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2  Methodik

2.1 DNS-Präparation

2.1.1 Bakterienkultur

E. coli Wirtsstämme mit den zu isolierenden Plasmiden (vgl. Tab. 3-5) wurden bei –70°C in 25% Glyzerin gelagert. Inokuliert wurde direkt in LB-Flüssigmedium (Fluka) mit Zusatz von 100 µg/ml Ampicillin. Die Kulturen (12 ml für Miniprep, 500 ml für Maxiprep) wuchsen über Nacht bei 37°C und unter aeroben Bedingungen in einem Schüttler.

2.1.2 Miniprep

Für eine DNS-Ausbeute bis zu 25 µg wurde das QIAprep Spin Miniprep Kit von QIAGEN verwendet. Die Bakterienflüssigkultur wurde zehn Minuten lang mit 3000 g bei Raumtemperatur zentrifugiert, das Sediment in einem RNAse enthaltenden Puffer resuspendiert. Die bakteriellen Zellen wurden alkalisch lysiert in 100 mM NaOH und 0,5% SDS (Endkonzentration). Nach Neutralisieren mit einem Puffer mit hoher Salzkonzentration und Abzentrifugieren ausgefällter Zellbestandteile bei 15000 g wurde die Plasmid-DNS selektiv an eine Silikagelmembran gebunden und konnte nach einem Waschschritt mit einem wenig Salz enthaltenden Puffer eluiert werden.

2.1.3 Maxiprep

Größere DNS-Mengen (bis zu 800 µg) wurden mit dem QIAGEN Plasmid Maxi Kit erhalten.
Das Verfahren ist der Miniprep analog, allerdings wurde die Plasmid-DNS an einen Anionen­austau­scher gebunden. Die Zentrifugationsschritte nach der Bakterienernte wurden in einer Ultrazentri­fuge bei 80000 g und 4°C vorgenommen. Nach der Elution wurde die DNS mit Isopropanol präzipitiert, mit 70%‑igem Ethanol gewaschen und in 400 µl TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) gelöst.

2.1.4 Phenol/Chloroform-Extraktion

Die Extraktion mit Phenol und Chloroform diente dazu, Nukleinsäurelösungen von Protein­beimischungen zu reinigen [148]. 300-400 µl DNS-Lösung wurden in ein 1,5‑ml-Eppendorf-Röhrchen überführt. Kleinere Volumina wurden mit TE-Puffer (vgl. 2.1.3) aufgefüllt. Ein Volumen Phenol (pH 7,5-8,0; Roth) wurde hinzugefügt und durch zweiminütiges Schütteln (Vortexen) eine Emulsion hergestellt. Durch 15‑minütiges Zentrifugieren bei 4°C und 15000 g wurden die zwei Phasen wieder getrennt. Die wässrige Phase wurde in ein neues Reaktionsgefäß überpipettiert und die Extraktion zweimal mit einer Mischung von Phe­nol:Chlo­ro­form:Iso­amyl­al­kohol (25:24:1) wiederholt. 10‑minütiges Zentrifugieren war hier ausreichend. Ein letzter Extrak­tionsschritt wurde mit reinem Chloroform vorgenommen. Nach fünfminütigem Zentri­fu­gie­ren wurde die wäßrige Phase mit der gereinigten DNS in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Unmittelbar darauf folgte immer eine Ethanolpräzipitation (2.1.5).

2.1.5 Ethanolpräzipitation

1/10 Volumen 3 M Natriumazetat (pH 5,2) und zwei Volumina eiskaltes, 100%‑iges Ethanol wurden zur DNS-Lösung pipettiert. Präzipitiert wurde über Nacht bei –20°C. Das Präzipitat wurde 15 min lang bei 15000 g und 4°C abzentrifugiert, der Überstand abgenommen und das DNS-Pellet zweimal mit 70%‑igem Ethanol gewaschen. Dadurch wurden Spuren von Phenol sowie Salze entfernt. Nach einem letzten Waschschritt mit 100%‑igem Ethanol wurde die DNS vorsichtig getrocknet und in einem geeigneten Volumen sterilen, deionisierten Wassers gelöst. Die Lagerung erfolgte bei –20°C (modifiziert nach [85]).

2.1.6 Messen der DNS-Konzentration

Die Konzentration von DNS-Lösungen wurde mit einem UV-Photometer (Pharmacia LKB Ultrospec III) durch Absorptionsmessung der 1:200 verdünnten Lösung bei 260 nm Wellenlänge ermittelt.

2.2 Klonieren und Sequenzieren

2.2.1 Klonierungsvektoren

Tab. 2 - 1 Ausgangsplasmide für Klonierungsvektoren

Plasmid Nr.

Vektor

Insert

Wirtsstamm

(E. coli)

laborinterne

Stammnummer

P1

pUC19

EcoRI – vsv – KpnI – rhoAPstI

TG1

S 117

P2

pKC3

EcoRI – Sendai – KpnI – rhoAPstI

DH5 α

S 134

P3

pUC19

(leer)

TG1

S 49

P4

pKC3

EcoRI – Sendai – KpnI – rhoBXbaI

TG1

S 83

Konstrukte wurden in pUC19 kloniert und sequenziert. Um die Konstrukt-DNS in HeLa-Zellen zu exprimieren, wurde sie in den eukaryotischen Expressionsvektor pKC3 (Cold Spring Harbor Laboratory), der einen SV40 Promotor enthält, umkloniert. Auf beiden Plasmiden ist Ampicillinresistenz kodiert, was eine einfache Selektion von transformierten Wirtsbakte­rien ermöglicht. Klonierungsvektoren wurden ausgehend von den Plasmiden in Tab. 2-1 konstruiert.


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2.2.2  Schneiden von DNS mit Restriktionsenyzmen

DNS wurde mit Restriktionsenzymen von MBI Fermentas geschnitten. Benutzt wurden EcoRI, KpnI, PstI und XbaI (Konzentration jeweils 10 U/µl) in den vom Hersteller empfohlenen Puffern inklusive BSA und bei einer Inkubationstemperatur von 37°C. Das in den Vorratslösun­gen der Enzyme enthaltene Glyzerin kann in hoher Konzentration die Reaktion stören. Daher betrug das Ansatzvolumen immer mindestens das 20‑fache des Volumens der eingesetzten Vorratslösung. Die Enzymmenge wurde mit 1‑2 U/µg DNS berechnet. Nach mindestens vierfachem Überverdau (üblicherweise doppelte Enzymmenge und mindestens 2 h Reaktions­zeit) wurde die Reaktion durch 20‑minütiges Erhitzen auf 65°C beendet; die Restrikti­onsenzyme wurden dabei inaktiviert.

