[Seite 72↓]

4  Diskussion

4.1 Diskussion der Methoden

4.1.1 System zur fluoreszenzoptischen Darstellung dreidimensionaler Strukturen

Um das Rekrutierungsmuster der Rho-Mutanten innerhalb der Zellen beurteilen zu können, mußte ein plastischer, dreidimensionaler Eindruck der Präparate gewonnen werden. Dieser kann dadurch erreicht werden, daß eine Serie von horizontalen „optischen Schnitten“ durch die betreffenden Zellen angefertigt wird. Eines der üblichen Verfahren hierzu ist die Konfokale Laserscanning-Mikroskopie [135]. Da die an der Charité vorhandenen Konfokalmikroskope aus organisatorischen oder technischen Gründen für die gegebene Fragestellung nicht genutzt werden konnten und eine Neuanschaffung eines solchen Instruments aus Kostengründen nicht möglich war, wurde auf eine andere, preisgünstigere Technik ausgewichen: Benutzt wurde ein herkömmliches, speziell aufgerüstetes Fluoreszenzmikroskop, und die gewonnenen digitalen Bilddaten wurden mit dem von Fay et al. entwickelten Dekonvolutionsalgorithmus bearbeitet (US Patent # 5047968).

Der Ansatz des empirischen Dekonvolutionsalgorithmus ist wie folgt: In der Fokusebene eines optischen Systems ist immer auch Streulicht aus benachbarten Ebenen sichtbar, das die Bildqualität vermindert. Die Ausbreitung dieses Streulichts kann mit einer für das verwendete optische System spezifischen Funktion beschrieben werden. Diese sogenannte point-spread-Funktion wird empirisch ermittelt, indem von einer „punkt“-förmigen Lichtquelle, deren Durchmesser (0,1 µm) kleiner als das maximale Auflösungsvermögen des Mikroskops ist, eine Z‑Serie von Mikrofotografien aufgenommen wird, d.h. eine Serie von Aufnahmen mit definier­tem Abstand der Fokussierungsebenen. Die mittlere Ebene entspricht dabei der Lage der Licht­quelle (Fokusebene); in den Ebenen darüber und darunter ist nur das Streulicht sichtbar. Nach Bestimmung der Funktion, die durch das benutzte Mikroskop, das Untersuchungsobjekt sowie sämtliche brechenden Medien charakterisiert wird, kann Streulicht gezielt wieder seinen Ursprungspunkten zugeordnet werden. Verschwommenheit der Bilder, die durch das optische System verursacht ist, wird gezielt korrigiert, die Abbildung kommt dadurch den „wahren“ Strukturverhältnissen näher [48]. Das bearbeitete Bild verfügt auch über mehr Helligkeitsstufen als das Original. Strukturen, die vorher durch Streulicht verdeckt waren, können durch die Dekonvolution freigelegt werden [31].

Die Qualität der optischen Schnitte, die durch Anwendung des Dekonvolutionsalgorithmus erhalten werden, ist der von Konfokalbildern vergleichbar. Ein Vorteil gegenüber der Konfo­kalen Laserscanning-Mikroskopie besteht darin, daß das volle Spektrum einer Halogen­lampe genutzt werden kann. Während mit einem Laser nur Farbstoffe mit einer eng definierten Wellenlänge angeregt werden können, steht bei der hier verwendeten Methode eine größere Auswahl von Farbstoffen zur Verfügung.

4.1.2 Protein-tagging

Um eine einfache Markierung zu ermöglichen, wurden alle Konstrukte mit einem vsv-Peptid-tag versehen. Der vsv-tag wurde deshalb gewählt, weil im Labor bereits monoklonale Antikör­per gegen dieses Epitop vorhanden waren (P5D4 [93]; Geschenk von T. Kreis). Der tag mußte am N‑Terminus von Rho angebracht werden, da eine Markierung am C‑Terminus aufgrund der dort stattfindenden posttranslationalen Modifikation [4] unmöglich war: Mit Abspaltung der drei C‑terminalen Aminosäuren wäre auch der tag vom zu markierenden Protein abgetrennt worden.

Das Anfügen eines Epitop-tag war eine Grundvoraussetzung für die vorliegende Arbeit: Isoform­spezifische Antikörper für Rho waren nicht verfügbar und wären überdies schwie­rig einsetzbar gewesen. Für jedes der Konstrukte – die sich oft nur in wenigen Aminosäuren unterschieden – hätte ein besonderer Antikörper hergestellt werden müssen, was wiederum methodische Fragen aufgeworfen hätte: Unterschiede im Verteilungsmuster hätten dann auch auf Unterschiede der Antikörperspezifitäten zurückgeführt werden können. Durch das Anfügen des vsv-tag konnte für alle Konstrukte derselbe Primärantikörper eingesetzt werden.

Andererseits mußte in Kauf genommen werden, daß mit dem tag in die zu untersuchenden Proteine selbst eine Veränderung eingeführt wurde, welche einen Einfluß auf Eigenschaften der Moleküle haben könnte. Dieser Einwand läßt sich aber weitgehend entkräften. Der angefügte tag ist relativ kurz; zusammen mit der zwischen tag und Rho-Sequenz eingefügten Restriktions­schnittstelle beträgt die Länge des angehängten Peptids 14 Aminosäuren oder ungefähr 7% der Länge der Aminosäuresequenz. Da das Peptid am N‑Terminus der Rho-Mutanten angebracht werden konnte, ist es – zumindest auf der Ebene der Primärstruktur – weit entfernt von dem im Zusam­menhang mit der Rekrutierung funktionell interessanten C‑Terminus. In welchem Bereich der dreidimensionalen Struktur sich der tag einfügt, ist hingegen nicht genau bekannt. Alle Kon­strukte verursachten bei Expression in HeLa-Zellen die erwarteten morphologischen Verände­rungen (vgl. Abb. 3-11), allen voran die Ausbildung von Streßfilamenten [143]. Auch mit tag blieben die exprimierten Konstrukte also funktionell. Adamson et al. berichteten, daß das Anfügen eines zehn Aminosäuren langen myc-tag an RhoA, B und C weder Funktion noch Lokalisation der Proteine beeinflußt [5].

Mit hoher Sicherheit kann ausgeschlossen werden, daß das Rekrutierungsphänomen ein auf den tag zurückzuführendes Artefakt ist: Mit demselben tag wurden unterschiedliche differen­tielle Rekrutierungsmuster dargestellt, und andererseits wurden die verschiedenen Rekrutie­rungsmuster (RhoA bzw. RhoB) mit unterschiedlichen tags (vsv, Sendai) in gleicher Weise reproduziert. ([3], T. Adam, unveröffentliche Ergebnisse). Entsprechend wurde in Rekrutie­rungsexperimenten mit Wachstumsfaktoren als Auslösern gezeigt, daß das Verhalten von myc-markiertem und endogenem RhoA übereinstimmen [169].

