Die bakterielle Dysenterie (Ruhr) ist eine durch gramnegative Bakterien der Gattung In jüngerer Zeit wurde vorgeschlagen, Shigella nicht als eigenständige Gattung, sondern als Gruppe von Klonen der Spezies Escherichia coli zu betrachten [142]. Da sich diese Einteilung in der internationalen Fachliteratur jedoch noch nicht durchgesetzt hat, wird in dieser Arbeit die bisherige Klassifikation beibehalten.xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx
Das Genus Shigella, nach dem Erstbeschreiber Kiyoshi Shiga [162] benannt, gehört zur Familie der Enterobacteriaceae und ist eng mit E. coli verwandt. Die Gattung wird in vier Spezies gegliedert, die jeweils epidemiologische Besonderheiten aufweisen, jedoch alle das Krankheitsbild der bakteriellen Dysenterie hervorrufen können [137]. S. sonnei ist die in gemäßigten Breiten am häufigsten isolierte Spezies, bei insgesamt sehr niedriger Dysenteriemorbidität [22]. S. dysenteriae, die als einzige Art das Shiga-Toxin produziert, und S. flexneri sind dagegen vor allem in tropischen und subtropischen Regionen endemisch. S. flexneri ist dort meist das vorherrschende Pathogen [86, 117, 146]. S. dysenteriae wird periodenweise kaum isoliert, kann jedoch als einzige Spezies plötzlich auftretende und sich rasch ausbreitende Pandemien verursachen [55]. S. boydii spielt nur eine untergeordnete Rolle. Die Spezies können weiter in Serotypen unterteilt werden.
Die bakterielle Ruhr wird von Mensch zu Mensch übertragen, hauptsächlich auf dem fäkal-oralen Weg [137]. Um das Vollbild der Erkrankung hervorzurufen, sind äußerst niedrige Infektionsdosen in der Größenordnung von 102 KBE und darunter ausreichend [46, 101]. Eine im Vergleich zu anderen Enterobacteriaceae erhöhte Säureresistenz [61] gewährleistet, daß Shigella auch bei geringem Inokulum das saure Milieu des Magens unbeschadet passieren und den eigentlichen Ort der Infektion, das Kolon, erreichen kann. Der Mensch gilt als einziger natürlicher Wirt dieses Bakteriums. Ob auch andere Primaten unter natürlichen Bedingungen befallen werden, konnte bisher nicht mit Sicherheit ausgeschlossen werden [1, 137, 170]. Bei anderen Säugern kann das Krankheitsbild der Shigellose dagegen – wenn überhaupt – nur unter bestimmten experimentellen Bedingungen und mit entsprechend hohen Infektionsdosen hervorgerufen werden [140, 170].
Histopathologische Studien der Shigellose an Tiermodellen [140, 150, 170] oder menschlichem Biopsiematerial [108, 109] erbrachten prinzipiell vergleichbare Ergebnisse: An der luminalen Seite des befallenen Kolonepithels wird ein hämorrhagisches Exsudat beobachtet, das abgestoßene Epithelzellen, neutrophile Granulozyten, Erythrozyten, Fibrin, sowie massenhaft Shigellen enthält. Die darunterliegende Epithelschicht zeigt ausgeprägte Nekrosen und Erosionen; oft sind große Epithelflächen abgelöst. Ulzera treten bereits in sehr frühen Stadien der Erkrankung in denjenigen Epithelregionen auf, welche die schleimhautassoziierten Lymphfollikel bedecken (Peyer-Plaques). Die befallene Darmschleimhaut ist massiv mit neutrophilen Granulozyten, Lymphozyten und Makrophagen infiltriert und erscheint ödematös und hyperämisch. Die Interzellulärspalten zwischen den Epithelzellen sind verbreitert und werden durch transmigrierende Leukozyten noch stärker aufgeweitet. Die Kolonepithelzellen selbst zeigen häufig Degenerationszeichen. Shigellen sind in den Interzellulärspalten, in Makrophagen oder neutrophilen Granulozyten zu sehen. Innerhalb von Epithelzellen liegen sie sowohl in Vakuolen eingeschlossen als auch frei im Zytoplasma.
Die Fähigkeit von Shigella in Kolonepithelzellen einzudringen ist eine notwendige Bedingung für die Entstehung der Shigellose. Stämme, die zur Zellinvasion unfähig sind, sind apathogen [95, 101]. Es erscheint dabei zunächst paradox, daß Shigella nicht in der Lage ist, in polarisierte Kolonozyten vom apikalen – dem Darmlumen zugewandten und mit Mikrovilli besetzten – Pol her einzudringen. Tatsächlich kann die Invasion nur an der basolateralen Zelloberfläche erfolgen [123], dem Zellpol, der unter physiologischen Bedingungen vom Darmlumen aus nicht direkt zugänglich ist.
Shigella benutzt M‑Zellen als Eintrittspforte zur Überwindung der Epithelbarriere [150]. M‑Zellen sind Bestandteil des follikelassoziierten Epithels und spielen eine wichtige immunologische Rolle: Sie nehmen Makromoleküle (z.B. Antigene) und Mikroorganismen aus dem Darmlumen auf, transportieren sie durch das Epithel, übergeben sie an Makrophagen, B‑Lymphozyten oder dendritische Zellen und induzieren so eine spezifische, lokale Immunabwehr. Mikroorganismen überstehen die Transzytose durch die M‑Zellen normalerweise unbeschadet [128]. Nach der Zellpassage findet sich Shigella auf der basalen Seite des Epithels sowohl frei im Interzellulärraum als auch im Inneren von Makrophagen wieder [150]. Durch die Fähigkeit, in Makrophagen Apoptose zu induzieren [191, 192], entgehen die Bakterien der lysosomalen Zerstörung, gewinnen (erneut) Zugang zum basolateralen Extrazellulärraum und können von hier aus in Kolonozyten eindringen.
Mit Shigella infizierte Makrophagen setzen bereits vor ihrem apoptotischen Untergang das proinflammatorische Interleukin 1 (IL‑1) frei [190]. In der Folge wird die Mukosa massiv von chemotaktisch angelockten Granulozyten infiltriert, die in das Darmlumen migrieren, die Basalmembran angreifen und zur Ablösung des Epithels führen. In vitro induziert Shigella auch direkt vom apikalen Pol aus die Wanderung von Granulozyten durch das Epithel. Nachdem der Epithelzellverband derart aufgelockert ist, gewinnt das Pathogen auch vom Lumen her Zugang zur basolateralen Oberfläche der Kolonozyten [139]. Es konnte gezeigt werden, daß durch Blockade von IL‑1‑Rezeptoren [151] bzw. der Leukozytenmigration [140] das Ausmaß sowohl der bakteriellen Invasion als auch der Gewebszerstörung vermindert wird. Dies deutet darauf hin, daß die Entzündungsreaktion des Wirts in der Anfangsphase der Erkrankung nicht zur Bekämpfung des Pathogens beiträgt, sondern im Gegenteil dessen Ausbreitung unterstützt und für einen großen Teil der Gewebsläsionen unmittelbar verantwortlich ist [140, 151].
Seitdem die fundamentale Bedeutung der Zellinvasion für die Pathogenese der Dysenterie erkannt wurde, gilt der Aufklärung der daran beteiligten molekularen Mechanismen große wissenschaftliche Aufmerksamkeit. Einen wichtigen Beitrag zum Verständnis des Invasionsprozesses leisteten elektronenmikroskopisch-morphologische Studien, welche auf eine zentrale Rolle des Aktinzytoskeletts hinwiesen [2, 40]: Kleinere Mengen von F‑Aktin akkumulieren sehr rasch nach Adhärenz von Shigella an die Wirtszelle an derjenigen Stelle der Zellmembran, die unmittelbar „unter“ dem Pathogen liegt. Räumlich getrennt davon finden sich an der Membran auch im Umkreis des Pathogens Aktinnukleationsfokusse. Ausgehend von diesen unterschiedlich lokalisierten Fokussen bilden sich verschiedene Strukturen aus: Um das Bakterium herum wachsen pfeilerartige Protrusionen mehrere Mikrometer über das Zelloberflächenniveau hinaus; deren Gerüst wird von F‑Aktin-Bündeln gebildet, welche mit ihrem barbed end in Richtung der Protrusionsspitzen orientiert sind. Da die Membran durch die Aktinbündel mit angehoben wird, bildet sich eine blütenähnliche Struktur aus, die das Pathogen weit überragt. Membranfalten erstrecken sich von Pfeiler zu Pfeiler, während das Bakterium am Grund des „Blütenkelchs“ liegt. „Unterhalb“ des Bakteriums führt die weitere Ansammlung von F‑Aktin dagegen zur Ausbildung einer in Richtung des Zellinneren orientierten „sprinklerartigen“ Filamentstruktur. Indem sich die Blütenstruktur schließt, wird das Pathogen in einer von einem Netz von Mikrofilamenten umgebenen Vakuole in die Zelle aufgenommen. Reste der zellulären Protrusionen bleiben dabei zunächst erhalten. Bei 37°C ist die Aufnahme extrazellulärer Bakterien nach
18 min abgeschlossen [2, 40]. Innerhalb von weniger als 15 min nach Invasion induziert Shigella die Lyse der Vakuolenmembran. Nachdem das Bakterium auf diese Weise Zugang zum nährstoffreichen intrazellulären Milieu gewonnen hat, vermehrt es sich sehr rasch und kolonisiert die befallene Zelle [154].
Shigella, im extrazellulären Medium unbeweglich, kann im Zytoplasma der Wirtszelle zelluläre Komponenten zur Fortbewegung nutzen: So führt in Fibroblasten eine zentripetale „organellenartige“ Bewegung von Shigella entlang von Streßfilamenten (vgl. 1.4.1) zur Bildung von Mikrokolonien um den Zellkern [177]. Eine weitere, von Streßfilamenten unabhängige Form der Beweglichkeit wird durch Induktion von Aktinfilamenten an einem Pol der Bakterien ermöglicht. Dabei entsteht eine kometenschweifähnliche F‑Aktin-Struktur. Durch diese ungerichtete Motilität kann Shigella benachbarte Zellen befallen, ohne erneut mit dem extrazellulären Milieu in Kontakt zu treten [20, 141]. Diese Invasion „von innen“ unterscheidet sich jedoch von der primären Invasion „von außen“: Die Bakterien buchten zunächst lokal durch eine zentrifugale Bewegung die Membran der bereits kolonisierten Zellen von innen aus. Dadurch werden handschuhfingerartige Membranprotrusionen gebildet, welche die Membranen unmittelbar benachbarter Zellen einstülpen können. Die Shigellen, die sich an der Spitze dieser somit aus zwei Membranen bestehenden Protrusionen befinden, werden nun von den penetrierten Zellen in Vakuolen internalisiert („intercellular spread“). Auch aus diesen doppelwandigen Vakuolen kann sich Shigella durch Lyse der Membranen wieder befreien, sich im Zytoplasma vermehren und von dort aus weitere Zellen kolonisieren [82].
Die bakteriellen Proteine IcsA und B regulieren die intra- und interzelluläre Ausbreitung von Shigella [8, 20, 59] und bilden somit die molekulare Grundlage der effizienten Ausbreitung innerhalb größerer Epithelzellverbände. Für die primäre Invasion von Epithelzellen sind diese ics-Genprodukte jedoch nicht essentiell.
Die Fähigkeit von Shigella zur Epithelinvasion und -kolonisierung ist an das Vorhandensein eines 220 kb-Virulenzplasmids gebunden [153, 154]. Der Transfer des Plasmids in E. coli K‑12 vermittelt auch diesem nichtinvasiven Bakterienstamm typische Charakteristika von Shigella, darunter die Fähigkeit, in HeLa-Zellen einzudringen [152]. Die für die Ausbildung des invasiven Phänotyps essentiellen Gene liegen auf einem Abschnitt von 31 kb Länge, der die ipa-, mxi- und spa-Operons enthält [116]. Die mxi- und spa-Genprodukte bilden einen Typ III‑Sekretionsapparat, über den die ipa-Genprodukte innerhalb von Minuten ins extrazelluläre Medium abgegeben werden können [16]. Das experimentelle Ausschalten einzelner Komponenten des Sekretionsapparats geht mit dem Verlust der Invasivität von Shigella einher [9, 10].
Die Ausschüttung von Ipa-Proteinen wird durch den Kontakt des Bakteriums mit Epithelzellen induziert [114, 184]. Die Interaktion mit dem basolateralen Pol polarisierter Epithelzellen führt dabei zu einer stärkeren Sekretion als der Kontakt mit dem apikalen Pol. In vitro konnte die Sekretion mit Glykoproteinen der extrazellulären Matrix induziert werden [184]. Vier Ipa-Proteine wurden charakterisiert und mit den Buchstaben A bis D gekennzeichnet. IpaB [70], C [17] und D sind essentiell für Epithelzellinvasion und die darauf folgende Lyse der Phagosomenmembran [116]. IpaA erhöht die Invasionseffizienz um das Zehnfache [173]. IpaB und C bilden im extrazellulären Medium einen löslichen Komplex, an dem möglicherweise noch weitere Proteine beteiligt sind [115]. Mit diesem Komplex beschichtete Latexpartikel werden von HeLa-Zellen in einem aktinabhängigen Mechanismus internalisiert, der morphologisch und funktionell der Invasion durch intakte Bakterien entspricht [113].
Einen wesentlichen Fortschritt in der Erforschung der Signalübertragungskette zwischen Ipa-Komplex und Zytoskelett brachte der Nachweis, daß die kleine GTPase Rho, ein Protein der Wirtszelle, für die Zellinvasion durch Shigella essentiell ist. Durch Inhibition dieses Proteins läßt sich die Invasion von kultivierten Epithelzellen durch Shigella blockieren und der blütenartige Invasionskomplex kommt nicht mehr zustande [3, 113, 183]. Die Untersuchung von Rho dürfte somit auch zu einem besseren Verständnis der Epithelzellinvasion durch Shigella auf molekularer Ebene beitragen.
Invasivität ist ein Merkmal vieler Darmpathogene, darunter auch Salmonella und Listeria. Die Invasionsstrategien von Listeria monocytogenes und Shigella gleichen sich durch das bevorzugte Eindringen auf der basolateralen Seite polarisierter Epithelzellen, die Lyse des Phagosoms, die Art der intrazellulären Bewegung und die Fähigkeit, sich unmittelbar von Zelle zu Zelle auszubreiten. In der Art des Internalisierungsprozesses ergeben sich hingegen Unterschiede: Während Shigella in einem relativ großen Umkreis Membranfältelungen induziert und durch einen makropinozytoseähnlichen Prozeß aufgenommen wird, wird Listeria „reißverschlußartig“ eng von der Wirtszellmembran umschlossen und so internalisiert [41].
Salmonella typhimurium induziert wie Shigella an der Oberfläche der Wirtszelle Membranfältelungen, die zur Aufnahme des Pathogens in nichtphagozytische Darmepithelzellen führen. Die Mikromorphologie des Invasionskomplexes, der Typ‑III-Sekretionsapparat und die eingesetzten bakteriellen Invasine ähneln den entsprechenden Merkmalen von Shigella. Im Gegensatz zu Shigella dringt Salmonella in polarisierte Zellen aber von der apikalen Seite her ein. Nach Internalisierung bleibt Salmonella innerhalb der phagozytischen Vakuole [54]. Sowohl bei Salmonella als auch bei Listeria sind die Virulenzfaktoren chromosomal kodiert und nicht, wie bei Shigella, auf einem Plasmid [41, 54].
Alle drei Pathogene „benutzen“ das zelluläre Aktinzytoskelett, um in die Wirtszelle einzudringen. Unterschiede bestehen in der Mikromorphologie und der Art, wie die Zytoskelettrearrangements induziert werden [2, 41 68]. Für die Internalisierung von S. typhimurium sind die mit Rho verwandten kleinen GTPasen Rac und Cdc42 notwendig [68], nicht aber Rho selbst [183]. Ob GTPasen der Rho-Familie für die Invasion durch Listeria eine wesentliche Rolle spielen, ist noch nicht bekannt [41].
Invasionsstrategien verschiedener enteroinvasiver Bakterien unterscheiden sich in wichtigen Details. Dies eröffnet auch eine Vielfalt wissenschaftlicher Zugänge zur Erforschung von Funktionen der Wirtszellen. Shigella läßt sich von diesem Blickwinkel aus auch als zellbiologisches Werkzeug betrachten, mit dem sich – unter anderem – die Funktion von Rho studieren läßt.