2.2.3 Dephosphorylierung

Um eine Religation geschnittener Plasmide zu verhindern, wurden DNS-Enden durch Inku­bation mit 0,05 U/pmol Alkalischer Phosphatase (CIAP, MBI Fermentas) dephosphoryliert. Dieser Schritt erfolgte im vom Hersteller mitgelieferten Puffer (0,1 M Tris-HCl, 0,1 M MgCl2, pH 8,0) oder direkt nach dem Schneiden mit Restriktionsenzymen im entsprechenden Restrik­tionspuffer. 3'‑überlappende Enden wurden 15 min bei 37°C und 15 min bei 56°C inkubiert, 5'‑überlappende Enden 30 min bei 37°C. In beiden Fällen wurde(n) der (die) Inkubations­schritt(e) nach erneuter Enzymzugabe einmal wiederholt.

2.2.4 Agarose-Gelelektrophorese

Benutzt wurde der Elektrophoreseapparat Mupid‑2 von Eurogentec mit 1,5%‑igen Gelen in 0,5x TAE Laufpuffer (20 mM Trisacetat; 0,5 mM EDTA). Agarosepulver wurde abgewogen und in 0,5x TAE durch Erhitzen im Mikrowellen­herd gelöst, die Lösung auf 55°C abgekühlt und in Förmchen mit den Maßen 107 x 60 x 8 mm3 bzw. 52 x 60 x 8 mm3 gegossen (Gel Maker Set EM‑2). Ein Kamm wurde eingesetzt, um Taschen zu bilden, in welche später die zu untersu­chende DNS-Lösung pipettiert werden konnte. Die Volumina der Taschen wurden nach Bedarf zwischen etwa 18 µl und 160 µl variiert. Die einzusetzende DNS-Lösung wurde wie in Tab. 2-2 angegeben eingestellt:

Tab. 2 - 2 DNS-Lösung für Agarosegelelektrophorese

DNS

max. 25 ng/µl

TAE (Endkonzentration)

0,5x

6x loading buffer (MBI Fermentas; 0,25% Bromphenolblau; 0,25% Xylenzyanol; 30% Glyzerin; 50 mM EDTA)

1/6 des Endvolumens


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Für präparative Gele wurde grundsätzlich gereinigte und in deionisiertem Wasser gelöste DNS benutzt. Plasmide wurden in der Regel einmal mit einem Restriktionsenzym geschnitten (linearisiert), um eine größenabhängige Wanderungsgeschwindigkeit der DNS zu erreichen. Als Vergleichsmaß­stab für die DNS-Fragmentlänge dienten eine 100 bp- und eine 1 kb-DNS-Leiter (MBI Fermen­tas).

Das polymerisierte Gel wurde in den Elektrophoreseapparat in 0,5x TAE gelegt. Anschlie­ßend wurden die DNS-Lösungen aufgetragen. Nach Anlegen einer Gleichspannung von 100 V wanderten die DNS-Moleküle und die Farbstoffe des loading buffer zur Anode. Anhand der Lage der Bromphenol-Farbstoffbande, die im 1,5%‑igen Gel mit der gleichen Geschwindigkeit wanderte wie ein DNS-Fragment von etwa 400 bp Länge, konnte die geeignete Laufzeit der Elek­trophorese bestimmt werden. Nachdem das Gel 10‑20 min in Ethidiumbromidlösung (1 µg/ml, Merck) gefärbt worden war, ließen sich die DNS-Banden im UV-Licht betrachten. Die Doku­mentation des Ergebnisses erfolgte durch Fotografie mit einer CCD-Kamera.

2.2.5 Isolierung von DNS-Fragmenten durch Gelelektrophorese

Ein Agarosegel mit zwei kleinen und einer fünf- bis zehnmal so großen Tasche wurde vorbe­reitet. Die zu trennende DNS-Lösung wurde auf eine kleine und die große Tasche aufgeteilt; die zweite kleine Tasche war für die 1 kb-DNS-Leiter bestimmt. Nach der elektrophoretischen Trennung der DNS-Fragmente wurde das Gel längs zur Wanderungsrichtung in zwei Teile geschnitten. Nur das Gelfragment mit den kleinen Taschen wurde in Ethidiumbromid gefärbt. Unter UV-Beleuchtung konnte die Position der interessieren­den Bande auf dem gefärbten Gel erkannt und markiert werden. Nachdem die beiden Gelfragmente wieder zusammengesetzt worden waren, konnte auf die Lage der entsprechenden Bande im ungefärbten Gel geschlossen werden. Das korrespondierende Gelareal wurde ausgeschnitten. Der verbleibende Gelrahmen wurde in Ethidiumbromid gefärbt und die Präzision des Ausschnitts im UV-Licht kontrolliert.

2.2.6 DNS-Extraktion aus Agarosegelen

Einzelne DNS-Banden aus Agarosegelen wurden mit dem QIAquick-Kit von QIAGEN extra­hiert: Das ausgeschnittene Gelstück mit der zu extrahierenden DNS-Bande wurde in dem mitgelieferten, auf einen pH <7,5 eingestellten Puffer mit chaotropen Salzen bei 50°C aufgelöst. Die DNS wurde an eine Silikagelmatrix gebunden (vgl. 2.1.2 Miniprep), mit einem ethanolhalti­gen Puffer gewaschen und mit deionisiertem Wasser oder dem mitgelieferten Elutionspuffer eluiert.


