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1  Einführung

1.1 Bakterielle Dysenterie, Shigella und Zellinvasion

1.1.1 Alle vier Shigella-Spezies sind Erreger der Dysenterie beim Menschen

Die bakterielle Dysenterie (Ruhr) ist eine durch gramnegative Bakterien der Gattung1 Shigella hervorgerufene entzündliche Erkrankung des Dickdarms, die vor allem in tropischen und subtropischen Entwicklungsländern endemisch ist. Typische klinische Zeichen der Krankheit sind blutig-schleimige Durchfälle, begleitet von abdominellen Krämpfen, Tenesmen und Fieber [101]. Besonders häufig und schwer sind Kinder betroffen [19].

Das Genus Shigella, nach dem Erstbeschreiber Kiyoshi Shiga [162] benannt, gehört zur Fa­milie der Enterobacteriaceae und ist eng mit E. coli verwandt. Die Gattung wird in vier Spezies gegliedert, die jeweils epidemiologische Besonderheiten aufweisen, jedoch alle das Krankheits­bild der bakteriellen Dysenterie hervorrufen können [137]. S. sonnei ist die in gemäßigten Breiten am häufigsten isolierte Spezies, bei insgesamt sehr niedriger Dysenteriemorbidität [22]. S. dysenteriae, die als einzige Art das Shiga-Toxin produziert, und S. flexneri sind dagegen vor allem in tropischen und subtropischen Regionen endemisch. S. flexneri ist dort meist das vorherrschende Pathogen [86, 117, 146]. S. dysenteriae wird periodenweise kaum isoliert, kann jedoch als einzige Spezies plötzlich auftretende und sich rasch ausbreitende Pandemien verursachen [55]. S. boydii spielt nur eine untergeordnete Rolle. Die Spezies können weiter in Serotypen unterteilt werden.

Die bakterielle Ruhr wird von Mensch zu Mensch übertragen, hauptsächlich auf dem fäkal-oralen Weg [137]. Um das Vollbild der Erkrankung hervorzurufen, sind äußerst niedrige Infektionsdo­sen in der Größenordnung von 102 KBE und darunter ausreichend [46, 101]. Eine im Vergleich zu anderen Enterobacteriaceae erhöhte Säureresistenz [61] gewährleistet, daß Shigella auch bei geringem Inokulum das saure Milieu des Magens unbeschadet passieren und den eigentlichen Ort der Infektion, das Kolon, erreichen kann. Der Mensch gilt als einziger natürlicher Wirt dieses Bakteriums. Ob auch andere Primaten unter natürlichen Bedingungen befallen werden, konnte bisher nicht mit Sicherheit ausgeschlossen werden [1, 137, 170]. Bei anderen Säugern kann das Krankheitsbild der Shigellose dagegen – wenn überhaupt – nur unter bestimmten experimentel­len Bedingungen und mit entsprechend hohen Infektionsdosen hervor­gerufen werden [140, 170].

1.1.2 Die bakterielle Dysenterie ist eine entzündliche Erkrankung des Dickdarms

Histopathologische Studien der Shigellose an Tiermodellen [140, 150, 170] oder menschli­chem Biopsiematerial [108, 109] erbrachten prinzipiell vergleichbare Ergebnisse: An der luminalen Seite des befallenen Kolonepithels wird ein hämorrhagisches Exsudat beobachtet, das abgestoßene Epithelzellen, neutrophile Granulozyten, Erythrozyten, Fibrin, sowie massenhaft Shigellen enthält. Die darunterliegende Epithelschicht zeigt ausgeprägte Nekrosen und Erosio­nen; oft sind große Epithelflächen abgelöst. Ulzera treten bereits in sehr frühen Stadien der Erkrankung in denjenigen Epithelregionen auf, welche die schleimhautassoziierten Lymphfolli­kel bedecken (Peyer-Plaques). Die befallene Darmschleimhaut ist massiv mit neutrophilen Granulozyten, Lymphozyten und Makrophagen infiltriert und erscheint ödematös und hyper­ämisch. Die Interzellulärspalten zwischen den Epithelzellen sind verbreitert und werden durch transmigrierende Leukozyten noch stärker aufgeweitet. Die Kolon­epithelzellen selbst zeigen häufig Degenerationszeichen. Shigellen sind in den Interzellulärspalten, in Makrophagen oder neutrophilen Granulozyten zu sehen. Innerhalb von Epithelzellen liegen sie sowohl in Vakuolen eingeschlossen als auch frei im Zytoplasma.

1.1.3 Die Epithelzellinvasion durch Shigella ist ein notwendiger Schritt bei der Pathogenese der dysenterischen Kolitis

Die Fähigkeit von Shigella in Kolonepithelzellen einzudringen ist eine notwendige Bedingung für die Entstehung der Shigellose. Stämme, die zur Zellinvasion unfähig sind, sind apathogen [95, 101]. Es erscheint dabei zunächst paradox, daß Shigella nicht in der Lage ist, in polari­sierte Kolonozyten vom apikalen – dem Darmlumen zugewandten und mit Mikro­villi besetzten – Pol her einzudringen. Tatsächlich kann die Invasion nur an der basolateralen Zellober­fläche erfolgen [123], dem Zellpol, der unter physiologischen Bedingungen vom Darmlumen aus nicht direkt zugänglich ist.

Shigella benutzt M‑Zellen als Eintrittspforte zur Überwindung der Epithelbarriere [150]. M‑Zellen sind Bestandteil des follikelassoziierten Epithels und spielen eine wichtige immuno­logi­sche Rolle: Sie nehmen Makromoleküle (z.B. Antigene) und Mikroorganismen aus dem Darmlumen auf, transportieren sie durch das Epithel, übergeben sie an Makrophagen, B‑Lymphozyten oder dendritische Zellen und induzie­ren so eine spezifische, lokale Immunab­wehr. Mikroorganismen überstehen die Transzytose durch die M‑Zellen normalerweise unbe­schadet [128]. Nach der Zellpassage findet sich Shigella auf der basalen Seite des Epithels sowohl frei im Interzellulärraum als auch im Inneren von Makrophagen wieder [150]. Durch die Fähigkeit, in Makrophagen Apoptose zu induzieren [191, 192], entge­hen die Bakterien der lysosomalen Zerstörung, gewinnen (erneut) Zugang zum basolateralen Extrazel­lulärraum und können von hier aus in Kolonozyten eindringen.

Mit Shigella infizierte Makrophagen setzen bereits vor ihrem apoptotischen Untergang das proinflammatorische Interleukin 1 (IL‑1) frei [190]. In der Folge wird die Mukosa massiv von chemotaktisch angelockten Granulozyten infiltriert, die in das Darmlumen migrieren, die Basal­membran angreifen und zur Ablösung des Epithels führen. In vitro induziert Shigella auch direkt vom apikalen Pol aus die Wanderung von Granulozyten durch das Epithel. Nachdem der Epithelzellverband derart aufgelockert ist, gewinnt das Pathogen auch vom Lumen her Zugang zur basolateralen Oberfläche der Kolonozyten [139]. Es konnte gezeigt werden, daß durch Blockade von IL‑1‑Rezeptoren [151] bzw. der Leukozytenmigration [140] das Ausmaß sowohl der bakteriellen Invasion als auch der Gewebszerstörung vermindert wird. Dies deutet darauf hin, daß die Entzündungsreaktion des Wirts in der Anfangsphase der Erkrankung nicht zur Bekämpfung des Pathogens beiträgt, sondern im Gegenteil dessen Ausbreitung unterstützt und für einen großen Teil der Gewebsläsionen unmittelbar verantwortlich ist [140, 151].

