Aus dem Institut für Mikrobiologie und Hygiene
der Medizinischen Fakultät Charité der Humboldt-Universität zu Berlin

DISSERTATION

Epithelzellinvasion durch Shigella flexneri: Charakterisierung eines Rekrutierungsmoduls
der kleinen GTPase Rho

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Thomas Haustein
aus
Freiburg im Breisgau

Dekan: Prof. Dr. Joachim W. Dudenhausen

Gutachter:
1. Prof. Dr. Dr. Ulf B. Göbel
2. Prof. Dr. Martin Zeitz
3. PD Dr. Christoph von Eichel-Streiber

Eingereicht am 21. Mai 2001

Promotionsdatum: 11. Januar 2002

Inhaltsverzeichnis

• 1  Einführung
  • 1.1 Bakterielle Dysenterie, Shigella und Zellinvasion
    • 1.1.1 Alle vier Shigella-Spezies sind Erreger der Dysenterie beim Menschen
    • 1.1.2 Die bakterielle Dysenterie ist eine entzündliche Erkrankung des Dickdarms
    • 1.1.3 Die Epithelzellinvasion durch Shigella ist ein notwendiger Schritt bei der Pathogenese der dysenterischen Kolitis
    • 1.1.4 Von Shigella induzierte Rearrangements des Wirtszell-Aktinzytoskeletts führen zur Internalisierung des Pathogens
    • 1.1.5 Eine effiziente Epithelkolonisierung wird durch intra- und interzelluläre Beweglichkeit von Shigella ermöglicht
    • 1.1.6  Die Fähigkeit zur Epithelinvasion ist auf einem Plasmid kodiert
    • 1.1.7 Zellinvasion durch Shigella ist abhängig von einem Protein der Wirtszelle, der kleinen GTPase Rho
    • 1.1.8  Aspekte der Invasionsstrategien von Salmonella und Listeria
  • 1.2 Rho gehört zur Superfamilie der Ras-ähnlichen kleinen GTPasen
    • 1.2.1 GTPasen teilen ein gemeinsames Funktionsprinzip
    • 1.2.2 Ras ist der Prototyp der Superfamilie der kleinen GTPasen
    • 1.2.3 Die Rho-Proteine bilden eine eigene Subfamilie kleiner GTPasen
    • 1.2.4 Die kleinen GTPasen der Rho-Familie sind Regulatoren des Aktinzytoskeletts
    • 1.2.5 Rho-GTPasen werden posttranslational modifiziert
  • 1.3 Der „Schalter“ Rho wird von Steuerungsproteinen kontrolliert
    • 1.3.1 GEFs, GAPs und GDIs
    • 1.3.2 GEFs versetzen Rho in den aktivierten Zustand
    • 1.3.3 GAPs erhöhen die GTP-Hydrolyserate von Rho
    • 1.3.4 RhoGDI inhibiert die Trennung von GDP und Rho
  • 1.4 Rho steuert das Aktinzytoskelett über vielfältige Angriffspunkte
    • 1.4.1 Das Aktinzytoskelett reguliert Gestalt und Bewegung von Zellen
    • 1.4.2 Rho, Rac und Cdc42 spielen bei der Steuerung des Zytoskeletts abgrenzbare Rollen
    • 1.4.3 Rho reguliert Fokalkomplexe und Streßfilamente
    • 1.4.4 Rho beeinflußt Zell-Zell-Kontakte
    • 1.4.5  Rho interagiert in komplexer Weise mit Ezrin, Radixin und Moesin
    • 1.4.6 RhoD – und möglicherweise RhoB – regulieren die Dynamik von Endosomen
    • 1.4.7 Mit der Funktion von Rho assoziierte Zytoskelettbestandteile sind an der Zellinvasion durch Shigella beteiligt
  • 1.5 Rho-Isoformen haben unterschiedliche biologische Eigenschaften
    • 1.5.1 Rho-Isoformen unterscheiden sich in ihrer intrazellulären Lokalisation
    • 1.5.2 Rho-Isoformen werden während der Shigelleninvasion differentiell rekrutiert
    • 1.5.3 Primärstrukturen der Rho-Isoformen
  • 1.6 Fragestellung
• 2  Methodik
  • 2.1 DNS-Präparation
    • 2.1.1 Bakterienkultur
    • 2.1.2 Miniprep
    • 2.1.3 Maxiprep
    • 2.1.4 Phenol/Chloroform-Extraktion
    • 2.1.5 Ethanolpräzipitation
    • 2.1.6 Messen der DNS-Konzentration
  • 2.2 Klonieren und Sequenzieren
    • 2.2.1 Klonierungsvektoren
    • 2.2.2  Schneiden von DNS mit Restriktionsenyzmen
    • 2.2.3 Dephosphorylierung
    • 2.2.4 Agarose-Gelelektrophorese
    • 2.2.5 Isolierung von DNS-Fragmenten durch Gelelektrophorese
    • 2.2.6 DNS-Extraktion aus Agarosegelen
    • 2.2.7  PCR
    • 2.2.8 Oligonukleotide (Oligos)
    • 2.2.9 DNS-Matrizen (templates) für die PCR
    • 2.2.10 DNS-Hybridisierung
    • 2.2.11 Ligation
    • 2.2.12 Präparation von kompetenten E. coli (DH_{5 α}, TG1, ZK501)