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2.2.7  PCR

Die PCR diente als Werkzeug, um gezielt Mutationen in DNS-Sequenzen einzuführen. Es fanden abhängig von der Anforderung an die Güte des PCR-Produkts zwei verschiedene Enzyme Verwendung. Taq-DNS-Polymerase (MBI Fermentas) wird aus Thermus aquaticus gewonnen und besitzt keine 3'‑Exonukleaseaktivität zur Korrektur von Replikations­fehlern. Pwo-DNS-Polymerase (SAWADY) ist die rekombinant hergestellte Form einer Polymerase aus Pyrococcus woesei. Sie erreicht durch ihre 3'‑Exonukleaseaktivität (proofreading) eine nach Herstelleranga­ben zehnmal höhere Replikationstreue als Taq-Polyme­rase. Folgende Bedingun­gen wurden für die PCRs eingestellt (Tab. 2-3 und 2-4):

Tab. 2 - 3 PCR-Ansatz mit Taq-Polymerase

Taq - Polymerase

Reaktionsvolumen

100 µl

PCR-Puffer

(MBI Fermentas)

Tris-HCl

10 mM (pH 8,8)

KCl

50 mM

Nonidet P40

0,08%

MgCl2

1,5 mM

dNTP-Mix (MBI Fermentas) (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

50 µM (jeweils)

Rinderserumalbumin (BSA) (MBI Fermentas)

100 µg/ml

Taq -DNS-Polymerase (MBI Fermentas)

1 U

5'-Primer

200 nM

3'-Primer

200 nM

DNS-Matrize

variabel

Mineralöl als Verdunstungsschutz (ICN Biomedicals, Inc.)

70 µl

 

Anzahl der Replikationszyklen

13-30

Inkubationstemperaturen und -zeiten je Zyklus

Denaturierung der DNS-Doppelstränge

Anlagerung der DNS-Einzelstränge (Primer/Matrize)

Extensionsreaktion

94°C / 1 min (1. Zyklus: 3 min)

50°C (wenn nicht anders angegeben) / 1 min

72°C / 1 min (letzter Zyklus: 10 min)


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Tab. 2 - 4 PCR-Ansatz mit Pwo-Polymerase

Pwo -Polymerase

Reaktionsvolumen

100 µl

PCR-Puffer (peqlab)

Tris-HCl

10 mM (pH 8,8)

(NH4)2SO4

5 mM

KCl

25 mM

MgSO4

1,5 mM

dNTP-Mix (MBI Fermentas) (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

50 µM (jeweils)

Pwo -DNS-Polymerase (peqlab)

1,5 U (entspricht 1,5 µl )

5'-Primer

200 nM

3'-Primer

200 nM

DNS-Matrize

variabel

Mineralöl (Verdunstungsschutz)

70 µl

 

Anzahl der Replikationszyklen

13-30

Inkubationstemperaturen und -zeiten je Zyklus

Denaturierung der DNS-Doppelstränge

Anlagerung der DNS-Einzelstränge (Primer/Matrize)

Extensionsreaktion

94°C / 1 min (1. Zyklus: 3 min)

50°C (wenn nicht anders angegeben) / 1 min

72°C / 1 min (letzter Zyklus: 10 min)

Die Reaktionen wurden auf einer PCR-Maschine von Perkin Elmer Cetus durchgeführt (DNA Thermal Cycler 480).

2.2.8 Oligonukleotide (Oligos)

Oligonukleotide wurden auf Bestellung von den Firmen EUROGENTEC oder MWG (nur
Nr. 25 und Nr. 79) synthetisiert (Tab. 2-5). Oligo-Paare wurden als PCR-Primer benötigt. Eine Ausnahme bildeten lediglich die Oligos Nr. 68/69, die direkt nach Hybridisierung in einen geeigneten Vektor kloniert werden konnten. Die PCR-Primer wurden alle nach dem gleichen Muster aufgebaut: Am 3'‑Ende befindet sich eine Sequenz von Nukleotiden, die zum 3'‑Ende eines Strangs der PCR-Matrize vollständig oder größtenteils komplementär ist. Durch einzelne „unpassende“, mutierte Basen konnten in das PCR-Produkt gezielt Mutationen eingeführt werden. Richtung 5'‑Ende wurde die palindromische Erkennungssequenz für ein Restriktionsen­zym vorangestellt (relevante Erkennungssequenzen sind in Tab. 2-5 fett gedruckt). Damit sich das Restriktionsenzym an die DNS anlagern konnte, wurden vor der Restriktionssequenz nochmals einige Nukleotide angefügt.


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Tab. 2 - 5 Verwendete Oligonukleotide.

Nr.

Name

Nukleotidsequenz

Tm/°C

5

RhoB1

5'-CA-GGTACC-ATG-GCG-GCC-ATC-CGC-AAG-A-3'

60,7

6

RhoA5

5'-GC-CTGCAG-TCA-CAA-GAC-AAG-GCA-ACC-AGA-3'

59,0

7

RhoA4

5'-CAT-GGTACC-ATG-GCT-GCC-ATC-CGG-AAG-AAA-CTG-GTG-ATT-G-3'

62,9

25

vsvRhoC

5'-TAC-GAATTC-ATG-TAC-ACC-GAC-ATC-GAG-ATG-AAC-CGG-CTG-GGC-AAG-GGTACC-CAT-ATG-GCT-GCA-3'

68,1 (Temp3)

66,0 (Temp4)

60

RhoAgly14val

5'-GCAAG-GGTACC-ATG-GCT-GCC-ATC-CGG-AAG-AAA-CTG-GTG-ATT-GTT-GGT-GAT-GTA-GCC-TGT-GGA-3'

68,5

61

RhoAthr19asn

5'-GCAAG-GGTACC-ATG-GCT-GCC-ATC-CGG-AAG-AAA-CTG-GTG-ATT-GTT-GGT-GAT-GGA-GCC-TGT-GGA-AAG-AAT-TGC-TT-3'

68,6

62

RhoBBA3

5'-TGC-CTGCAG-TCA-TAG-CAC-CAG-GCA-GCA-GTT-GA-3'

59,4

63

RhoCCA3

5'-TGC-CTGCAG-TCA-GAG-AAC-GAG-ACA-GCC-CCT-CCG-A-3'

63,0

64

RhoAAB3

5'-TGC-CTGCAG-TCA-CAA-GAC-CTT-GCA-ACC-AGA-3'

55,9

65

RhoD5

5'-ACG-GAATTC-GAT-ATC-ATG-AAC-GCG-TCC-CAG-GTT-GCG-GGA-3'