Es sind mehrere Gruppen von Guanosintriphosphat-hydrolysierenden Proteinen (GTPasen) beschrieben, die sich in Größe, Struktur und Aufgaben unterscheiden, in ihrem Funktionsprinzip einander aber gleichen. GTPasen können als molekulare Schalter betrachtet werden, deren Affinität zu anderen Makromolekülen von ihrem Schaltzustand abhängt. Im GTP-gebundenen Zustand sind diese Proteine „aktiv“ bzw. „eingeschaltet“, im Komplex mit GDP dagegen „inaktiv“ bzw. „ausgeschaltet“. Diese beiden Zustände können zum sogenannten GTPase-Zyklus verbunden werden: Wenn GDP freigesetzt wird, tritt das Protein in einen vorübergehenden „Leerzustand“ ein. Unter physiologischen Bedingungen lagert sich an der freigewordenen Bindungsstelle jedoch sofort GTP an, wodurch sich die Konformation des Enzyms und folglich die Affinität zu bestimmten Effektorproteinen ändert. Schließlich wird GTP zu GDP hydrolysiert; die GTPase nimmt ihre Ausgangskonformation an, und der Kreislauf kann von neuem beginnen. Die Kinetik sowohl der Freisetzung von GDP als auch des Hydrolyseschritts wird bei den meisten GTPasen von einer Reihe von Steuerungsproteinen reguliert. Die Hydrolyse von GTP stellt einen irreversiblen Schritt dar. Dadurch ist gewährleistet, daß der Zyklus nur in einer Richtung abläuft [26].
Die GTPasen lassen sich nach Struktur und Funktion in mehrere Superfamilien gliedern: Die heterotrimerischen G‑Proteine vermitteln und verstärken Signale an der Zellmembran. GTP-gesteuerte Initiations- und Elongationsfaktoren spielen bei der ribosomalen Proteinbiosynthese wesentliche Rollen. Die „kleinen GTPasen“, zu denen auch die Rho-GTPasen gezählt werden, sind dagegen vor allem mit der Regulation von Differenzierung, Zellproliferation, Endosomenreifung und von Funktionen des Aktinzytoskeletts assoziiert. Ein typisches Merkmal ist ihr geringes Molekulargewicht zwischen 21kDa und 35kDa. Einen weitergehenden Überblick über Funktion und Struktur von GTPasen geben die Referenzen [26] und [27].
Das onkogene Mäusesarkomvirus (MSV) führte Ende der 70er Jahre auf die Spur der Ras-GTPasen: Es wurde erkannt, daß von den Harvey- und Kirsten-Viren kodierte 21kD-Proteine infizierte Zellen zur Proliferation zwingen. Später stellte sich heraus, daß sich die viralen Onkogene von eukaryotischen Genen ableiten, welche dann als ras-Gene bezeichnet wurden. Zelluläre Ras-GTPasen sind als Signalmoleküle an der Steuerung von Zellwachstum,
-proliferation und -differenzierung beteiligt [23, 26, 47]. In der Folgezeit wurde eine Fülle von verschiedenen kleinen GTPasen entdeckt. „Ras“ dient seitdem gleichzeitig als Name einzelner GTPasen wie auch einer ganzen Superfamilie von „Ras-ähnlichen“ Proteinen mit unterschiedlichen Aufgaben. Eine detaillierte Übersicht hierzu findet sich z.B. in der Arbeit von Bos [24].
Gene der ras-Superfamilie sind evolutionär hochkonserviert und wurden aus einer Vielzahl eukaryotischer Zellen, von Hefen bis Säugerzellen, isoliert [105]. Die folgende Darstellung beschränkt sich jedoch auf die im Kontext mit Shigella unmittelbar relevanten kleinen GTPasen, die mammalischen Vertreter der Rho-Familie.
Die Rho-Familie wurde 1985 von Madaule und Axel als eine neue Familie von ras-homologen Genen beschrieben. Die Übereinstimmung der Aminosäuresequenzen von Rho und Ras beträgt etwa 35%, wobei sich Regionen starker Homologie von Abschnitten größerer Variabilität abgrenzen lassen [105]. Rho-GTPasen im engsten Sinne sind die drei Isoformen RhoA, B und C, die eine Vielzahl biochemischer Charakteristika teilen und deren Aminosäuresequenzen zu 84‑92% identisch sind Sequenzidentität und -ähnlichkeit wurden mit der Funktion "gap" des unter http://genome.dkfz-heidelberg.de zugänglichen Programms "HUSAR" berechnet.
Ähnlich wie schon im Fall von Ras wurden auch zu RhoA, B und C in rascher Folge homologe GTPasen entdeckt, so daß der Begriff „Rho“ in der Literatur auch zur Kennzeichnung einer ganzen Superfamilie benutzt wird. Die Rho-Superfamilie wird derzeit in acht Mitglieder(gruppen) eingeteilt: Rho (mit den Isoformen A, B und C), Rac (Isoformen 1 und 2), Cdc42 (Isoformen Cdc42Hs und G25K), RhoD, RhoG, Rnd (Isoformen 1, 2 und 3/RhoE), TC10 und RhoH/TTF [42, 104, 131]. Die Aminosäuresequenzen der Rho-verwandten GTPasen stimmen mit der Sequenz von RhoA zu 40% (RhoH) bis 54% (Rac1) überein.
Kleine GTPasen der Rho-Familie kontrollieren die Organisation des Aktin-Zytoskeletts in eukaryotischen Zellen [130], eine Rolle, die bei einer Vielzahl zellulärer Funktionen zum Tragen kommt. Rho-GTPasen werden auch mit der Regulation der Dynamik intrazellulärer Vesikel in Verbindung gebracht [112, 126]. Möglicherweise kommt den Proteinen zusätzlich auch eine Aufgabe bei der Steuerung der Gentranskription zu [71, 159, 171]. In dieser Arbeit gilt das Interesse jedoch der Rolle von Rho als Regulator des Zytoskeletts.
Die meisten Daten liegen zum jetzigen Zeitpunkt zu Rho, Rac und Cdc42 vor. Die übrigen Familienmitglieder sind noch wenig erforscht und bleiben im folgenden – mit Ausnahme von RhoD – unberücksichtigt. TC10 scheint vom erzeugten Phänotyp her Cdc42 nahezustehen [127]. RhoG ist der Nomenklatur zum Trotz näher mit Rac (68% Identität), Cdc42 und TC10 verwandt als mit den klassischen Rho-Isoformen (54% Identität mit RhoA) und stellt evolutionsgeschichtlich möglicherweise eine frühe Abzweigung dar [178]. Rnd/RhoE fördert die Auflösung von F‑Aktin-Strukturen [65, 131]. RhoH/TTF wurde nur in hämatopoetischen Zellen nachgewiesen [42].
Rho-Proteine werden – wie auch andere kleine GTPasen der Ras-Superfamilie [67] – im C‑terminalen Bereich posttranslational modifiziert. Notwendige Bedingung hierfür ist ein sogenanntes CaaX-Motiv am Carboxy-Terminus [67], wobei „C“ für Zystein steht, „a“ für eine aliphatische Aminosäure und „X“ für eine beliebige Aminosäure. RhoA, B und C werden an dem an viertletzter Position stehenden Zystein über eine Thioetherbindung isoprenyliert, und die letzten drei Aminosäuren („‑aaX“) werden abgespalten [4]. Am Beispiel von RhoA wurde gezeigt, daß die Prenylierung von Cys190 der Abspaltung des Tripeptids vorausgeht (vgl. Abb. 1-1). Anschließend wird der neue Carboxyterminus methyliert [83]. Sind – wie bei RhoB – vor der CaaX-Gruppe weitere Zysteinreste vorhanden, können auch Palmitoylgruppen angekoppelt werden [4]. Am Beispiel von Ras wurde gezeigt, daß auch für diese Art der Modifikation eine vollständige CaaX-Gruppe notwendig ist [67]. Die genannten posttranslationalen Veränderungen erhöhen die Affinität der Proteine zu Lipidmembranen beträchtlich [164]. Es ist nicht endgültig geklärt, ob Rho-Isoformen dank ihrer lipophilen posttranslationalen Modifikationen direkt an Membranen binden oder eines „Adapters“ in der Membran bedürfen. Daten aus einem Erythrozytenmodell deuten darauf hin, daß RhoA GTP-abhängig an integrale Membrankomponenten binden kann [25]. Klar gezeigt wurde, daß die posttranslationale Modifikation für eine Reihe von Funktionen, darunter die Interaktion mit Steuerungsproteinen des GTPase-Zyklus, unerläßlich ist [75, 110].
GTP-Hydrolyse und GDP-GTP-Austausch sind bei RhoA/B/C und anderen kleinen GTPasen komplex regulierte Prozesse. Die intrinsischen GTP-Hydrolyse- und GDP-Dissoziationsraten sind sehr niedrig [26], wobei die Hydrolyserate von RhoA kleiner ist als die von Rac1 oder Cdc42 [188]. Diese Ausgangskonstellation ist Grundlage für die Schalterfunktion der kleinen GTPasen. Durch den Einsatz von Steuerungsproteinen, die den GTPase-Zyklus bei Bedarf vorantreiben oder auch bremsen, wird es möglich, den „Schalter“ Rho präzise zu regulieren. GDP/GTP-Austauschfaktoren (GEF), auch als -Austauschproteine (GEP) oder GDP-Dissoziationsstimulatoren (GDS) bezeichnet, aktivieren Rho, indem sie den Übergang in den GTP-gebundenen Zustand fördern [32]. GTPase-aktivierende Proteine (GAP) beschleunigen den Hydrolyseschritt und inaktivieren Rho [188]. GDP-Dissoziationsinhibitoren (GDI) binden Rho im inaktiven Status [119] und hemmen die Aktivierung durch GEFs [110].
Extrazelluläre Signale müssen auf die Ebene der Steuerung des GDP/GTP-Gleichgewichts transduziert werden (oder unmittelbar auf dieser Ebene wirken), um die Aktivität von Rho zu beeinflussen, wobei über diese Signalkette wenig bekannt ist. Beispiele für Rho-aktivierende extrazelluläre Signale sind die Wachstumsfaktoren LPA [143] und Bombesin [50], die, durch Rho vermittelt, Streßfilamente und Fokaladhäsionskomplexe in Fibroblasten induzieren. Rezeptorgekoppelte heterotrimerische G‑Proteine können an der Transduktion des LPA-Signals durch die Plasmamembran beteiligt sein [30]. Sphingosin-1-Phosphat aktiviert Rho ebenfalls in Fibroblasten, scheint aber nicht über einen Rezeptor an der Zelloberfläche zu wirken [180]. Über welche Zwischenschritte der Ipa-Komplex von Shigella die Verschiebung des GDP/GTP-Gleichgewichts induziert, ist ebenfalls noch nicht bekannt.
Über 20 verschiedene GEFs für Mitglieder der Rho-Superfamilie sind beschrieben worden. GEFs werden oft mit einer (proto-)onkogenen Rolle in Verbindung gebracht. Zum Teil können sie mit mehreren Rho-Unterfamilien (Rho, Rac, Cdc42) interagieren, zum Teil sind sie für einzelne Proteine spezifisch [32]. Lbc [189], mNET1-GEF [7] und mRhoGEP [110] gelten als für Rho spezifisch. Eine weitergehende, differentielle Spezifität für einzelne Rho-Isoformen ist bisher nicht nachgewiesen worden. GEFs wurden meist aus der Zytosolfraktion isoliert; es soll jedoch auch membranassoziierte GEFs geben. Ein Beispiel hierfür ist mRhoGEP [110]. Für rhoGDS und mRhoGEP wurde auch gezeigt, daß die posttranslationale Modifikation von Rho für die Interaktion zwischen GEF und GTPase notwendig ist [75, 110].
Auch die Rho-inaktivierenden GAPs bilden eine Familie mit mehreren Vertretern unterschiedlicher Spezifität. Die GAPs myr 5 [125], p190 [188] und p122 [74] sollen für Rho spezifisch sein; Isoformspezifität ist auch hier nicht bekannt. Ebenfalls auf Rho wirkt p50rhoGAP, jedoch soll dieses Steuerungsprotein zu Cdc42 eine noch höhere Affinität aufweisen [188]. Durch p190 oder p50rhoGAP wird die GTP-Hydrolyserate von RhoA mindestens um den Faktor 4000 erhöht [188]. Im Gegensatz zu GDIs und manchen GEFs kann rhoGAP auch an posttranslational unmodifiziertem Rho aktiv sein [75].
Einige GAPs zeigen neben ihrer eigentlichen GAP-Funktion noch andere Aktivitäten. So bindet p122 an PLC-delta 1 und aktiviert dieses Enzym. Dadurch wird die Hydrolyse von 4,5‑PIP2 gesteigert [74] und eine Funktion von Rho, die Stimulation der PIP2-Synthese [36], auch indirekt antagonisiert. Das Klasse‑IX-Myosin myr5 hat in vitro und in vivo rhoGAP-Aktivität mit einer hohen Spezifität für Rho. Überexpression von myr5 in HeLa-Zellen führt zur Inaktivierung von Rho [125].
RhoGDI hat neben seiner Rho-inaktivierenden Funktion [119] auch Einfluß auf die intrazelluläre Lokalisation von Rho. Mit RhoGDI komplexiertes Rho liegt im Zytosol vor [80, 94]. GDI löst membrangebundenes RhoB von der Membran ab, wenn RhoB im Komplex mit GDP vorliegt [80]. Mikroinjektion von RhoGDI inhibiert entsprechend die wachstumsfaktorinduzierte Translokation an die Plasmamembran [169]. RhoGDI wird nur an posttranslational modifiziertem Rho aktiv [75] und bindet zehnmal besser an GDP-Rho als an GTP-Rho [155]. Mit GDI komplexiertes GDP-RhoA kann von GEFs nicht aktiviert werden [94, 110].
RhoA verfügt als einzige Rho-Isoform über einen Serinrest an Position 188. Wenn RhoA an Ser188 von der cAMP-gesteuerten Proteinkinase A (PKA) phosphoryliert wird, ist RhoGDI in der Lage, auch mit GTP komplexiertes, membrangebundenes RhoA zu binden und ins Zytosol zu translozieren [97]. Die biologische Aktivität von RhoA wird entsprechend durch die PKA-vermittelte Phosphorylierung am Ser188 in vivo vermindert [45].
Von RhoGDI sind drei Isoformen bekannt, die mit α, β und γ bezeichnet werden und sich in ihrem Expressionsmuster unterscheiden. Während RhoGDIα ubiquitär vorkommt, sind die anderen beiden Isoformen nur aus bestimmten Geweben isoliert worden [156]. Unterschiede in der Substratspezifität wurden bisher nicht beschrieben. RhoGDI ist nicht spezifisch für Rho und interagiert auch mit anderen Vertretern der Rho-Superfamilie wie Rac und Cdc42 [119].
Die präzise Kontrolle des GTPase-Zyklus durch das oben beschriebene Arsenal von Steuerungsproteinen ermöglicht die feine Regulierung der Aktivität von Rho-Effektormolekülen. Die meisten der bekannten Effektoren von Rho wiederum nehmen Einfluß auf Abläufe innerhalb der Zelle, an denen Aktin und mit Aktin assoziierte Zellkomponenten beteiligt sind. Aktin ist im Zytoplasma von Eukaryotenzellen das am stärksten repräsentierte Protein. Es kann – in Abhängigkeit vom Zelltyp – bis zu 10% der Gesamtproteinmenge ausmachen. Aus 42kD-Aktinmonomeren (G‑Aktin) können durch Polymerisation Mikrofilamente (F‑Aktin) entstehen. Der Anbau neuer Monomere erfolgt – unter Bedingungen, wie sie im Zytosol herrschen – vorzugsweise an einem Ende der Filamente, dem sogenannten barbed end, während das Abspalten von Monomeren im wesentlichen auf das andere Ende (pointed end) beschränkt ist [166].
Aktinfilamente sind ein wesentlicher Bestandteil des Zytoskeletts, das an einer Vielzahl von Zellfunktionen beteiligt ist. Es strukturiert die Zelle, bestimmt ihre Morphologie, definiert Polarität und ist für Zellbewegung und -teilung notwendig [166]. Charakteristisch für das Aktinzytoskelett ist die enge Anbindung an Plasmamembranen [175]. Damit Aktinfilamente zu einer funktionsfähigen Einheit zusammengesetzt werden können, bedarf es einer Fülle weiterer Proteine, die Filamente untereinander oder mit anderen Zellelementen verbinden. Beschrieben sind Moleküle, die Aktinfasern bündeln, bewegen oder in der Plasmamembran verankern.
Mit der Wirkung der kleinen GTPasen der Rho-Familie stehen mindestens drei Organisationsformen von F‑Aktin in Beziehung: (a) Lange, kontraktile, parallel in Gruppen angeordnete und Myosin enthaltende Bündel von F‑Aktin, die die Zelle in vielen Richtungen von Membran zu Membran durchqueren können, werden als Streßfilamente bezeichnet. Sie sind an sogenannten Fokaladhäsionen mit Integrinen und damit – indirekt – mit der extrazellulären Matrix verbunden. (b) Ein dichtes Geflecht von Aktinfasern findet sich am freien, sich vorwölbenden Rand von Lamellipodien und Membranfältelungen (membrane ruffles), wellenähnlichen Ausbuchtungen der Plasmamembran. (c) Kurze F‑Aktinbündel schließlich geben von der Zelloberfläche abstehenden fadenförmigen Membranprotrusionen, die als Filopodien oder mikrospikes bezeichnet werden, ihre Gestalt [130].