4.1.3 Replikationstreue der PCR

Die mit Hilfe der PCR hergestellten vsv-rho-Konstrukte mußten dem Anspruch auf voll­kommene Fehlerfreiheit der Basensequenz genügen. Die PCR unter In-vitro-Bedingungen ist jedoch fehlerträchtig, und es können „falsche“ Basen in den Tochterstrang eingebaut werden, die nicht zur Matrize komplementär sind. Für die Taq-Polymerase, die keine 3'Õ5' Korrekturakti­vität besitzt, wurde für eine 30 Zyklen umfassende PCR eine Fehlerfrequenz von 0,25% berichtet [147]. Im Falle der hier beschriebenen PCR-Produkte, die je etwa 600 bp lang sind, ist dieser Fehler erheblich. Für die korrekte Herstellung der Konstrukte war es daher essentiell, die Replikations­treue der PCR zu optimieren. Dies wurde auf zwei Wegen erreicht: Erstens wurde die Zahl der PCR-Zyklen auf 10‑16 limitiert, was durch Einsetzen einer großen Matrizenmenge (90‑180 fmol) kompensiert wurde, und zweitens wurde die thermostabile Pwo-DNS-Polymerase verwendet, die eine 3'‑Exonukleaseaktivität (Fehlerkorrekturaktivität) besitzt [72]. Da dieses Enzym erheblich teurer als Taq-Polymerase ist, wurden die Reaktionsbedingungen vor der Synthese der jeweiligen Konstrukte unter Verwendung der Taq-Polymerase optimiert.

Die neuen Konstrukte wurden durch Sequenzierung kontrolliert. Bei der hier verwendeten Sequenzierungsmethode nach Sanger [149] waren die Primer mit dem Fluoreszenzfarbstoff IRD 800 (MWG) markiert. Aufgrund der Verwendung von pUC19 als Sequenziervektor und der relativ geringen Länge der Sequenzen konnte für alle Konstrukte mit demselben Primer-Paar gearbeitet werden. Die ebenfalls mögliche Markierung der Nukleotide wäre in diesem Fall weniger kostengünstig gewesen. Die Ergebnisse der Sequenzierungen bestätigten die hohe Replikationstreue der PCR unter den hier eingestellten Bedingungen: Im Rahmen dieser Arbeit wurden Konstrukte mit einer Gesamtlänge von über 5000 Basen hergestellt, ohne daß bei der Sequenzierung ein Replikations­fehler entdeckt werden konnte.


[Seite 75↓]

4.1.4  Eigenschaften des Expressionsvektors

Für die Expression der Konstrukte in HeLa-Zellen wurde der Vektor pKC3 benutzt, der vom Plasmid pko-neo [176] abgeleitet ist. pKC3 war für die hier beschriebenen Experimente optimal, da er einen SV40-Promotor enthält. Dieser Promotor ist schwächer als der CMV-Promotor [44, 98] und ermöglichte die gewünschte mäßige Expression der Rho-Konstrukte. Ein Nachteil des Vektors pKC3 ist, daß seine Nukleinsäurensequenz nicht vollständig vorliegt. Zum Klonieren wurden hier nur beschriebene Schnittstellen benutzt. Da diese Situation nicht völlig befriedigend war, soll im Labor nachfolgend ein neuer Expressionsvektor konstruiert werden.

4.1.5 Plasmidpräparation

Für die Präparation von Plasmid-DNS wurden kommerzielle Kits von QIAgen verwendet. Grundsätzlich kann Plasmid-DNS auch mit im Labor verfügbaren Reagenzien nach Standard­methoden (z. B. [148]) gewonnen werden. Es hatte sich allerdings bereits im Vorfeld herausge­stellt, daß die Transfektionseffizienz bei Verwendung der mit den kommerziellen Kits gewonne­nen DNS deutlich höher ist (B. Bohm und T. Adam, unveröffentlichte Ergebnisse). Aufgrund dieses qualitativen Unterschieds war die Investition in die Kits gerechtfertigt.

4.1.6 Transfektion und Infektion

Die für diese Arbeit gewählte Transfektionsmethode sollte einerseits effizient sein und ande­rerseits nicht mit der anschließenden Infektion der transfizierten Zellen interferieren. Unter diesem Apekt wurden die verschiedenen zur Verfügung stehenden Methoden beurteilt:

Bei der Transfektion durch Elektroporation müssen die Zellen im Medium supendiert sein [14]. Durch die dazu erforderliche Trypsinbehandlung büßen die Zellen Oberflächenproteine ein und sind zunächst refraktär gegen die Shigelleninvasion (T. Adam, unveröffentlichte Ergeb­nisse). Erst nach 18‑24 h sind die Zellen sedimentiert und die Oberflächenproteine wieder ausreichend exprimiert. Als das Transfektions-Infektions-Modell etabliert wurde, sollten auch kurze Expressionszeiten der Konstrukte nach Transfektion getestet werden. Deshalb schied die Elektroporation als Transfektionsmethode aus. Bei der Transfektion mit Hilfe von Lipid-Mikrosphären (Liposomen) wäre mit dem Einbau von fremden Lipiden in das Membrankompar­timent der zu transfizierenden Zelle zu rechnen gewesen [132]. Da die Signaltransduktion an der Plasmamembran für die Shigelleninvasion eine zentrale Rolle spielt, sollte eine Veränderung der Membrankomposition vermieden werden. Aus diesem Grund wurde auch auf die Liposomen-Transfektionsmethode nicht zurückgegriffen.


[Seite 76↓]

Die Transfektion mit Kalziumphosphat-DNS-Kopräzipitaten [64], die wahrscheinlich durch Endozytose aufgenommen werden [6], erwies sich als effizient für die hergestellten Rho-Konstrukte und als kompatibel mit der nachfolgenden Infektion mit Shigella. Alle Konstrukte konnten in HeLa-Zellen exprimiert werden. Bei der Auswertung der Präparate fiel allerdings auf, daß die auf RhoD basierenden Konstrukte regelmäßiger und stärker exprimiert wurden als DNS, die auf den anderen Rho-Isoformen basierte. Dieser Unterschied spiegelt sich auf der molekula­ren Ebene wider: Dem ähnlichen Expressionsverhalten der RhoA-, B- und C-Konstrukte entspricht eine DNS-Sequenzhomologie zwischen den Konstrukten von nahezu 80%. Die Übereinstimmung der DNS-Sequenz von rhoD mit den Sequenzen von rhoA, B oder C beträgt dagegen jeweils weniger als 60%. Es ist bekannt, daß die Transfektionsef­fizienz von der eingesetzten DNS abhängt [64]. Ein gemeinsames Sequenzmerkmal von rhoA, B oder C könnte somit die im Vergleich zu rhoD geringere Expression bedingen.