56,2

66

RhoD3

5'-TAT-CCC-GGG-TCTAGA-TCA-GGT-GGC-CAA-GCA-3'

44,8

67

RhoDDA3

5'-TAT-CCC-GGG-TCTAGA-TCA-GAG-GAC-CAA-GCA-ACA-A-3'

42,1

68

vsvRhoD.cs

5'-AATT-GTC-GAC-ATG-TAC-ACC-GAC-ATC-GAG-ATG-AAC-CGG-CTG-GGC-AAG-GAATTC-GGC-ACC-TCTAGA-CTGCA-3'

68,1

69

vsvRhoD.ncs

5'-G-TCTAGA-GGT-GCC-GAATTC-CTT-GCC-CAG-CCG-GTT-CAT-CTC-GAT-GTC-GGT-GTA-CAT-GTC-GAC-3'

69,6

70

RhoA188p

5'-TATA-CTGCAG-TCA-CAA-GAC-AAG-GCA-ACC-AGG-TTT-TTT-CTT-CCC-A-3'

59,8

79

RhoCAC.3

5'-TATA-CTGCAG-TCA-GAG-AAT-GGG-ACA-GCC-CGA-CTT-CTT-CTT-GCC-CCT-GCG-GGC-CTG-GAG-GCC-A-3'

68,7

Erkennungssequenzen der für diese Studie relevanten Restriktions­enzyme: CTGCAG- PstI, GAATTC- EcoRI, GGTACC- KpnI, TCTAGA- XbaI. Formel für die Berechnung von Tm: Tm = 81,5 + 0,41 (%G + C) + 16,6 log [K+] – 500/dmit (%G + C) – gemeinsamer Anteil von Guanosin und Cytosin am gesamten Oligonukleotid in %; [K+] – Molarität von K+ im Reaktionsan­satz (25 mM); d – Länge des hybridisierten DNS-Doppelstrangs Oligo/Matrize (nach [148]).

2.2.9 DNS-Matrizen (templates) für die PCR

Ausgangsbasis für die PCR-vermittelte Herstellung neuer DNS-Moleküle waren Konstrukte von RhoA, B, C und D, die im Labor bereits vorhanden waren (Tab. 2-6).


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Tab. 2 - 6 PCR-Matrizen.

Matrize

Isoform

Vektor

Insert (Zahlen beziehen sich auf Kodons)

Wirts­stamm

(E.coli)

laborin­terne Stamm­nummer

Temp1

RhoA

pUC19

EcoRI – vsv – KpnI – rhoA 1-193 – stop – PstI

TG1

S 117

Temp2

RhoB

pKC3

EcoRI – vsv – KpnI – rhoB 1-192 – stop – PstI
(interne PstI-Schnittstelle eliminiert: Kodon 180 „CAG“à „CAA“, beide Glu. CaaX-Gruppe fehlt.)

DH5 α

S 307

Temp3

RhoC

pUC19

EcoRI – vsv – KpnI – „CAT“ – rhoC 1-193 – stop – PstI

DH5 α

S 139

Temp4

RhoC

pKC3

SacI – vsv – EcoRI – rhoC 1-193 – stop – PstI

TG1

S 138

Temp5

RhoD

pGEM

NcoI – myc NdeI – rhoD 1-210 – stop – BamHI

DH5 α

S 314

In Temp3 ist aus technischen Gründen zwischen der KpnI-Schnittstelle und dem Beginn der rhoC-Sequenz das Triplett „CAT“ eingefügt.

2.2.10 DNS-Hybridisierung

Die komplementären Oligonukleotide Nr. 68 und 69 wurden zu Doppelsträngen hybridisiert (Tab. 2-7). Der Reaktionsansatz wurde mit 70 µl Mineralöl überschichtet, zur Denaturierung der DNS 10 min auf 98°C erhitzt, zur Ausbildung komplementärer Doppelstränge langsam auf 65°C gebracht und schließlich in Eiswasser forciert abgekühlt.

Tab. 2 - 7 Reaktionsansatz für DNS-Hybridisierung

Komponente

Konzentration

Oligo Nr. 68

20 µM

Oligo Nr. 69

20 µM

Tris-HCl pH 8,0

20 mM

NaCl

10 mM

H2O

(ad 100 µl )

2.2.11 Ligation

Linearisierte, an den Enden dephosphorylierte Vektoren und passende, nicht dephosphory­lierte Inserts wurden mit T4-DNS-Ligase (MBI Fermentas) im mitgelieferten Reaktionspuffer zu zirkulären Plasmiden verbunden (Tab. 2-8) und anschließend zur Transformation von kompe­tenten Wirtsbakterien eingesetzt.

Um das für die Ligation ideale Verhältnis von Vektor und Insert zu erhalten, wurde die Insertmenge in fünf separaten Ansätzen variiert. Drei Negativkontrollen wurden bei jedem Experiment mit angesetzt: (a) ohne DNS, (b) mit Insert aber ohne Vektor, (c) mit Vektor aber ohne Insert. Mit dem ersten Kontrollansatz konnte nach der Transformation verifiziert werden, daß nichttransformierte Wirtsbakterien durch das in den Kulturplatten enthaltene Ampicillin ausselektiert wurden. Mit dem zweiten konnte beurteilt werden, ob das Insert ausreichen gut isoliert war (Insertkontrolle). Im dritten Ansatz wurde kontrolliert, ob Religation des Vektors mit seinem ursprünglichen Insert stattfand, bzw. ob ungeschnittener Vektor in der Präparation enthalten war (Vektorkontrolle). Das ursprüngliche Insert war im Ansatz mit enthalten, wenn die Plasmidfragmente nach Restriktion lediglich durch Dephosphorylierung voneinander getrennt wurden. Die Ansätze wurden bei 17°C mindestens 1 h lang inkubiert.