Cdc42, Rac und Rho regulieren die Organisation des Aktinzytoskeletts und interagieren auf komplexe Weise miteinander. Die Entwicklung des entsprechenden Forschungsgebiet weist eine hohe Dynamik auf, und ständig werden neue Aspekte der Funktionen und Interaktionen kleiner Rho-GTPasen aufgedeckt. Hier soll nur ein grober Abriß erfolgen:
In Mikroinjektionsexperimenten an Fibroblasten zeigte sich zuerst, daß Cdc42 Aktinpolymerisation induziert und zur Ausbildung von Filopodien und microspikes führt [130]. Rac vermittelt dagegen die Entstehung von Lamellipodien und Membranfältelungen durch Aktinpolymerisation de novo [103]. Das nach einer Punktmutation konstitutiv aktive RhoAG14V führt nach Mikroinjektion in Fibroblasten zu ausgeprägten Veränderungen der Zellmorphologie. Der Zellkörper kontrahiert sich, während fingerartige Fortsätze noch am Substrat haften bleiben [138]. Mit diesem Phänomen assoziiert ist die durch Rho induzierte Reorganisation von Aktin- und Myosinfilamenten zu Streßfasern. Rho scheint hier allerdings keine De-novo-Aktinpolymerisation zu induzieren [103, 130]. Anhand dieser Fibroblastenexperimente wurde eine Hierarchie von Rho, Rac und Cdc42 postuliert: Es wurde gezeigt, daß in diesem System unter dem Einfluß von Cdc42 die Aktivität von Rac zunimmt, während andererseits Rac einer der Faktoren ist, die die Aktivität von Rho steigern können [130]. Möglicherweise gilt diese Rangordnung nicht in allen Zelltypen und nicht für alle Aufgaben der GTPasen der Rho-Familie. Wahrscheinlich ist aber, daß die Steuerung der vielfältigen und komplexen Funktionen des Aktinzytoskeletts häufig der Kooperation mehrerer kleiner GTPasen der Rho-Familie bedarf. Dabei können diesen Proteinen auch antagonistische Rollen zufallen: Bei der Steuerung der Morphologie des Wachstumskegels von Neuronen, beispielsweise, sind Rho einerseits und Rac und Cdc42 andererseits an Signalketten beteiligt, die miteinander im Wettbewerb zu stehen scheinen [92].
Trotz des komplexen Zusammenspiels der kleinen GTPasen ist eine Dissektion der Signalketten möglich. So konnte einzelnen Mitgliedern der Rho-Familie eine Reihe spezifischer und eng definierter Funktionen zugeordnet werden. Dabei ist wichtig zu berücksichtigen, daß Rho-Proteine in verschiedenen Zelltypen nicht die gleichen Aufgaben erfüllen müssen. In Epithelzellen kann Rho auch Membranfältelung induzieren, die zeitlich dem Erscheinen von Streßfilamenten deutlich vorausgeht [169]. Diese Fältelungen lassen sich morphologisch von den Rac-ruffles abgrenzen [129]. Die Wirkung von Rac ist andererseits in MDCK-Epithelzellen zwar notwendig, nicht aber hinreichend, um Membranfältelung zu erzeugen [65]. In Thrombozyten ist RhoA notwendig für die Aggregation [120], und in Makrophagen spielt Rho eine essentielle Rolle bei der Fcγ-vermittelten Phagozytose [66]. Während der Zellteilung (Zytokinese) reguliert Rho den kontraktilen Aktin-Myosin-Ring an der Teilungsfurche [106].
Im folgenden werden einige Funktionsmechanismen und potentielle Interaktionspartner der klassischen Rho-Isoformen A, B, C, sowie von RhoD im Bereich der Zytoskelettregulation vorgestellt. Dies muß lückenhaft geschehen, da das Wissen darüber, wie Rho wirkt, noch sehr unvollständig ist. In vielen bisher veröffentlichten Arbeiten wurde zwischen RhoA, B und C nicht differenziert, da die biochemischen Unterschiede oft unwesentlich zu sein schienen. Häufig wird „Rho“ synonym verwendet mit RhoA, der wohl am besten untersuchten Isoform. Die Wirkung von Rho auf das Aktinzytoskelett scheint über eine Vielzahl von Angriffspunkten vermittelt zu werden. Insbesondere Zell-Zell-Kontakte, Mitglieder der Ezrin-Radixin-Moesin-(ERM-)Familie sowie die Verankerung von Aktinfilamenten an der Plasmamembran durch Fokalkomplexe stehen unter der Kontrolle von Rho.
Fokalkomplexe oder Fokaladhäsionen sind in der Plasmamembran lokalisierte, plattenförmige Ansammlungen (cluster) von Integrinen und aus dem Zytoplasma rekrutierten Proteinen, darunter unter anderem Talin, Vinculin, α‑Aktinin, Paxillin, Tensin und die Tyrosinkinasen pp125FAK und Src [38]. Integrine sind weitverbreitete heterodimerische Glykoproteine, die die Plasmamembran durchspannen und mindestens zwei Funktionen erfüllen: Sie können die Zelle an die extrazelluläre Matrix fixieren und Signale in die Zelle übertragen [38]. Die „klassischen“ Fokaladhäsionsplaques tragen auf der zytoplasmatischen Seite Verankerungsstellen für Streßfilamente. Es konnte gezeigt werden, daß – neben dem Kontakt mit der extrazellulären Matrix als Grundvoraussetzung – die Aktivität von Rho notwendig ist, damit diese Fokalkomplexe entstehen können [77, 143]. Und nur wenn zuvor Integrine zu Fokaladhäsionsplaques zusammengezogen wurden, können Aktinfilamente als parallele, kontraktile Streßfasern organisiert werden. In Abwesenheit von Fokaladhäsionen entstehen unter dem Einfluß von Rho lediglich dünne Aktinfilamentbündel [103, 130]. Fokaladhäsionsplaques können aber auch dann induziert werden, wenn die Bildung von Streßfilamenten unterbunden wird [130]. Fokaladhäsionsplaques sind hochdynamische Strukturen und verschwinden nach experimentellem „Abschalten“ von Rho binnen weniger Minuten [130].
Über welche Mechanismen reguliert Rho die Fokaladhäsionskomplexe? Während dieser Vorgang als Ganzes noch nicht verstanden ist, gibt es bruchstückhafte Informationen zu einzelnen Aspekten. In Fibroblasten kolokalisiert RhoA offenbar nicht mit Fokaladhäsionen [169]. Die Induktion von Streßfilamenten und das Zusammenziehen von phosphotyrosinhaltigen Proteinen an Fokaladhäsionen soll in Fibroblasten aber von einer downstream von Rho gelegenen Tyrosinkinase abhängig sein, wobei die Identität dieses Enzyms unklar ist [144]. Bekannt ist, daß Rho (nicht aber Rac) die Phosphorylierung der Tyrosinkinase pp125FAK, die ein Substrat von Src ist, stimuliert [50, 180]. Rho induziert weiterhin auch die Tyrosinphosphorylierung der Fokaladhäsionsproteine Paxillin und p130 in Fibroblasten [50]. In-vitro-Daten deuten darauf hin, daß Paxillin dabei von pp125FAK phosphoryliert werden kann [18]. Die Bedeutung dieser Modifikation ist allerdings unklar; zumindest ist sie keine notwendige Bedingung für die Rekrutierung des Proteins an Fokaladhäsionen [18].
Eine andere Verbindung zwischen Rho und Fokalkomplexen ergibt sich über die von Rho stimulierte 4,5‑PIP2-Synthese durch Aktivierung einer Phosphatidylinositol-4-phosphat 5-Kinase [36]. RhoA erhöht die Konzentration von Vinculin, einem Protein, das als Ankerstelle für F‑Aktin gilt, an Fokalkomplexen von MDCK-Zellen [91]; in Fibroblasten wurde auch die Rekrutierung von Talin als Rho-abhängig beschrieben [143]. Die Bindung von Vinculin sowohl an Aktin als auch an Talin wird in Fibroblasten von 4,5‑PIP2 verstärkt. Durch Blockierung von PIP2 mit monoklonalen Antikörpern konnte die Ausbildung von Fokaladhäsionsplaques und Streßfilamenten vollständig unterbunden werden [58].
Eines der am besten untersuchten Zielmoleküle von Rho ist die Rho-Kinase, eine 160kDa Serin/Threonin-Kinase, die spezifisch an GTP-Rho bindet und deren Aktivität durch diese Interaktion etwa um den Faktor zwei erhöht wird [111]. In der Literatur trägt dieses Enzym mehrere Namen: „Rho-assoziierte Kinase“, „Rho-Kinase“ und „ROKα“ sind als identisch zu betrachten; p160ROCK ist eine Isoform der Rho-Kinase [53]. Die Mikroinjektion der katalytischen Domäne von Rho-Kinase oder Überexpression des Enzyms können unabhängig von Rho die Bildung von Streßfilamenten und Fokaladhäsionen induzieren [11, 35, 99]. Konstitutiv aktives RhoA bewirkt die Rekrutierung von Rho-Kinase an Membranen und die Kolokalisation mit F‑Aktin in der Zellperipherie [100]. Die Kinase gilt aufgrund dieser Beobachtungen als ein Vermittler von Rho-Signalen.
Die Verbindung zwischen Rho-Kinase und der Induktion von Streßfilamenten ergibt sich möglicherweise über die Interaktion der Kinase mit leichten Myosinketten (MLC): Rho-Kinase ist in der Lage, MLC in vivo und in vitro zu phosphorylieren [12, 35], und zwar an der gleichen Stelle wie die Calmodulin-gesteuerte MLC-Kinase [12]. Durch diese Modifikation wird die ATPase-Aktivität von MLC – und damit die Motorfunktion von Myosin – angeschaltet [166]. Auch die Myosin-bindende Untereinheit (MBS) der Myosinphosphatase, dem direkten Gegenspieler der Myosin-phosphorylierenden Enzyme, ist ein Substrat der Rho-Kinase. GTP-RhoA scheint diese katalytische Wechselwirkung durch spezifische Interaktion mit der MBS zu vermitteln. Durch Phosphorylierung wird die Myosinphosphatase inaktiviert, was den Phosphorylierungs- und Aktivierungsgrad von MLC indirekt – als Folge verminderter Dephosphorylierung – zusätzlich steigert [89]. Somit ergibt sich ein Modell der doppelten Regulierung der Phosphorylierung von MLC. Dieser Mechanismus könnte auch die beschriebene „Erhöhung der Ca2+-Sensitivität“ der Phosphorylierung von MLC in glatten Muskelzellen durch aktiviertes und an die Membran transloziertes RhoA erklären [60].
Über das Na+‑H+-Austauschprotein NHE1 eröffnet sich ein weiterer Signalweg. Aktivität von NHE1 soll für die Entstehung von Streßfasern und Fokaladhäsionen in Fibroblasten und Epithelzellen notwendig sein. RhoA aktiviert NHE1 über p160ROCK [172].
Rho ist an der Regulierung von tight junctions in polarisierten Epithelzellen beteiligt [134]. In Keratinozyten steuern Rho und Rac die Einrichtung von Zell-Zell-Kontakten über die lokale Anreicherung von Cadherinen in der Plasmamembran. Cadherine sind Ca2+-abhängige Zell-Zell-Haftmoleküle, die – vermittelt durch Catenine – mit dem Aktinzytoskelett interagieren [28]. Ein anderes aktinbindendes Membran/Skelett-Protein, das an Zell-Zell-Kontaktstellen in Epithelzellen konzentriert ist, ist α‑Adduzin. Auch hier spielt die bereits im Zusammenhang mit der Induktion von Streßfilamenten erwähnte Rho-Kinase möglicherweise eine Rolle, indem sie α‑Adduzin phosphoryliert. Diese Phosphorylierung verstärkt die Interaktion mit Aktinfilamenten in vitro. Auch α‑Adduzin kann durch Myosinphosphatase dephosphoryliert werden. Dieser Schritt scheint, ähnlich wie für MLC beschrieben, gleichzeitig von Rho gehemmt zu werden, so daß auch hier eine zweigleisige Regulation vorliegen könnte [88].
Die eng verwandten Proteine Ezrin, Radixin und Moesin (ERM) [157] bilden eine weitere Familie von Molekülen, die die Verankerung von F‑Aktin in der Plasmamembran vermitteln können [175]. Ein möglicher Verankerungspunkt für ERM-Proteine ist das integrale Membranprotein CD44 [175]. ERM-Proteine sind innerhalb der Zelle an Stellen lokalisiert, wo Aktinfilamente dicht mit der Plasmamembran assoziiert sind, wie Teilungsfurchen, Mikrovilli, Membranfältelungen, Zell-Zell- und Zell-Matrix-Haftstellen [175]. Ezrin ist konzentriert in Mikrovilli und anderen aktinreichen Protrusionen von Epithelzellen. Moesin findet sich dagegen nur in manchen Epithelzellen, hauptsächlich jedoch in Endothelzellen [21]. ERM-Proteine interagieren in komplexer Weise mit Rho und sollen an der Aktivierung von Rho beteiligt sein [168]. Gleichzeitig gibt es Hinweise, die dafür sprechen, daß Rho umgekehrt auch die Funktion und Lokalisation von Ezrin, Radixin und Moesin reguliert (vgl. Abb. 1-2):
RhoA erzeugt in Fibroblasten Aktin/Membran-Protrusionen. Radixin wird Rho-abhängig phosphoryliert und in diese Protrusionen rekrutiert [161]. Der GEF Dbl interagiert in vitro mit der N‑terminalen Region von Radixin, ohne daß diese Interaktion einen Einfluß auf die Aktivität von Dbl hätte. Dbl interagiert nicht mit Radixin, wenn dieses mit RhoGDI komplexiert vorliegt. Umgekehrt verdrängt RhoGDI jedoch Dbl von Radixin. Es wird spekuliert, daß Radixin für die Rekrutierung dieser Rho-Steuerungsproteine eine Rolle spielt [167]. In Epithelzellen induziert Rho die Entstehung von Membranfältelungen und die Ansammlung von Moesin und MBS an der Plasmamembran im Bereich der freien Kante der Protrusion [53]. RhoA kolokalisiert mit ERM-Proteinen an Zell-Zell-Haftstellen, in Teilungsfurchen und dort, wo sich Membranfältelungen bilden [169]. Ähnlich wie MLC oder α‑Adduzin ist Moesin ein Substrat sowohl der Rho-Kinase als auch der Myosinphosphatase. Die Phosphorylierung erfolgt in einem Abschnitt von Moesin, der an der Aktinbindung beteiligt ist und könnte somit den Funktionszustand des Moleküls modifizieren [53].
Auch die Bildung des CD44/ERM-Komplexes soll in vivo von Rho gesteuert werden. Die Bindung zwischen ERM-Proteinen und CD44 wird in Anwesenheit von 4,5‑PIP2 verstärkt [73]. Die 4,5‑PIP2-Konzentration wiederum steht unter dem Einfluß von Rho [36]. Darüber hinaus wurde festgestellt, daß der CD44/ERM-Komplex in BHK-Zellen RhoGDI enthält [73]. Wenn RhoGDI an das N‑terminale Fragment von ERM-Proteinen, das auch die CD44-Bindungsstelle enthält, bindet, wird die Aktivität des Steuerungsproteins reduziert und damit die Aktivierung von Rho eingeleitet. Somit ergibt sich ein potentieller Mechanismus für die Aktivierung von Rho durch ERM-Proteine [168].
RhoD bewirkt bei Überexpression in BHK-Zellen die Ausbildung F‑Aktin-haltiger Membranfortsätze und den Abbau von Streßfasern und Fokaladhäsionen, Funktionen, die das Protein von den drei Isoformen A‑C unterscheiden. Weiterhin soll RhoD die Dynamik früher Endosomen regulieren. Expression der konstitutiv aktiven Mutante RhoDG26V führt zu verringerter Motilität der Organellen und hemmt – offenbar über diesen Mechanismus – die homotypische Fusion der Endosomen. RhoD ist in BHK-Zellen an der Plasmamembran sowie an vesikulären Strukturen in der ganzen Zelle lokalisiert [126].
RhoB zeigt ein ähnliches subzelluläres Verteilungsmuster und könnte aufgrunddessen ebenfalls für eine Rolle bei der Endosomensteuerung prädisponiert sein [5, 112]. Die Proteinkinase N („PKN“, „PRK1“) wird von RhoB an Endosomen rekrutiert [112]. PRK1 ist eine Serin/Threonin-Kinase, die in vitro sowohl von RhoA [13, 181] als auch RhoB [112] gebunden und aktiviert wird. In vivo soll PRK1 jedoch nur mit aktiviertem RhoB interagieren [112]. PRK1 interagiert andererseits auch mit α‑Aktinin [124], einem aktinfilamentbündelnden Protein, das u. a. in Fokalkomplexen gefunden wird [38]. Diese Wechselwirkung ist in vitro 4,5‑PIP2-abhängig [124].