Nach Abschluß der DNS-Aufnahme und vor Durchführung der Infektionsexperimente wur­den die Zellen mehrfach mit Medium gewaschen. Dadurch wurden auf der Oberfläche liegende Ca3(PO4)2-Präzipitate, die den Zustand der Zellen beeinträchtigen und den Infektions­prozeß behindern können, weggespült. Daß der Transfektionsvorgang selbst ohne Effekt auf das Aktinzytoskelett der nichtinfizierten Zelle ist, zeigen die Experimente (ohne Infektion) mit RhoAT19N: Mit diesem konstitutiv inaktiven Konstrukt transfizierte HeLa-Zellen ließen sich am Lichtmikroskop morphologisch nicht von nichttransfizierten Zellen unterscheiden (Abb.3-11 c,d). Nach Transfektion mit sämtlichen Konstrukten ließen sich HeLa-Zellen problemlos infizieren. Da die pathogeninduzierte Internalisierung der Bakterien eine aktive Leistung der Zelle darstellt [2, 3, 40], kann auf einen guten funktionellen Status der schwach transfizierten HeLa-Zellen rückgeschlossen werden.

Nur die sehr stark transfizierten Zellen erschienen abgerundet und waren z.T. vom Boden der Kulturplatten abgelöst. Hier konnten auch nur selten intrazelluläre Shigellen beobachtet werden. Diese Zellen wurden bei der Dokumentation und Auswertung der Experimente daher nicht berücksichtigt.

Für die Infektion verwendete Shigellen wurden in der frühen exponentiellen Wachstumsphase geerntet. In diesem Stadium ist das Invasionsvermögen der Bakterien am ausgeprägtesten [121]. Nach Zugabe der Bakteriensuspension wurden die Zellkulturplatten auf Eis gelagert. Bei einer Temperatur von ca. 4°C können die Shigellen zwar auf die Zellen sedimentieren, es findet aber keine Invasion statt [40]. Der verwendete Stamm SC301 besitzt das afimbrische Adhäsin AFA I von E. coli und kann sich damit an die HeLa-Zellen anheften [179]. Daher konnte die bei Wildtypstämmen notwendige Zentrifugation der Bakterien auf die Zellen entfallen [40]. Durch die anschließende rasche Temperaturerhöhung auf etwas über 37°C wurden die Bedingungen für eine mögliche Invasion geschaffen. Der Invasionsprozess läuft an den einzelnen Zellen jedoch nicht völlig synchron ab, so daß verschiedene Stadien beobachtet werden können. Nach weniger als 20 min ist ein großer Teil der Bakterien in die Zellen aufge­nommen [40] und der optimale Zeitpunkt für die Beobachtung der Rho-Rekrutierung ist erreicht.

4.2 Diskussion der Ergebnisse

4.2.1 Funktionalität der mutierten Proteine in der transfizierten Zelle

Um eine orientierende Aussage über die Funktionsfähigkeit der hergestellten Konstrukte treffen zu können, wurde deren Wirkung auf das Aktinzytoskelett transfizierter Zellen (ohne nachfolgende Infektion mit Shigella) untersucht und dokumentiert (Abb. 3-11/12). Alle auf der Basis von RhoA, B und C (Sequenzen vgl. Abb. 1-3) hergestellten Konstrukte wiesen die bekannte Fähigkeit, in Epithelzellen ein dichtes Netz von Streßfilamenten zu induzieren ([130] und eigene Beobachtun­gen), auf. Die einzige – erwartete – Ausnahme bildete das konstitutiv-inaktive Konstrukt RhoAT19N.

Die beiden auf rhoD (vgl. Abb. 1-4) basierenden Konstrukte RhoD und RhoDDA unterschie­den sich in ihrer Wirkung auf das Aktinzytoskelett ebenfalls erwartungsgemäß von RhoA, B und C. In [126] war die Wirkung von RhoD auf BHK-Zellen bereits beschrieben worden, wobei die Induktion von 20‑30 µm langen, aktinreichen Zellfortsätzen und das Verschwinden von Streßfi­lamenten in transfizierten Zellen als charakteristische Merkmale genannt wurden. In dem in der vorliegenden Arbeit verwendeten Expressionssystem mit HeLa-Zellen konnte der beschriebene RhoD-Phänotyp in ähnlicher Weise, aber mit Abweichungen reproduziert werden. Da hier mit HeLa-Zellen gearbeitet wurde, die zum Zeitpunkt der Transfektion keine oder kaum Streßfila­mente ausbildeten, konnte über die Wirkung von RhoD auf bestehende Filamente keine Aussage getroffen werden. Allerdings wurden durch die RhoD-Konstrukte auch keine neuen Streßfila­mente induziert: Es konnte höchstens eine leichte, diffuse Vermehrung von F‑Aktin in transfi­zierten Zellen beobachtet werden. Somit stimmt zumindest der beobachtete Endzustand nach Transfektion mit dem in [126] beschriebenen Phänotyp überein. Nicht konstant beobachtet werden konnte im hier verwendeten System die Ausbildung von langen, dünnen, aktinreichen Zellpro­trusionen unter der Wirkung von RhoD. Lediglich in Abb. 3-12 c,d weist die sehr stark transfizierte Zelle einige filiforme Fortsätze auf. Die beobachteten Abweichungen im Vergleich zu [126] können auf eine Vielzahl von Faktoren zurückgeführt werden, darunter auf den verwendeten Zelltyp, die Transfektionsmethode und das erreichte Expressionsniveau. Die zentrale Aussage, daß der Phänotyp mit rhoD transfizierter Zellen deutlich vom Aspekt mit rhoA/B/C transfi­zierter Zellen abzugrenzen ist, konnte hier jedoch uneingeschränkt bestätigt werden.

4.2.2 Rekrutierungsverhalten von RhoAG14V und RhoAT19N

Sowohl das konstitutiv aktive RhoAG14V, dessen Fähigkeit zur Hydrolyse von GTP herabge­setzt ist [56], als auch das konstitutiv inaktive RhoAT19N [99], welches in GDP-gebundener Form vorliegt [96], werden bei der Zellinvasion durch Shigella wie RhoA rekrutiert (Abb. 3-16 a-f). Das Translokationsphänomen erwies sich somit überraschenderweise als vom „Schaltzu­stand“ der GTPase unabhängig: Ausgehend von der bekannten Aktivität von RhoGDI, mit GDP-gebunde­nem Rho einen zytosolischen Komplex zu bilden, hätte man RhoAT19N eher diffus im Zytoplasma verteilt als an der Membran konzentriert erwartet [80, 155]. Für die Rekrutierung während der bakteriellen Invasion scheint es jedoch ohne Bedeutung zu sein, ob RhoA mit GTP oder mit GDP komplexiert vorliegt. Hieraus läßt sich folgern, daß die Konforma­tionsänderun­gen, die beim Übergang zwischen GDP- und GTP-gebundenem Zustand auftreten [79], nicht mit den Mechanismen interferieren, die die Rekrutierung von RhoA vermitteln.

