der DCM-Patienten und Kontrollen (1 Freiheitsgrad, Yates-Korrektur).
• Tab. 30: Anamnestische und klinische Daten aller Patienten, bei denen der Polymorphismus im Promotor nachgewiesen werden konnte.
• Tab. 31: Echoparameter der Patienten mit dem Promotorpolymorphismus
• Tab. 32: Katheterdaten für Patient Nr. 240
• Tab. 33: Ergebnisse der HPLC-Analyse der Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz (LVEF<40%).
• Tab. 34: Ergebnisse der HPLC-Analyse der Patienten mit normaler LVEF.
• Tab. 35: Ergebnisse der HPLC-Analyse der Patienten nach Transplantation (LVEF>45%).
• Tab. 36: Korrelation der relativen CT-1-mRNA-Expression zu Funktionsparametern

Bilder

• Abb. 1: Prinzip der Expressions-Klonierung, das zur Identifizierung von Cardiotrophin-1 führte , ICM= innere Zellmasse, ES-cells= Embryonale Stammzellen, MLC-2v/a= ventrikuläre/atriale Myosin-Leichtkette-2, ANF= Atrialer natriuretischer Faktor, NRVM= neonatale Ratten Ventrikelkardiomyozyten [Wollert, 1997]
• Abb. 2: mRNA-Expressionsmuster von CT-1 in verschiedenen humanen Geweben. A: Hybridisierung mit CT-1-Probe, B: Rehybridisierung derselben Blots mit einer Aktin-Probe (aus Pennica, 1996b)
• Abb. 3: Rezeptorkomplexe der IL-6-Familie. Die gp130-Untereinheit wird von allen Familienmitgliedern benutzt. CT-1, CNTF, LIF und OSM bilden Heterodimere aus gp130 und dem LIF-Rezeptor [aus Hibi, 1996].
• Abb. 4: Vereinfachtes Schema der intrazellulären Signaltransduktion nach CT-1-Stimulation. Bisherige Studien weisen auf eine Beteiligung von STAT3 bei der Hypertrophie und von STAT1 sowie dem MAPK-Signalweg bei der Apoptose hin. Darüberhinaus existieren vermutlich weitere Signalwege sowie Querverbindungen. [aus Wollert, 1997]
• Abb. 5: Vereinfachte Darstellung der möglichen Signaltransduktionswege über die CT-1 die Faktoren p38, Akt, ERK aktivieren könnte, und wie diese möglicherweise gemeinsam in eine NF-κB-Aktivierung münden. Verschiedene Studien weisen auf die zentrale Rolle dieses Faktors bei der Zytoprotektion hin. Nicht dargestellt sind die NF-κB-unabhängigen Wege über Akt, ERK und p38 die ebenfalls an der Antiapoptose beteiligt sind. [aus Craig, 2001]
• Abb. 6: Prinzip des ACRS-Assay. Darstellung anhand der Variante +274 G→A im Fragment "ct1exon3.2.". Die Sterne markieren die Position des "mismatch"; die Pfeile die Position der Variante.
• Abb. 7: Graphische Darstellung der HPLC-Daten des Plateauversuches für CT-1. Da die Amplifizierung der PCR-Produkte einer exponentiellen Funktion folgt, wurden die Daten logarhythmisch aufgetragen. Es ist zu erkennen, daß bei einer Zyklenzahl von 30 die Vervielfältigung der Proben noch sicher im linear ansteigenden Bereich liegt. Das Plateau beginnt bei einer Zyklenzahl von ca. 36.
• Abb. 8: Sequenz der 5´-untranslatierten Region des humanen Cardiotrophin-Gens. Unterstrichen sind die zur Herstellung der Deletionsfragmente eingesetzten Primer (CT1F-CT6F und CT1ex1R). Die Numerierung erfolgte ausgehend vom ATG-Startcodon im Exon 1. Konsensussequenzen für Transkriptionsfaktorbindungsstellen (entsprechend der TRANSFAC-Analyse) sind durch den jeweiligen Faktor markiert. Die Sequenz wurde in der EMBL-Datenbank mit der Zugangsnummer AJ002743 registriert.
• Abb. 9: Basale Promotoraktivität der sechs 5´-terminalen Deletionsfragmente. COS-7-Zellen wurden mit Konstrukten transfiziert, die Fragmente der 5´-flankierenden Region des humanen CT-1-Gens (quergestreifte Boxen) enthielten. Diese wurden in die „upstream“-Region des Luciferase-Gens (offene Box) integriert. Die mittlere relative Luciferaseaktivität (Balkendiagramm rechts) wurde durch mindestens drei Transfektionen bestimmt und im Vergleich zur β-Galaktosidaseaktivität normalisiert. Alle Daten werden in Relation zum pGL3basic-Vektor (Aktivität =1) dargestellt.
• Abb. 10: Aufbau des humanen Cardiotrophin-1-Gens. Es handelt sich um eine nicht-maßstabgerechte Darstellung. Die Größe der Introns ist unbekannt. Schematisch dargestellt ist außerdem die ungefähre Lage der PCR-Fragmente.