    • 2.2.13 Transformation von kompetenten E. coli
    • 2.2.14 Sequenzieren
    • 2.2.15 Sequenzanalyse
    • 2.2.16 Vorhandene, in Transfektionsexperimenten verwendete Rho-Konstrukte
  • 2.3  Shigella flexneri SC301
    • 2.3.1 Bakterienstamm
    • 2.3.2 Bakterienkultur
  • 2.4 HeLa-Zellen
    • 2.4.1 Zellkultur
  • 2.5 Vorübergehende Expression von Rho-Konstrukten in HeLa-Zellen
    • 2.5.1 Transiente Transfektion von HeLa-Zellen
  • 2.6 Infektionsexperimente mit Shigella flexneri SC301
    • 2.6.1 Infektion von HeLa-Zellen
  • 2.7 Immunfluoreszenzmikroskopie
    • 2.7.1 Behandlung der infizierten HeLa-Zellen
    • 2.7.2  Antikörper und Farbstoffe
    • 2.7.3 Mikroskopie
    • 2.7.4 Mikrofotografie
    • 2.7.5 Digitale Bildbearbeitung: MetaMorph, epr-Algorithmus
• 3  Ergebnisbeschreibung
  • 3.1 PCR-vermittelte gezielte Mutagenese
    • 3.1.1 PCR-Strategie für alle Konstrukte
    • 3.1.2 Konstrukte auf der Basis von rhoA, B oder C
    • 3.1.3 Konstrukte, die auf rhoD basieren
  • 3.2 Präparation der Klonierungsvektoren
    • 3.2.1 pUC19 für auf rhoA, B oder C basierende Konstrukte
    • 3.2.2 pKC3 für auf rhoA, B oder C basierende Konstrukte
    • 3.2.3 pUC19 für auf rhoD basierende Konstrukte
    • 3.2.4 pKC3 für auf rhoD basierende Konstrukte
    • 3.2.5 Übersichtstabelle über die Klonierungsvektoren
  • 3.3 Klonieren und Sequenzieren der auf rhoA, B oder C basierenden  DNS-Konstrukte
    • 3.3.1 Isolierung der PCR-Produkte
    • 3.3.2 Klonieren der PCR-Produkte in pUC19
    • 3.3.3 Sequenzierung
    • 3.3.4 Umklonieren der Konstrukte in pKC3
  • 3.4 Klonieren und Sequenzieren der auf rhoD basierenden Konstrukte
    • 3.4.1 Klonieren der PCR-Produkte in pUC19
    • 3.4.2 Abweichung der DNS-Sequenz von rhoD gegenüber der publizierten Sequenz
    • 3.4.3 Umklonieren der Konstrukte in pKC3
  • 3.5 Übersicht über die hergestellten Konstrukte
  • 3.6  Übersichtstabelle über die transformierten E. coli-Stämme
  • 3.7 Expression der Konstrukte in HeLa-Zellen
  • 3.8 Zytoskelettdarstellung von nichtinfizierten, aber mit mutierten rho-Konstrukten transfi­zierten HeLa-Zellen
    • 3.8.1 Auf rhoA, B oder C basierende Konstrukte
    • 3.8.2 Auf rhoD basierende Konstrukte
  • 3.9 Rekrutierungsverhalten der mutierten Rho-Proteine während der HeLa-Zellinvasion durch Shigella flexneri SC301
    • 3.9.1  Kontrollen: RhoA, RhoB und RhoC
    • 3.9.2 RhoD
    • 3.9.3 RhoA^T19N und RhoA^G14V
    • 3.9.4 RhoAAB, RhoBBA, RhoCCA und RhoDDA
    • 3.9.5 RhoA^S188P
    • 3.9.6  RhoCAC und RhoACA
    • 3.9.7 RhoA^R183K
    • 3.9.8 RhoA^KK186-187RR
    • 3.9.9  Übersicht über das Rekrutierungsverhalten der untersuchten Konstrukte
• 4  Diskussion
  • 4.1 Diskussion der Methoden
    • 4.1.1 System zur fluoreszenzoptischen Darstellung dreidimensionaler Strukturen
    • 4.1.2 Protein-tagging
    • 4.1.3 Replikationstreue der PCR
    • 4.1.4  Eigenschaften des Expressionsvektors
    • 4.1.5 Plasmidpräparation
    • 4.1.6 Transfektion und Infektion
  • 4.2 Diskussion der Ergebnisse
    • 4.2.1 Funktionalität der mutierten Proteine in der transfizierten Zelle
    • 4.2.2 Rekrutierungsverhalten von RhoA^G14V und RhoA^T19N
    • 4.2.3 Die Rolle der CaaX-Gruppe
    • 4.2.4 Rekrutierungsverhalten von RhoD
    • 4.2.5 Prä- CaaX-Gruppe von RhoA und RhoC
    • 4.2.6 Mögliche Rollen für die Lysine 186-187 von RhoA
    • 4.2.7 Differentielle Rekrutierung und Strukturmodelle von RhoA
    • 4.2.8 Rekrutierung anderer Proteine während der Zellinvasion durch Shigella
    • 4.2.9 Überlegungen zum Rekrutierungsmechanismus
    • 4.2.10  Shigella als zellbiologisches Werkzeug
    • 4.2.11 Modell und natürliche Verhältnisse
• 5  Zusammenfassung
• Abkürzungsverzeichnis
• Literaturverzeichnis
• Lebenslauf
• Eidesstattliche Erklärung
• Danksagung