Es mag zunächst überraschen, daß bei Überexpression einer konstitutiv inaktiven Mutante die Ausbildung der typischen Shigella-Eintrittsstellen nicht unterbunden wird (Abb. 3-16 a-c), wie dies bei Inhibition von Rho durch C3-vermittelte ADP-Ribosylierung der Fall ist [3]. Der fluores­zen­zoptische Aspekt der Aktin-„Blüte“ ist bei transfizierten und nichttransfizierten Zellen nicht unterscheidbar. Übereinstimmend damit unterscheiden sich auch Zellen, die nicht mit Shigella infiziert, jedoch mit RhoAT19N-DNS transfiziert wurden, nicht von nichttransfi­zierten Kontroll­zellen, die nur über endogenes Rho verfügen (Abb. 3-11 c-d). Der Grund dafür liegt wahrscheinlich in der Einstellung experimenteller Parameter: Da in erster Linie die Rekrutierung beurteilt werden sollte, wurde das Expressionsniveau aller Konstrukte bewußt niedrig gehalten. Somit stand intrazellulär möglicherweise zu wenig RhoAT19N zur Verfügung, als daß die Mutante eine dominant negative Wirkung hätte entfalten können. Der Bestand an endogenem Rho würde nach dieser Vorstellung immer noch ausreichen, um die typischen Aktinrearrangements induzieren zu können.

4.2.3 Die Rolle der CaaX-Gruppe

Die CaaX-Gruppe der Isoformen RhoA, B und C ist für die Rekrutierung an sich zwar essen­tiell (B. Bohm und T. Adam, unveröffentlichte Ergebnisse), determiniert aber nicht das differen­tielle Rekrutierungsmuster (Abb. 3-18a-i).

Die verschiedenen Isoformen weisen Unterschiede in der posttranslationalen Isoprenylierung bzw. Palmitoylierung auf. Während RhoB an Cys189 und Cys192 palmitoyliert und an Cys192 und Cys193 geranylgeranyliert bzw. farnesyliert werden kann [4], werden RhoA und RhoC weder farnesyliert noch palmitoyliert, sondern lediglich an Cys190 geranylgeranyliert [83]. Die Sequenz der CaaX-Gruppe scheint das Modifikationsmuster nur eingeschränkt zu beeinflussen. Während bei Ha‑Ras die Mutation des C‑terminalen Ser189 zu Leu (CaaS zu CaaL) zur Folge hat, daß das Protein in vivo und in vitro geranylgeranyliert statt farnesyliert wird [90], kann RhoB trotz des termina­len Leuzins auch farnesyliert werden. Auch die beiden „aliphatischen“ („aa“) Aminosäu­ren spielen hier offenbar keine bestimmende Rolle. Selbst wenn RhoB durch Mutation von Lys194 zu Leu eine RhoA-CaaX-Gruppe erhält, ändert sich sein Prenylierungs­muster nicht [4].

Während das (primäre) Vorhandensein der vier Aminosäuren der CaaX-Gruppe also eine Grundvoraussetzung sowohl für die posttranslationale Modifikation [67, 83] als auch für die Rekrutierung der Proteine während der Shigelleninvasion darzustellen scheint, enthält dieser Sequenzabschnitt für keinen der beiden Vorgänge die vollständige Information. Besondere Beachtung verdient, daß das RhoB/C-Rekrutierungsmuster von der Art der posttranslational angefügten Lipide unabhängig zu sein scheint. RhoB zeigt trotz unterschiedlicher Modifikation das gleiche Verteilungsmuster wie RhoC, während RhoC und RhoA trotz offenbar identischer Isoprenylierung mit Geranylgeranyl verschieden rekrutiert werden. Die Abhängigkeit des Rekrutierungsphänomens vom Vorhandensein der CaaX-Gruppe ist, mit den morphologischen Daten zusammengenommen, ein Indiz dafür, daß der Zielort der Translokation der Rho-Isofor­men nicht nur der membrannahe Bereich, sondern die Zytoplasmamembran selbst ist.

4.2.4 Rekrutierungsverhalten von RhoD

Erstmals wurde hier das Translokationsverhalten von RhoD während der Epithelzellinvasion durch Shigella untersucht (Abb. 3-14 a-c). Es konnte gezeigt werden, daß auch RhoD rekrutiert wird und dabei ein Verteilungsmuster aufweist, das – nach lichtmikroskopischer Beurteilung – dem von RhoB und RhoC gleicht.

RhoD läßt sich anhand der Primärstruktur innerhalb der Rho-Familie deutlich von den drei „Geschwistern“ RhoA, B und C abgrenzen. Dennoch teilen RhoD und RhoB Eigenschaften, in denen sich diese zwei Moleküle gemeinsam von RhoA und RhoC unterscheiden. Es wurde gezeigt, daß sowohl RhoD als auch RhoB hauptsächlich an frühen Endosomen lokalisiert sind, während sich nur ein kleiner Anteil an der Plasmamembran findet [5, 126]. Entsprechend finden sich auch in der Zusammensetzung des C‑Terminus Parallelen. So liegt unmittelbar vor der CaaX-Box jeweils noch ein zweiter Zysteinrest (bei RhoB noch ein dritter), und der C‑terminale Bereich ist länger als bei RhoA und RhoC. Bei RhoB sind drei, bei RhoD fünf zusätzliche Aminosäuren eingefügt. Allerdings endet die Aminosäuresequenz von RhoD im Gegensatz zu RhoA, B und C mit Threonin statt mit Leuzin. Über die Art der posttranslationalen Modifikation von RhoD liegen keine Angaben vor, es erscheint aber aufgrund der genannten Gemeinsamkei­ten nicht unwahrscheinlich, daß RhoD das gleiche Prenylierungsmuster aufweist wie RhoB. Der Austausch der CaaX-Gruppe von RhoD gegen die entsprechende Sequenz von RhoA läßt das Rekrutierungsverhalten unberührt (Abb. 3-18 k-m). Ausgehend von der Hypothese, daß RhoD wie RhoB modifi­ziert wird, kann überdies spekuliert werden, daß, ähnlich wie für RhoB gezeigt [4], der Austausch der CaaX-Gruppe auch das Prenylierungsmuster von RhoD unberührt läßt.

Aus dem Vergleich mit RhoC drängt sich jedoch die Hypothese auf, daß die beschriebenen Rekrutierungsmuster während der bakteriellen Invasion von anderen Merkmalen determiniert werden als die Lokalisation von RhoB und RhoD in der nichtinfizierten Zelle: RhoC wird, obgleich intrazellulär zunächst anders verteilt als RhoB und RhoD [5, 126], in gleicher Weise in die Membranprotrusionen rekrutiert. Immerhin ist denkbar, daß sich die Rekrutierungsmuster von RhoB, C und D in Feinheiten unterscheiden, die mit den benutzten Methoden nicht aufge­deckt werden konnten.

4.2.5 Prä- CaaX-Gruppe von RhoA und RhoC

Ser188 von RhoA, das von der cAMP-gesteuerten Proteinkinase A (PKA) phosphoryliert wird [97], ist für die Ausprägung des RhoA-typischen Rekrutierungsmusters nicht notwendig (Abb. 3-20 a-c). Somit spielt PKA in ihrer Funktion als Kinase keine Rolle für die Rekrutierung von RhoA an die Bakterieneintrittsstelle. Dem Ser188 scheint vielmehr die Rolle eines „Aus“-Schalters zuzukommen: GTP-RhoA wird durch die Phosphorylierung und durch das dann erleichterte Komplexieren mit Rho-GDI von der Zellmembran, einem wahrscheinlichen Aktions­ort, entfernt [97]. In menschlichen Neuroblastomzellinien konnte auch gezeigt werden, daß PKA durch die Phosphorylierung die biologische Aktivität von RhoA antagonisiert, möglicher­weise durch Verringerung der Affinität zur Rho-Kinase ROKα [45]. Nimmt man an, daß RhoA während der Shigelleninvasion zur Membran hin rekrutiert wird und dort im aktivier­ten Zustand vorliegen muß, könnte die PKA der Rekrutierung sogar entgegenwirken.