1.1.4 Von Shigella induzierte Rearrangements des Wirtszell-Aktinzytoskeletts führen zur Internalisierung des Pathogens

Seitdem die fundamentale Bedeutung der Zellinvasion für die Pathogenese der Dysenterie erkannt wurde, gilt der Aufklärung der daran beteiligten molekularen Mechanismen große wissenschaftliche Aufmerksamkeit. Einen wichtigen Beitrag zum Verständnis des Invasionspro­zesses leisteten elektronenmikroskopisch-morphologische Studien, welche auf eine zentrale Rolle des Aktinzytoskeletts hinwiesen [2, 40]: Kleinere Mengen von F‑Aktin akkumulieren sehr rasch nach Adhärenz von Shigella an die Wirtszelle an derjenigen Stelle der Zellmembran, die unmittelbar „unter“ dem Pathogen liegt. Räumlich getrennt davon finden sich an der Membran auch im Umkreis des Pathogens Aktinnukleationsfokusse. Ausgehend von diesen unterschiedlich lokalisierten Fokussen bilden sich verschiedene Strukturen aus: Um das Bakterium herum wachsen pfeilerartige Protrusionen mehrere Mikrometer über das Zelloberflächenniveau hinaus; deren Gerüst wird von F‑Aktin-Bündeln gebildet, welche mit ihrem barbed end in Richtung der Protrusionsspitzen orientiert sind. Da die Membran durch die Aktinbündel mit angehoben wird, bildet sich eine blütenähnliche Struktur aus, die das Pathogen weit überragt. Membranfalten erstrecken sich von Pfeiler zu Pfeiler, während das Bakterium am Grund des „Blütenkelchs“ liegt. „Unterhalb“ des Bakteriums führt die weitere Ansammlung von F‑Aktin dagegen zur Ausbil­dung einer in Richtung des Zellinneren orientier­ten „sprinklerartigen“ Filamentstruktur. Indem sich die Blütenstruktur schließt, wird das Pathogen in einer von einem Netz von Mikrofi­lamen­ten umgebenen Vakuole in die Zelle aufgenommen. Reste der zellulären Protrusionen bleiben dabei zunächst erhalten. Bei 37°C ist die Aufnahme extrazellulärer Bakterien nach
18 min abgeschlossen [2, 40]. Innerhalb von weniger als 15 min nach Invasion induziert Shigella die Lyse der Vakuolenmembran. Nachdem das Bakterium auf diese Weise Zugang zum nähr­stoffreichen intrazellulären Milieu gewonnen hat, vermehrt es sich sehr rasch und kolonisiert die befallene Zelle [154].

1.1.5 Eine effiziente Epithelkolonisierung wird durch intra- und interzelluläre Beweglichkeit von Shigella ermöglicht

Shigella, im extrazellulären Medium unbeweglich, kann im Zytoplasma der Wirtszelle zellu­läre Komponenten zur Fortbewegung nutzen: So führt in Fibroblasten eine zentripetale „orga­nellenartige“ Bewegung von Shigella entlang von Streßfilamenten (vgl. 1.4.1) zur Bildung von Mikrokolo­nien um den Zellkern [177]. Eine weitere, von Streßfilamenten unabhängige Form der Beweglichkeit wird durch Induktion von Aktinfilamenten an einem Pol der Bakterien ermög­licht. Dabei entsteht eine kometenschweifähnliche F‑Aktin-Struktur. Durch diese ungerichtete Motilität kann Shigella benachbarte Zellen befallen, ohne erneut mit dem extrazellulären Milieu in Kontakt zu treten [20, 141]. Diese Invasion „von innen“ unterscheidet sich jedoch von der primären Invasion „von außen“: Die Bakterien buchten zunächst lokal durch eine zentrifugale Bewegung die Membran der bereits kolonisierten Zellen von innen aus. Dadurch werden handschuhfingerartige Membranprotrusionen gebildet, welche die Membranen unmittelbar benachbarter Zellen einstülpen können. Die Shigellen, die sich an der Spitze dieser somit aus zwei Membranen bestehenden Protrusionen befinden, werden nun von den penetrierten Zellen in Vakuolen internalisiert („intercellular spread“). Auch aus diesen doppelwandigen Vakuolen kann sich Shigella durch Lyse der Membranen wieder befreien, sich im Zytoplasma vermehren und von dort aus weitere Zellen kolonisieren [82].

Die bakteriellen Proteine IcsA und B regulieren die intra- und interzelluläre Ausbreitung von Shigella [8, 20, 59] und bilden somit die molekulare Grundlage der effizienten Ausbreitung innerhalb größerer Epithelzellverbände. Für die primäre Invasion von Epithelzellen sind diese ics-Genprodukte jedoch nicht essentiell.


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1.1.6  Die Fähigkeit zur Epithelinvasion ist auf einem Plasmid kodiert

Die Fähigkeit von Shigella zur Epithelinvasion und -kolonisierung ist an das Vorhandensein eines 220 kb-Virulenzplasmids gebunden [153, 154]. Der Transfer des Plasmids in E. coli K‑12 vermittelt auch diesem nichtinvasiven Bakterienstamm typische Charakteristika von Shigella, darunter die Fähigkeit, in HeLa-Zellen einzudringen [152]. Die für die Ausbildung des invasiven Phänotyps essentiellen Gene liegen auf einem Abschnitt von 31 kb Länge, der die ipa-, mxi- und spa-Operons enthält [116]. Die mxi- und spa-Genprodukte bilden einen Typ III‑Sekretions­apparat, über den die ipa-Genprodukte innerhalb von Minuten ins extrazelluläre Medium abgegeben werden können [16]. Das experimentelle Ausschalten einzelner Komponenten des Sekretionsapparats geht mit dem Verlust der Invasivität von Shigella einher [9, 10].

Die Ausschüttung von Ipa-Proteinen wird durch den Kontakt des Bakteriums mit Epithelzel­len induziert [114, 184]. Die Interaktion mit dem basolateralen Pol polarisierter Epithelzellen führt dabei zu einer stärkeren Sekretion als der Kontakt mit dem apikalen Pol. In vitro konnte die Sekretion mit Glykoproteinen der extrazel­lulären Matrix induziert werden [184]. Vier Ipa-Proteine wurden charakterisiert und mit den Buchstaben A bis D gekennzeichnet. IpaB [70], C [17] und D sind essentiell für Epithelzellinvasion und die darauf folgende Lyse der Phago­somenmembran [116]. IpaA erhöht die Invasionseffizienz um das Zehnfache [173]. IpaB und C bilden im extrazellulären Medium einen löslichen Komplex, an dem möglicherweise noch weitere Proteine beteiligt sind [115]. Mit diesem Komplex beschichtete Latexpartikel werden von HeLa-Zellen in einem aktinabhängigen Mecha­nismus internalisiert, der morphologisch und funktionell der Invasion durch intakte Bakterien entspricht [113].

1.1.7 Zellinvasion durch Shigella ist abhängig von einem Protein der Wirtszelle, der kleinen GTPase Rho

Einen wesentlichen Fortschritt in der Erforschung der Signalübertragungskette zwischen Ipa-Komplex und Zytoskelett brachte der Nachweis, daß die kleine GTPase Rho, ein Protein der Wirtszelle, für die Zellinvasion durch Shigella essentiell ist. Durch Inhibition dieses Proteins läßt sich die Invasion von kultivierten Epithelzellen durch Shigella blockieren und der blütenartige Invasionskomplex kommt nicht mehr zustande [3, 113, 183]. Die Untersuchung von Rho dürfte somit auch zu einem besseren Verständnis der Epithelzellinvasion durch Shigella auf molekula­rer Ebene beitragen.


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1.1.8  Aspekte der Invasionsstrategien von Salmonella und Listeria

Invasivität ist ein Merkmal vieler Darmpathogene, darunter auch Salmonella und Listeria. Die Invasionsstrategien von Listeria monocytogenes und Shigella gleichen sich durch das bevorzugte Eindringen auf der basolateralen Seite polarisierter Epithelzellen, die Lyse des Phagosoms, die Art der intrazellulären Bewegung und die Fähigkeit, sich unmittelbar von Zelle zu Zelle auszu­brei­ten. In der Art des Internalisierungsprozesses ergeben sich hingegen Unterschiede: Während Shigella in einem relativ großen Umkreis Membranfältelungen induziert und durch einen makropi­nozytoseähnlichen Prozeß aufgenommen wird, wird Listeria „reißverschlußartig“ eng von der Wirtszellmembran umschlossen und so internalisiert [41].

Salmonella typhimurium induziert wie Shigella an der Oberfläche der Wirtszelle Membran­fältelungen, die zur Aufnahme des Pathogens in nichtphagozytische Darmepithelzellen führen. Die Mikromorphologie des Invasionskomplexes, der Typ‑III-Sekretionsapparat und die eingesetzten bakteriellen Invasine ähneln den entsprechenden Merkmalen von Shigella. Im Gegensatz zu Shigella dringt Salmonella in polarisierte Zellen aber von der apikalen Seite her ein. Nach Internalisierung bleibt Salmonella innerhalb der phagozyti­schen Vakuole [54]. Sowohl bei Salmonella als auch bei Listeria sind die Virulenzfaktoren chromosomal kodiert und nicht, wie bei Shigella, auf einem Plasmid [41, 54].