Tabellen

• Tab. 2 - 1 Ausgangsplasmide für Klonierungsvektoren
• Tab. 2 - 2 DNS-Lösung für Agarosegelelektrophorese
• Tab. 2 - 3 PCR-Ansatz mit Taq-Polymerase
• Tab. 2 - 4 PCR-Ansatz mit Pwo-Polymerase
• Tab. 2 - 5 Verwendete Oligonukleotide.
• Tab. 2 - 6 PCR-Matrizen.
• Tab. 2 - 7 Reaktionsansatz für DNS-Hybridisierung
• Tab. 2 - 8 Reaktionsansatz für Ligation
• Tab. 2 - 9 Primer für die Sequenzierung der DNS-Konstrukte
• Tab. 2 - 10 Reaktionsbedingungen für Sequenzierung
• Tab. 2 - 11 Zusammensetzung eines 5,5%-igen Sequenziergels
• Tab. 2 - 12 In der Studie verwendete Rho-Konstrukte, die zu Beginn der Arbeit bereits vorhanden waren.
• Tab. 2 - 13 Antikörper und Farbstoffe
• Tab. 2 - 14 Mikroskopobjektive
• Tab. 2 - 15 Filtersätze für Immunfluoreszenzmikroskopie
• Tab. 3 - 1 PCR-Reaktionsbedingungen für RhoA/B/C-Konstrukte
• Tab. 3 - 2 PCR-Reaktionsbedingungen für RhoD-Konstrukte
• Tab. 3 - 3 Übersichtstabelle über die Klonierungsvektoren
• Tab. 3 - 4 Im Rahmen der vorliegenden Studie hergestellte Konstrukte
• Tab. 3 - 5 Im Rahmen der vorliegenden Studie transformierte und asservierte Stämme von E. coli
• Tab. 3 - 6 Zusammenfassung der Ergebnisse aus den Transfektions-Infektions-Experimenten