[Seite 81↓]

Als essentiell für die Bestimmung des Rekrutierungstyps konnte schließlich eine prä-C‑termi­nale Region ausgemacht werden. Veränderung der Aminosäuren 186‑187 von RhoA von „Lys-Lys“ zu „Arg-Arg“ bewirkte die Modifikation des RhoA-Rekrutierungsmusters zum RhoC-Muster (Abb. 3-26 a-c). Umgekehrt zeigte RhoC nach Angleichen von sechs prä-C‑terminalen Aminosäuren zwischen Position 181 und 188 an die RhoA-Sequenz einen RhoA-Rekrutierungs­phänotyp (Abb. 3-22 a-c). Möglicherweise gibt es also Sequenzmotive, welche die Ausprägung des jeweiligen Rekrutierungsmusters hinreichend bedingen. Bisher sind die jeweilige Rolle der einzelnen präterminalen Aminosäuren für die Rekrutierung sowie der Mechanismus der diffe­rentiellen Translokation ungeklärt. Der Vergleich mit publizierten Daten erlaubt jedoch eine Reihe von Rückschlüssen und Spekulationen hinsichtlich möglicher Mechanismen.

4.2.6 Mögliche Rollen für die Lysine 186-187 von RhoA

Es fällt auf, daß die zweifache Substitution von Lysin (RhoA) durch Arginin (RhoC) einen konservativen Austausch darstellt. Beide Aminosäuren tragen hydrophile, basische, unter physiologischen Bedingungen positiv geladene Reste, wobei der positive Ladungscharakter der Argininseitenkette etwas stärker augeprägt ist als der des Lysinrests. Es erscheint nicht sehr wahrscheinlich, daß es durch Austausch dieser beiden Aminosäuren zu einer wesentlichen Beeinflussung der Konformation des C‑Terminus von Rho kommen könnte. Interessanterweise ähnelt RhoC an dieser Stelle von der Ladungsverteilung her (polybasischer Abschnitt) viel mehr RhoA als dem „Rekrutierungszwilling“ RhoB, der zwischen Arg182 und dem C‑terminalen Zystein keine positiv geladenen Aminosäuren aufweist. Möglicherweise vermittelt also eine andere Eigenschaft von Lysin als die Ladung seiner Seitenkette den Einfluß auf das Rekrutie­rungsmuster.

Ein oder mehrere Lysinreste von RhoA könnten Ort einer noch zu definierenden post­transla­tionalen Modifikation sein, welche Konformation, Membranbindungseigenschaften oder Protein-Protein-Bindung beeinflußt. Der eukaryotische Initiationsfaktor 5A (eIF‑5A) enthält beispielsweise die Aminosäure Hypusin, die durch posttranslationale Modifikation eines Lysinrests entsteht. Allerdings ist der Initiationsfaktor das einzige bekannte Protein, das diese Modifikation enthält [87]. Lysinreste können auch acetyliert werden, wodurch gleichzeitig die positive Ladung neutralisiert wird [102]. Derartige Modifikationen sind für kleine GTPasen bisher jedoch nicht beschrieben worden.

Die Lysinreste 186 und/oder 187 könnten für das Zustandekommen einer spezifischen Bin­dung von RhoA an ein Regulator- oder Effektorprotein oder ein Membranphospholipid oder für die Aktivierung eines Interaktionspartners notwendig sein. Es sind eine Reihe von Fällen bekannt, in denen der Austausch von Lysin zu Arginin die spezifische Interaktion zwischen Proteinen behindert oder unmöglich macht. Für die Tyrosinkinase pp60v-src wurde gezeigt, daß der Austausch von drei nahe benachbarten N‑terminalen Lysinen gegen Arginin die Bindung an einen membrangebundenen Rezeptor verhindert [163]. Substitution eines einzelnen Lysins durch Arginin im Penizillinbindenden Protein 5 von E. coli beeinträchtigt dagegen zwar nicht die Komplexbildung mit Penizillin, wohl aber die Carboxypeptidaseaktivität des Proteins [107]. Ein entsprechendes Modell mit erhaltener Bindung bei Verlust der enzymatischen Interaktion ließe sich auch für die Wechselwirkung von RhoAS188P mit PKA konstruieren: Das Lysinpaar, das RhoA von den Isoformen B und C sowie von RhoD unterscheidet, ist Bestandteil einer poten­tiellen Konsensussequenz für die Interaktion mit PKA [97]. Auch wenn Phosphorylierung von Ser188 für die Rekrutierung keine Rolle spielt, wäre es vorstellbar, daß PKA allein durch eine (hypothetische) Bindung an RhoA das Rekrutierungsmuster beeinflußt. Auch die S188P-Mutante wäre in diesem Modell in der Lage, an PKA zu binden, obwohl die katalytische Aktivität der Kinase blockiert wäre. Der Phosphorylierung könnte schließlich auch im Rahmen der Shigel­leninvasion die Rolle eines Abschaltsignals zukommen. Allerdings kann dies anhand der vorliegenden Daten nicht beurteilt werden. Möglicherweise konnte dieser hypothetische Mechanismus in den hier durchgeführten Experimenten auch von vorn herein nicht zum Tragen kommen, da der Invasionsprozeß frühzeitig artifiziell unterbrochen wurde.

Wie aber ist zu erklären, daß die anderen drei untersuchten Proteine, RhoB, C und D, die zwar alle nicht über die Lysinreste von RhoA verfügen, deren Sequenzen sich aber untereinander deutlich unterscheiden, bei fluoreszenzoptischer Darstellung identischen Rekrutierungsmustern zu folgen scheinen? Man könnte sich eine Interaktion mit einem Partnermolekül vorstellen, das eine ausreichend große Toleranz besäße, um RhoB, C und D gleichermaßen, RhoA jedoch trotzdem nicht zu erkennen. Andererseits erscheinen die Sequenzunterschiede zwischen den C‑Termini von RhoD und RhoC mindestens so groß wie zwischen RhoA und RhoC. Möglicher­weise bilden RhoB, C und D am Carboxyende jedoch eine ähnliche Tertiärstruktur aus, die sie von RhoA unterscheidet und für eine spezifische Interaktion hinreichend ist. Denkbar ist ebenfalls, daß RhoA, B, C und D gleichermaßen zu der Interaktion fähig sind, die dem „RhoC“-Muster zugrundeliegt, und daß Rho an dieser Wechselwirkung mit einem Sequenzabschnitt teilnimmt, der allen drei Isoformen und RhoD gemeinsam ist. RhoA könnte nach dieser Vor­stellung, ähnlich wie im Zusammenhang mit PKA spekuliert wurde, in einer ausschließlich für diese Isoform spezifischen Interaktion gebunden werden, dadurch in der charakteristischen Art und Weise rekrutiert werden und so für die „gemeinsame“ Interaktion nicht mehr zur Verfügung stehen. Schließlich wurde bereits darauf hingewiesen, daß die Rekrutierungsmuster von RhoB, C und D in mit den hier verwendeten Methoden nicht erkennbaren Details differieren könnten und somit an eine Interaktion mit für jedes der drei Proteine jeweils spezifischen Bindungspartnern gedacht werden müßte.