Alle drei Pathogene „benutzen“ das zelluläre Aktinzytoskelett, um in die Wirtszelle einzu­dringen. Unterschiede bestehen in der Mikromorphologie und der Art, wie die Zytoskelett­rearrangements induziert werden [2, 41 68]. Für die Internalisierung von S. typhimurium sind die mit Rho verwandten kleinen GTPasen Rac und Cdc42 notwendig [68], nicht aber Rho selbst [183]. Ob GTPasen der Rho-Familie für die Invasion durch Listeria eine wesentliche Rolle spielen, ist noch nicht bekannt [41].

Invasionsstrategien verschiedener enteroinvasiver Bakterien unterscheiden sich in wichtigen Details. Dies eröffnet auch eine Vielfalt wissenschaftlicher Zugänge zur Erforschung von Funk­tionen der Wirtszellen. Shigella läßt sich von diesem Blickwinkel aus auch als zellbio­logisches Werkzeug betrachten, mit dem sich – unter anderem – die Funktion von Rho studieren läßt.

1.2 Rho gehört zur Superfamilie der Ras-ähnlichen kleinen GTPasen

1.2.1 GTPasen teilen ein gemeinsames Funktionsprinzip

Es sind mehrere Gruppen von Guanosintriphosphat-hydrolysierenden Proteinen (GTPasen) beschrieben, die sich in Größe, Struktur und Aufgaben unterscheiden, in ihrem Funktionsprinzip einander aber gleichen. GTPasen können als molekulare Schalter betrachtet werden, deren Affinität zu anderen Makromolekülen von ihrem Schaltzustand abhängt. Im GTP-gebundenen Zustand sind diese Proteine „aktiv“ bzw. „eingeschaltet“, im Komplex mit GDP dagegen „inaktiv“ bzw. „ausge­schaltet“. Diese beiden Zustände können zum sogenannten GTPase-Zyklus verbunden werden: Wenn GDP freigesetzt wird, tritt das Protein in einen vorüberge­henden „Leerzu­stand“ ein. Unter physiologischen Bedingungen lagert sich an der freigewor­denen Bindungs­stelle jedoch sofort GTP an, wodurch sich die Konformation des Enzyms und folglich die Affinität zu bestimmten Effektorproteinen ändert. Schließlich wird GTP zu GDP hydroly­siert; die GTPase nimmt ihre Ausgangskonformation an, und der Kreislauf kann von neuem beginnen. Die Kinetik sowohl der Freisetzung von GDP als auch des Hydrolyse­schritts wird bei den meisten GTPasen von einer Reihe von Steuerungsproteinen reguliert. Die Hydrolyse von GTP stellt einen irreversiblen Schritt dar. Dadurch ist gewährleistet, daß der Zyklus nur in einer Richtung abläuft [26].

Die GTPasen lassen sich nach Struktur und Funktion in mehrere Superfamilien gliedern: Die heterotrimerischen G‑Proteine vermitteln und verstärken Signale an der Zellmembran. GTP-gesteuerte Initiations- und Elonga­tionsfaktoren spielen bei der ribosomalen Proteinbiosynthese wesentliche Rollen. Die „kleinen GTPasen“, zu denen auch die Rho-GTPasen gezählt werden, sind dagegen vor allem mit der Regulation von Differenzierung, Zellproliferation, Endosomen­reifung und von Funktionen des Aktinzytoskeletts assoziiert. Ein typisches Merkmal ist ihr geringes Molekular­gewicht zwischen 21kDa und 35kDa. Einen weitergehenden Überblick über Funktion und Struktur von GTPasen geben die Referenzen [26] und [27].

1.2.2 Ras ist der Prototyp der Superfamilie der kleinen GTPasen

Das onkogene Mäusesarkomvirus (MSV) führte Ende der 70er Jahre auf die Spur der Ras-GTPasen: Es wurde erkannt, daß von den Harvey- und Kirsten-Viren kodierte 21kD-Proteine infizierte Zellen zur Proliferation zwingen. Später stellte sich heraus, daß sich die viralen Onkogene von eukaryotischen Genen ableiten, welche dann als ras-Gene bezeichnet wurden. Zelluläre Ras-GTPasen sind als Signalmoleküle an der Steuerung von Zellwachstum,
-proliferation und -differenzierung beteiligt [23, 26, 47]. In der Folgezeit wurde eine Fülle von verschiedenen kleinen GTPasen entdeckt. „Ras“ dient seitdem gleichzeitig als Name einzelner GTPasen wie auch einer ganzen Superfamilie von „Ras-ähnlichen“ Proteinen mit unterschiedli­chen Aufgaben. Eine detaillierte Übersicht hierzu findet sich z.B. in der Arbeit von Bos [24].

Gene der ras-Superfamilie sind evolutionär hochkonserviert und wurden aus einer Vielzahl eukaryotischer Zellen, von Hefen bis Säugerzellen, isoliert [105]. Die folgende Darstellung beschränkt sich jedoch auf die im Kontext mit Shigella unmittelbar relevanten kleinen GTPasen, die mammalischen Vertreter der Rho-Familie.

1.2.3 Die Rho-Proteine bilden eine eigene Subfamilie kleiner GTPasen

Die Rho-Familie wurde 1985 von Madaule und Axel als eine neue Familie von ras-homo­logen Genen beschrieben. Die Übereinstimmung der Aminosäuresequenzen von Rho und Ras beträgt etwa 35%, wobei sich Regionen starker Homologie von Abschnitten größerer Variabilität abgrenzen lassen [105]. Rho-GTPasen im engsten Sinne sind die drei Isoformen RhoA, B und C, die eine Vielzahl biochemischer Charakteristika teilen und deren Aminosäuresequenzen zu 84‑92% identisch sind2. Von ihren Eigenschaften her ähneln sich die drei Isoformen so sehr, daß der Schwerpunkt wissenschaftlicher Arbeit lange Zeit fast ausschließlich auf die Isoform RhoA gelegt wurde. Erst kürzlich konnte am Beispiel der Metastasierung von Melanomzellen in einem Mäusemodell eine spezifische biologische Rolle für RhoC aufgezeigt werden [39].

Ähnlich wie schon im Fall von Ras wurden auch zu RhoA, B und C in rascher Folge homo­loge GTPasen entdeckt, so daß der Begriff „Rho“ in der Literatur auch zur Kennzeichnung einer ganzen Superfamilie benutzt wird. Die Rho-Superfamilie wird derzeit in acht Mitglie­der(gruppen) eingeteilt: Rho (mit den Isoformen A, B und C), Rac (Isoformen 1 und 2), Cdc42 (Isoformen Cdc42Hs und G25K), RhoD, RhoG, Rnd (Isoformen 1, 2 und 3/RhoE), TC10 und RhoH/TTF [42, 104, 131]. Die Aminosäuresequenzen der Rho-verwandten GTPasen stimmen mit der Sequenz von RhoA zu 40% (RhoH) bis 54% (Rac1) überein.

1.2.4 Die kleinen GTPasen der Rho-Familie sind Regulatoren des Aktinzytoskeletts

Kleine GTPasen der Rho-Familie kontrollieren die Organisation des Aktin-Zytoskeletts in eukaryotischen Zellen [130], eine Rolle, die bei einer Vielzahl zellulärer Funktionen zum Tragen kommt. Rho-GTPasen werden auch mit der Regulation der Dynamik intrazellulärer Vesikel in Verbindung gebracht [112, 126]. Möglicherweise kommt den Proteinen zusätzlich auch eine Aufgabe bei der Steuerung der Gentranskription zu [71, 159, 171]. In dieser Arbeit gilt das Interesse jedoch der Rolle von Rho als Regulator des Zytoskeletts.

Die meisten Daten liegen zum jetzigen Zeitpunkt zu Rho, Rac und Cdc42 vor. Die übrigen Familienmitglieder sind noch wenig erforscht und bleiben im folgenden – mit Ausnahme von RhoD – unberücksichtigt. TC10 scheint vom erzeugten Phänotyp her Cdc42 nahezustehen [127]. RhoG ist der Nomenklatur zum Trotz näher mit Rac (68% Identität), Cdc42 und TC10 ver­wandt als mit den klassischen Rho-Isofor­men (54% Identität mit RhoA) und stellt evolutionsge­schichtlich möglicherweise eine frühe Abzweigung dar [178]. Rnd/RhoE fördert die Auflösung von F‑Aktin-Strukturen [65, 131]. RhoH/TTF wurde nur in hämatopoetischen Zellen nachgewie­sen [42].