Bilder

• Abb. 1 - 1 Durch posttranslationale Isoprenylierung und Methylierung erhält Rho einen lipophilen C‑Terminus (hier am Beispiel von RhoA).
• Abb. 1 - 2 Rho und ERM-Proteine regulieren sich wechselseitig (Erläuterungen vgl. 1.4.5).
• Abb. 1 - 3 DNS-Sequenzen von RhoA, B und C im Vergleich. Unterschiede in den Aminosäuresequenzen sind rot markiert.
• Abb. 1 - 4 DNS-Sequenzen von RhoA und RhoD im Vergleich. Unterschiede in den Aminosäuresequenzen sind rot markiert.
• Abb. 3 - 1 PCR-Schema für RhoA/B/C-Konstrukte
• Abb. 3 - 2 PCR-Schema für RhoD-Konstrukte
• Abb. 3 - 3 Schema des Klonierungsvektors V1
• Abb. 3 - 4 Schema des Klonierungsvektors V2
• Abb. 3 - 5 Schema des Klonierungsvektors V3
• Abb. 3 - 6 Schema des Klonierungsvektors V4
• Abb. 3 - 7 Klonieren der rhoA/B/C-PCR-Produkte in pUC19
• Abb. 3 - 8 Klonieren der kompletten vsv-rhoA/B/C-DNS-Konstrukte in pKC3
• Abb. 3 - 9 Klonieren der rhoD-PCR-Produkte in pUC19
• Abb. 3 - 11 Expression der auf rhoA, B oder C basierenden Konstrukte in HeLa-Zellen.
• Abb. 3 - 12 Expression der auf rhoD basierenden Konstrukte in HeLa-Zellen.
• Abb. 3 - 13 Rekrutierungsverhalten von RhoA (a-c; d-g), RhoB (h-k) und RhoC (l-n).
• Abb. 3 - 14 Rekrutierungsverhalten von RhoD (a-c). Rot: Rho. Grün: F‑Aktin. Abb. (c) setzt sich aus (a) und (b) zusammen.
• Abb. 3 - 15 Schematische Darstellung der Konstrukte RhoA^T19N (a) und RhoA^G14V (b).
• Abb. 3 - 16 Rekrutierungsverhalten von RhoAT19N (a-c) und RhoAG14V (d-f).
• Abb. 3 - 17 Schematische Darstellung der Konstrukte RhoAAB (a), RhoBBA (b), RhoCCA (c) und RhoDDA (d).
• Abb. 3 - 18 Rekrutierungsverhalten von RhoAAB (a-c), RhoBBA (d-f), RhoCCA (g-i) und RhoDDA (k-m).
• Abb. 3 - 19 Schematische Darstellung des Konstrukts RhoA^S188P.
• Abb. 3 - 20 Rekrutierungsverhalten von RhoA^S188P (a-c).
• Abb. 3 - 21 Schematische Darstellung der Konstrukte RhoCAC (a) und RhoACA (b).
• Abb. 3 - 22 Rekrutierungsverhalten von RhoCAC (a-c) und RhoACA (d-f).
• Abb. 3 - 23 Schematische Darstellung des Konstrukts RhoA^R183K.
• Abb. 3 - 24 Rekrutierungsverhalten von RhoA^R183K (a-c).
• Abb. 3 - 25 Schematische Darstellung des Konstrukts RhoA^KK186-187RR.
• Abb. 3 - 26 Rekrutierungsverhalten von RhoA^KK186-187RR (a-c). Rot: Rho. Grün: F‑Aktin. Abb. (c) setzt sich aus (a) und (b) zusammen.