• Abb. 11: A) Darstellung des aberranten Laufverhaltens des HCM-Patienten mit der G274A-Mutation im Codon 92 in der SSCP bei 4°C. Es zeigten sich zwei zusätzliche Banden (Pfeile). Spur 1: Marker, Spuren 2-11: Patienten mit gleichem Laufverhalten (Wildtyp), Spur 12: HCM-Patient mit abweichendem Muster B) RFLP mit Taq I.Spur 1: DCM-Patient mit Mutation, Spur 2: HCM-Patient mit Mutation, Spuren 3-7: Patienten mit Wildtyp, Spuren 8+9: Marker. Zu erkennen sind zwei Banden (entsprechend 171 und 156 bp, Pfeile) bei beiden Mutationsträgern (heterozygot). Alle übrigen Patienten weisen wie erwartet nur eine Bande bei 171 bp auf.
• Abb. 12: A) SSCP-Gel mit Darstellung des aberranten Laufmusters bei drei Patienten (Spuren 3, 6 und 8) mit dem G zu T-Austausch an der Position –130 im Promotorfragment „ct1gap6“, Spur 1: Marker, Spuren 2,4,5,7,9,10: Patienten mit Wildtyp. B) Restriktionsverdau mit MnlI. Es zeigen sich zwei Banden (entsprechend 104und 119 bp) bei einem heterozygoten Patienten mit dem Polymorphismus (Spur 4). Im Vergleich dazu weisen Patienten mit dem Wildtyp nur eine Bande mit 119 bp auf (Spuren 1,2,5,6)
• Abb. 13: A) Ausschnitt aus einem SSCP-Gel bei Raumtemperatur für das Promotorfragment „ct1Prom1F/ct1prb“. Es sind bei einer Patientin (Spur 4) zwei zusätzliche Banden zu erkennen. Spur 1: Marker, Spuren 2-3 + 5-6: Patienten mit Wildtyp. B) Restriktionsverdau mit EarI. Bei der Patientin mit der CTTT-Deletion (Spur 9) sind deutlich drei Banden (entsprechend 131, 75 und 59 bp, Pfeile) zu erkennen. Alle übrigen Patienten (Spuren 2-8) weisen wie erwartet nur eine Bande mit ca. 131 bp auf. Spur 1: Marker
• Abb. 14: Box-and-Whisker-Plot-Diagramme mit Darstellung der HPLC-Daten der mRNA-Quantifizierung für CT-1 und PDH. A): Mittelwertverteilung der HPLC-Peakhöhen für CT-1, B): Mittelwertverteilung der HPLC-Höhen für PDH, C): Verteilung der Quotienten aus CT- 1 und PDH (relative mRNA-Expression). Zu erkennen sind eine höhere CT-1-Expression in der Patientengruppe mit Herzinsuffizienz sowie eine gleiche Expression der PDH-mRNA in beiden Gruppen (CHI vs. KO+TX). CHI: Patienten mit verminderter LVEF; Kontrollen: aufgrund der geringen Patientenzahlen wurden beide Subgruppen der Patienten nach Transplantation (TX) sowie der Patienten mit normaler LVEF (KO) zusammengefasst, Box-Plot: Werte innerhalb der Box liegen zwischen der 25%- und 75%-Quantile, waagerechte Linie in der Box entspricht dem Median, senkrechte Linien mit waagerechter Begrenzung (Whisker) entsprechen 5%- bzw. 95%-Quantile, außerhalb liegende Punkte entsprechen Extremwerten
• Abb. 15: Graphische Darstellung der Korrelation zwischen kardialen Funktionsparametern und der relativen CT-1-Expression (CT-1/PDH). Zu erkennen ist eine negative Korrelation zwischen der links- und rechtsventrikulären Ejektionsfraktion (LVEF, RVEF) sowie eine positive Korrelation mit den enddiastolischen und endsystolischen Volumenindizes (LVEDVI, LVESVI) und dem Masseindex (LVMI).
• Abb. 16: Schematische Darstellung der Aminosäuresequenzhomologien im Bereich von Codon 87 bis 100 zwischen den CT-1-Proteinen von Mensch, Maus und Ratte. Der Pfeil markiert die Aminosäure 92, die durch eine Mutation (G→A) durch Threonin ersetzt wird.
• Abb. 17: Vergleich der IL-6- und LIF-Struktur der Proteine der Maus. Gezeigt sind die Regionen, deren Beteiligung an der Rezeptorbindung der Proteine der Maus sowie des Menschen angenommen wird. Diese werden als Site I (hellgrau), Site II (dunkelgrau) und Site III (schwarz) bezeichnet. (entnommen aus Simpson, 1997)
• Abb. 18: Ausschnitt, entsprechend der Helix B, aus Alignment der humanen CT-1 und LIF-Sequenzen aus (Pennica, 1996b). Konservierte AS zwischen den unterschiedlichen Proteinen CT-1, LIF und CNTF sind gesondert gekennzeichnet (Box). Das Alanin an Position 92 wird durch die hier beschriebene Mutation durch Threonin ersetzt und ist durch einen Kreis und einen Pfeil gekennzeichnet.
• Abb. 19: Ausschnitt aus dem Modell der Sekundärstrukturen des Wildtyp (WT) und mutierten Cardiotrophins nach der Methode von Garnier und Osguthorpe . Zu erkennen ist gestörte Ausbildung der alpha-Helix durch die Mutation. H=Helix, E=Faltblattstruktur