4.2.7 Differentielle Rekrutierung und Strukturmodelle von RhoA

Nach den vorangegangenen Überlegungen zur Primärstruktur verspricht die Gegenüberstel­lung experimenteller Daten mit dreidimensionalen Strukturmodellen von Rho eine weitere Annäherung an ein Verständnis des Rekrutierungsphänomens. Erste Hinweise auf die funktio­nelle Architektur von Rho ergaben sich aus der Analyse der Wirkung von bakteriellen Toxinen. Gleich mehrere Toxine greifen Rho an und nehmen dadurch Einfluß auf die Funktion der GTPase. Clostridium botulinum C3-Transferase ADP-ribosyliert RhoA‑C an Asn41. ADP-ribosyliertes Rho ist konstitutiv inaktiv, wobei der Mechanismus der Inaktivie­rung des Moleküls noch nicht schlüssig geklärt ist [160]. Toxin B von Clostridium difficile glycosyliert RhoA an Thr37. RhoA (und andere GTPasen der Rho-Familie) werden dadurch konstitutiv inaktiv. Die funktionelle Inaktivierung resultiert wahrscheinlich aus einer Inhibition der Interak­tion mit Effektorproteinen [160]. Cytotoxic necrotizing factor 1 (CNF1) von uro­pathogenen E. coli [49, 158] und Dermonekrotisierendes Toxin von Bordetella bronchiseptica [76] deamidieren Gln63 von Rho zu Glutamat. Dadurch wird die GTP-Hydrolyse behindert, auch GAP wird wirkungslos: Rho wird konstitutiv aktiv.

Mit dem Yeast-Two-Hybrid-Verfahren konnten Regionen von Rho eingegrenzt werden, wel­che für die Interaktion mit Effektorproteinen wie Rho-Kinase und PKN wichtig sind [52]. Innerhalb von zwei Abschnitten, As 23‑40 und As 75‑92, liegen demnach Aminosäu­ren, die die spezifische Bindung mit Effektoren vermitteln. Die Primärstrukturen von RhoA und RhoC sind in den bezeichneten Abschnitten identisch; RhoB weicht in jedem der beiden Abschnitte an nur einer Position ab, wobei unbekannt ist, ob diese beiden Aminosäuren für die Protein-Protein-Interaktionen eine essentielle Rolle spielen.

Anhand von Kristallstrukturanalysen von RhoA war es möglich, die Konformationsänderun­gen während des GTPase-Zyklus zu beschreiben und die Aminosäurereste zu definieren, die für die GTPase-Funktion und die Interaktion mit GAP von Bedeutung sind [79, 145, 185]. Ab­schnitte, deren Position sich in Abhängigkeit vom „Schaltzustand“ am deutlichsten ändert, erstrecken sich demnach zwischen Asp28 und Pro36 im Bereich der „Schalter‑I-Region“ (As 28‑38) und zwischen Gly62 und Leu69 am Anfang der „Schalter‑II-Region“ (As 61‑78). Aminosäu­ren, die möglicherweise für Bindung und Hydrolyse von GTP notwendig sind, finden sich in der sogenannten phosphatbindenden Schleife (As 13‑20), im Bereich von Schalter I und unmittelbar vor Schalter II, sowie an den Positionen 116‑121 und 160‑162. Aminosäuren, die an der Interak­tion mit GEF teilnehmen, sind ebenfalls im Bereich der Schalter I und II lokalisiert. Alle genannten Sequenzabschnitte sind bei RhoA und RhoC identisch; RhoB weicht nur an einzelnen Positionen ab.

Keines der veröffentlichten dreidimensionalen Rho-Strukturmodelle enthält den bei dieser Arbeit im Mittelpunkt stehenden C‑Terminus nach As 181. Auch die verwandte GTPase Ras konnte nur ohne das Carboxyende kristallisiert werden [136]. Der Grund dafür liegt offenbar darin, daß der C‑Terminus stark beweglich ist und keine feste Konformation annimmt [29]. Über Zusammen­hänge zwischen Molekülstruktur und der Rolle des C‑Terminus bei der Be­stimmung des Rekrutierungsmusters kann somit wenig Konkretes gesagt werden. Die Kenntnis der Stelle, an der das bewegliche Carboxyende im Molekül „verankert“ ist (Ala181), kann jedoch als Grundlage für gezielte Spekulationen dienen.

Betrachtet man Rho-Strukturmodelle (http://molbio.info.nih.gov/cgi‑bin/pdb, Brookhaven-Codes 1a2b, 1ftn, 1tx4;) mit einer der im Internet verfügbaren Visualisierungsprogramme (z.B. RasMol, http://www.umass.edu/microbio/rasmol), fällt auf, daß die Guaninnukleotidbin­dungs­stelle und die Schleifen, die im Laufe des GTPase-Zyklus ihre Konformation ändern (Schalter I und II), der „Wurzel“ des C‑Terminus gegenüberliegen. GAP bindet ebenfalls an die dem Carboxyende abgewandte Seite von Rho (1tx4). Aufgrund dieser Strukturdaten könnten also Interaktionen, an denen der C‑Terminus beteiligt ist, vom „Schaltzustand“ der GTPase unabhän­gig sein. Dies stimmt mit der Beobachtung überein, daß sowohl GTP-gebundenes (RhoAG14V) als auch GDP-gebundenes (RhoAT19N) Rho zum Shigella-Invasionskomplex rekrutiert werden.

Die Oberflächensegmente von Rho, die für die Interaktion mit Effektorproteinen notwendig und hinreichend sind, sind weniger präzise definiert, und es ist hier nur eine grobe Orientierung möglich [52]. Der Abschnitt von As 23‑40 beinhaltet den Schalter I, und liegt somit dem C‑Terminus gegenüber. Die zweite Region, innerhalb derer für die Interaktion mit Downstream-Effektoren wichtige Reste vermutet werden, läßt sich in drei Bereiche unterteilen. As 79‑84 verlaufen als β‑Faltblatt verdeckt im Inneren des Proteins und sind somit für Protein-Protein-Interaktionen nicht von unmittelbarem Interesse. As 85‑92 liegen oberflächlich in einer Mulde, deren Rand unter anderem von Resten des Schalters I gebildet wird, dem Carboxyterminus vermutlich diametral entgegengesetzt. As 75‑78 sind dagegen auf der Seite lokalisiert, auf der auch der C‑Terminus aus dem Molekül herausragt. Ob sich daraus Interferenzen zwischen Protein-Protein-Interaktionen und Funktionen des C‑Terminus ergeben, hängt unter anderem davon ab, welches die möglichen Konformationen des C‑Terminus sind und ob die As 75‑78 überhaupt eine Rolle für die Vermittlung von Bindungen mit Effek­tormolekülen spielen.