Die Aktivität von Rho ist notwendig, damit Shigella in Zellen eindringen kann. An Modellen mit HeLa-Zellen, anderen Epithelzellen und Fibroblasten wurde gezeigt, daß die Invasion stark einschränkt ist, wenn zuvor das Clostridium botulinum-Toxin C3, das Rho spezifisch inhibiert [160], in die Zellen eingeschleust wurde [3, 183]. Rho reguliert die Entstehung der langen F‑Aktinbündel, die das Gerüst der bakterieninduzierten blütenkelchähnlichen Membranveränderungen bilden. Nur die Aktinnuklei unmittelbar unter den eindringenden Bakterien bilden sich Rho-unabhängig [3].
Ipa B, C und D von Shigella interagieren in vitro und kolokalisieren in vivo mit α5β1-Integrin [182] und können möglicherweise auf diesem Weg eine Aktivierung der Fokaladhäsionskomplexe vermitteln [183]. Die Invasionseffizienz von Shigella in CHO-Zellen korreliert mit dem Expressionsniveau von α5β1-Integrin in der Wirtszelle und scheint von der Ipa-Integrin-Interaktion abhängig zu sein [182]. Das in einem anderen Zusammenhang gefundene Ergebnis, daß Rho offenbar nicht nur regulatorische Signale an die Fokaladhäsionen vermittelt, sondern möglicherweise auch umgekehrt extrazelluläre Signale – durch Integrine weitergegeben – die Aktivität von Rho beeinflussen, könnte hier von Bedeutung sein [159].
IpaA interagiert im Zytoplasma von HeLa-Zellen mit Vinculin und induziert die Rekrutierung von Vinculin und α‑Aktinin an die Bakterieneintrittsstelle [173]. Auch Ezrin, dessen Funktion für die Epithelzellinvasion durch Shigella notwendig ist, wird an die Invasionskomplexe transloziert und kolokalisert dort mit Aktinfilamenten [165]. Weitere aktinassoziierte Proteine, die üblicherweise an Fokaladhäsionskomplexen vorkommen, konnten an der Bakterieninvasionsstelle nachgewiesen werden, darunter Paxillin, Talin, Cortactin, pp125FAK und Src [43, 182, 183]. Überdies konnte gezeigt werden, daß pp125FAK und Paxillin in CHO-Zellen im Laufe des Invasionsprozesses phosphoryliert werden [182, 183]. Auch Cortactin wird tyrosinphosphoryliert. Dieses Phänomen konnte in HeLa- und polarisierten Epithelzellen nachgewiesen werden und soll durch die Tyrosinkinase pp60c-src (Src) vermittelt werden [43, 186]. HeLa-Zellen, die Src überexprimieren, können von nichtinvasiven Shigellenstämmen infiziert werden [43]. Src und Cortactin werden an die Bakterieneintrittsstelle rekrutiert, wo sie mit F‑Aktin kolokalisieren [43]. Cortactin ist ein F‑Aktin-bindendes und -bündelndes Protein [78], das hauptsächlich in randständigen Zellstrukturen wie Lamellipodien und Membranfältelungen konzentriert vorkommt und eine SH3-Domäne enthält [186]. Die Phosphorylierung mindert die Fähigkeit des Proteins, F‑Aktin zu binden, in vitro geringfügig [78] und in vivo nicht meßbar [186]. Die Fähigkeit zur F‑Aktin-Bündelung wird jedoch durch die Einwirkung von Src in vitro deutlich herabgesetzt [78]. Aufgrund dieser Beobachtung wurde über eine antagonistische Rolle von Cortactin (und damit Src) gegenüber der aktinbündelnden Wirkung von Rho spekuliert [1]. Möglicherweise übt Src überdies auch auf einem anderen Weg eine hemmende Wirkung auf Rho aus: Src kann p190rhoGAP phosphorylieren und führt bei Überexpression zur Auflösung von Streßfilamenten. Es wird vermutet, daß die Phosphorylierung die Aktivität von rhoGAP erhöht und es dadurch sekundär zur Inaktivierung von Rho kommt [33].
Daß RhoB sich im Muster seiner posttranslationalen Modifikation und in der subzellulären Lokalisation von den anderen beiden Isoformen unterscheidet, ist seit längerem bekannt: Während RhoA und RhoC geranylgeranyliert werden, kann RhoB, das im C‑terminalen Bereich über zwei weitere Zysteine verfügt, zusätzlich oder alternativ farnesyliert und palmitoyliert werden [4]. Am Beispiel von Ras konnte gezeigt werden, daß die Art des angefügten Isoprenoidrests die intrazelluläre Lokalisation beeinflußt [23]. Entsprechend liegen bei Überexpression in Fibroblasten und Epithelzellen RhoA und RhoC hauptsächlich im Zytosol vor, während RhoB im wesentlichen an Endosomen lokalisiert ist. Ein kleiner Anteil aller drei Isoformen A, B und C findet sich an der Plasmamembran. [5, 112]. RhoD ähnelt in seinem Verteilungsmuster RhoB und kommt ebenfalls an der Plasmamembran und an frühen Endosomen vor [126]. Für RhoD, das wie RhoB in der C‑terminalen Region über mehr als ein Zystein verfügt, kann darüber hinaus nach [67] gemutmaßt werden, daß es ebenfalls isoprenyliert und palmitoyliert wird. Vor diesem Hintergrund könnte man versucht sein, zwei Paare mit gemeinsamen Eigenschaften gegenüberzustellen, RhoA/C einerseits und RhoB/D andererseits.
Die drei Rho-Isoformen A, B und C werden, induziert durch das Invasionssignal von Shigella, in einem Zeitraum von Minuten an die Bakterieneintrittsstelle rekrutiert, wo sie mit F‑Aktin kolokalisieren [3]. Die Translokation von RhoA an seine Wirkungsorte, unter anderem an Membranfältelungen, war bereits zuvor beschrieben worden [169]. Im Zusammenhang mit der Shigelleninvasion wurde jedoch ein völlig neuer Aspekt aufgedeckt: Verschiedene Isoformen weisen unterscheidbare Rekrutierungsmuster auf. RhoA akkumuliert in unmittelbarer Nähe der eindringenden Bakterien, während RhoB und RhoC im wesentlichen in die Spitzen der F‑Aktin-reichen, bakteriell induzierten, zellulären Protrusionen rekrutiert werden [3]. Überraschend war hier, daß RhoA und RhoC, die sich hinsichtlich ihrer Lokalisation in der nichtinfizierten Zelle und ihrer posttranslationalen Modifikation nicht unterscheiden ließen, durch ihr Translokationsverhalten unterscheidbar wurden. Dagegen weisen die Isoformen RhoB und RhoC, die verschieden lokalisiert sind und modifiziert werden [4, 5], lichtmikroskopisch nicht unterscheidbare Rekrutierungsmuster auf. Auf der Grundlage des Rekrutierungsverhaltens läßt sich RhoA somit nicht nur gegen RhoB, sondern zusätzlich auch gegen RhoC abgrenzen.
Die Vermutung liegt nahe, daß die Unterschiede hinsichtlich der Lokalisation in der nichtinfizierten Zelle auf die verschiedenen posttranslationalen Modifikationen der Isoformen zurückzuführen sind. Welche Eigenschaften der Isoformen erklären aber die unterschiedlichen differentiellen Rekrutierungsmuster von RhoA und RhoC? Es bot sich an, bei der Suche nach Determinanten der Rekrutierungsmuster von einer Analyse der Primärstruktur auszugehen.
Die Sequenzen von RhoA, RhoB und RhoC (Abb. 1-3) wurden Ende der Achtzigerjahre publiziert [187, 34]. RhoA und RhoC werden als 193 Aminosäuren lange Proteine synthetisiert; RhoB ist drei As länger. Zwischen As1 und 122 unterscheiden sich RhoA und RhoC nur in einer einzigen Aminosäure. Erweitert man den Bereich bis zur Position 180, besteht immer noch eine Übereinstimmung von 96%. Im selben Bereich beträgt die Homologie zwischen RhoA und RhoB 89%. Die Homologie nimmt zum C‑Terminus hin ab; die Mehrzahl der Unterschiede findet sich im C‑terminalen Sequenzdrittel einschließlich der CaaX-Gruppen.
Durch die vorangegangenen Untersuchungen von Birgit Bohm in unserem Labor war bereits bekannt, daß das Vorhandensein der CaaX-Region eine notwendige Bedingung für die Shigella-induzierte Rekrutierung von Rho in unserem System darstellt. Ebenso ergaben sich durch präliminäre Analysen eines Konstrukts (RhoACA, vgl. Tab. 2-12) mit herkömmlichen fluoreszenzmikroskopischen Techniken Hinweise auf eine wesentliche Rolle des prä-C‑terminalen Sequenzabschnitts As 181‑189 für die Determinierung des Rekrutierungsmusters, während die CaaX-Regionen von RhoA und RhoC keinen Einfluß auf das Rekrutierungsmuster hatten.
Ziel der vorliegenden Studie war es, den Einfluß der CaaX-Gruppe und prä-C‑terminaler Aminosäuren auf die Rekrutierung von Rho-Isoformen näher zu untersuchen und den Sequenzabschnitt einzugrenzen, welcher das Rekrutierungsmuster bestimmt. Darüber hinaus wurde der Frage nachgegangen, ob sich das Rekrutierungsphänomen auf die drei Isoformen RhoA, B und C beschränkt, oder ob auch andere, verwandte kleine GTPasen an die Bakterieneintrittsstelle transloziert werden. Zu diesem Zweck wurde hier das Rekrutierungsverhalten der kleinen GTPase RhoD [126], die den drei Isoformen A, B und C auf der Primärstrukturebene nur zu etwa 50% homolog ist (vgl. Abb. 1-4), erstmals untersucht. Eine Reihe von rho-Hybridkonstrukten wurde mit Hilfe PCR-vermittelter Mutagenese hergestellt, in Vektoren kloniert und im HeLa-Zell-Modell analysiert. HeLa Zellen wurden mit der Konstrukt-DNS transient transfiziert und mit invasiven S. flexneri SC301 infiziert. Nach Fixierung und Färbung wurden die exprimierten Konstrukte schließlich hinsichtlich ihres Verteilungsmusters in der Zelle untersucht. Dies erfolgte durch Markierung der mutierten Proteine mit fluoreszierenden Antikörpern, Aufnahme einer Z‑Serie digitaler Mikrofotografien mit definiertem Abstand der Fokussierungsebenen und nachfolgender Bearbeitung der Bilddaten mit dem epr-Dekonvolutionsalgorithmus [48].
E. coli Wirtsstämme mit den zu isolierenden Plasmiden (vgl. Tab. 3-5) wurden bei –70°C in 25% Glyzerin gelagert. Inokuliert wurde direkt in LB-Flüssigmedium (Fluka) mit Zusatz von 100 µg/ml Ampicillin. Die Kulturen (12 ml für Miniprep, 500 ml für Maxiprep) wuchsen über Nacht bei 37°C und unter aeroben Bedingungen in einem Schüttler.
Für eine DNS-Ausbeute bis zu 25 µg wurde das QIAprep Spin Miniprep Kit von QIAGEN verwendet. Die Bakterienflüssigkultur wurde zehn Minuten lang mit 3000 g bei Raumtemperatur zentrifugiert, das Sediment in einem RNAse enthaltenden Puffer resuspendiert. Die bakteriellen Zellen wurden alkalisch lysiert in 100 mM NaOH und 0,5% SDS (Endkonzentration). Nach Neutralisieren mit einem Puffer mit hoher Salzkonzentration und Abzentrifugieren ausgefällter Zellbestandteile bei 15000 g wurde die Plasmid-DNS selektiv an eine Silikagelmembran gebunden und konnte nach einem Waschschritt mit einem wenig Salz enthaltenden Puffer eluiert werden.
Größere DNS-Mengen (bis zu 800 µg) wurden mit dem QIAGEN Plasmid Maxi Kit erhalten.
Das Verfahren ist der Miniprep analog, allerdings wurde die Plasmid-DNS an einen Anionenaustauscher gebunden. Die Zentrifugationsschritte nach der Bakterienernte wurden in einer Ultrazentrifuge bei 80000 g und 4°C vorgenommen. Nach der Elution wurde die DNS mit Isopropanol präzipitiert, mit 70%‑igem Ethanol gewaschen und in 400 µl TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) gelöst.
Die Extraktion mit Phenol und Chloroform diente dazu, Nukleinsäurelösungen von Proteinbeimischungen zu reinigen [148]. 300-400 µl DNS-Lösung wurden in ein 1,5‑ml-Eppendorf-Röhrchen überführt. Kleinere Volumina wurden mit TE-Puffer (vgl. 2.1.3) aufgefüllt. Ein Volumen Phenol (pH 7,5-8,0; Roth) wurde hinzugefügt und durch zweiminütiges Schütteln (Vortexen) eine Emulsion hergestellt. Durch 15‑minütiges Zentrifugieren bei 4°C und 15000 g wurden die zwei Phasen wieder getrennt. Die wässrige Phase wurde in ein neues Reaktionsgefäß überpipettiert und die Extraktion zweimal mit einer Mischung von Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) wiederholt. 10‑minütiges Zentrifugieren war hier ausreichend. Ein letzter Extraktionsschritt wurde mit reinem Chloroform vorgenommen. Nach fünfminütigem Zentrifugieren wurde die wäßrige Phase mit der gereinigten DNS in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Unmittelbar darauf folgte immer eine Ethanolpräzipitation (2.1.5).
1/10 Volumen 3 M Natriumazetat (pH 5,2) und zwei Volumina eiskaltes, 100%‑iges Ethanol wurden zur DNS-Lösung pipettiert. Präzipitiert wurde über Nacht bei –20°C. Das Präzipitat wurde 15 min lang bei 15000 g und 4°C abzentrifugiert, der Überstand abgenommen und das DNS-Pellet zweimal mit 70%‑igem Ethanol gewaschen. Dadurch wurden Spuren von Phenol sowie Salze entfernt. Nach einem letzten Waschschritt mit 100%‑igem Ethanol wurde die DNS vorsichtig getrocknet und in einem geeigneten Volumen sterilen, deionisierten Wassers gelöst. Die Lagerung erfolgte bei –20°C (modifiziert nach [85]).
Die Konzentration von DNS-Lösungen wurde mit einem UV-Photometer (Pharmacia LKB Ultrospec III) durch Absorptionsmessung der 1:200 verdünnten Lösung bei 260 nm Wellenlänge ermittelt.
Konstrukte wurden in pUC19 kloniert und sequenziert. Um die Konstrukt-DNS in HeLa-Zellen zu exprimieren, wurde sie in den eukaryotischen Expressionsvektor pKC3 (Cold Spring Harbor Laboratory), der einen SV40 Promotor enthält, umkloniert. Auf beiden Plasmiden ist Ampicillinresistenz kodiert, was eine einfache Selektion von transformierten Wirtsbakterien ermöglicht. Klonierungsvektoren wurden ausgehend von den Plasmiden in Tab. 2-1 konstruiert.
DNS wurde mit Restriktionsenzymen von MBI Fermentas geschnitten. Benutzt wurden EcoRI, KpnI, PstI und XbaI (Konzentration jeweils 10 U/µl) in den vom Hersteller empfohlenen Puffern inklusive BSA und bei einer Inkubationstemperatur von 37°C. Das in den Vorratslösungen der Enzyme enthaltene Glyzerin kann in hoher Konzentration die Reaktion stören. Daher betrug das Ansatzvolumen immer mindestens das 20‑fache des Volumens der eingesetzten Vorratslösung. Die Enzymmenge wurde mit 1‑2 U/µg DNS berechnet. Nach mindestens vierfachem Überverdau (üblicherweise doppelte Enzymmenge und mindestens 2 h Reaktionszeit) wurde die Reaktion durch 20‑minütiges Erhitzen auf 65°C beendet; die Restriktionsenzyme wurden dabei inaktiviert.
Um eine Religation geschnittener Plasmide zu verhindern, wurden DNS-Enden durch Inkubation mit 0,05 U/pmol Alkalischer Phosphatase (CIAP, MBI Fermentas) dephosphoryliert. Dieser Schritt erfolgte im vom Hersteller mitgelieferten Puffer (0,1 M Tris-HCl, 0,1 M MgCl2, pH 8,0) oder direkt nach dem Schneiden mit Restriktionsenzymen im entsprechenden Restriktionspuffer. 3'‑überlappende Enden wurden 15 min bei 37°C und 15 min bei 56°C inkubiert, 5'‑überlappende Enden 30 min bei 37°C. In beiden Fällen wurde(n) der (die) Inkubationsschritt(e) nach erneuter Enzymzugabe einmal wiederholt.