Tab. 2 - 8 Reaktionsansatz für Ligation

Komponente

Konzentration / Menge

Vektor

0,5 · 10-16 mol

Insert

Größenordnung 10-14-10-16 mol

T4-DNS-Ligase

2 U/Ansatz

Tris-HCl (pH 7,8)

40 mM

MgCl2

10 mM

DTT

10 mM

ATP

0,5 mM

H2O ad 20 µl

2.2.12 Präparation von kompetenten E. coli (DH5 α, TG1, ZK501)

Kompetente Bakterien können zirkuläre DNS (Plasmide) aus der Umgebung aufnehmen.
E. coli (DH5 α, TG1 oder ZK501) wurden in 50 ml LB inokuliert und über Nacht bei 37°C unter Schütteln kultiviert. Von dieser Kultur wurden 4 ml in 400 ml LB verdünnt und weiter bebrütet. Nach Erreichen der frühen log-Phase (OD590 = 0,375; optische Dichte bei 590 nm Wellenlänge, gemessen mit SPECTRONIC 20+-Spectrophotometer) wurde die Bakteriensuspension auf 50‑ml-Röhrchen verteilt und 5-10 min auf Eis stehen gelassen. Die Bakterien wurden 7 min bei 1600 g und 4°C zentrifugiert und in je 10 ml eiskalter CaCl2-Lösung (60 mM CaCl2, 10 mM HEPES (pH 7,0), 15% v/v Glyzerin) resuspendiert. Nach fünfminütigem Zentrifugieren bei 1100 g wurden die Sedimente nochmals in je 10 ml eiskalter CaCl2-Lösung aufgenommen und 30 min auf Eis gestellt. Ein letztes Mal wurde fünf Minuten lang bei 1100 g zentrifugiert, die sedimen­tierten Bakterien in je 2 ml eiskalter CaCl2-Lösung resuspendiert, zu jeweils 1 ml aliquotiert und bei –70°C tiefgefroren (nach [15]).

2.2.13 Transformation von kompetenten E. coli

In 1,5 ml Eppendorf-Hütchen wurde zu je 100 µl Bakteriensuspension (kompetente E. coliDH5 α, TG1 oder ZK501) 1 µl gereinigte Plasmidlösung (entsprechend ca. 0,2 µg DNS) bzw. ein kompletter Ligationsansatz (20 µl ) gegeben. Nach zwanzigminütiger Lagerung auf Eis wurden die Bakterien einem Hitzeschock ausgesetzt, indem die Reaktionsgefäße 2 min in ein 42°C warmes Wasserbad gestellt wurden. Durch diese Behandlung wurden einige Bakterien mit dem jeweiligen Plasmid transformiert. Zu den Bakterien wurden rasch 900 µl LB dazupipettiert. Nach einstündiger Inkubation bei 37°C wurde die Bakteriensuspension 2 min bei 5000 g zentrifugiert, das Sediment in 70 µl LB resuspendiert und auf LB/Ampicillin-Agarplatten (1,5% Agar, 100 µg/ml Ampicillin) ausplattiert.

Ausgehend von den mit pUC19 und pKC3-Plasmiden transformierten und damit ampicillinre­sistenten Bakterien bildeten sich bei 37°C innerhalb von 20 h sichtbare Einzelkolonien. Negativ­kontrollen sind in 2.2.11 beschrieben. Auf allen drei Kontrollplatten sollten keine Kolonien erscheinen. Einzelne Kolonien auf der Insert- und Vektorkontrollplatte wurden toleriert, wenn die Anzahl relativ niedrig war (<1/100 der im jeweiligen Experiment maximalen Kolonienzahl). Erst durch Sequenzierung wurde sicher bestätigt, daß das richtige Insert-Vektor-Paar vorlag.

Sollte der transformierte Stamm asserviert werden, wurden einzelne Kolonien zur verlässli­chen Abtrennung von ampicillinsensiblen Bakterien erneut auf Ampicillinplatten ausgestrichen und bei 37°C inkubiert. Hierdurch gewonnene Einzelkolonien wurden in LB-Flüssigmedium mit 100 µg/ml Ampicillin kultiviert und nach Zugabe von 25% (v/v) Glyzerin bei –70°C eingefroren.

2.2.14 Sequenzieren

Die durch PCR gewonnenen und in pUC19 klonierten DNS-Konstrukte wurden nach der Sanger-Methode [149] sequenziert, um ihre Fehlerfreiheit zu kontrollieren (Überein­stimmung mit Matrize und Primern). Benutzt wurde das „Thermo Sequenase“ Sequenzierkit mit didesoxy-NTPs und 7-deaza-dGTP (Amersham Pharmacia Biotech). Am 5'‑Ende mit dem Fluoreszenz­farbstoff IRD 800 markierte Primer stammten von MWG (Tab. 2-9).

Tab. 2 - 9 Primer für die Sequenzierung der DNS-Konstrukte

Primer

Sequenz

M13universalCS(-43)

5'-AGG-GTT-TTC-CCA-GTC-ACG-ACG-TT-3'

M13reverseCS(-49)24

5'-GAG-CGG-ATA-ACA-ATT-TCA-CAC-AGG-3'

Reaktionsansätze wurden nach Herstellerangaben pipettiert. Um die Sequenz in einer Rich­tung zu lesen, waren vier Ansätze notwendig, die jeweils ein anderes ddNTP enthielten. Da Strang und Gegenstrang gelesen wurden, ergaben sich insgesamt acht Ansätze. Die in Tab. 2-10 angegebenen Reaktionsbedingungen wurden für jeden Ansatz hergestellt. Nach Ende der Reaktion wurden zu jeder Probe 6 µl loading buffer (98% deionisiertes Formamid; 10 mM EDTA pH 8,0; 0,025% Xylenzyanol FF; 0,025% Bromphenolblau [148]) pipettiert.

Tab. 2 - 10 Reaktionsbedingungen für Sequenzierung

zu sequenzierende DNS

0,05 pmol

Primer („vorwärts“ oder „rückwärts“)

0,5 pmol

A/C/G/T-Reagens

Tris-HCl (pH 9,5); MgCl2; Tween20; Nonidet P-40; 2-Mercaptoethanol

2 μl

dATP, dCTP, 7-deaza-dGTP, dTTP

ddATP oder ddCTP oder ddGTP oder ddTTP

thermostabile Pyrophosphatase

Thermo Sequenase DNS-Polymerase

H2O

ad 8 μl

 

Denaturierung

95°C, 5 min

30 Replikations­zyklen

Denaturierung

95°C, 30 sec

Anlagerung

55°C, 30 sec

Verlängerung

70°C, 1 min

Tab. 2 - 11 Zusammensetzung eines 5,5%-igen Sequenziergels

Harnstoff

12,6 g

Vor Zugabe der restlichen Kompo­nenten im Wasserbad bei 37°C auflösen.