1.2.5 Rho-GTPasen werden posttranslational modifiziert

Abb. 1 - 1 Durch posttranslationale Isoprenylierung und Methylierung erhält Rho einen lipophilen C‑Terminus (hier am Beispiel von RhoA).

Rho-Proteine werden – wie auch andere kleine GTPasen der Ras-Superfamilie [67] – im C‑terminalen Bereich posttranslational modifiziert. Notwendige Bedingung hierfür ist ein soge­nanntes CaaX-Motiv am Carboxy-Terminus [67], wobei „C“ für Zystein steht, „a“ für eine aliphatische Aminosäure und „X“ für eine beliebige Aminosäure. RhoA, B und C werden an dem an viertletzter Position stehenden Zystein über eine Thioetherbindung isoprenyliert, und die letzten drei Aminosäuren („‑aaX“) werden abgespalten [4]. Am Beispiel von RhoA wurde gezeigt, daß die Prenylierung von Cys190 der Abspaltung des Tripeptids vorausgeht (vgl. Abb. 1-1). Anschlie­ßend wird der neue Carboxyterminus methyliert [83]. Sind – wie bei RhoB – vor der CaaX-Gruppe weitere Zysteinreste vorhanden, können auch Palmitoylgruppen angekoppelt werden [4]. Am Beispiel von Ras wurde gezeigt, daß auch für diese Art der Modifikation eine vollständige CaaX-Gruppe notwendig ist [67]. Die genannten posttranslationalen Veränderun­gen erhöhen die Affinität der Proteine zu Lipidmembranen beträchtlich [164]. Es ist nicht endgültig geklärt, ob Rho-Isoformen dank ihrer lipophilen posttrans­lationalen Modifikationen direkt an Membranen binden oder eines „Adapters“ in der Membran bedürfen. Daten aus einem Erythro­zytenmodell deuten darauf hin, daß RhoA GTP-abhängig an integrale Membrankompo­nenten binden kann [25]. Klar gezeigt wurde, daß die posttranslatio­nale Modifikation für eine Reihe von Funktionen, darunter die Interaktion mit Steuerungspro­teinen des GTPase-Zyklus, unerläßlich ist [75, 110].

1.3 Der „Schalter“ Rho wird von Steuerungsproteinen kontrolliert

1.3.1 GEFs, GAPs und GDIs

GTP-Hydrolyse und GDP-GTP-Austausch sind bei RhoA/B/C und anderen kleinen GTPasen komplex regulierte Prozesse. Die intrinsischen GTP-Hydrolyse- und GDP-Dissoziationsraten sind sehr niedrig [26], wobei die Hydrolyserate von RhoA kleiner ist als die von Rac1 oder Cdc42 [188]. Diese Ausgangskonstellation ist Grundlage für die Schalterfunktion der kleinen GTPasen. Durch den Einsatz von Steuerungsproteinen, die den GTPase-Zyklus bei Bedarf vorantreiben oder auch bremsen, wird es möglich, den „Schalter“ Rho präzise zu regulieren. GDP/GTP-Austauschfaktoren (GEF), auch als -Austauschproteine (GEP) oder GDP-Dissozia­tionsstimulatoren (GDS) bezeichnet, aktivieren Rho, indem sie den Übergang in den GTP-gebundenen Zustand fördern [32]. GTPase-aktivierende Proteine (GAP) beschleu­nigen den Hydrolyseschritt und inaktivieren Rho [188]. GDP-Dissoziationsinhibitoren (GDI) binden Rho im inaktiven Status [119] und hemmen die Aktivierung durch GEFs [110].

Extrazelluläre Signale müssen auf die Ebene der Steuerung des GDP/GTP-Gleichgewichts transduziert werden (oder unmittelbar auf dieser Ebene wirken), um die Aktivität von Rho zu beeinflussen, wobei über diese Signalkette wenig bekannt ist. Beispiele für Rho-aktivierende extrazelluläre Signale sind die Wachstumsfaktoren LPA [143] und Bombesin [50], die, durch Rho vermittelt, Streßfilamente und Fokaladhäsionskomplexe in Fibroblasten induzieren. Rezeptorgekoppelte heterotrimerische G‑Proteine können an der Transduktion des LPA-Signals durch die Plasmamembran beteiligt sein [30]. Sphingosin-1-Phosphat aktiviert Rho ebenfalls in Fibroblasten, scheint aber nicht über einen Rezeptor an der Zelloberfläche zu wirken [180]. Über welche Zwischenschritte der Ipa-Komplex von Shigella die Verschiebung des GDP/GTP-Gleichgewichts induziert, ist ebenfalls noch nicht bekannt.

1.3.2 GEFs versetzen Rho in den aktivierten Zustand

Über 20 verschiedene GEFs für Mitglieder der Rho-Superfamilie sind beschrieben worden. GEFs werden oft mit einer (proto-)onkogenen Rolle in Verbindung gebracht. Zum Teil können sie mit mehreren Rho-Unterfamilien (Rho, Rac, Cdc42) interagieren, zum Teil sind sie für einzelne Proteine spezifisch [32]. Lbc [189], mNET1-GEF [7] und mRhoGEP [110] gelten als für Rho spezifisch. Eine weitergehende, differentielle Spezifität für einzelne Rho-Isoformen ist bisher nicht nachgewiesen worden. GEFs wurden meist aus der Zytosolfraktion isoliert; es soll jedoch auch membranassoziierte GEFs geben. Ein Beispiel hierfür ist mRhoGEP [110]. Für rhoGDS und mRhoGEP wurde auch gezeigt, daß die posttranslationale Modifikation von Rho für die Interaktion zwischen GEF und GTPase notwendig ist [75, 110].

1.3.3 GAPs erhöhen die GTP-Hydrolyserate von Rho

Auch die Rho-inaktivierenden GAPs bilden eine Familie mit mehreren Vertretern unter­schiedlicher Spezifität. Die GAPs myr 5 [125], p190 [188] und p122 [74] sollen für Rho spezifisch sein; Isoformspezifität ist auch hier nicht bekannt. Ebenfalls auf Rho wirkt p50rhoGAP, jedoch soll dieses Steuerungsprotein zu Cdc42 eine noch höhere Affinität aufweisen [188]. Durch p190 oder p50rhoGAP wird die GTP-Hydrolyserate von RhoA mindestens um den Faktor 4000 erhöht [188]. Im Gegensatz zu GDIs und manchen GEFs kann rhoGAP auch an posttrans­lational unmodifi­ziertem Rho aktiv sein [75].

Einige GAPs zeigen neben ihrer eigentlichen GAP-Funktion noch andere Aktivitäten. So bindet p122 an PLC-delta 1 und aktiviert dieses Enzym. Dadurch wird die Hydrolyse von 4,5‑PIP2 gesteigert [74] und eine Funktion von Rho, die Stimulation der PIP2-Synthese [36], auch indirekt antagonisiert. Das Klasse‑IX-Myosin myr5 hat in vitro und in vivo rhoGAP-Aktivität mit einer hohen Spezifität für Rho. Überexpression von myr5 in HeLa-Zellen führt zur Inaktivie­rung von Rho [125].

1.3.4 RhoGDI inhibiert die Trennung von GDP und Rho

RhoGDI hat neben seiner Rho-inaktivierenden Funktion [119] auch Einfluß auf die intrazel­luläre Lokalisation von Rho. Mit RhoGDI komplexiertes Rho liegt im Zytosol vor [80, 94]. GDI löst membrangebundenes RhoB von der Membran ab, wenn RhoB im Komplex mit GDP vorliegt [80]. Mikroinjektion von RhoGDI inhibiert entsprechend die wachstumsfaktorinduzierte Translokation an die Plasmamembran [169]. RhoGDI wird nur an posttranslational modifizier­tem Rho aktiv [75] und bindet zehnmal besser an GDP-Rho als an GTP-Rho [155]. Mit GDI komplexiertes GDP-RhoA kann von GEFs nicht aktiviert werden [94, 110].

RhoA verfügt als einzige Rho-Isoform über einen Serinrest an Position 188. Wenn RhoA an Ser188 von der cAMP-gesteuerten Proteinkinase A (PKA) phosphoryliert wird, ist RhoGDI in der Lage, auch mit GTP komplexiertes, membrangebundenes RhoA zu binden und ins Zytosol zu translozieren [97]. Die biologische Aktivität von RhoA wird entsprechend durch die PKA-vermittelte Phosphorylierung am Ser188 in vivo vermindert [45].