Benutzt wurde der Elektrophoreseapparat Mupid‑2 von Eurogentec mit 1,5%‑igen Gelen in 0,5x TAE Laufpuffer (20 mM Trisacetat; 0,5 mM EDTA). Agarosepulver wurde abgewogen und in 0,5x TAE durch Erhitzen im Mikrowellenherd gelöst, die Lösung auf 55°C abgekühlt und in Förmchen mit den Maßen 107 x 60 x 8 mm3 bzw. 52 x 60 x 8 mm3 gegossen (Gel Maker Set EM‑2). Ein Kamm wurde eingesetzt, um Taschen zu bilden, in welche später die zu untersuchende DNS-Lösung pipettiert werden konnte. Die Volumina der Taschen wurden nach Bedarf zwischen etwa 18 µl und 160 µl variiert. Die einzusetzende DNS-Lösung wurde wie in Tab. 2-2 angegeben eingestellt:
Das polymerisierte Gel wurde in den Elektrophoreseapparat in 0,5x TAE gelegt. Anschließend wurden die DNS-Lösungen aufgetragen. Nach Anlegen einer Gleichspannung von 100 V wanderten die DNS-Moleküle und die Farbstoffe des loading buffer zur Anode. Anhand der Lage der Bromphenol-Farbstoffbande, die im 1,5%‑igen Gel mit der gleichen Geschwindigkeit wanderte wie ein DNS-Fragment von etwa 400 bp Länge, konnte die geeignete Laufzeit der Elektrophorese bestimmt werden. Nachdem das Gel 10‑20 min in Ethidiumbromidlösung (1 µg/ml, Merck) gefärbt worden war, ließen sich die DNS-Banden im UV-Licht betrachten. Die Dokumentation des Ergebnisses erfolgte durch Fotografie mit einer CCD-Kamera.
Ein Agarosegel mit zwei kleinen und einer fünf- bis zehnmal so großen Tasche wurde vorbereitet. Die zu trennende DNS-Lösung wurde auf eine kleine und die große Tasche aufgeteilt; die zweite kleine Tasche war für die 1 kb-DNS-Leiter bestimmt. Nach der elektrophoretischen Trennung der DNS-Fragmente wurde das Gel längs zur Wanderungsrichtung in zwei Teile geschnitten. Nur das Gelfragment mit den kleinen Taschen wurde in Ethidiumbromid gefärbt. Unter UV-Beleuchtung konnte die Position der interessierenden Bande auf dem gefärbten Gel erkannt und markiert werden. Nachdem die beiden Gelfragmente wieder zusammengesetzt worden waren, konnte auf die Lage der entsprechenden Bande im ungefärbten Gel geschlossen werden. Das korrespondierende Gelareal wurde ausgeschnitten. Der verbleibende Gelrahmen wurde in Ethidiumbromid gefärbt und die Präzision des Ausschnitts im UV-Licht kontrolliert.
Einzelne DNS-Banden aus Agarosegelen wurden mit dem QIAquick-Kit von QIAGEN extrahiert: Das ausgeschnittene Gelstück mit der zu extrahierenden DNS-Bande wurde in dem mitgelieferten, auf einen pH <7,5 eingestellten Puffer mit chaotropen Salzen bei 50°C aufgelöst. Die DNS wurde an eine Silikagelmatrix gebunden (vgl. 2.1.2 Miniprep), mit einem ethanolhaltigen Puffer gewaschen und mit deionisiertem Wasser oder dem mitgelieferten Elutionspuffer eluiert.
Die PCR diente als Werkzeug, um gezielt Mutationen in DNS-Sequenzen einzuführen. Es fanden abhängig von der Anforderung an die Güte des PCR-Produkts zwei verschiedene Enzyme Verwendung. Taq-DNS-Polymerase (MBI Fermentas) wird aus Thermus aquaticus gewonnen und besitzt keine 3'‑Exonukleaseaktivität zur Korrektur von Replikationsfehlern. Pwo-DNS-Polymerase (SAWADY) ist die rekombinant hergestellte Form einer Polymerase aus Pyrococcus woesei. Sie erreicht durch ihre 3'‑Exonukleaseaktivität (proofreading) eine nach Herstellerangaben zehnmal höhere Replikationstreue als Taq-Polymerase. Folgende Bedingungen wurden für die PCRs eingestellt (Tab. 2-3 und 2-4):
Die Reaktionen wurden auf einer PCR-Maschine von Perkin Elmer Cetus durchgeführt (DNA Thermal Cycler 480).
Oligonukleotide wurden auf Bestellung von den Firmen EUROGENTEC oder MWG (nur
Nr. 25 und Nr. 79) synthetisiert (Tab. 2-5). Oligo-Paare wurden als PCR-Primer benötigt. Eine Ausnahme bildeten lediglich die Oligos Nr. 68/69, die direkt nach Hybridisierung in einen geeigneten Vektor kloniert werden konnten. Die PCR-Primer wurden alle nach dem gleichen Muster aufgebaut: Am 3'‑Ende befindet sich eine Sequenz von Nukleotiden, die zum 3'‑Ende eines Strangs der PCR-Matrize vollständig oder größtenteils komplementär ist. Durch einzelne „unpassende“, mutierte Basen konnten in das PCR-Produkt gezielt Mutationen eingeführt werden. Richtung 5'‑Ende wurde die palindromische Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym vorangestellt (relevante Erkennungssequenzen sind in Tab. 2-5 fett gedruckt). Damit sich das Restriktionsenzym an die DNS anlagern konnte, wurden vor der Restriktionssequenz nochmals einige Nukleotide angefügt.
Ausgangsbasis für die PCR-vermittelte Herstellung neuer DNS-Moleküle waren Konstrukte von RhoA, B, C und D, die im Labor bereits vorhanden waren (Tab. 2-6).
Die komplementären Oligonukleotide Nr. 68 und 69 wurden zu Doppelsträngen hybridisiert (Tab. 2-7). Der Reaktionsansatz wurde mit 70 µl Mineralöl überschichtet, zur Denaturierung der DNS 10 min auf 98°C erhitzt, zur Ausbildung komplementärer Doppelstränge langsam auf 65°C gebracht und schließlich in Eiswasser forciert abgekühlt.
Linearisierte, an den Enden dephosphorylierte Vektoren und passende, nicht dephosphorylierte Inserts wurden mit T4-DNS-Ligase (MBI Fermentas) im mitgelieferten Reaktionspuffer zu zirkulären Plasmiden verbunden (Tab. 2-8) und anschließend zur Transformation von kompetenten Wirtsbakterien eingesetzt.
Um das für die Ligation ideale Verhältnis von Vektor und Insert zu erhalten, wurde die Insertmenge in fünf separaten Ansätzen variiert. Drei Negativkontrollen wurden bei jedem Experiment mit angesetzt: (a) ohne DNS, (b) mit Insert aber ohne Vektor, (c) mit Vektor aber ohne Insert. Mit dem ersten Kontrollansatz konnte nach der Transformation verifiziert werden, daß nichttransformierte Wirtsbakterien durch das in den Kulturplatten enthaltene Ampicillin ausselektiert wurden. Mit dem zweiten konnte beurteilt werden, ob das Insert ausreichen gut isoliert war (Insertkontrolle). Im dritten Ansatz wurde kontrolliert, ob Religation des Vektors mit seinem ursprünglichen Insert stattfand, bzw. ob ungeschnittener Vektor in der Präparation enthalten war (Vektorkontrolle). Das ursprüngliche Insert war im Ansatz mit enthalten, wenn die Plasmidfragmente nach Restriktion lediglich durch Dephosphorylierung voneinander getrennt wurden. Die Ansätze wurden bei 17°C mindestens 1 h lang inkubiert.
Kompetente Bakterien können zirkuläre DNS (Plasmide) aus der Umgebung aufnehmen.
E. coli (DH5
α, TG1 oder ZK501) wurden in 50 ml LB inokuliert und über Nacht bei 37°C unter Schütteln kultiviert. Von dieser Kultur wurden 4 ml in 400 ml LB verdünnt und weiter bebrütet. Nach Erreichen der frühen log-Phase (OD590 = 0,375; optische Dichte bei 590 nm Wellenlänge, gemessen mit SPECTRONIC 20+-Spectrophotometer) wurde die Bakteriensuspension auf 50‑ml-Röhrchen verteilt und 5-10 min auf Eis stehen gelassen. Die Bakterien wurden 7 min bei 1600 g und 4°C zentrifugiert und in je 10 ml eiskalter CaCl2-Lösung (60 mM CaCl2, 10 mM HEPES (pH 7,0), 15% v/v Glyzerin) resuspendiert. Nach fünfminütigem Zentrifugieren bei 1100 g wurden die Sedimente nochmals in je 10 ml eiskalter CaCl2-Lösung aufgenommen und 30 min auf Eis gestellt. Ein letztes Mal wurde fünf Minuten lang bei 1100 g zentrifugiert, die sedimentierten Bakterien in je 2 ml eiskalter CaCl2-Lösung resuspendiert, zu jeweils 1 ml aliquotiert und bei –70°C tiefgefroren (nach [15]).
In 1,5 ml Eppendorf-Hütchen wurde zu je 100 µl Bakteriensuspension (kompetente E. coliDH5 α, TG1 oder ZK501) 1 µl gereinigte Plasmidlösung (entsprechend ca. 0,2 µg DNS) bzw. ein kompletter Ligationsansatz (20 µl ) gegeben. Nach zwanzigminütiger Lagerung auf Eis wurden die Bakterien einem Hitzeschock ausgesetzt, indem die Reaktionsgefäße 2 min in ein 42°C warmes Wasserbad gestellt wurden. Durch diese Behandlung wurden einige Bakterien mit dem jeweiligen Plasmid transformiert. Zu den Bakterien wurden rasch 900 µl LB dazupipettiert. Nach einstündiger Inkubation bei 37°C wurde die Bakteriensuspension 2 min bei 5000 g zentrifugiert, das Sediment in 70 µl LB resuspendiert und auf LB/Ampicillin-Agarplatten (1,5% Agar, 100 µg/ml Ampicillin) ausplattiert.
Ausgehend von den mit pUC19 und pKC3-Plasmiden transformierten und damit ampicillinresistenten Bakterien bildeten sich bei 37°C innerhalb von 20 h sichtbare Einzelkolonien. Negativkontrollen sind in 2.2.11 beschrieben. Auf allen drei Kontrollplatten sollten keine Kolonien erscheinen. Einzelne Kolonien auf der Insert- und Vektorkontrollplatte wurden toleriert, wenn die Anzahl relativ niedrig war (<1/100 der im jeweiligen Experiment maximalen Kolonienzahl). Erst durch Sequenzierung wurde sicher bestätigt, daß das richtige Insert-Vektor-Paar vorlag.
Sollte der transformierte Stamm asserviert werden, wurden einzelne Kolonien zur verlässlichen Abtrennung von ampicillinsensiblen Bakterien erneut auf Ampicillinplatten ausgestrichen und bei 37°C inkubiert. Hierdurch gewonnene Einzelkolonien wurden in LB-Flüssigmedium mit 100 µg/ml Ampicillin kultiviert und nach Zugabe von 25% (v/v) Glyzerin bei –70°C eingefroren.
Die durch PCR gewonnenen und in pUC19 klonierten DNS-Konstrukte wurden nach der Sanger-Methode [149] sequenziert, um ihre Fehlerfreiheit zu kontrollieren (Übereinstimmung mit Matrize und Primern). Benutzt wurde das „Thermo Sequenase“ Sequenzierkit mit didesoxy-NTPs und 7-deaza-dGTP (Amersham Pharmacia Biotech). Am 5'‑Ende mit dem Fluoreszenzfarbstoff IRD 800 markierte Primer stammten von MWG (Tab. 2-9).
Reaktionsansätze wurden nach Herstellerangaben pipettiert. Um die Sequenz in einer Richtung zu lesen, waren vier Ansätze notwendig, die jeweils ein anderes ddNTP enthielten. Da Strang und Gegenstrang gelesen wurden, ergaben sich insgesamt acht Ansätze. Die in Tab. 2-10 angegebenen Reaktionsbedingungen wurden für jeden Ansatz hergestellt. Nach Ende der Reaktion wurden zu jeder Probe 6 µl loading buffer (98% deionisiertes Formamid; 10 mM EDTA pH 8,0; 0,025% Xylenzyanol FF; 0,025% Bromphenolblau [148]) pipettiert.
Sequenziert wurde mit einem halbautomatischen Sequenzierer von LICOR (DNA Sequencer model 4000) auf einem Long Ranger Gel (FMC) (Tab. 2-11). Das Gel wurde zwischen zwei LICOR Glasplatten (255 mm x 410 mm) mit einem Abstand von 0,25 mm gegossen, eine bis eineinhalb Stunden bei Raumtemperatur zum Polymerisieren stehen gelassen, in den Sequenzierapparat eingebaut und vor Auftragen der Proben auf 50°C vorgewärmt. Die Parameter am Apparat wurden nach Herstellerangaben eingestellt. Nachdem der Gellauf beendet war, wurden die Sequenzen halbautomatisch gelesen. Jede Base wurde nochmals manuell nachkontrolliert. Die vorwärts und rückwärts gelesenen Sequenzen überschnitten sich in einem großen Bereich (56% bei RhoA V14 bis 100% bei RhoD und RhoDDA), so daß hier eine Kontrolle möglich war.
Um DNS- und Aminosäuresequenzen untereinander zu vergleichen und zu analysieren, wurde das über Internet und Telnet zugängliche Computerprogramm HUSAR (
Verwendet wurde der Stamm SC301 [40] von S. flexneri Serotyp 5, der bei –70°C in 25% Glyzerin gelagert wurde. SC301 besitzt das 140 MDa-Virulenzplasmid pWR100 mit eingefügtem Kanamycinresistenz-Transposon Tn5 (=pWR110) [153] sowie das Plasmid pIL22, welches für das afimbrische Adhäsin AFA I von E. coli [179] und für Ampicillinresistenz kodiert. AFA I erhöht durch die verbesserte Adhärenz der Bakterien an die Zellen die Infektionseffizienz [40].
SC 301 wurde aus dem Glyzerin-Vorrat in 20 ml TSB (Fluka) inokuliert und wuchs über Nacht bei 37°C, unter aeroben Bedingungen und ständigem Schütteln. Dem Medium wurden 50 µg/ml Kanamycin (SIGMA) und 100 µg/ml Ampicillin (Fluka) zugesetzt. Um Bakterien in der logarithmischen Wachstumsphase zu erhalten, wurden die Kulturen 1‑3 h vor dem Experiment 1:20 bis 1:50 mit TSB verdünnt, nochmals bei 37°C inkubiert und nach Erreichen einer OD600 zwischen 0,3 und 0,5 geerntet (optische Dichte bei 600 nm Wellenlänge, gemessen mit SPECTRONIC 20+-Spectrophotometer; OD600 1,0 entspricht ca. 4 · 108 Bakterien ml-1). Ein der benötigten Bakterienmenge entsprechendes Volumen der Flüssigkultur wurde zentrifugiert (5000 g, 5 min) und der Überstand verworfen.
HeLa-Zellen wurden in 600 ml Kunststoff-Zellkulturflaschen (Nunclon) unter sterilen Bedingungen angezüchtet. Alle Arbeitsschritte fanden in einer Sterilbox (antair BSK, Steril) statt. Als Kulturmedium diente MEM (Gibco) mit einem Zusatz von 10% FCS (Gibco; Komplement inaktiviert durch Erhitzen auf 56°C während 20 min). Die Flaschen wurden mit 30 ml Zellsuspension befüllt; die Zellen sedimentierten auf den Boden der Flaschen.
In einer mit 10% CO2 angereicherten Atmosphäre vermehrten sich die Zellen bei 37°C und bildeten auf dem Flaschenboden innerhalb weniger Tage einen konfluenten Zellrasen. Bei der Ernte wurde das Medium abgesaugt, die Zellen mit Trypsin-EDTA-Lösung (0,25% Trypsin (Gibco), 0,5 mM EDTA, 140 mM NaCl, 3 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,5 KH2PO4) vom Flaschenboden abgelöst, in MEM suspendiert und 4 min lang bei 125 g abzentrifugiert. Nach vollständiger Suspension des Zellsediments in 2‑4 ml MEM konnte mit Hilfe einer Zählkammer (Neubauer) die Zellkonzentration bestimmt werden. Davon ausgehend konnten mit MEM (+10% FCS) Suspensionen mit einer definierten Zelldichte hergestellt werden. Die Zellinie wurde fortgeführt, indem ein Teil der Zellen in frische Kulturflaschen eingesät wurde.