TBE 10x (890 mM Tris Base, 890 mM Borsäure,
20 mM Na2EDTA⋅2 H2O)

3,6 ml

H2O

ad 26,7 ml

   

Long Ranger Gel Lösung (50%)

3,3 ml

 

TEMED

14,4 µl

 

10% APS

144 µl

(Zugabe direkt vor dem Gießen)

Sequenziert wurde mit einem halbautomatischen Sequenzierer von LICOR (DNA Sequencer model 4000) auf einem Long Ranger Gel (FMC) (Tab. 2-11). Das Gel wurde zwischen zwei LICOR Glasplatten (255 mm x 410 mm) mit einem Abstand von 0,25 mm gegossen, eine bis eineinhalb Stunden bei Raumtemperatur zum Polymerisieren stehen gelassen, in den Sequenzier­apparat eingebaut und vor Auftragen der Proben auf 50°C vorgewärmt. Die Parameter am Apparat wurden nach Herstellerangaben eingestellt. Nachdem der Gellauf beendet war, wurden die Sequenzen halbautomatisch gelesen. Jede Base wurde noch­mals manuell nachkontrolliert. Die vorwärts und rückwärts gelesenen Sequenzen überschnitten sich in einem großen Bereich (56% bei RhoA V14 bis 100% bei RhoD und RhoDDA), so daß hier eine Kontrolle möglich war.

2.2.15 Sequenzanalyse

Um DNS- und Aminosäuresequenzen untereinander zu vergleichen und zu analysieren, wurde das über Internet und Telnet zugängliche Computerprogramm HUSAR (http://genome.dkfz-heidelberg.de) benutzt.

2.2.16 Vorhandene, in Transfektionsexperimenten verwendete Rho-Konstrukte

Tab. 2 - 12 In der Studie verwendete Rho-Konstrukte, die zu Beginn der Arbeit bereits vorhanden waren.

Konstruktname

tag

Vektor

Insert

Wirts­stamm

(E.coli)

laborint. Stamm­nummer

RhoA

vsv

pKC3

EcoRI – vsv – KpnI – rhoAPstI

DH5 α

S 135

RhoA

Sendai

pKC3

EcoRI – Sendai – KpnI – rhoAPstI

TG1

S 59

RhoB

vsv

pKC3

Sma I – vsv – KpnI – rhoBBamHI

DH5 α

S 129

RhoC

vsv

pKC3

SacI – vsv – EcoRI – rhoCPstI

DH5 α

S 130

RhoACA

vsv

pKC3

EcoRI – vsv – KpnI – rhoA 1-180 – rhoC 181-188 – rhoA 189-193 – stop – PstI

DH5 α

S 148

RhoAR183K

vsv

pKC3

EcoRI – vsv – KpnI – rhoA mit Kodon 183 analog zu rhoCPstI

DH5 α

S 142

RhoAKK186-187RR

vsv

pKC3

EcoRI – vsv – KpnI – rhoA mit Kodons 186 und 187 analog zu rhoCPstI

DH5 α

S 143

2.3  Shigella flexneri SC301

2.3.1 Bakterienstamm

Verwendet wurde der Stamm SC301 [40] von S. flexneri Serotyp 5, der bei –70°C in 25% Glyzerin gelagert wurde. SC301 besitzt das 140 MDa-Virulenzplasmid pWR100 mit eingefüg­tem Kanamycinresistenz-Transposon Tn5 (=pWR110) [153] sowie das Plasmid pIL22, welches für das afimbrische Adhäsin AFA I von E. coli [179] und für Ampicillinresistenz kodiert. AFA I erhöht durch die verbesserte Adhärenz der Bakterien an die Zellen die Infektionseffizienz [40].

2.3.2 Bakterienkultur

SC 301 wurde aus dem Glyzerin-Vorrat in 20 ml TSB (Fluka) inokuliert und wuchs über Nacht bei 37°C, unter aeroben Bedingungen und ständigem Schütteln. Dem Medium wurden 50 µg/ml Kanamycin (SIGMA) und 100 µg/ml Ampicillin (Fluka) zugesetzt. Um Bakterien in der logarithmischen Wachstumsphase zu erhalten, wurden die Kulturen 1‑3 h vor dem Experiment 1:20 bis 1:50 mit TSB verdünnt, nochmals bei 37°C inkubiert und nach Erreichen einer OD600 zwischen 0,3 und 0,5 geerntet (optische Dichte bei 600 nm Wellenlänge, gemessen mit SPECTRONIC 20+-Spectrophotometer; OD600 1,0 entspricht ca. 4 · 108 Bakterien ml-1). Ein der benötig­ten Bakterien­menge entsprechendes Volumen der Flüssigkultur wurde zentrifugiert (5000 g, 5 min) und der Überstand verworfen.

2.4 HeLa-Zellen

2.4.1 Zellkultur

HeLa-Zellen wurden in 600 ml Kunststoff-Zellkulturflaschen (Nunclon) unter sterilen Bedin­gungen angezüchtet. Alle Arbeitsschritte fanden in einer Sterilbox (antair BSK, Steril) statt. Als Kulturmedium diente MEM (Gibco) mit einem Zusatz von 10% FCS (Gibco; Komplement inaktiviert durch Erhitzen auf 56°C während 20 min). Die Flaschen wurden mit 30 ml Zell­suspension befüllt; die Zellen sedimentierten auf den Boden der Flaschen.

In einer mit 10% CO2 angereicherten Atmosphäre vermehrten sich die Zellen bei 37°C und bildeten auf dem Flaschenboden innerhalb weniger Tage einen konfluenten Zellrasen. Bei der Ernte wurde das Medium abgesaugt, die Zellen mit Trypsin-EDTA-Lösung (0,25% Trypsin (Gibco), 0,5 mM EDTA, 140 mM NaCl, 3 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,5 KH2PO4) vom Flaschenboden abgelöst, in MEM suspendiert und 4 min lang bei 125 g abzentrifugiert. Nach vollständiger Suspension des Zellsediments in 2‑4 ml MEM konnte mit Hilfe einer Zählkammer (Neubauer) die Zellkonzentration bestimmt werden. Davon ausgehend konnten mit MEM (+10% FCS) Suspensionen mit einer definierten Zelldichte hergestellt werden. Die Zellinie wurde fortgeführt, indem ein Teil der Zellen in frische Kulturflaschen eingesät wurde.