Von RhoGDI sind drei Isoformen bekannt, die mit α, β und γ bezeichnet werden und sich in ihrem Expressionsmuster unterscheiden. Während RhoGDIα ubiquitär vorkommt, sind die anderen beiden Isoformen nur aus bestimmten Geweben isoliert worden [156]. Unterschiede in der Substratspezifität wurden bisher nicht beschrieben. RhoGDI ist nicht spezifisch für Rho und interagiert auch mit anderen Vertretern der Rho-Superfamilie wie Rac und Cdc42 [119].

1.4 Rho steuert das Aktinzytoskelett über vielfältige Angriffspunkte

1.4.1 Das Aktinzytoskelett reguliert Gestalt und Bewegung von Zellen

Die präzise Kontrolle des GTPase-Zyklus durch das oben beschriebene Arsenal von Steue­rungsproteinen ermöglicht die feine Regulierung der Aktivität von Rho-Effek­tormolekülen. Die meisten der bekannten Effektoren von Rho wiederum nehmen Einfluß auf Abläufe innerhalb der Zelle, an denen Aktin und mit Aktin assoziierte Zellkomponenten beteiligt sind. Aktin ist im Zytoplasma von Eukaryotenzellen das am stärksten repräsentierte Protein. Es kann – in Abhän­gigkeit vom Zelltyp – bis zu 10% der Gesamtproteinmenge ausma­chen. Aus 42kD-Aktinmo­nomeren (G‑Aktin) können durch Polymerisation Mikrofilamente (F‑Aktin) entstehen. Der Anbau neuer Monomere erfolgt – unter Bedingungen, wie sie im Zytosol herrschen – vorzugs­weise an einem Ende der Filamente, dem sogenannten barbed end, während das Abspalten von Monomeren im wesentlichen auf das andere Ende (pointed end) beschränkt ist [166].

Aktinfilamente sind ein wesentlicher Bestandteil des Zytoskeletts, das an einer Vielzahl von Zellfunktionen beteiligt ist. Es strukturiert die Zelle, bestimmt ihre Morphologie, definiert Polarität und ist für Zellbewegung und -teilung notwendig [166]. Charakteristisch für das Aktinzytoskelett ist die enge Anbindung an Plasmamembranen [175]. Damit Aktinfilamente zu einer funktionsfähigen Einheit zusammengesetzt werden können, bedarf es einer Fülle weiterer Proteine, die Filamente untereinander oder mit anderen Zellelementen verbinden. Beschrieben sind Moleküle, die Aktinfasern bündeln, bewegen oder in der Plasmamembran verankern.

Mit der Wirkung der kleinen GTPasen der Rho-Familie stehen mindestens drei Organisa­tionsformen von F‑Aktin in Beziehung: (a) Lange, kontraktile, parallel in Gruppen angeordnete und Myosin enthaltende Bündel von F‑Aktin, die die Zelle in vielen Richtungen von Membran zu Membran durchqueren können, werden als Streßfilamente bezeichnet. Sie sind an sogenann­ten Fokaladhäsionen mit Integrinen und damit – indirekt – mit der extrazellulären Matrix verbunden. (b) Ein dichtes Geflecht von Aktinfasern findet sich am freien, sich vorwölbenden Rand von Lamellipodien und Membranfältelungen (membrane ruffles), wellenähnlichen Ausbuch­tungen der Plasmamembran. (c) Kurze F‑Aktinbündel schließlich geben von der Zelloberfläche abstehenden fadenförmigen Membranprotrusionen, die als Filopodien oder mikrospikes bezeich­net werden, ihre Gestalt [130].

1.4.2 Rho, Rac und Cdc42 spielen bei der Steuerung des Zytoskeletts abgrenzbare Rollen

Cdc42, Rac und Rho regulieren die Organisation des Aktinzytoskeletts und interagieren auf komplexe Weise miteinander. Die Entwicklung des entsprechenden For­schungsgebiet weist eine hohe Dynamik auf, und ständig werden neue Aspekte der Funktionen und Interaktionen kleiner Rho-GTPasen aufgedeckt. Hier soll nur ein grober Abriß erfolgen:

In Mikroinjektionsexperimen­ten an Fibroblasten zeigte sich zuerst, daß Cdc42 Aktinpolyme­risation induziert und zur Ausbildung von Filopodien und microspikes führt [130]. Rac vermit­telt dagegen die Entstehung von Lamellipodien und Membranfältelungen durch Aktinpolymeri­sation de novo [103]. Das nach einer Punktmutation konsti­tutiv aktive RhoAG14V führt nach Mikroin­jektion in Fibroblasten zu ausgeprägten Veränderun­gen der Zellmorphologie. Der Zellkörper kontrahiert sich, während fingerartige Fortsätze noch am Substrat haften bleiben [138]. Mit diesem Phänomen assoziiert ist die durch Rho induzierte Reorganisation von Aktin- und Myosinfilamenten zu Streßfasern. Rho scheint hier allerdings keine De-novo-Aktinpolyme­risation zu induzieren [103, 130]. Anhand dieser Fibroblastenexperimente wurde eine Hierarchie von Rho, Rac und Cdc42 postuliert: Es wurde gezeigt, daß in diesem System unter dem Einfluß von Cdc42 die Aktivität von Rac zunimmt, während andererseits Rac einer der Faktoren ist, die die Aktivität von Rho steigern können [130]. Möglicherweise gilt diese Rangordnung nicht in allen Zelltypen und nicht für alle Aufgaben der GTPasen der Rho-Familie. Wahrschein­lich ist aber, daß die Steuerung der vielfältigen und komplexen Funktionen des Aktinzytoskeletts häufig der Koope­ration mehrerer kleiner GTPasen der Rho-Familie bedarf. Dabei können diesen Proteinen auch antagonistische Rollen zufallen: Bei der Steuerung der Morphologie des Wachs­tumskegels von Neuronen, beispielsweise, sind Rho einerseits und Rac und Cdc42 andererseits an Signalketten beteiligt, die miteinander im Wettbewerb zu stehen scheinen [92].

Trotz des komplexen Zusammenspiels der kleinen GTPasen ist eine Dissektion der Signalketten möglich. So konnte einzelnen Mitgliedern der Rho-Familie eine Reihe spezifischer und eng definierter Funktionen zugeordnet werden. Dabei ist wichtig zu berücksichtigen, daß Rho-Proteine in verschiedenen Zelltypen nicht die gleichen Aufgaben erfüllen müssen. In Epithelzellen kann Rho auch Membranfältelung induzieren, die zeitlich dem Erscheinen von Streßfilamenten deutlich vorausgeht [169]. Diese Fältelungen lassen sich morphologisch von den Rac-ruffles abgrenzen [129]. Die Wirkung von Rac ist andererseits in MDCK-Epithelzellen zwar notwendig, nicht aber hinreichend, um Membranfältelung zu erzeugen [65]. In Thrombozyten ist RhoA notwendig für die Aggregation [120], und in Makrophagen spielt Rho eine essentielle Rolle bei der Fcγ-vermittelten Phagozytose [66]. Während der Zellteilung (Zytokinese) reguliert Rho den kontraktilen Aktin-Myosin-Ring an der Teilungsfurche [106].

Im folgenden werden einige Funktionsmechanismen und potentielle Interaktionspartner der klassischen Rho-Isoformen A, B, C, sowie von RhoD im Bereich der Zytoske­lettregulation vorgestellt. Dies muß lückenhaft geschehen, da das Wissen darüber, wie Rho wirkt, noch sehr unvollständig ist. In vielen bisher veröffentlichten Arbeiten wurde zwischen RhoA, B und C nicht differenziert, da die biochemischen Unterschiede oft unwesentlich zu sein schienen. Häufig wird „Rho“ synonym verwendet mit RhoA, der wohl am besten untersuchten Isoform. Die Wirkung von Rho auf das Aktinzytoskelett scheint über eine Vielzahl von An­griffspunkten vermittelt zu werden. Insbesondere Zell-Zell-Kontakte, Mitglieder der Ezrin-Radixin-Moesin-(ERM-)Familie sowie die Verankerung von Aktinfilamenten an der Plasmamembran durch Fokalkomplexe stehen unter der Kontrolle von Rho.