Für die Durchführung der Experimente erfolgte die Aussaat in Kunststoffkulturplatten (Cellstar, Greiner Labortechnik) mit sechs zylindrischen Vertiefungen von 35 mm Durchmesser. Jede Vertiefung („Loch“) wurde mit 2 ml Medium bzw. Zellsuspension beschickt (nach [95]).
Nach (2.4.1) kultivierte HeLa-Zellen wurden in einer Dichte von etwa 200/mm2 (1 · 105 ml-1, 2 ml/Loch) in Zellkulturplatten auf sterilen, entfetteten Deckgläschen (22 mm x 22 mm) ausgesät und 24 h unter den oben beschriebenen Bedingungen inkubiert. Zwei bis vier Stunden vor Zugabe der zu exprimierenden DNS wurde das Medium erneuert.
Für die Infektion von HeLa-Zellen wurden die Shigellen in MEM resuspendiert, wobei eine Bakteriendichte von 6 · 107 ml-1 eingestellt wurde. Das Medium der HeLa-Zellen wurde gegen die Bakteriensuspension ausgetauscht. Die AFA I exprimierenden Bakterien sedimentierten innerhalb von 45 min und hefteten sich an die Zellen. Weitere Interaktionen zwischen Zellen und Shigellen während dieses Schritts wurden durch Kühlung der Kulturplatten auf Eiswasser verhindert. Die Multiplizität der Infektion betrug etwa 50 Bakterien pro Zelle. Zur Infektion flottierten die Zellkulturplatten auf 39,6°C warmem Wasser. Um eine Momentaufnahme des Invasionsprozesses zu erhalten, wurde dieser nach 20 min durch Zellfixation mit Paraformaldehyd unterbrochen (2.7.1).
Nach (2.6.1) infizierte HeLa-Zellen wurden viermal mit 1x PBS gewaschen um nicht adhärente Bakterien zu entfernen. Während 20 min wurde mit 3,7 % Paraformaldehyd in PBS (w/v) fixiert. Nach erneutem Waschen wurden die Zellen mindestens 5 min lang mit 0,1 M Glyzin in PBS inkubiert um freie Aldehydgruppen abzusättigen und damit unspezifische Bindung der Antikörper zu verringern. Die Permeabilisierung der Zellen erfolgte durch Einwirkung von 0,2% Triton X‑100 (Sigma) in PBS während 5 min. Abschließend wurde erneut mit PBS gewaschen.
40 µl der in PBS verdünnten Antikörper- bzw. Farbstofflösung (Tab. 2-13) wurden auf ein Stück Parafilm getropft, und das Deckgläschen mit den HeLa-Zellen wurde mit der bewachsenen Seite nach unten auf den Tropfen gelegt. Die Präparate wurden mindestens 20 min in der Primärantikörperlösung inkubiert und vorsichtig gewaschen. Daran schloß sich die Färbung mit einem fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper und weiteren Farbstoffen an (standardmäßig: Alexa-Phalloidin zur spezifischen Färbung von F‑Aktin, in einzelnen Experimenten auch DAPI zur Markierung von bakterieller und zellulärer DNS). Phalloidin (Tab. 2-13), als methanolische Lösung gelagert, wurde getrocknet, bevor es in PBS aufgenommen wurde. Nach einem weiteren Waschschritt wurden die Präparate in Mowiol [69] eingedeckt, 10 min bei 37°C inkubiert und dann bei Dunkelheit und 4°C gelagert.
Benutzt wurde ein konventionelles inverses Fluoreszenzmikroskop (Axiovert 135, ZEISS) mit einer 50W Quecksilberdampf-Kurzbogenlampe (HBO 50) und einem 10x Binokular. Objektive und Filtersätze sind in Tab. 2-14 und 2-15 angegeben.
Das Mikroskop war auf einem Erschütterungen dämpfenden Tisch (Technical Manufacturing Corporation, Micro‑g Modell 63-530), der mit einem Kompressor (JUN-AIR, Modell Troll) betrieben wurde, montiert.
Experimentelle Ergebnisse wurden mit Hilfe einer Peltier-gekühlten CCD-Kamera mit on-chip-Integration sowie einer Mutech frame-grabber-Karte dokumentiert (Photonic Science CoolView). Die Kamera war mit einem 1,0 C‑mount Adapter (ZEISS) an das Mikroskop angeschlossen. Es wurden 8‑bit-Schwarzweißbilder (256 mögliche Helligkeitsstufen) mit einer Auflösung von 768 x 568 Pixel erhalten.
Das 100er Objektiv war auf einen Piezomotor (Physik Instrumente, Typ P-721.10) montiert, der über einen Servo positionsgesteuert wurde (E‑662.LR LVPZT Position Servo Controller, Physik Instrumente). Damit konnte das Objektiv auf der vertikalen Achse in definierte Positionen gebracht werden, was die Aufnahme einer Serie von Objektebenen mit bestimmten Abständen ermöglichte („stack“, „Z‑Serie“). Standardmäßig wurden Stapel von 20 Ebenen mit je 0,4 µm Abstand aufgenommen. Um deckungsgleiche Fotografien mit verschiedenen Wellenlängen zu machen, wurde die gleiche Serie von optischen Schnitten am selben Bildausschnitt mit unterschiedlichen Filtersätzen wiederholt.
Mit dem 40er Objektiv wurden lediglich Aufnahmen in einer Ebene gemacht, ebenfalls mit verschiedenen Filtersätzen für denselben Ausschnitt.
Die CCD-Kamera war an einen Rechner angeschlossen, der mit der Bildbearbeitungssoftware MetaMorph Imaging System 3.0 (Universal Imaging Corporation) ausgestattet war. Die Bilderstapel wurden auf quadratische Ausschnitte im Format 360 x 360 Pixel reduziert, von den mit dem 40er Objektiv fotografierten Einzelebenen wurden Ausschnitte von 342 x 342 Pixel ausgewählt. Der Helligkeitsumfang von Bildern, die die 256 Helligkeitsstufen nicht ganz ausfüllten, wurde auf die volle Breite gespreizt. Durch diesen Schritt wurde zwar die Helligkeitsabstufung vergröbert, der Kontrast aber verstärkt. Die Schwarzweißbilder wurden entsprechend den Fluoreszenzfarbstoffen mit Falschfarben digital eingefärbt.
Die ausgewählten Ausschnitte der Serien von Bildebenen wurden mit dem von Fay et al.entwickelten (US Patent #5047968) Dekonvolutionsalgorithmus (epr, Scanalytics) bearbeitet, der auf folgendem Prinzip basiert [48]: Photonen aus einer idealisiert punktförmigen Lichtquelle werden in einem optischen System (hier: Mikroskop) nicht nur in der optimalen Brennebene sichtbar, sondern auch – unscharf – darüber und darunter. Dieses Streulicht reduziert Kontrast und Bildschärfe und kann Strukturen sogar verdecken. Für das benutzte optische System kann eine sogenannte Point-spread-Funktion bestimmt werden, die beschreibt, wie das von einem Punkt ausgehende Licht im benutzten optischen System außerhalb der optimalen Brennebene gestreut wird. Die Funktion wurde charakterisiert, indem von fluoreszierenden Kügelchen (entsprechend den benutzten Farbstoffen) mit einem Durchmesser von 0,1 µm (Molecular Probes) Z‑Serien von Aufnahmen angefertigt wurden. Hierbei wurden die gleichen Parameter (Anzahl und Abstand der Ebenen) eingestellt wie bei den zu bearbeitenden Bilderstapeln. Auf einem handelsüblichen Rechner konnten dann mit der epr-Software für eine Z‑Serie von Aufnahmen eines Objekts gestreute Photonen wieder ihrem Ursprungspunkt zugeordnet werden. Dabei liegt die Annahme zugrunde, daß sich alles Licht im Präparat so ausbreitet wie von der empirischen Point-spread-Funktion beschrieben. Das nach Korrektur der durch das optische System eingeführten Unschärfe resultierende Bild ist den „wahren“ Strukturverhältnissen näher. Es ist kontrastreicher und zeigt Strukturen, die vorher nicht sichtbar waren. Folgende Parameter wurden bei der Bearbeitung mit epr eingestellt: Konvergenz: 2,5 · 10-5; maximale Anzahl der Iterationen: 50; smoothing: 13; Skalierungsfaktor: 1,0.
Von den bearbeiteten Bildstapeln wurden einzelne Ebenen ausgewählt. Mit verschiedenen Filtersätzen aufgenommene Bilder von identischen Ebenen wurden übereinander gelegt, um die Lagebeziehung der einzelnen Bildkomponenten zu prüfen. Schließlich wurden diese Einzelebenen auf die willkürlich gewählte Standardgröße von 342 x 342 Pixel gebracht.
Um Sequenzabschnitte einzugrenzen, die das differentielle Rekrutierungsmuster von Rho-Isoformen während der Zellinvasion durch Shigella determinieren, wurde eine Reihe von rho-Hybridkonstrukten mit Hilfe PCR-vermittelter Mutagenese hergestellt, in Vektoren kloniert und im HeLa-Zell-Modell analysiert. Bei den exprimierten Hybridkonstrukten war ein kurzer Abschnitt der Aminosäuresequenz durch den entsprechenden Bereich einer anderen Isoform ersetzt. Damit konnte der Einfluß dieser Abschnitte auf das Rekrutierungsverhalten untersucht werden. Durch einen N‑terminal angebrachten vsv-Peptid-tag wurde eine einfache Markierung mit antikörpergekoppelten Fluoreszenzfarbstoffen ermöglicht. An den beiden Enden jedes Konstrukts und zwischen rho-Sequenz und vsv-tag-Sequenz wurden Schnittstellen für definierte Restriktionsenzyme eingefügt.
HeLa Zellen wurden mit rho-Konstrukt-DNS transient transfiziert und fixiert. Das exprimierte Konstrukt sowie F-Aktin wurden spezifisch angefärbt, um die Wirkung der Konstrukte auf das Aktinzytoskelett zu beobachten. In weiteren Experimenten wurden die Zellen zusätzlich mit S. flexneri SC301 infiziert. Nach Fixierung und Färbung wurde so eine Momentaufnahme des Invasionsprozesses erhalten. Die mutierten Rho-Proteine konnten dann hinsichtlich ihres Verteilungsmusters in der Zelle untersucht werden.
Die Molekülregionen, die variiert werden sollten, befanden sich nahe am 5'‑ oder 3'‑Ende der rho-DNS (Kodons 14, 19, sowie die letzten 4 (RhoB,D) bzw. 13 (RhoA, C) Kodons). Daher ließen sich Mutationen durch PCR mit modifizierten Oligonukleotiden vergleichsweise einfach einführen. Verwendet wurden Pwo-Polymerase, die Oligonukleotide aus Tab. 2-5, sowie DNS-Matrizen aus Tab. 2-6. Die Reaktionsbedingungen wurden zuvor unter Verwendung der preisgünstigeren Taq-Polymerase optimiert. Mit Hilfe der Oligos wurde die rho-Sequenz auch mit Schnittstellen für Restriktionsenzyme versehen.
Die Matrizenplasmide wurden mit dem Miniprep-Kit aus E. coli-Wirtsstämmen präpariert und durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolpräzipitation gereinigt.
Benutzt wurden die Matrizen Temp1-4, sowie alle Oligos außer Nr. 65-69. Alle 5'-Primer enthielten eine KpnI-Schnittstelle, alle 3'-Primer eine PstI-Schnittstelle. (Schema: Abb. 3-1)
Die PCRs zur Herstellung der einzelnen Konstrukte wurden nach Tab. 2-4 durchgeführt. Abweichungen vom Standardprotokoll sind in Tab. 3-1 aufgeführt.
Für die PCR wurden die Oligos 65-67 sowie die Matrize Temp5 verwendet. Alle 5'‑Primer enthielten eine EcoRI-Schnittstelle, alle 3'‑Primer eine XbaI-Schnittstelle (Schema: Abb. 3-2). Für das Konstrukt RhoD wurden lediglich Schnittstellen angefügt, die Sequenz blieb ansonsten unverändert. Reaktionsbedingungen für die RhoD-Konstrukt-PCRs sind in Tab. 2-4 und 3-2 angegeben.
Die durch die PCR gewonnenen, veränderten rho-DNS-Moleküle wurden zunächst in den Standardvektor pUC19, von dem die vollständige Sequenz bekannt ist, kloniert und sequenziert. Zur Expression in HeLa-Zellen wurden die Konstrukte dann in den eukaryotischen Expressionsvektor pKC3 umkloniert. Die Konstrukte wurden nicht direkt, d.h. ohne den Umweg über pUC19, in pKC3 kloniert, weil die bei den RhoA/B/C-Konstrukten zwischen vsv-tag und rho-Sequenz angebrachte Schnittstelle KpnI in pKC3 außerhalb der Klonierungsstelle noch einmal vorkommt.
Das pUC19-Plasmid „P1“ (Tab. 2-1) mit dem Insert „EcoRI – vsv – KpnI – rhoA 1‑193 – Stop – PstI“ wurde mit Hilfe des Miniprep-Kits präpariert. Die DNS wurde dreimal mit KpnI und PstI geschnitten und dephosphoryliert, um eine Religation der Fragmente zu verhindern. Nach jedem dieser drei Zyklen wurde die DNS mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. So ergab sich ein für die PCR-Produkte geeigneter Klonierungsvektor, mit dem gleichzeitig N‑terminal die Nukleinsäuresequenz für den vsv-Peptid-tag angefügt werden konnte. Der Vektor wird im folgenden als V1 bezeichnet (Abb. 3-3).
Das Plasmid „P2“ (Tab. 2-1) wurde zweimal mit EcoRI und PstI geschnitten, an den Enden dephosphoryliert und jeweils gereinigt. In den resultierenden offenen Vektor V2 (Abb. 3-4) konnten die kompletten Konstrukte einschließlich des vsv-tag kloniert werden.
Ein „leerer“ pUC19 Vektor (Plasmid P3, Tab. 2-1) wurde mit dem Miniprep-Kit präpariert, zweimal mit EcoRI und XbaI geschnitten und dephosphoryliert. Nach jedem Reaktionszyklus wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Es ergab sich ein für die auf rhoD basierenden PCR-Produkte geeigneter Klonierungsvektor, ohne vsv-Peptid-tag. Er erhielt die Bezeichnung V3 (Abb. 3-5).
Um die rhoD-Sequenzen mit dem vsv-Peptid-tag zu versehen, wurde ein pKC3-Vektor entsprechend vorbereitet: Ein pKC3-Plasmid mit dem Insert EcoRI – Sendai-tag – KpnI – rhoB – XbaI wurde mit EcoRI und PstI geschnitten. Dies ergab drei Fragmente, weil rhoB eine interne PstI-Schnittstelle enthält. Da ein nicht phosphoryliertes DNS-Molekül mit dem Vektor ligiert werden sollte, durften die Enden der Vektor-DNS nicht dephosphoryliert werden. Deshalb wurde das Vektorfragment über ein Agarosegel von den beiden kleinen Insertfragmenten isoliert, aus dem Gel extrahiert und durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolpräzipitation gereinigt.
Die Oligos 68 und 69 wurden zu folgendem DNS-Doppelstrang hybridisiert:
Dieses Oligo-Insert wurde mit dem präparierten pKC3-Vektor ligiert und zur Transformation von E. coli DH5 α eingesetzt. Am 5'‑Ende des Inserts war eine unvollständige, offene EcoRI-Schnittstelle angebracht, die eine Ligation mit dem EcoRI-geschnittenen Vektor zwar ermöglichte, danach aber nicht mehr von EcoRI erkannt werden konnte. Somit wurde die andere, im Insert nach dem vsv-tag angebrachte, EcoRI-Sequenz zur einzigen EcoRI-Schnittstelle. Zwischen die EcoRI- und die XbaI-Schnittstelle des pKC3-Plasmids konnten nun die modifizierten rhoD-Sequenzen kloniert werden. Das Plasmid wurde zweimal mit EcoRI und XbaI geschnitten und an den Enden dephosphoryliert. Es erhielt die Bezeichnung V4 (Abb. 3-6).
Um die DNS aus dem PCR-Ansatz in möglichst reiner Form zu erhalten, wurde zunächst eine Phenol/Chloroform-Extraktion mit anschließender Ethanolpräzipitation durchgeführt. Darauf wurden die PCR-Produkte von den Matrizenplasmiden elektrophoretisch getrennt. Um eine gleichmäßige Wanderungsgeschwindigkeit der Plasmide zu erreichen, wurden sie zuvor mit PstI geschnitten und damit linearisiert. Dadurch wurde gleichzeitig je ein Ende der PCR-Produkte für die Klonierung präpariert. Die Banden mit den PCR-Produkten wurden aus dem Gel ausgeschnitten, und die DNS wurde extrahiert. Durch Schneiden der DNS mit KpnI wurde auch das jeweils andere Ende der PCR-Produkte zum Klonieren in den pUC19-Vektor (V1) vorbereitet.