Für die Durchführung der Experimente erfolgte die Aussaat in Kunststoffkulturplatten (Cell­star, Greiner Labortechnik) mit sechs zylindrischen Vertiefungen von 35 mm Durchmesser. Jede Vertiefung („Loch“) wurde mit 2 ml Medium bzw. Zellsuspension beschickt (nach [95]).

2.5 Vorübergehende Expression von Rho-Konstrukten in HeLa-Zellen

2.5.1 Transiente Transfektion von HeLa-Zellen

Nach (2.4.1) kultivierte HeLa-Zellen wurden in einer Dichte von etwa 200/mm2 (1 · 105 ml-1, 2 ml/Loch) in Zellkulturplatten auf sterilen, entfetteten Deckgläschen (22 mm x 22 mm) ausgesät und 24 h unter den oben beschriebenen Bedingungen inkubiert. Zwei bis vier Stunden vor Zugabe der zu exprimierenden DNS wurde das Medium erneuert.


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Um die Aufnahme von DNS durch die Zellen zu ermöglichen, wurden Kalziumphosphat-DNS-Kopräzipitate hergestellt: 4-20 µg DNS wurden in 130 µl 0,25 M CaCl2 gelöst. Unter ständigem Vortexen wurden 130 µl 2x BBS (50 mM BES; 280 mM NaCl; 1,5 mM Na2HPO4; pH 6,95) langsam dazugetropft (um möglichst kleine Präzipitate zu erhalten) und der Ansatz 15‑20 min bei Raumtemperatur stehengelassen. Je Loch wurden 250 µl der Suspension zu den mit Medium bedeckten Zellen gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 16-24 h wurden die Zellen dreimal mit je 2 ml MEM gewaschen, um die nicht aufgenommenen Präzipitate zu entfernen, und mit neuem Komplettmedium versetzt. Nach weiteren 16-24 h war das Maximum der DNS-Expression erreicht und die Zellen konnten für Infektionsexperimente benutzt werden (nach [148]).

2.6 Infektionsexperimente mit Shigella flexneri SC301

2.6.1 Infektion von HeLa-Zellen

Für die Infektion von HeLa-Zellen wurden die Shigellen in MEM resuspendiert, wobei eine Bakteriendichte von 6 · 107 ml-1 eingestellt wurde. Das Medium der HeLa-Zellen wurde gegen die Bakteriensuspension ausgetauscht. Die AFA I exprimierenden Bakterien sedimentierten innerhalb von 45 min und hefteten sich an die Zellen. Weitere Interaktionen zwischen Zellen und Shigellen während dieses Schritts wurden durch Kühlung der Kulturplatten auf Eiswasser verhindert. Die Multiplizität der Infektion betrug etwa 50 Bakterien pro Zelle. Zur Infektion flottierten die Zellkulturplatten auf 39,6°C warmem Wasser. Um eine Momentaufnahme des Invasionsprozesses zu erhalten, wurde dieser nach 20 min durch Zellfixation mit Paraformalde­hyd unterbrochen (2.7.1).

2.7 Immunfluoreszenzmikroskopie

2.7.1 Behandlung der infizierten HeLa-Zellen

Nach (2.6.1) infizierte HeLa-Zellen wurden viermal mit 1x PBS gewaschen um nicht adhä­rente Bakterien zu entfernen. Während 20 min wurde mit 3,7 % Paraformaldehyd in PBS (w/v) fixiert. Nach erneutem Waschen wurden die Zellen mindestens 5 min lang mit 0,1 M Glyzin in PBS inkubiert um freie Aldehydgruppen abzusättigen und damit unspezifische Bindung der Antikörper zu verringern. Die Permeabilisierung der Zellen erfolgte durch Einwir­kung von 0,2% Triton X‑100 (Sigma) in PBS während 5 min. Abschließend wurde erneut mit PBS gewaschen.


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2.7.2  Antikörper und Farbstoffe

40 µl der in PBS verdünnten Antikörper- bzw. Farbstofflösung (Tab. 2-13) wurden auf ein Stück Parafilm getropft, und das Deckgläschen mit den HeLa-Zellen wurde mit der bewachsenen Seite nach unten auf den Tropfen gelegt. Die Präparate wurden mindestens 20 min in der Primärantikörperlösung inkubiert und vor­sichtig gewaschen. Daran schloß sich die Färbung mit einem fluoreszenzmarkierten Sekun­därantikörper und weiteren Farbstoffen an (standardmäßig: Alexa-Phalloidin zur spezifi­schen Färbung von F‑Aktin, in einzelnen Experi­menten auch DAPI zur Markierung von bakteri­eller und zellulärer DNS). Phalloidin (Tab. 2-13), als methanolische Lösung gelagert, wurde getrock­net, bevor es in PBS aufgenommen wurde. Nach einem weiteren Waschschritt wurden die Präparate in Mowiol [69] eingedeckt, 10 min bei 37°C inkubiert und dann bei Dunkelheit und 4°C gelagert.

Tab. 2 - 13 Antikörper und Farbstoffe

Substanz

Farbstoff

Hersteller / Referenz

Verdünnung in 1x PBS

Absorptions­max. (nm)

Emissions­max. (nm)

P5D4 anti-vsv (monoklonal, Maus-Hybridom)

-

[93]

1:200

-

-

Ziegenantikörper anti-Maus IgG

Alexa 594

Molecular Probes

1:300

580

609

Ziegenantikörper anti-Maus IgG

Texas Red

Jackson Immuno

Research Labs

1:100

589, 594

623

Phalloidin

Alexa 488

Molecular Probes

1:30

495

519

DAPI

DAPI

Molecular Probes

1:100

359

461

2.7.3 Mikroskopie

Benutzt wurde ein konventionelles inverses Fluoreszenzmikroskop (Axiovert 135, ZEISS) mit einer 50W Quecksilberdampf-Kurzbogenlampe (HBO 50) und einem 10x Binokular. Objektive und Filtersätze sind in Tab. 2-14 und 2-15 angegeben.

