Aus dem Deutschen Herzzentrum Berlin
Abteilung für Kardiologie
Stiftung des Bürgerlichen Rechts

DISSERTATION

Rolle von Cardiotrophin-1 für die Pathogenese von Kardiomyopathien: Genetische Variabilität und Regulation der Expression im menschlichen Myokard

Zur Erlangung des akademischen Grades
Dr. medicinae (Dr. med.)

Vorgelegt der Medizinische Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

Von
Sabine Haßfeld

Dekan: Prof. Dr. Joachim W. Dudenhausen

Gutachter:
1. Prof. Dr. med. V. Regitz-Zagrosek
2. Prof. Dr. med. J. Holtz
3. PD Dr. med. G. Nickenig

eingereicht: 04.07.2003

Datum der Promotion: 23.04.2004

Abstrakt

Cardiotrophin-1 ist ein Zytokin der Familie Interleukin-6-Familie, zu der auch IL-11, CNTF, OSM und LIF gehören. Diese Substanzen wirken über die gemeinsame Rezeptoruntereinheit gp130.

CT-1 induziert die Hypertrophie von Kardiomyozyten und inhibiert die Apoptose kardialer und Zellen. In verschiedenen Tiermodellen der Herzinsuffizienz konnte eine gesteigerte myokardiale CT-1 Expression beobachtet werden.

Kardiomyopathien sind wiederum kardiale Erkrankungen, die mit einer Hypertrophie und Apoptose einhergehen und zu einer Herzinsuffizienz führen können. Man geht davon aus, dass 25-50 Prozent der familiär sind. Hierbei handelt es sich um eine monogenetische Erkrankung, die überwiegend autosomal-dominant vererbt werden. Daneben konnten aber auch modifizierende Polymorphismen in neurohumoralen Faktoren identifiziert werden.

Basierend auf diesen Ergebnissen war das Ziel dieser Arbeit die Analyse der möglichen Beteiligung genetischer Varianten der kodierenden sowie der regulatorischen Region an der Pathogenese der Hypertrophen bzw. Dilatativen Kardiomyopathie. Zusätzlich sollte die mRNA-Expression von CT-1 in Myokardbiopsien von Patienten mit Herzinsuffizienz quantifiziert werden.

Hierfür musste zunächst die Sequenzen der 5´-flankierenden Region identifiziert und bezüglich ihrer regulatorischen Eigenschaften analysiert werden. Es konnten 1,1 kb der 5´-flankierenden Region sequenziert werden. Die anschließende Luciferase-Reportergen-Analyse wies regulatorische Aktivitäten für den gesamten Bereich nach. Diese Region enthält zahlreiche cis-aktive DANN-Sequenzen aber keine TATA-Box.

Für die Mutationssuche wurden 64 Patienten mit DCM, 53 Patienten mit HCM sowie 100 Kontrollpersonen mittels PCR-SSCP-Analyse untersucht. Es konnte eine kodierende Variante A92T bei jeweils einem DCM- bzw. HCM-Patienten identifiziert werden. Diese Substitution liegt in einem Bereich, der zwischen verschiedenen Spezies (Ratte, Maus, Mensch) konserviert ist. Diese Mutation könnte eine Veränderung der Sekundärstruktur bewirken und liegt in einem möglichen funktionellen Bereich.

Die Promotorregion wies eine Basenpaarsubstitution bei -130 (G/T) sowie eine Deletion der Basen CTTT zwischen -992 und -995 auf. Der Polymorphismus an Position -130 fand sich tendenziell häufiger bei Patienten mit Dilatativer Kardiomyopathie. Die CTTT-Deletion konnte nur bei einer Patientin mit HCM nachgewiesen werden.

Für die Quantifizierung der CT-1 mRNA wurden rechtsventrikuläre Endomyokardbiopsien von 6 Patienten mit eingeschränkter LVEF (CHI), 5 Patienten nach Herztransplantation (TX) sowie 3 Kontrollpatienten (KO) eingesetzt. Es konnte ein relativer Anstieg der CT-1 Expression um 82% bei den Patienten mit eingeschränkter LVEF festgestellt werden. Interessanterweise besteht eine enge Korrelation zur Schwere der eingeschränkten Herzfunktion sowie zur Zunahme der Hypertrophie.

Eigene Schlagworte: Cardiotrophin-1, CT-1, Interleukin-6, IL-6, IL-11, LIF, CNTF, OSM, gp130, Hypertrophie, Apoptose, Herzinsuffizienz, Hypertrophe Kardiomyopathie, HCM, Dilatative Kardiomyopathie, DCM, Promotor, Muatation, mRNA-Expression, PCR, SSCP, Luciferase Reportergen Analyse, HPLC

Abstract

Cardiotrophin-1 is a cytokine, which belongs to the interleukin-6 family, which includes IL-11, CNTF, OSM and LIF. These factors act via the receptor subunit gp130.