Die PCR-Produkte wurden mit dem offenen Vektor V1 ligiert (Abb. 3-7), und die resultierenden Plasmide wurden zur Transformation von kompetenten E. coli DH5 α eingesetzt. Die transformierten Stämme wurden asserviert und bei –80°C gelagert.
Um die PCR-Produkte auf eventuelle Replikationsfehler zu überprüfen, wurden die in pUC19 klonierten DNS-Konstrukte einschließlich des vsv-tag sequenziert und mit den ursprünglichen rho-Sequenzen sowie den verwendeten Primern verglichen. Alle Konstrukte waren fehlerfrei.
Um die kompletten vsv-Rho-Konstrukte in HeLa-Zellen exprimieren zu können, wurde die DNS in den eukaryotischen Expressionsvektor pKC3 umkloniert. Die pUC19-Plasmide mit den rho-Sequenzen wurden aus dem transformierten Wirtsstamm E. coli DH5 α präpariert und mit EcoRI und PstI geschnitten. Die Inserts wurden vom pUC19-Vektor elektrophoretisch getrennt, mit Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolpräzipitation gereinigt und mit dem offenen pKC3-Vektor V2 ligiert (Abb. 3-8). Mit den kompletten Plasmiden wurden kompetente E. coliDH5 α transformiert. Die transformierten Stämme wurden bei –80°C eingefroren.
Es wurde analog zu Abschnnitt 3.3 verfahren. Im folgenden wird daher nur auf Besonderheiten eingegangen.
Die mit den Restriktionsenzymen EcoRI und XbaI geschnittenen PCR-Produkte wurden mit dem offenen Vektor V3 ligiert; die resultierenden Plasmide (Abb. 3-9) wurden zur Transformation von kompetenten E. coli ZK501 eingesetzt. Die Verwendung dieses Stamms erwies sich als notwendig, da sich auf dem nichtkodierenden Strang der rhoD-Konstrukte am Übergang zur XbaI-Schnittstelle die Dam-sensitive Sequenz 5'‑GATC‑3' ergab. Die Dam-Methylase erkennt dieses Sequenzmotiv spezifisch und modifiziert die DNS an dieser Stelle durch Methylierung von Adenin [57, 148]. In dam-positiven Stämmen wie DH5 α wird dadurch die XbaI-Erkennungssequenz TCTAGA für das Restriktionsenzym unkenntlich, und das Molekül kann an dieser Stelle nicht geschnitten werden. ZK501 ist dagegen dam-negativ. Die transformierten Stämme wurden asserviert und bei —80°C gelagert.
Die in pUC19 klonierten auf rhoD basierenden DNS-Konstrukte wurden ebenfalls zur Kontrolle sequenziert. Kodon 27 von rhoD wich von der publizierten Sequenz [126] in einer Base ab. Die publizierte Sequenz ist „GGG“ (Glyzin), während die in dieser Studie gefundene Sequenz „GTG“ (Valin) lautet. Dieser Unterschied zeigte sich beim Sequenzieren in beiden Richtungen und bei beiden RhoD-Konstrukten (RhoD und RhoDDA).
Die pUC19-Plasmide mit den von rhoD abgeleiteten Konstrukten wurden präpariert und mit den Restriktionsenzymen EcoRI und XbaI geschnitten. Die Inserts wurden vom pUC19-Vektor elektrophoretisch getrennt, gereinigt und mit dem offenen Vektor ligiert. Somit wurden vollständige Konstrukte mit vsv-tag erhalten, die in HeLa-Zellen exprimiert werden konnten (Abb. 3-10).
Mit den kompletten Plasmiden wurden kompetente E. coli DH5 α transformiert. Dam-Methylierung spielte jetzt keine Rolle mehr, da das DNS-Molekül nicht mehr geschnitten werden mußte. Die transformierten Stämme wurden bei –80°C eingefroren.
Die pKC3-Plasmide mit den klonierten rho-Konstrukten wurden mit dem Maxiprep-Kit präpariert, um für die Transfektionsexperimente ausreichende Mengen an DNS zur Verfügung zu haben. Die so erhaltene DNS wurde zusätzlich durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolpräzipitation gereinigt. Verwendet wurden sowohl die in Tab. 3-4 aufgeführten Konstrukte als auch die im Labor bereits vorhandenen Konstrukte aus Tab. 2-12. Alle analysierten rho-DNS-Konstrukte ließen sich mit der oben beschriebenen Transfektionsmethode in HeLa-Zellen einführen und wurden von den Zellen exprimiert. Wurden die exprimierten Proteine, wie beschrieben, mit einem vsv-Antikörper und einem farbstoffkonjugierten Sekundärantikörper markiert, erschienen große Teile des Zytoplasmas transfizierter Zellen intensiv gefärbt.
Innerhalb eines Experiments wurden die Zellen in den verschiedenen Löchern der Kulturplatten immer mit unterschiedlichen Konstrukten transfiziert, um die Möglichkeit des unmittelbaren Vergleichs zu haben. Grundsätzlich wurden Kontrollzellen mit rhoA einerseits und rhoB oder rhoC andererseits transfiziert. Außerdem dienten nicht transfizierte Zellen als Kontrollen für die Spezifität der verwendeten Antikörper.
Da gleichzeitig mit den mutierten Rho-Proteinen auch F‑Aktin fluoreszenzmarkiert wurde, konnten benachbarte transfizierte und nichttransfizierte Zellen hinsichtlich ihres Aktinzytoskeletts verglichen werden. Paare von Fotografien in einer einzigen Ebene, die denselben Bildausschnitt zeigen, wurden mit dem 40er-Objektiv und der CCD-Kamera mit den Filtersätzen I und II (Tab. 2-15) aufgenommen. Der epr-Algorithmus fand hier keine Anwendung. Für alle gezeigten Bilder gilt: Rho-Proteine sind rot, F‑Aktin ist grün eingefärbt.
Zellen, die mit auf rhoA, B oder C basierenden Konstrukten transfiziert waren, zeigten ein im Vergleich zu nicht transfizierten Kontrollzellen deutlich verändertes Aktinzytoskelett
(Abb. 3-11 a-u). Die Menge an F‑Aktin war vermehrt. Ein dichtes Netz von Streßfaserbündeln war sichtbar, das über das gesamte Zytoplasma verteilt war, während der Zellkern typischerweise als Aussparung in diesem Fasernetz erschien. Die beiden bereits bekannten Rho-Mutanten RhoAG14V (Abb. 3-11 a,b) und RhoAT19N (Abb. 3-11 c,d) dienten als Positiv- bzw. Negativkontrolle: Zellen, die das konstitutiv aktive RhoAG14V exprimierten, zeigten ein im Vergleich zu nichttransfizierten Zellen sehr dichtes Netz von Streßfilamenten. Zellen, die das konstitutiv inaktive RhoAT19N enthielten, konnten dagegen weder morphologisch, noch aufgrund ihres Gehalts an F‑Aktin von nichttransfizierten Nachbarzellen unterschieden werden.
Die beiden auf rhoD basierenden Konstrukte RhoD und RhoDDA unterschieden sich in ihrer Wirkung auf das HeLa-Zytoskelett von den anderen Rho-Isoformen. Transfizierte Zellen konnten aufgrund der Morphologie ihres Zellgerüsts entweder nicht sicher von Kontrollzellen abgegrenzt werden (Abb. 3-12 a,b; e,f), oder sie zeigten eher dezente Veränderungen: F‑Aktin war in manchen Zellen, die RhoD-Konstrukte überexprimierten, leicht vermehrt, erschien aber mehr diffus verteilt und war nur vereinzelt in Form von Streßfilamenten organisiert (Abb. 3-12 c,d; g,h). Zwischen RhoD und RhoDDA konnte hier kein Unterschied festgestellt werden.
Mit rho-Konstrukten transfizierte HeLa-Zellen wurden mit S. flexneri SC301 infiziert (vgl. 2.6.1). Die mit dem vsv-tag versehenen Rho-Proteine und F‑Aktin wurden wie beschrieben (2.7) angefärbt. Alle Experimente wurden mindestens dreimal reproduziert.
Die Bakterieneintrittsstellen an transfizierten Zellen wurden am Mikroskop mit dem 100er-Objektiv betrachtet und mit der CCD-Kamera fotografiert. Jeder Bildausschnitt (eine Ebene eines Bilderstapels) wird hier in drei verschiedenen Ansichten gezeigt: Die einfarbigen Bilder zeigen entweder das Verteilungsmuster des jeweiligen mutierten Rho-Proteins (rot) oder die Architektur des F‑Aktin-Zytoskeletts (grün). In der dritten Ansicht sind die beiden monochromen Bilder übereinander projiziert, um die Lagebeziehung der einzelnen Bildkomponenten darzustellen.
Das Rekrutierungsverhalten von RhoA (Abb. 3-13 a-g), RhoB (Abb. 3-13 h-k) und RhoC (Abb. 3-13 l-n) war bereits bekannt [3] und diente als Ausgangspunkt für die vorliegende Studie. Um einen Vergleichsmaßstab für die Rekrutierungsmuster der einzelnen hier untersuchten Mutanten zu haben, mußte das Verhalten der drei Isoformen mit der neuen, hier benutzten Technik jedoch nochmals dokumentiert werden. Die beobachteten Rekrutierungsmuster bestätigten die publizierten Ergebnisse: RhoA akkumulierte hauptsächlich in unmittelbarer Nähe der eindringenden Bakterien, während RhoB und RhoC im wesentlichen in die Spitzen der F‑Aktin-reichen, bakteriell induzierten, zellulären Protrusionen rekrutiert wurden. Das RhoA-Präparat in Abb. 3-13 d-g wurde zusätzlich mit DAPI gefärbt, wodurch sowohl der Zellkern als auch die Bakterien markiert wurden. Hier wird die für RhoA typische Akkumulation um die Bakterien herum besonders deutlich.
Bei RhoD galt das Interesse vornehmlich der Frage, ob sich auch hier ein bakterieninduziertes Rekrutierungsphänomen beobachten läßt und welches Muster dabei gegebenenfalls auftritt. Da RhoD auf der Primärstrukturebene mit RhoA, B und C deutlich geringere Homologie aufweist als die drei Isoformen untereinander, war es im voraus kaum möglich, über den Ausgang dieses Experiments zu spekulieren. Es zeigte sich, daß das mit dem vsv-tag versehene RhoD, ähnlich wie RhoB und RhoC, hauptsächlich in die von Shigella induzierten aktinreichen zellulären Protrusionen rekrutiert wird (Abb. 3-14).
Um die mögliche Auswirkung von Mutationen, die die Funktion von RhoA alterieren, auf das Rekrutierungsverhalten zu untersuchen, wurden die beiden Konstrukte RhoAT19N (Abb. 3-15 a, 3-16 a-c) und RhoAG14V (Abb. 3-15 b, 3-16 d-f) hergestellt und im HeLa-Zell-Modell analysiert. Beide Proteine, die die konstitutiv inaktive Mutation Thr19Asn [99] bzw. die konstitutiv aktive Mutation Gly14Val [56] tragen, wurden während der Zellinvasion durch Shigella rekrutiert. Die subzelluläre Verteilung beider Moleküle ließ sich dabei nicht vom klassischen RhoA-Verteilungsmuster unterscheiden.
Birgit Bohm, ebenfalls Doktorandin im Labor, hatte bereits vor Beginn dieser Studie klar zeigen können, daß die CaaX-Region für die Rekrutierung eine wesentliche Rolle spielt: Deletionsmutanten von RhoA, B und C, denen die letzten vier Aminosäuren fehlten, verloren die Fähigkeit, während der Shigelleninvasion rekrutiert zu werden und blieben diffus im Zytoplasma verteilt. Das Vorhandensein der CaaX-Region ist also eine notwendige Bedingung dafür, daß das Rekrutierungsphänomen überhaupt auftreten kann. Da sich die Primärstrukturen der CaaX-Boxen der verschiedenen Isoformen unterscheiden, bot es sich an zu untersuchen, ob diese Region auch das differentielle Rekrutierungsmuster bestimmt.
Von diesen Voraussetzungen ausgehend wurden die Hybridproteine RhoAAB (Abb. 3-17 a), RhoBBA (Abb. 3-17 b), RhoCCA (Abb. 3-17 c) und RhoDDA (Abb. 3-17 d) konstruiert, bei denen die ursprüngliche CaaX-Gruppe gegen diejenige einer anderen Isoform ausgetauscht wurde: RhoA erhielt die CaaX-Box von RhoB, während bei RhoB, RhoC und RhoD die letzten vier Aminosäuren gegen die entsprechende Sequenz von RhoA ausgetauscht wurden. Wenn die CaaX-Gruppe das Verteilungsmuster bestimmte, wäre zu erwarten gewesen, daß das Rekrutierungsverhalten der Hybridproteine sich nach ihr richtete. Es zeigte sich aber, daß trotz der „fremden“ CaaX-Gruppen das ursprüngliche Muster auftrat. RhoAAB wurde wie RhoA rekrutiert (Abb. 3-18 a-c), RhoBBA wie RhoB (Abb. 3-18 d-f), RhoCCA wie RhoC (Abb. 3-18 g-i) und RhoDDA wie RhoD (Abb. 3-18 k-m). Die das Rekrutierungsmuster bestimmenden Aminosäuren mußten also auf einem anderen Abschnitt des Moleküls liegen.
Es lag nahe, als nächstes die Region unmittelbar vor der CaaX-Region zu untersuchen: Der gewählte prä-C‑terminale Abschnitt, der bei RhoA und C neun Aminosäuren umfaßt (As 181‑189), bei RhoB 12 (As 181‑192) und bei RhoD 14 (As 193‑206), stellt eine Region starker Heterogenität zwischen den Isoformen dar. Durch seine räumliche Nachbarschaft zu der für die Rekrutierung an sich notwendigen CaaX-Gruppe gewann dieser Bereich zusätzlich an Interesse. Aufgrund der größeren Ähnlichkeit zwischen RhoA und RhoC, insbesondere der besseren Vergleichbarkeit der präterminalen Region, wurde der Sequenzabschnitt anhand dieser beiden Isoformen weiter untersucht.
Innerhalb der prä-CaaX-Region wurde zuerst die Rolle des Ser188 von RhoA betrachtet. Serin kommt bei den anderen Isoformen an vergleichbarer Position nicht vor. Es ist bekannt, daß membrangebundenes RhoA am Ser188 von PKA phosphoryliert und dadurch die Translokation ins Zytosol induziert wird [97]. Bei RhoAS188P wurde die PKA-vermittelte Phosphorylierung dadurch verhindert, daß Ser188 durch Prolin ersetzt wurde (Abb. 3-19). Das Rekrutierungsverhalten änderte sich dadurch nicht: RhoAS188P akkumulierte wie RhoA vorwiegend um die eindringenden Bakterien (Abb. 3-20 a-c).
In einem nächsten Schritt wurde die gesamte Region der As 181‑188 zwischen RhoA und RhoC ausgetauscht (Konstrukte RhoCAC (3-21 a) und RhoACA (3-21 b)). RhoACA war bereits von Birgit Bohm hergestellt worden, und unter Verwendung eines konventionellen Fluoreszenzmikroskops hatten sich bereits erste Hinweise darauf ergeben, daß dieses Protein anders als RhoA rekrutiert werden könnte. Durch die Darstellung von optischen Schnitten mit der in 2.7.4‑5 beschriebenen Technik gelang es, die Rekrutierungsmuster von RhoCAC und RhoACA eindeutig zu beschreiben: RhoCAC akkumulierte wie RhoA um die Bakterien (Abb. 3-22 a-c) und RhoACA wurde wie RhoC in die Spitzen der zellulären Membranprotrusionen rekrutiert (Abb. 3-22 d-f). Im Bereich dieser 8 Aminosäuren liegen somit notwendige Informationen für das differentielle Rekrutierungsmuster von RhoA und RhoC.
Von diesem Ergebnis ausgehend wurden zwei weitere von Birgit Bohm hergestellte Konstrukte – RhoAR183K und RhoAKK186-187RR – untersucht, mit dem Ziel, den für die Bestimmung des Rekrutierungsmusters hinreichenden Abschnitt der Primärstruktur von Rho weiter einzugrenzen. Die ausgetauschten Aminosäuren entsprachen dabei den Stellen, an denen sich RhoA sowohl von RhoC als auch von RhoB unterschied. Bei RhoAR183K wurde das ursprüngliche Arg183 durch Lys183 von RhoC ersetzt (Abb. 3-23). Dieser Austausch brachte keine Modifikation des subzellulären Verteilungsmusters mit sich. RhoAR183K konnte in seinem Rekrutierungsverhalten nicht von RhoA unterschieden werden (Abb. 3-24 a-c).