4.2.8 Rekrutierung anderer Proteine während der Zellinvasion durch Shigella

Während diese Arbeit geschrieben wurde, wurde berichtet, daß das Shigella-Invasin IpaC die Aktivierung der kleinen GTPasen Cdc42 und (nachfolgend) Rac induziert [174]. Es wurde gezeigt, daß auch Cdc42 und Rac in einem Muster, das dem von RhoA ähnelt, an die Bakterien­eintrittsstelle rekrutiert werden [63] und für die Epithelzellinvasion durch Shigella ebenfalls essentiell zu sein scheinen [122]. Das Klasse‑IX-Myosin und GAP myr5 weist dagegen ein Rekrutierungsmuster auf, das sich lichtmikroskopisch mit demjenigen von RhoC deckt [63].

Ob Rekrutierungsmuster und -mechanismus von RhoA/Cdc42/Rac einerseits und RhoB/C/D/myr5 andererseits identisch oder lediglich sehr ähnlich sind, ist unklar. Die Vorstel­lung einer Aktivierungskaskade von Cdc42 über Rac zu RhoA [130] läßt an ein identisches Verteilungsmuster dieser drei GTPasen denken. Während für jedes dieser Proteine spezifische Rekrutierungsmechanismen nicht ausgeschlossen werden können, erscheint es möglich, daß die in dieser Arbeit untersuchten prä-C‑terminalen Sequenzabschnitte von RhoA und RhoC Aa 181 bis 188 Prototypen zweier das jeweilige Rekrutierungsmuster bestimmender Peptidmotive darstellen, die sich auch in den anderen entsprechend rekrutierten Proteinen wiederfinden. Nachdem gezeigt werden konnte, daß auch Cdc42 und Rac im wesentlichen dem Rekrutie­rungsmuster von RhoA folgen [63], wird es interessant sein zu untersuchen, ob für das RhoA-Rekrutierungsmuster eine Konsensussequenz bei kleinen GTPasen der Rho-Familie definiert werden kann und ob eine solche Konsensussequenz gegebenenfalls auch bei Nicht-Rho-Protei­nen mit ähnlichem Rekrutierungsmuster zu finden ist. Schließlich ist von Interesse, ob die Proteinfaltung und damit mögliche intramolekulare Interaktionen der C‑terminalen Region eine Rolle spielen für die Determinierung des Rekrutierungsmusters. Dazu wird das C‑terminale Motiv derzeit im Labor Adam mit Nicht-Rho-Proteinen fusioniert. Damit soll geklärt werden, ob das hier beschriebene C‑terminale Rekrutierungsmotiv allein ausreicht, um ein beliebiges Protein nach Induktion durch invasive Shigellen in spezifischer Weise in den bakteriellen Invasions­komplex zu rekrutieren. Weitere offene Fragen sind, ob auch der Austausch nur eines der beiden Lysine 186/187 von RhoA gegen Arginin ausreichend ist, um ein Rekrutierungsmuster des RhoC-Typs zu erhalten, ob umgekehrt die Substitution der beiden Arginine 186/187 von RhoC durch Lysin hinreichend ist, um das Rekrutierungsverhalten zu ändern, oder ob weitere Positio­nen im Bereich der As 181‑188 essentiell sind für die Bestimmung des Rekrutierungsmusters von RhoA.

4.2.9 Überlegungen zum Rekrutierungsmechanismus

Durch den bakteriellen Invasionsreiz müssen an der Invasionsstelle in oder an der Plasma­membran „Verankerungspunkte“, also integrale Membranpro­teine, Lipide oder andere Mole­küle, mit denen die rekrutierten Proteine direkt oder indirekt über weitere Mittlermoleküle interagieren können, in einem Muster angeordnet und/oder zugänglich gemacht werden, das dem beobachte­ten Rekrutierungsmuster entspricht. Mindestens zwei Typen von „Verankerungs­punkten“ scheinen für die beiden bekannten Muster erforderlich zu sein. Ob Rho und die anderen rekru­tierten Proteine am „Zielort“ mit weiteren Proteinen, oder – vermittelt durch den lipophilen C‑Terminus – mit Membranlipiden, oder mit beiden interagieren, ist nicht geklärt.

In der Plasmamembran enthaltene Phosphoinositide können an zwei Stellen spezifisch mit Rho-GTPasen interagieren: an der Insertionsregion (As 124‑136 von RhoA [185]) und dem C‑Terminus [118] und sind somit mögliche Determinanten der differentiellen Rekrutierung. 3,4,5‑PIP3 und 3,4‑PIP2 binden an Rac1 und RhoA, nicht aber an Cdc42, während 4,5‑PIP2 mit Cdc42 stärker interagiert als mit den anderen beiden GTPasen. Es läßt sich spekulieren, daß auch zwischen RhoA einerseits und RhoB, C und D andererseits Unterschiede hinsichtlich der Interaktion mit verschiedenen Phosphoinositiden bestehen, welche das Phänomen der differen­tiellen Rekrutierung erklären könnten.

Wie gelangen die rekrutierten Moleküle an die Bakterieneintrittsstelle? Prinzipiell denkbar scheint, daß sie durch ungerichtete Brown’sche Molekülbewegung unter anderem an die Invasionsstelle diffundieren und dort spezifisch konzentriert werden, indem sie an „ihre“ lokalen „Verankerungspunkte“ binden. Ebenso könnten sie spezifisch mit Komponenten an der Oberflä­che von verschiedenen Vesikeln interagieren, deren differentielle Rekrutierung zur Invasions­stelle durch Shigella ausgelöst wird. Theoretisch denkbar wäre in diesem Zusammen­hang auch, daß das Pathogen die Expression von Membranproteinen induziert, die rekrutierten Moleküle bereits am endoplasmatischen Retikulum an diese Proteine binden und dann gemeinsam mit ihnen an die vom Bakterium definierte Region der Plasmamembran transportiert werden. Allerdings ist die Zeit von wenigen Minuten, innerhalb derer die Invasion abläuft, für einen derartigen Prozeß wahrscheinlich nicht ausreichend.