1.4.3 Rho reguliert Fokalkomplexe und Streßfilamente

Fokalkomplexe oder Fokaladhäsionen sind in der Plasmamembran lokalisierte, plattenförmige Ansammlungen (cluster) von Integrinen und aus dem Zytoplasma rekrutierten Proteinen, darunter unter anderem Talin, Vinculin, α‑Aktinin, Paxillin, Tensin und die Tyrosinkinasen pp125FAK und Src [38]. Integrine sind weitverbreitete heterodimerische Glykoproteine, die die Plasmamembran durchspannen und mindestens zwei Funktionen erfüllen: Sie können die Zelle an die extrazelluläre Matrix fixieren und Signale in die Zelle übertragen [38]. Die „klassischen“ Fokaladhäsionsplaques tragen auf der zytoplasmatischen Seite Veranke­rungsstellen für Streßfi­lamente. Es konnte gezeigt werden, daß – neben dem Kontakt mit der extrazellulären Matrix als Grundvoraussetzung – die Aktivität von Rho notwendig ist, damit diese Fokal­komplexe entstehen können [77, 143]. Und nur wenn zuvor Integrine zu Fokaladhä­sionsplaques zusam­mengezogen wurden, können Aktinfilamente als parallele, kontraktile Streßfasern organisiert werden. In Abwesenheit von Fokaladhäsionen entstehen unter dem Einfluß von Rho lediglich dünne Aktinfilamentbündel [103, 130]. Fokaladhäsionsplaques können aber auch dann induziert werden, wenn die Bildung von Streßfilamenten unterbunden wird [130]. Fokal­adhäsionsplaques sind hochdynamische Strukturen und verschwinden nach experimentellem „Abschalten“ von Rho binnen weniger Minuten [130].

Über welche Mechanismen reguliert Rho die Fokaladhäsionskomplexe? Während dieser Vorgang als Ganzes noch nicht verstanden ist, gibt es bruchstückhafte Informationen zu einzelnen Aspekten. In Fibroblasten kolokalisiert RhoA offenbar nicht mit Fokaladhä­sionen [169]. Die Induktion von Streßfilamenten und das Zusammenziehen von phosphotyrosin­halti­gen Proteinen an Fokaladhäsionen soll in Fibroblasten aber von einer downstream von Rho gelege­nen Tyrosinkinase abhängig sein, wobei die Identität dieses Enzyms unklar ist [144]. Bekannt ist, daß Rho (nicht aber Rac) die Phosphorylierung der Tyrosinkinase pp125FAK, die ein Substrat von Src ist, stimuliert [50, 180]. Rho induziert weiterhin auch die Tyrosin­phosphory­lierung der Fokaladhäsionsproteine Paxillin und p130 in Fibroblasten [50]. In-vitro-Daten deuten darauf hin, daß Paxillin dabei von pp125FAK phosphoryliert werden kann [18]. Die Bedeutung dieser Modifikation ist allerdings unklar; zumindest ist sie keine notwendige Bedingung für die Rekrutierung des Proteins an Fokaladhäsionen [18].

Eine andere Verbindung zwischen Rho und Fokalkomplexen ergibt sich über die von Rho stimulierte 4,5‑PIP2-Synthese durch Aktivierung einer Phosphatidylinositol-4-phosphat 5-Kinase [36]. RhoA erhöht die Konzentration von Vinculin, einem Protein, das als Ankerstelle für F‑Aktin gilt, an Fokalkomplexen von MDCK-Zellen [91]; in Fibroblasten wurde auch die Rekru­tierung von Talin als Rho-abhängig beschrieben [143]. Die Bindung von Vinculin sowohl an Aktin als auch an Talin wird in Fibroblasten von 4,5‑PIP2 verstärkt. Durch Blockierung von PIP2 mit monoklonalen Antikörpern konnte die Ausbildung von Fokaladhäsionsplaques und Streßfi­lamenten vollständig unterbunden werden [58].

Eines der am besten untersuchten Zielmoleküle von Rho ist die Rho-Kinase, eine 160kDa Serin/Threonin-Kinase, die spezifisch an GTP-Rho bindet und deren Aktivität durch diese Interaktion etwa um den Faktor zwei erhöht wird [111]. In der Literatur trägt dieses Enzym mehrere Namen: „Rho-assoziierte Kinase“, „Rho-Kinase“ und „ROKα“ sind als iden­tisch zu betrachten; p160ROCK ist eine Isoform der Rho-Kinase [53]. Die Mikroinjektion der katalyti­schen Domäne von Rho-Kinase oder Überexpression des Enzyms können unabhängig von Rho die Bildung von Streßfilamenten und Fokaladhäsionen induzieren [11, 35, 99]. Konsti­tutiv aktives RhoA bewirkt die Rekrutierung von Rho-Kinase an Membranen und die Kolokali­sation mit F‑Aktin in der Zellperipherie [100]. Die Kinase gilt aufgrund dieser Beob­achtungen als ein Vermittler von Rho-Signalen.

Die Verbindung zwischen Rho-Kinase und der Induktion von Streßfilamenten ergibt sich möglicherweise über die Interaktion der Kinase mit leichten Myosinketten (MLC): Rho-Kinase ist in der Lage, MLC in vivo und in vitro zu phosphorylieren [12, 35], und zwar an der gleichen Stelle wie die Calmodulin-gesteuerte MLC-Kinase [12]. Durch diese Modifikation wird die ATPase-Aktivität von MLC – und damit die Motorfunktion von Myosin – angeschaltet [166]. Auch die Myosin-bindende Untereinheit (MBS) der Myosinphospha­tase, dem direkten Gegen­spieler der Myosin-phosphorylierenden Enzyme, ist ein Substrat der Rho-Kinase. GTP-RhoA scheint diese katalytische Wechselwirkung durch spezifische Interaktion mit der MBS zu vermitteln. Durch Phosphorylierung wird die Myosinphosphatase inaktiviert, was den Phospho­rylierungs- und Aktivierungsgrad von MLC indirekt – als Folge verminderter Dephos­phory­lierung – zusätzlich steigert [89]. Somit ergibt sich ein Modell der doppelten Regulierung der Phosphorylierung von MLC. Dieser Mechanismus könnte auch die beschriebene „Erhöhung der Ca2+-Sensitivität“ der Phosphorylierung von MLC in glatten Muskelzellen durch aktiviertes und an die Membran transloziertes RhoA erklären [60].

Über das Na+‑H+-Austauschprotein NHE1 eröffnet sich ein weiterer Signalweg. Aktivität von NHE1 soll für die Entstehung von Streßfasern und Fokaladhäsionen in Fibroblasten und Epithelzellen notwendig sein. RhoA aktiviert NHE1 über p160ROCK [172].

1.4.4 Rho beeinflußt Zell-Zell-Kontakte

Rho ist an der Regulierung von tight junctions in polarisierten Epithelzellen beteiligt [134]. In Keratinozyten steuern Rho und Rac die Einrichtung von Zell-Zell-Kontakten über die lokale Anreicherung von Cadherinen in der Plasmamembran. Cadherine sind Ca2+-abhängige Zell-Zell-Haftmole­küle, die – vermittelt durch Catenine – mit dem Aktinzytoskelett interagieren [28]. Ein anderes aktinbindendes Membran/Skelett-Protein, das an Zell-Zell-Kontaktstellen in Epithelzel­len konzentriert ist, ist α‑Adduzin. Auch hier spielt die bereits im Zusammenhang mit der Induktion von Streßfilamenten erwähnte Rho-Kinase mögli­cherweise eine Rolle, indem sie α‑Adduzin phosphoryliert. Diese Phospho­rylierung verstärkt die Interaktion mit Aktinfilamenten in vitro. Auch α‑Adduzin kann durch Myosinphosphatase dephosphoryliert werden. Dieser Schritt scheint, ähnlich wie für MLC beschrieben, gleichzeitig von Rho gehemmt zu werden, so daß auch hier eine zweigleisige Regulation vorliegen könnte [88].