Tab. 2 - 14 Mikroskopobjektive

Objektiv

Vergrößerung

num. Apertur

Weitere Angaben

Plan-NEOFLUAR

100x

1,30

Ölimmersion

LD (Long Distance) – ACHROPLAN

40x

0,60

Korr Ph2


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Tab. 2 - 15 Filtersätze für Immunfluoreszenzmikroskopie

Filtersatz

Anregungsfilter: Durchlässigkeit

Dichroischer Spiegel: Durchlässig oberhalb von

Sperrfilter: Durchlässigkeit

Wellenlänge, nm

I

530-585

600

615- ∞

II

450-490

510

515-565

III

365±12

395

450-490

Das Mikroskop war auf einem Erschütterungen dämpfenden Tisch (Technical Manufacturing Corporation, Micro‑g Modell 63-530), der mit einem Kompressor (JUN-AIR, Modell Troll) betrieben wurde, montiert.

2.7.4 Mikrofotografie

Experimentelle Ergebnisse wurden mit Hilfe einer Peltier-gekühlten CCD-Kamera mit on-chip-Integration sowie einer Mutech frame-grabber-Karte dokumentiert (Photonic Science CoolView). Die Kamera war mit einem 1,0 C‑mount Adapter (ZEISS) an das Mikroskop angeschlossen. Es wurden 8‑bit-Schwarzweißbilder (256 mögliche Helligkeitsstufen) mit einer Auflösung von 768 x 568 Pixel erhalten.

Das 100er Objektiv war auf einen Piezomotor (Physik Instrumente, Typ P-721.10) montiert, der über einen Servo positionsgesteuert wurde (E‑662.LR LVPZT Position Servo Control­ler, Physik Instrumente). Damit konnte das Objektiv auf der vertikalen Achse in defi­nierte Positio­nen gebracht werden, was die Aufnahme einer Serie von Objektebenen mit bestimmten Abstän­den ermöglichte („stack“, „Z‑Serie“). Standardmäßig wurden Stapel von 20 Ebenen mit je 0,4 µm Abstand aufgenommen. Um deckungsgleiche Fotografien mit verschiedenen Wellen­längen zu machen, wurde die gleiche Serie von optischen Schnitten am selben Bildausschnitt mit unterschiedlichen Filtersätzen wiederholt.

Mit dem 40er Objektiv wurden lediglich Aufnahmen in einer Ebene gemacht, ebenfalls mit verschiedenen Filtersätzen für denselben Ausschnitt.

2.7.5 Digitale Bildbearbeitung: MetaMorph, epr-Algorithmus

Die CCD-Kamera war an einen Rechner angeschlossen, der mit der Bildbearbeitungssoftware MetaMorph Imaging System 3.0 (Universal Imaging Corporation) ausgestattet war. Die Bilder­stapel wurden auf quadratische Ausschnitte im Format 360 x 360 Pixel reduziert, von den mit dem 40er Objektiv fotografierten Einzelebenen wurden Ausschnitte von 342 x 342 Pixel ausgewählt. Der Helligkeitsumfang von Bildern, die die 256 Helligkeitsstufen nicht ganz ausfüllten, wurde auf die volle Breite gespreizt. Durch diesen Schritt wurde zwar die Helligkeits­abstufung vergröbert, der Kontrast aber verstärkt. Die Schwarzweißbilder wurden entspre­chend den Fluoreszenzfarbstoffen mit Falschfarben digital eingefärbt.

Die ausgewählten Ausschnitte der Serien von Bildebenen wurden mit dem von Fay et al.entwickelten (US Patent #5047968) Dekonvolutionsalgorithmus (epr, Scanaly­tics) bearbeitet, der auf folgendem Prinzip basiert [48]: Photonen aus einer idealisiert punktför­migen Lichtquelle werden in einem optischen System (hier: Mikroskop) nicht nur in der optimalen Brennebene sichtbar, sondern auch – unscharf – darüber und darunter. Dieses Streulicht reduziert Kontrast und Bildschärfe und kann Strukturen sogar verdecken. Für das benutzte optische System kann eine sogenannte Point-spread-Funktion bestimmt werden, die beschreibt, wie das von einem Punkt ausgehende Licht im benutzten optischen System außerhalb der optimalen Brennebene gestreut wird. Die Funktion wurde charakterisiert, indem von fluoreszierenden Kügelchen (entsprechend den benutzten Farbstoffen) mit einem Durchmesser von 0,1 µm (Molecular Probes) Z‑Serien von Aufnahmen angefertigt wurden. Hierbei wurden die gleichen Parameter (Anzahl und Abstand der Ebenen) eingestellt wie bei den zu bearbeitenden Bilderstapeln. Auf einem handelsüblichen Rechner konnten dann mit der epr-Software für eine Z‑Serie von Aufnahmen eines Objekts gestreute Photonen wieder ihrem Ursprungspunkt zugeordnet werden. Dabei liegt die Annahme zugrunde, daß sich alles Licht im Präparat so ausbreitet wie von der empirischen Point-spread-Funktion beschrieben. Das nach Korrektur der durch das optische System einge­führten Un­schärfe resultierende Bild ist den „wahren“ Struktur­verhältnissen näher. Es ist kontrastreicher und zeigt Strukturen, die vorher nicht sichtbar waren. Folgende Parameter wurden bei der Bearbeitung mit epr eingestellt: Konvergenz: 2,5 · 10-5; maximale Anzahl der Iterationen: 50; smoothing: 13; Skalierungsfaktor: 1,0.

Von den bearbeiteten Bildstapeln wurden einzelne Ebenen ausgewählt. Mit verschiedenen Filtersätzen aufgenommene Bilder von identischen Ebenen wurden übereinander gelegt, um die Lagebeziehung der einzelnen Bildkomponenten zu prüfen. Schließlich wurden diese Einzelebe­nen auf die willkürlich gewählte Standardgröße von 342 x 342 Pixel gebracht.


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31.08.2004