Fraglich ist ebenfalls, ob Rho-GTPasen allein rekrutiert werden oder im Komplex mit einem oder mehreren weiteren Proteinen. Es ist bekannt, daß Rho im Zytoplasma mit RhoGDI komple­xiert vorliegt [80, 94]. Der Rho/RhoGDI-Komplex könnte von einem oder mehreren hypotheti­schen „Rekrutie­rungsfaktoren“ spezifisch erkannt, daraufhin gespalten werden, und Rho würde allein an die Membran rekrutiert. Für die kleine GTPase Rab und RabGDI wurde ein solcher Rekrutierungs­mechanismus nachgewiesen [133]; allerdings unterscheiden sich RhoGDI und RabGDI hinsichtlich Größe und Aminosäuresequenz beträchtlich [84]. Man könnte andererseits spekulieren, daß Rho-GTPasen und RhoGDI gemeinsam bis an die Membran rekrutiert werden und der Komplex erst unmittelbar am Zielort gespalten wird. Das ähnliche Rekrutierungsmuster von RhoA, Rac und Cdc42 könnte mit diesem Modell erklärt werden. RhoGDI bindet Rho-GTPasen über eine hydrophobe Tasche, welche die C‑terminal angefügte Prenylgruppe von posttranslational modifiziertem Rho aufnimmt, sowie über eine Protein-Protein-Interaktion, die wahrscheinlich C‑terminale Aminosäuren von Rho involviert. Die Protein-Protein-Interaktion ist alleine für die Komplexbildung nicht ausreichend, könnte der Bindung aber Spezifität verleihen [62, 75, 84]. Die Bindungsenergie von RhoGDI für Cdc42 beträgt etwa 12kcal/mol und liegt damit im selben Bereich wie die Bindungsenergie für geranylgeranyliertes und carboxymethy­liertes Zystein an Lipidmembra­nen [62, 164]. Dies deutet darauf hin, daß sehr feine regulatori­sche Impulse genügen, um das Verhältnis von membrangebundenen zu zytosolischen RhoGTPasen substantiell zu verändern. Mögliche Regulatoren der Rho/RhoGDI-Bindung sind Membranphospholipide wie Phosphatidat und Phosphoinositide, für die gezeigt werden konnte, daß sie einen Komplex aus RhoGDI und Rac spalten [37]. Verschiedene Phosphoinositide könnten somit gleichzeitig sowohl das Überspringen von Rho-GTPasen an die Membran steuern als auch die Spezifität der Rekrutierung bestimmen, ohne daß dafür unterschiedliche GDIs notwendig wären. Nach Trennung von Rho und RhoGDI könnte der – GEF-gesteuerte – Austausch von GDP zu GTP erfolgen, und das Protein befände sich schließlich am richtigen Ort im erforderlichen Aktivitäts­zustand.

4.2.10  Shigella als zellbiologisches Werkzeug

Eine Fülle von Proteinen, die mit RhoA in vitro und in vivo interagieren können, sind be­schrieben worden. Oft wurde in diesen Studien nur RhoA untersucht, oder es konnten zwischen den Isoformen RhoA, B und C keine Unterschiede gefunden werden. Aufgrund der fast vollstän­digen Übereinstimmung in den relevanten Molekülregionen kann man davon ausgehen, daß viele Rho-Effektorproteine von allen drei Isoformen aktiviert werden können. Ob eine Interaktion wirklich stattfindet und welche Folgen sie hat, hängt aber letztendlich von der gleichzeitigen Präsenz der beiden Partner an einem genau bestimmten Ort innerhalb der Zelle ab. Durch das Shigella-Invasionsmodell ergibt sich eine Möglichkeit, die Rolle des Ortsaspekts für die Wirkung von Proteinen innerhalb von Zellen näher zu untersuchen. Kürzlich konnte so die Relevanz des Rekrutierungsphänomens für die Selektion eines aus mehreren biochemisch möglichen Interaktionspartnern in vivo am Beispiel von myr5 gezeigt werden: Myr5 reagiert in vitro in ähnlicher Weise mit RhoA‑C, kolokalisiert während der Shigelleninvasion aber nur mit RhoC und nicht mit RhoA [63]. So scheint der tatsächliche Reaktionspartner von myr5 in der Zelle durch die spezifische Rekrutierung bestimmt zu werden. Auch anhand von metastasieren­den Tumorzellen wurde unlängst ein Unterschied der Funktionen von RhoA und RhoC in vivo aufgezeigt [39]. Ob dieser Unterschied durch Interaktion mit verschiedenen Effektoren oder ebenfalls durch ein Rekrutierungsphänomen (oder durch beide Mechanismen) erklärt werden kann, ist jedoch noch unklar.

4.2.11 Modell und natürliche Verhältnisse

Alle Ergebnisse wurden an einem Zellkulturmodell mit HeLa-Zellen gewonnen, in welche die genetische Information für die untersuchten Proteine künstlich eingeführt wurde. Was die Invasion von Shigella unter natürlichen Verhältnisse betrifft, entsteht eine Reihe von neuen Fragen, die mit dem hier benutzten experimentellen System nicht ohne weiteres beantwortet werden können. RhoA und RhoC sind in Säugetiergeweben weit verbreitet, das Expres­sionsni­veau variiert allerdings in Abhängigkeit vom Gewebetyp. Während RhoA in allen untersuchten Geweben detektiert werden konnte, wurde RhoC z. B. in Muskel und Milz nicht nachgewiesen [51]. RhoB wird in vielen Zelltypen nicht konstitutiv exprimiert, sondern muß zunächst induziert werden [81]. RhoD ist im Gewebe von Mäusen weitverbreitet [126]. Darm­gewebe wurde jedoch in keiner der Arbeiten über Expression von Rho untersucht. Man muß annehmen, daß nur konstitutiv exprimiertes Rho für die Regulierung der bakteriellen Invasion zur Verfügung stehen kann, da der Invasionsprozeß in einem Zeitraum (wenige Minuten) abgeschlossen ist, in dem wahrscheinlich keine ausreichende De-novo-Proteinsynthese stattfin­den kann. Welche Rho-GTPasen in menschlichen Enterozyten tatsächlich exprimiert werden, ist zum jetzigen Zeitpunkt nicht bekannt.

Es ist gezeigt worden, daß Rho für die Epithelzellinvasion durch Shigella notwendig ist, indem HeLa- [3] und eine Reihe anderer kultivierbarer Zellen [183] mit C3-Exoenzym bzw. Clostridium difficile Toxin B behandelt wurden. Da diese Toxine nicht spezifisch für einzelne Isoformen sind [160], bleibt ungeklärt, ob alle Rho-Isoformen für die Invasion essentiell sind, oder nur einzelne. Diese Frage stellt sich vor allem für die Rho-Isoformen B und C, sowie für RhoD, für die mit den hier verwendeten Methoden kein Unterschied im Rekrutierungsmuster festgestellt werden konnte. Können sich diese drei GTPasen während der Internalisierung des Pathogens funktionell gegenseitig vertreten, oder nehmen sie unterschiedliche Funktionen wahr? Um entsprechende Antworten zu finden, müßten Enterozyten auf ihren Gehalt an Rho-Isoformen untersucht, und andererseits durch selektive Blockierung einzelner Isoformen deren Rollen im Invasionsprozeß determiniert werden. Durch die Identifizierung von Aminosäuresequenzab­schnitten, die das differentielle Rekrutierungsmuster definieren, ergibt sich ein Ansatzpunkt für eine solche isoformspezifische Blockierung. Die weitere Aufdeckung des komplexen Zusam­menspiels zwischen Shigella und der Darmepithelzelle im Rahmen der Epithelzellinvasion ist somit von hohem bakteriologischem, zellbiologischem und pathophysiologischem Interesse und verspricht ein vertieftes Verständnis bakterieller Pathogenitätsmechanismen.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 3.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
31.08.2004