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1.4.5  Rho interagiert in komplexer Weise mit Ezrin, Radixin und Moesin

Die eng verwandten Proteine Ezrin, Radixin und Moesin (ERM) [157] bilden eine weitere Familie von Molekülen, die die Verankerung von F‑Aktin in der Plasmamembran vermitteln können [175]. Ein möglicher Verankerungspunkt für ERM-Proteine ist das integrale Membran­protein CD44 [175]. ERM-Proteine sind innerhalb der Zelle an Stellen lokalisiert, wo Aktinfila­mente dicht mit der Plasmamembran assoziiert sind, wie Teilungsfurchen, Mikrovilli, Membranfältelungen, Zell-Zell- und Zell-Matrix-Haftstellen [175]. Ezrin ist konzentriert in Mikrovilli und anderen aktinreichen Protrusionen von Epithelzellen. Moesin findet sich dagegen nur in manchen Epithelzellen, hauptsächlich jedoch in Endothelzellen [21]. ERM-Proteine interagieren in komplexer Weise mit Rho und sollen an der Aktivierung von Rho beteiligt sein [168]. Gleichzei­tig gibt es Hinweise, die dafür sprechen, daß Rho umgekehrt auch die Funktion und Lokalisation von Ezrin, Radixin und Moesin reguliert (vgl. Abb. 1-2):

RhoA erzeugt in Fibroblasten Aktin/Membran-Protrusionen. Radixin wird Rho-abhängig phosphoryliert und in diese Protrusionen rekrutiert [161]. Der GEF Dbl interagiert in vitro mit der N‑terminalen Region von Radixin, ohne daß diese Interaktion einen Einfluß auf die Aktivität von Dbl hätte. Dbl interagiert nicht mit Radixin, wenn dieses mit RhoGDI komplexiert vorliegt. Umgekehrt verdrängt RhoGDI jedoch Dbl von Radixin. Es wird speku­liert, daß Radixin für die Rekrutierung dieser Rho-Steuerungsproteine eine Rolle spielt [167]. In Epithelzellen induziert Rho die Entstehung von Membranfältelungen und die Ansammlung von Moesin und MBS an der Plasmamembran im Bereich der freien Kante der Protrusion [53]. RhoA kolokalisiert mit ERM-Proteinen an Zell-Zell-Haftstellen, in Teilungsfurchen und dort, wo sich Membranfältelungen bilden [169]. Ähnlich wie MLC oder α‑Adduzin ist Moesin ein Substrat sowohl der Rho-Kinase als auch der Myosinphosphatase. Die Phosphorylierung erfolgt in einem Abschnitt von Moesin, der an der Aktinbindung beteiligt ist und könnte somit den Funktionszustand des Moleküls modifizieren [53].

Auch die Bildung des CD44/ERM-Komplexes soll in vivo von Rho gesteuert werden. Die Bindung zwischen ERM-Proteinen und CD44 wird in Anwesenheit von 4,5‑PIP2 verstärkt [73]. Die 4,5‑PIP2-Konzentration wiederum steht unter dem Einfluß von Rho [36]. Darüber hinaus wurde festgestellt, daß der CD44/ERM-Komplex in BHK-Zellen RhoGDI enthält [73]. Wenn RhoGDI an das N‑terminale Fragment von ERM-Proteinen, das auch die CD44-Bindungsstelle enthält, bindet, wird die Aktivität des Steuerungsproteins reduziert und damit die Aktivierung von Rho eingeleitet. Somit ergibt sich ein potentieller Mechanismus für die Aktivierung von Rho durch ERM-Proteine [168].


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Abb. 1 - 2 Rho und ERM-Proteine regulieren sich wechselseitig (Erläuterungen vgl. 1.4.5).

1.4.6 RhoD – und möglicherweise RhoB – regulieren die Dynamik von Endosomen

RhoD bewirkt bei Überexpression in BHK-Zellen die Ausbildung F‑Aktin-haltiger Membran­fortsätze und den Abbau von Streßfasern und Fokaladhäsionen, Funktionen, die das Protein von den drei Isoformen A‑C unterscheiden. Weiterhin soll RhoD die Dynamik früher Endosomen regulieren. Expression der konstitutiv aktiven Mutante RhoDG26V führt zu verringerter Motilität der Organellen und hemmt – offenbar über diesen Mechanismus – die homotypische Fusion der Endosomen. RhoD ist in BHK-Zellen an der Plasmamembran sowie an vesikulären Strukturen in der ganzen Zelle lokalisiert [126].

RhoB zeigt ein ähnliches subzelluläres Verteilungsmuster und könnte aufgrunddessen eben­falls für eine Rolle bei der Endosomensteuerung prädisponiert sein [5, 112]. Die Proteinkinase N („PKN“, „PRK1“) wird von RhoB an Endosomen rekrutiert [112]. PRK1 ist eine Serin/Threonin-Kinase, die in vitro sowohl von RhoA [13, 181] als auch RhoB [112] gebunden und aktiviert wird. In vivo soll PRK1 jedoch nur mit aktiviertem RhoB interagie­ren [112]. PRK1 interagiert andererseits auch mit α‑Aktinin [124], einem aktinfilamentbündelnden Protein, das u. a. in Fokalkomplexen gefunden wird [38]. Diese Wechselwirkung ist in vitro 4,5‑PIP2-abhängig [124].

1.4.7 Mit der Funktion von Rho assoziierte Zytoskelettbestandteile sind an der Zellinvasion durch Shigella beteiligt

Die Aktivität von Rho ist notwendig, damit Shigella in Zellen eindringen kann. An Modellen mit HeLa-Zellen, anderen Epithelzellen und Fibroblasten wurde gezeigt, daß die Invasion stark einschränkt ist, wenn zuvor das Clostridium botulinum-Toxin C3, das Rho spezifisch inhibiert [160], in die Zellen eingeschleust wurde [3, 183]. Rho reguliert die Entstehung der langen F‑Aktinbündel, die das Gerüst der bakterieninduzierten blütenkelchähnlichen Membranveränderungen bilden. Nur die Aktinnuklei unmittelbar unter den eindringenden Bakterien bilden sich Rho-unabhängig [3].

Ipa B, C und D von Shigella interagieren in vitro und kolokalisieren in vivo mit α5β1-Integrin [182] und können möglicherweise auf diesem Weg eine Aktivierung der Fokaladhäsionskom­plexe vermitteln [183]. Die Invasionseffizienz von Shigella in CHO-Zellen korreliert mit dem Expressionsniveau von α5β1-Integrin in der Wirtszelle und scheint von der Ipa-Integrin-Interak­tion abhängig zu sein [182]. Das in einem anderen Zusammenhang gefundene Ergebnis, daß Rho offenbar nicht nur regulatorische Signale an die Fokaladhäsionen vermittelt, sondern möglicher­weise auch umgekehrt extrazel­luläre Signale – durch Integrine weitergegeben – die Aktivität von Rho beeinflussen, könnte hier von Bedeutung sein [159].

IpaA interagiert im Zytoplasma von HeLa-Zellen mit Vinculin und induziert die Rekrutierung von Vinculin und α‑Aktinin an die Bakterieneintrittsstelle [173]. Auch Ezrin, dessen Funktion für die Epithelzellinvasion durch Shigella notwendig ist, wird an die Invasionskomplexe transloziert und kolokalisert dort mit Aktinfilamenten [165]. Weitere aktinasso­ziierte Proteine, die üblicher­weise an Fokaladhäsionskomplexen vorkommen, konnten an der Bakterieninvasions­stelle nachgewiesen werden, darunter Paxillin, Talin, Cortactin, pp125FAK und Src [43, 182, 183]. Überdies konnte gezeigt werden, daß pp125FAK und Paxillin in CHO-Zellen im Laufe des Invasionsprozesses phosphoryliert werden [182, 183]. Auch Cortactin wird tyrosinphospho­ryliert. Dieses Phänomen konnte in HeLa- und polarisierten Epithelzellen nachgewiesen werden und soll durch die Tyrosinkinase pp60c-src (Src) vermittelt werden [43, 186]. HeLa-Zellen, die Src überexprimieren, können von nichtinvasiven Shigellenstämmen infiziert werden [43]. Src und Cortactin werden an die Bakterieneintrittsstelle rekrutiert, wo sie mit F‑Aktin kolokalisieren [43]. Cortactin ist ein F‑Aktin-bindendes und -bündelndes Protein [78], das hauptsächlich in randständigen Zellstruktu­ren wie Lamellipodien und Membranfältelungen konzentriert vor­kommt und eine SH3-Domäne enthält [186]. Die Phosphorylierung mindert die Fähigkeit des Proteins, F‑Aktin zu binden, in vitro geringfügig [78] und in vivo nicht meßbar [186]. Die Fähigkeit zur F‑Aktin-Bündelung wird jedoch durch die Einwirkung von Src in vitro deutlich herabgesetzt [78]. Aufgrund dieser Beobachtung wurde über eine antagonistische Rolle von Cortactin (und damit Src) gegenüber der aktinbündelnden Wirkung von Rho spekuliert [1]. Möglicherweise übt Src überdies auch auf einem anderen Weg eine hemmende Wirkung auf Rho aus: Src kann p190rhoGAP phosphorylieren und führt bei Überexpression zur Auflösung von Streßfilamenten. Es wird vermutet, daß die Phosphorylierung die Aktivität von rhoGAP erhöht und es dadurch sekundär zur Inaktivierung von Rho kommt [33].

