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5  Zusammenfassung

Shigella ist der Erreger der bakteriellen Dysenterie (Ruhr), einer entzündlichen Erkrankung des Dickdarms. Notwendige Bedingung für die Pathogenese der Krankheit ist die Invasion von Darmepithelzellen durch den Erreger. Durch Sekretion von Invasionsproteinen (Ipa) induziert das Bakterium dabei seine eigene Aufnahme in Zellen, die normalerweise keine phagozytische Aktivität aufweisen. Shigella löst in der Wirtszelle Rearrangements des Aktinzytoskeletts aus, die zum Auswachsen von Plasmamembranprotrusionen und zur Bildung einer blütenkelchähnlichen Struktur führen. Innerhalb dieser Struktur wird das Pathogen schließlich internalisiert.

Die Umbauvorgänge am Aktinzytoskelett sind abhängig von der Funktion eines Wirtszell­proteins, der kleinen GTPase Rho. Rho bildet zusammen mit weiteren verwandten Proteinen wie Rac und Cdc42 eine Gruppe (Rho-Familie) innerhalb der Superfamilie der Ras-ähnlichen kleinen GTPasen und funktioniert als molekularer Schalter: Im GTP-gebundenen Zustand ist das Molekül in der Lage, Effektoren zu aktivieren, nach Hydrolyse von GTP zu GDP befindet sich das Protein dagegen im „Aus“-Zustand. Drei Isoformen von Rho (A, B und C) sind beschrieben, deren Sequenzen zu etwa 90% identisch sind und die sich auch von ihren biochemischen Eigenschaften her weitgehend ähneln. Daher konzentrierte sich das wissenschaftliche Interesse bislang vorwiegend auf eine Isoform, RhoA. Allerdings wurden in der Art der posttranslationa­len Modifikation und in der intrazellulären Lokalisation schon frühzeitig Unterschiede zwischen RhoB einerseits und RhoA und C andererseits aufgezeigt. Im Laufe der Zellinvasion durch Shigella werden Rho-Isoformen differentiell an die Bakterieneintrittsstelle rekrutiert, wobei sich lichtmikroskopisch zwei Muster definieren lassen, anhand derer sich RhoA gegen RhoB und RhoC abgrenzen läßt: RhoA akkumuliert vorwiegend um die eindringenden Bakterien herum, während sich RhoB und RhoC hauptsächlich in den bakterieninduzierten Membranprotrusionen konzentrieren.

Ziel der vorliegenden Studie war es, einen Abschnitt der Aminosäuresequenz der Rho-Iso­formen, der die Art des Rekrutie­rungsmusters determiniert oder zumindest beeinflußt, näher zu charakterisieren. Darüber hinaus wurde der Frage nachgegangen, ob sich das Rekrutierungs­phä­nomen auf die drei Isoformen RhoA, B und C beschränkt, oder ob auch andere, verwandte kleine GTPasen an die Bakterieneintrittsstelle transloziert werden können. Zu diesem Zweck wurde hier das Rekrutierungsverhalten der kleinen GTPase RhoD, die den drei Isoformen A, B und C auf der Primärstrukturebene nur zu etwa 50% homolog ist, untersucht. Durch die Herstel­lung einer Reihe mit einem Peptid-tag versehener Rho-(Hybrid-)Kon­strukte durch PCR-vermit­telte gezielte Mutagenese und Analyse dieser Konstrukte in einem HeLa-Zell-Modell gelang es, Primärstrukturabschnitte einzugrenzen, welche die Ausprägung des einen oder anderen Rekrutie­rungstyps determinieren. Ebenso wurde eine entsprechende Rolle für andere Abschnitte ausge­schlossen.

Das Vorhandensein der CaaX-Gruppe, Ort der posttranslationalen Isoprenylierung und Car­boxymethylierung von Rho, ist zwar – wie bereits bekannt war – eine notwendige Voraus­setzung für den Ablauf des Rekrutierungsphänomens an sich, das Motiv leistet aber keinen Beitrag zur Bestimmung des differentiellen Rekrutierungsmusters. Auch die Phosphorylierung von RhoA an Ser188 durch die Proteinkinase A (PKA) scheint im Zusammenhang mit der besonderen Rekrutierung dieser Isoform keine Rolle zu spielen. Dagegen konnte ein prä-C‑terminal gelege­ner Abschnitt von acht Aminosäuren eingegrenzt werden, der notwendige Informationen für die Expression des jeweiligen Transloka­tionsmusters während der Shigel­leninvasion tragen muß: Der Austausch der Aminosäuren 181‑188 zwischen RhoA und RhoC führt zum Wechsel der Rekrutierungsmuster. Nach näherer Untersuchung des prätermina­len Abschnitts konnte ein Motiv von zwei Lysinen (Lys186-Lys187) definiert werden, das für die Ausprägung des RhoA-Rekrutierungsmusters essentiell ist.

Erstmals wurde hier nachgewiesen, daß außer RhoA, B und C zumindest noch eine weitere verwandte kleine GTPasen an die Bakterieneintrittsstelle rekrutiert werden kann. Interessanter­weise wird auch RhoD, ein Protein, das sich in Funktion und Primärstruktur deutlich von den drei „klassischen“ Isoformen A, B und C abgrenzen läßt, im Laufe der Zellinvasion durch Shigella transloziert und folgt dabei dem bereits bekannten Rekrutierungsmuster von RhoB und RhoC.

Die gezeigten Ergebnisse lenken die Aufmerksamkeit auf die Bedeutung einer präzise defi­nierten subzellulären Lokalisation für die Funktion von Biomolekülen und geben Anlaß zur Spekulation, daß auch biochemisch sehr ähnliche Proteine wie RhoA und RhoC lediglich aufgrund eines unterschiedlichen Verteilungsmusters unterschiedliche Aufgaben erfüllen könnten. Nach Identifizierung der das differentielle Rekrutierungsmuster definie­renden Amino­säuren dürfte eine spezifische Blockierung einzelner Isoformen möglich werden. Dieser Ansatz könnte zu einem besseren Verständnis der konkreten Rolle der jeweiligen Isoformen für die Epithelzellinvasion durch Shigella führen.


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31.08.2004