CT-1 induces the hypertrophy of cardiomyocytes and inhibits the apoptosis of cardiac cells. Studies in animal models of congestive heart failure showed an enhanced expression of CT-1 in the myocardium.

Cardiomyopathies are cardiac diesorders, which are charakterized by hypertrophy and apoptosis and which can terminate with congestive heart failure. About 25-50 percent of all cases are familial. It is a monogenetic mendelian disorder with an autosomal-dominant inheritance in most cases. Beside this, modifying polymorphisms in neurohunoral factors could be identified.

Based on these facts, the aim of this study was to identify genetic variants within the coding and regulatory region of the CT-1 gene, which could influence the pathogenesis of hypertrophic or dilated cardiomyopathy. Additionally, the mRNA-expression of CT-1 in myocardial biopsies of heart failure patients should be quantified.

First, it was necessary to sequence the 5´-untranslated region and to analyse its regulatory function. We could sequence 1.1 kb of the 5´-UTR. The luciferase reportergene assay showed a significant promoter activity for the whole region. The region contains various cis-active DNA sequences but no TATA-box.The TRANSFAC-analysis identified different binding sites for transcription factors but no TATA-box.

The genetic material of 64 DCM and 53 HCM patients and 100 controls was screened for mutaions by using a PCR-based SSCP-analysis. A coding variant A92T could be identified for a patient with DCM and for an HCM patient. This mutation lies within a region which is conserved between different species (rat, mouse, human). This variant could disturb the secondary structure and lies in a probable functional region.

Within the promoter we could identify a basepair substitution at position -130 (G/T) and a 4-basepair deletion between -992 and -995 (CTTTdel). The polymorphism at –130 showed a tendency for a higher occurrence in DCM patients. One HCM patient was heterozygous for the CTTT-deletion.

To quantify the CT-1 mRNA we used endomyocardial biopsies of 6 patients with reduced LVEF (CHI), 5 patients after heart transplantation (TX) and 3 controls (KO). We performed a semiquantitative analysis by using HPLC and an external standard (PDH mRNA). We found an increased expression of CT-1 by 82% for patients with heart failure. Interestingly, we saw a tight correlation with to the reduction in LV function and to the degree of hypertrophy.

Keywords: cardiotrophin-1, CT-1, interleukin-6, IL-6, IL-11, LIF, CNTF, OSM, gp130, hypertrophy, apoptosis, heart failure, hypertrophic cardiomyopathy, HCM, dilated cardiomyopathy, DCM, promoter, muatation, mRNA-expression, PCR, SSCP, luciferase reportergene assay, HPLC

Publikationen:

Erdmann, J., S. Hassfeld, et al. (2000). ”Genetic variants in the promoter (g983G>T) and coding region (A92T) of the human cardiotrophin-1 gene (CTF1) in patients with dilated cardiomyopathy.” Hum Mut 16 (5): 448

Erdmann, J.,Hassfeld, S. et al. (1998).”Cloning and characterization of the 5´-flanking region of the human Cardiotrophin-1 gene.” Biochem and Biophys Res Comm 244: 494-497.

Kongressbeiträge:

47th Annual Meeting of the American Society of Human Genetics, 1997, Baltimore, “Identification of a coding variant (Ala92Thr) in the human cardiotrophin-1 gene and cloning of the promoter” Am J Hum Genet, 1997, 61 (4), A332, Abstract (Nr. 1944)

10. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Humangenetik, 1998, Jena, „“Cloning and charakterization of the 5´flanking region of the human Cardiotrophin-1 gene (CT-1)“ Medizinische Genetik, 1998, 10 (1), Abstract P6C-5

64. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Kardiologie, 1998, Mannheim, „Identifizierung und Charakterisierung von Varianten in der kodierenden Region und im Promotor des humanen Cardiotrophin-1 Gens“ sowie „ Klonierung und Charakterisierung des Promotors des humanen Cardiotrophin-1 Gens“ Zeitschr Kardiol, 1998, 87 (I), 199, Abstract (Nr. 778) und 266, Abstract (Nr. 989)

American Heart Association 71th Scientific Session, 1998, Dallas “Cloning and characterization of the promoter of the human cardiotrophin-1 (CT-1) and identification of genetic variants in 208 patients with dilated cardiomyopathy” Circ, 1998, Nov (Suppl.), I-245, Abstract (Nr. 1274)

20th Congress of the European Society of Cardiology, 1998, Wien, “Identification and characterization of variants within the coding and the promoter region of the human cardiotrophin-1 gene” sowie “Cloning and characterization of the 5´flanking region of the human cardiotrophin-1 gene” Eur Heart J, 1998, 19 (Suppl.), 37, Abstract (Nr. P422) und 483 (Nr. 2754)

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03.06.2004