1.5 Rho-Isoformen haben unterschiedliche biologische Eigenschaften

1.5.1 Rho-Isoformen unterscheiden sich in ihrer intrazellulären Lokalisation

Daß RhoB sich im Muster seiner posttranslationalen Modifikation und in der subzellulären Lokalisation von den anderen beiden Isoformen unterscheidet, ist seit längerem bekannt: Während RhoA und RhoC geranylgeranyliert werden, kann RhoB, das im C‑terminalen Bereich über zwei weitere Zysteine verfügt, zusätzlich oder alternativ farnesyliert und palmitoyliert werden [4]. Am Beispiel von Ras konnte gezeigt werden, daß die Art des angefügten Iso­prenoidrests die intrazelluläre Lokalisation beeinflußt [23]. Entsprechend liegen bei Über­expression in Fibroblasten und Epithelzellen RhoA und RhoC hauptsächlich im Zytosol vor, während RhoB im wesentlichen an Endosomen lokalisiert ist. Ein kleiner Anteil aller drei Isoformen A, B und C findet sich an der Plasmamembran. [5, 112]. RhoD ähnelt in seinem Verteilungsmuster RhoB und kommt ebenfalls an der Plasmamembran und an frühen Endoso­men vor [126]. Für RhoD, das wie RhoB in der C‑terminalen Region über mehr als ein Zystein verfügt, kann darüber hinaus nach [67] gemutmaßt werden, daß es ebenfalls isoprenyliert und palmitoyliert wird. Vor diesem Hintergrund könnte man versucht sein, zwei Paare mit gemein­samen Eigenschaften gegenüberzustellen, RhoA/C einerseits und RhoB/D andererseits.

1.5.2 Rho-Isoformen werden während der Shigelleninvasion differentiell rekrutiert

Die drei Rho-Isoformen A, B und C werden, induziert durch das Invasionssignal von Shigella, in einem Zeitraum von Minuten an die Bakterieneintrittsstelle rekrutiert, wo sie mit F‑Aktin kolokalisieren [3]. Die Translokation von RhoA an seine Wirkungsorte, unter anderem an Mem­branfältelungen, war bereits zuvor beschrieben worden [169]. Im Zusammenhang mit der Shi­gelleninvasion wurde jedoch ein völlig neuer Aspekt aufgedeckt: Verschiedene Isoformen wei­sen unterscheidbare Rekrutierungsmuster auf. RhoA akkumuliert in unmittelbarer Nähe der eindringenden Bakterien, während RhoB und RhoC im wesentlichen in die Spitzen der F‑Aktin-reichen, bakteriell induzierten, zellulären Protrusionen rekrutiert werden [3]. Überraschend war hier, daß RhoA und RhoC, die sich hinsichtlich ihrer Lokalisation in der nichtinfizierten Zelle und ihrer posttranslationalen Modifikation nicht unterscheiden ließen, durch ihr Transloka­tionsverhalten unterscheidbar wurden. Dagegen weisen die Isoformen RhoB und RhoC, die verschieden lokalisiert sind und modifiziert werden [4, 5], lichtmikroskopisch nicht unterscheid­bare Rekrutierungsmuster auf. Auf der Grundlage des Rekrutierungsverhaltens läßt sich RhoA somit nicht nur gegen RhoB, sondern zusätzlich auch gegen RhoC abgrenzen.

Die Vermutung liegt nahe, daß die Unterschiede hinsichtlich der Lokalisation in der nicht­infizierten Zelle auf die verschiedenen posttranslationalen Modifikationen der Isoformen zurück­zuführen sind. Welche Eigenschaften der Isoformen erklären aber die unterschiedlichen diffe­rentiellen Rekrutierungsmuster von RhoA und RhoC? Es bot sich an, bei der Suche nach Deter­minanten der Rekrutierungsmuster von einer Analyse der Primärstruktur auszuge­hen.

1.5.3 Primärstrukturen der Rho-Isoformen

Die Sequenzen von RhoA, RhoB und RhoC (Abb. 1-3) wurden Ende der Achtzigerjahre publiziert [187, 34]. RhoA und RhoC werden als 193 Aminosäuren lange Proteine synthetisiert; RhoB ist drei As länger. Zwischen As1 und 122 unterscheiden sich RhoA und RhoC nur in einer einzigen Aminosäure. Erweitert man den Bereich bis zur Position 180, besteht immer noch eine Übereinstimmung von 96%. Im selben Bereich beträgt die Homologie zwischen RhoA und RhoB 89%. Die Homologie nimmt zum C‑Terminus hin ab; die Mehrzahl der Unterschiede findet sich im C‑terminalen Sequenzdrittel einschließlich der CaaX-Gruppen.

Abb. 1 - 3 DNS-Sequenzen von RhoA, B und C im Vergleich. Unterschiede in den Aminosäuresequenzen sind rot markiert.

Durch die vorangegangenen Untersuchun­gen von Birgit Bohm in unserem Labor war bereits bekannt, daß das Vorhandensein der CaaX-Region eine notwendige Bedingung für die Shigella-induzierte Rekrutierung von Rho in unserem System darstellt. Ebenso ergaben sich durch präliminäre Analysen eines Konstrukts (RhoACA, vgl. Tab. 2-12) mit herkömmlichen fluores­zenzmikroskopischen Techniken Hinweise auf eine wesentliche Rolle des prä-C‑terminalen Sequenzabschnitts As 181‑189 für die Determinierung des Rekrutierungsmusters, während die CaaX-Regionen von RhoA und RhoC keinen Einfluß auf das Rekrutierungsmuster hatten.

1.6 Fragestellung

Ziel der vorliegenden Studie war es, den Einfluß der CaaX-Gruppe und prä-C‑terminaler Aminosäuren auf die Rekrutierung von Rho-Isoformen näher zu untersuchen und den Sequenz­abschnitt einzugrenzen, welcher das Rekrutierungsmuster bestimmt. Darüber hinaus wurde der Frage nachge­gangen, ob sich das Rekrutierungsphänomen auf die drei Isoformen RhoA, B und C beschränkt, oder ob auch andere, verwandte kleine GTPasen an die Bakterieneintrittsstelle transloziert werden. Zu diesem Zweck wurde hier das Rekrutierungsverhalten der kleinen GTPase RhoD [126], die den drei Isoformen A, B und C auf der Primärstrukturebene nur zu etwa 50% homolog ist (vgl. Abb. 1-4), erstmals untersucht. Eine Reihe von rho-Hybrid­kon­strukten wurde mit Hilfe PCR-vermittelter Mutagenese hergestellt, in Vektoren kloniert und im HeLa-Zell-Modell analysiert. HeLa Zellen wurden mit der Konstrukt-DNS transient trans­fiziert und mit invasiven S. flexneri SC301 infiziert. Nach Fixierung und Färbung wurden die expri­mierten Konstrukte schließlich hinsichtlich ihres Verteilungsmusters in der Zelle unter­sucht. Dies erfolgte durch Markierung der mutierten Proteine mit fluoreszierenden Antikörpern, Aufnahme einer Z‑Serie digitaler Mikrofotografien mit definiertem Abstand der Fokussie­rungsebenen und nachfolgender Bearbeitung der Bilddaten mit dem epr-Dekonvolutions­algorithmus [48].

Abb. 1 - 4 DNS-Sequenzen von RhoA und RhoD im Vergleich. Unterschiede in den Aminosäuresequenzen sind rot markiert.


Fußnoten und Endnoten

1 In jüngerer Zeit wurde vorgeschlagen, Shigella nicht als eigenständige Gattung, sondern als Gruppe von Klonen der Spezies Escherichia coli zu betrachten [142]. Da sich diese Einteilung in der internationalen Fachliteratur jedoch noch nicht durchgesetzt hat, wird in dieser Arbeit die bisherige Klassifikation beibehalten.xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

2 Sequenzidentität und -ähnlichkeit wurden mit der Funktion "gap" des unter http://genome.dkfz-heidelberg.de zugänglichen Programms "HUSAR" berechnet.



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31.08.2004