RhoAKK186-187RR basiert auf RhoA, wobei Lys186 und Lys187 durch die Aminosäuren Arg186 und Arg187 von RhoC ersetzt wurden (Abb 3-25). Diese Mutante zeigte kein RhoA-typisches Rekrutierungsverhalten, sondern konzentrierte sich wie RhoC in den während der bakteriellen Invasion gebildeten Membranprotrusionen (Abb. 3-26 a-c). Mit diesem Konstrukt konnten zwei Aminosäuren (Lys186-187) beschrieben werden, deren Austausch allein hinreichend ist, um das RhoC-Muster in ein RhoA-Muster zu konvertieren.
Die Ergebnisse der Transfektions-Infektions-Experimente sind in der folgenden Tabelle nochmals zusammengefaßt:
Um das Rekrutierungsmuster der Rho-Mutanten innerhalb der Zellen beurteilen zu können, mußte ein plastischer, dreidimensionaler Eindruck der Präparate gewonnen werden. Dieser kann dadurch erreicht werden, daß eine Serie von horizontalen „optischen Schnitten“ durch die betreffenden Zellen angefertigt wird. Eines der üblichen Verfahren hierzu ist die Konfokale Laserscanning-Mikroskopie [135]. Da die an der Charité vorhandenen Konfokalmikroskope aus organisatorischen oder technischen Gründen für die gegebene Fragestellung nicht genutzt werden konnten und eine Neuanschaffung eines solchen Instruments aus Kostengründen nicht möglich war, wurde auf eine andere, preisgünstigere Technik ausgewichen: Benutzt wurde ein herkömmliches, speziell aufgerüstetes Fluoreszenzmikroskop, und die gewonnenen digitalen Bilddaten wurden mit dem von Fay et al. entwickelten Dekonvolutionsalgorithmus bearbeitet (US Patent # 5047968).
Der Ansatz des empirischen Dekonvolutionsalgorithmus ist wie folgt: In der Fokusebene eines optischen Systems ist immer auch Streulicht aus benachbarten Ebenen sichtbar, das die Bildqualität vermindert. Die Ausbreitung dieses Streulichts kann mit einer für das verwendete optische System spezifischen Funktion beschrieben werden. Diese sogenannte point-spread-Funktion wird empirisch ermittelt, indem von einer „punkt“-förmigen Lichtquelle, deren Durchmesser (0,1 µm) kleiner als das maximale Auflösungsvermögen des Mikroskops ist, eine Z‑Serie von Mikrofotografien aufgenommen wird, d.h. eine Serie von Aufnahmen mit definiertem Abstand der Fokussierungsebenen. Die mittlere Ebene entspricht dabei der Lage der Lichtquelle (Fokusebene); in den Ebenen darüber und darunter ist nur das Streulicht sichtbar. Nach Bestimmung der Funktion, die durch das benutzte Mikroskop, das Untersuchungsobjekt sowie sämtliche brechenden Medien charakterisiert wird, kann Streulicht gezielt wieder seinen Ursprungspunkten zugeordnet werden. Verschwommenheit der Bilder, die durch das optische System verursacht ist, wird gezielt korrigiert, die Abbildung kommt dadurch den „wahren“ Strukturverhältnissen näher [48]. Das bearbeitete Bild verfügt auch über mehr Helligkeitsstufen als das Original. Strukturen, die vorher durch Streulicht verdeckt waren, können durch die Dekonvolution freigelegt werden [31].
Die Qualität der optischen Schnitte, die durch Anwendung des Dekonvolutionsalgorithmus erhalten werden, ist der von Konfokalbildern vergleichbar. Ein Vorteil gegenüber der Konfokalen Laserscanning-Mikroskopie besteht darin, daß das volle Spektrum einer Halogenlampe genutzt werden kann. Während mit einem Laser nur Farbstoffe mit einer eng definierten Wellenlänge angeregt werden können, steht bei der hier verwendeten Methode eine größere Auswahl von Farbstoffen zur Verfügung.
Um eine einfache Markierung zu ermöglichen, wurden alle Konstrukte mit einem vsv-Peptid-tag versehen. Der vsv-tag wurde deshalb gewählt, weil im Labor bereits monoklonale Antikörper gegen dieses Epitop vorhanden waren (P5D4 [93]; Geschenk von T. Kreis). Der tag mußte am N‑Terminus von Rho angebracht werden, da eine Markierung am C‑Terminus aufgrund der dort stattfindenden posttranslationalen Modifikation [4] unmöglich war: Mit Abspaltung der drei C‑terminalen Aminosäuren wäre auch der tag vom zu markierenden Protein abgetrennt worden.
Das Anfügen eines Epitop-tag war eine Grundvoraussetzung für die vorliegende Arbeit: Isoformspezifische Antikörper für Rho waren nicht verfügbar und wären überdies schwierig einsetzbar gewesen. Für jedes der Konstrukte – die sich oft nur in wenigen Aminosäuren unterschieden – hätte ein besonderer Antikörper hergestellt werden müssen, was wiederum methodische Fragen aufgeworfen hätte: Unterschiede im Verteilungsmuster hätten dann auch auf Unterschiede der Antikörperspezifitäten zurückgeführt werden können. Durch das Anfügen des vsv-tag konnte für alle Konstrukte derselbe Primärantikörper eingesetzt werden.
Andererseits mußte in Kauf genommen werden, daß mit dem tag in die zu untersuchenden Proteine selbst eine Veränderung eingeführt wurde, welche einen Einfluß auf Eigenschaften der Moleküle haben könnte. Dieser Einwand läßt sich aber weitgehend entkräften. Der angefügte tag ist relativ kurz; zusammen mit der zwischen tag und Rho-Sequenz eingefügten Restriktionsschnittstelle beträgt die Länge des angehängten Peptids 14 Aminosäuren oder ungefähr 7% der Länge der Aminosäuresequenz. Da das Peptid am N‑Terminus der Rho-Mutanten angebracht werden konnte, ist es – zumindest auf der Ebene der Primärstruktur – weit entfernt von dem im Zusammenhang mit der Rekrutierung funktionell interessanten C‑Terminus. In welchem Bereich der dreidimensionalen Struktur sich der tag einfügt, ist hingegen nicht genau bekannt. Alle Konstrukte verursachten bei Expression in HeLa-Zellen die erwarteten morphologischen Veränderungen (vgl. Abb. 3-11), allen voran die Ausbildung von Streßfilamenten [143]. Auch mit tag blieben die exprimierten Konstrukte also funktionell. Adamson et al. berichteten, daß das Anfügen eines zehn Aminosäuren langen myc-tag an RhoA, B und C weder Funktion noch Lokalisation der Proteine beeinflußt [5].
Mit hoher Sicherheit kann ausgeschlossen werden, daß das Rekrutierungsphänomen ein auf den tag zurückzuführendes Artefakt ist: Mit demselben tag wurden unterschiedliche differentielle Rekrutierungsmuster dargestellt, und andererseits wurden die verschiedenen Rekrutierungsmuster (RhoA bzw. RhoB) mit unterschiedlichen tags (vsv, Sendai) in gleicher Weise reproduziert. ([3], T. Adam, unveröffentliche Ergebnisse). Entsprechend wurde in Rekrutierungsexperimenten mit Wachstumsfaktoren als Auslösern gezeigt, daß das Verhalten von myc-markiertem und endogenem RhoA übereinstimmen [169].
Die mit Hilfe der PCR hergestellten vsv-rho-Konstrukte mußten dem Anspruch auf vollkommene Fehlerfreiheit der Basensequenz genügen. Die PCR unter In-vitro-Bedingungen ist jedoch fehlerträchtig, und es können „falsche“ Basen in den Tochterstrang eingebaut werden, die nicht zur Matrize komplementär sind. Für die Taq-Polymerase, die keine 3'Õ5' Korrekturaktivität besitzt, wurde für eine 30 Zyklen umfassende PCR eine Fehlerfrequenz von 0,25% berichtet [147]. Im Falle der hier beschriebenen PCR-Produkte, die je etwa 600 bp lang sind, ist dieser Fehler erheblich. Für die korrekte Herstellung der Konstrukte war es daher essentiell, die Replikationstreue der PCR zu optimieren. Dies wurde auf zwei Wegen erreicht: Erstens wurde die Zahl der PCR-Zyklen auf 10‑16 limitiert, was durch Einsetzen einer großen Matrizenmenge (90‑180 fmol) kompensiert wurde, und zweitens wurde die thermostabile Pwo-DNS-Polymerase verwendet, die eine 3'‑Exonukleaseaktivität (Fehlerkorrekturaktivität) besitzt [72]. Da dieses Enzym erheblich teurer als Taq-Polymerase ist, wurden die Reaktionsbedingungen vor der Synthese der jeweiligen Konstrukte unter Verwendung der Taq-Polymerase optimiert.
Die neuen Konstrukte wurden durch Sequenzierung kontrolliert. Bei der hier verwendeten Sequenzierungsmethode nach Sanger [149] waren die Primer mit dem Fluoreszenzfarbstoff IRD 800 (MWG) markiert. Aufgrund der Verwendung von pUC19 als Sequenziervektor und der relativ geringen Länge der Sequenzen konnte für alle Konstrukte mit demselben Primer-Paar gearbeitet werden. Die ebenfalls mögliche Markierung der Nukleotide wäre in diesem Fall weniger kostengünstig gewesen. Die Ergebnisse der Sequenzierungen bestätigten die hohe Replikationstreue der PCR unter den hier eingestellten Bedingungen: Im Rahmen dieser Arbeit wurden Konstrukte mit einer Gesamtlänge von über 5000 Basen hergestellt, ohne daß bei der Sequenzierung ein Replikationsfehler entdeckt werden konnte.
Für die Expression der Konstrukte in HeLa-Zellen wurde der Vektor pKC3 benutzt, der vom Plasmid pko-neo [176] abgeleitet ist. pKC3 war für die hier beschriebenen Experimente optimal, da er einen SV40-Promotor enthält. Dieser Promotor ist schwächer als der CMV-Promotor [44, 98] und ermöglichte die gewünschte mäßige Expression der Rho-Konstrukte. Ein Nachteil des Vektors pKC3 ist, daß seine Nukleinsäurensequenz nicht vollständig vorliegt. Zum Klonieren wurden hier nur beschriebene Schnittstellen benutzt. Da diese Situation nicht völlig befriedigend war, soll im Labor nachfolgend ein neuer Expressionsvektor konstruiert werden.
Für die Präparation von Plasmid-DNS wurden kommerzielle Kits von QIAgen verwendet. Grundsätzlich kann Plasmid-DNS auch mit im Labor verfügbaren Reagenzien nach Standardmethoden (z. B. [148]) gewonnen werden. Es hatte sich allerdings bereits im Vorfeld herausgestellt, daß die Transfektionseffizienz bei Verwendung der mit den kommerziellen Kits gewonnenen DNS deutlich höher ist (B. Bohm und T. Adam, unveröffentlichte Ergebnisse). Aufgrund dieses qualitativen Unterschieds war die Investition in die Kits gerechtfertigt.
Die für diese Arbeit gewählte Transfektionsmethode sollte einerseits effizient sein und andererseits nicht mit der anschließenden Infektion der transfizierten Zellen interferieren. Unter diesem Apekt wurden die verschiedenen zur Verfügung stehenden Methoden beurteilt:
Bei der Transfektion durch Elektroporation müssen die Zellen im Medium supendiert sein [14]. Durch die dazu erforderliche Trypsinbehandlung büßen die Zellen Oberflächenproteine ein und sind zunächst refraktär gegen die Shigelleninvasion (T. Adam, unveröffentlichte Ergebnisse). Erst nach 18‑24 h sind die Zellen sedimentiert und die Oberflächenproteine wieder ausreichend exprimiert. Als das Transfektions-Infektions-Modell etabliert wurde, sollten auch kurze Expressionszeiten der Konstrukte nach Transfektion getestet werden. Deshalb schied die Elektroporation als Transfektionsmethode aus. Bei der Transfektion mit Hilfe von Lipid-Mikrosphären (Liposomen) wäre mit dem Einbau von fremden Lipiden in das Membrankompartiment der zu transfizierenden Zelle zu rechnen gewesen [132]. Da die Signaltransduktion an der Plasmamembran für die Shigelleninvasion eine zentrale Rolle spielt, sollte eine Veränderung der Membrankomposition vermieden werden. Aus diesem Grund wurde auch auf die Liposomen-Transfektionsmethode nicht zurückgegriffen.
Nach Abschluß der DNS-Aufnahme und vor Durchführung der Infektionsexperimente wurden die Zellen mehrfach mit Medium gewaschen. Dadurch wurden auf der Oberfläche liegende Ca3(PO4)2-Präzipitate, die den Zustand der Zellen beeinträchtigen und den Infektionsprozeß behindern können, weggespült. Daß der Transfektionsvorgang selbst ohne Effekt auf das Aktinzytoskelett der nichtinfizierten Zelle ist, zeigen die Experimente (ohne Infektion) mit RhoAT19N: Mit diesem konstitutiv inaktiven Konstrukt transfizierte HeLa-Zellen ließen sich am Lichtmikroskop morphologisch nicht von nichttransfizierten Zellen unterscheiden (Abb.3-11 c,d). Nach Transfektion mit sämtlichen Konstrukten ließen sich HeLa-Zellen problemlos infizieren. Da die pathogeninduzierte Internalisierung der Bakterien eine aktive Leistung der Zelle darstellt [2, 3, 40], kann auf einen guten funktionellen Status der schwach transfizierten HeLa-Zellen rückgeschlossen werden.
Nur die sehr stark transfizierten Zellen erschienen abgerundet und waren z.T. vom Boden der Kulturplatten abgelöst. Hier konnten auch nur selten intrazelluläre Shigellen beobachtet werden. Diese Zellen wurden bei der Dokumentation und Auswertung der Experimente daher nicht berücksichtigt.
Für die Infektion verwendete Shigellen wurden in der frühen exponentiellen Wachstumsphase geerntet. In diesem Stadium ist das Invasionsvermögen der Bakterien am ausgeprägtesten [121]. Nach Zugabe der Bakteriensuspension wurden die Zellkulturplatten auf Eis gelagert. Bei einer Temperatur von ca. 4°C können die Shigellen zwar auf die Zellen sedimentieren, es findet aber keine Invasion statt [40]. Der verwendete Stamm SC301 besitzt das afimbrische Adhäsin AFA I von E. coli und kann sich damit an die HeLa-Zellen anheften [179]. Daher konnte die bei Wildtypstämmen notwendige Zentrifugation der Bakterien auf die Zellen entfallen [40]. Durch die anschließende rasche Temperaturerhöhung auf etwas über 37°C wurden die Bedingungen für eine mögliche Invasion geschaffen. Der Invasionsprozess läuft an den einzelnen Zellen jedoch nicht völlig synchron ab, so daß verschiedene Stadien beobachtet werden können. Nach weniger als 20 min ist ein großer Teil der Bakterien in die Zellen aufgenommen [40] und der optimale Zeitpunkt für die Beobachtung der Rho-Rekrutierung ist erreicht.
Um eine orientierende Aussage über die Funktionsfähigkeit der hergestellten Konstrukte treffen zu können, wurde deren Wirkung auf das Aktinzytoskelett transfizierter Zellen (ohne nachfolgende Infektion mit Shigella) untersucht und dokumentiert (Abb. 3-11/12). Alle auf der Basis von RhoA, B und C (Sequenzen vgl. Abb. 1-3) hergestellten Konstrukte wiesen die bekannte Fähigkeit, in Epithelzellen ein dichtes Netz von Streßfilamenten zu induzieren ([130] und eigene Beobachtungen), auf. Die einzige – erwartete – Ausnahme bildete das konstitutiv-inaktive Konstrukt RhoAT19N.
Die beiden auf rhoD (vgl. Abb. 1-4) basierenden Konstrukte RhoD und RhoDDA unterschieden sich in ihrer Wirkung auf das Aktinzytoskelett ebenfalls erwartungsgemäß von RhoA, B und C. In [126] war die Wirkung von RhoD auf BHK-Zellen bereits beschrieben worden, wobei die Induktion von 20‑30 µm langen, aktinreichen Zellfortsätzen und das Verschwinden von Streßfilamenten in transfizierten Zellen als charakteristische Merkmale genannt wurden. In dem in der vorliegenden Arbeit verwendeten Expressionssystem mit HeLa-Zellen konnte der beschriebene RhoD-Phänotyp in ähnlicher Weise, aber mit Abweichungen reproduziert werden. Da hier mit HeLa-Zellen gearbeitet wurde, die zum Zeitpunkt der Transfektion keine oder kaum Streßfilamente ausbildeten, konnte über die Wirkung von RhoD auf bestehende Filamente keine Aussage getroffen werden. Allerdings wurden durch die RhoD-Konstrukte auch keine neuen Streßfilamente induziert: Es konnte höchstens eine leichte, diffuse Vermehrung von F‑Aktin in transfizierten Zellen beobachtet werden. Somit stimmt zumindest der beobachtete Endzustand nach Transfektion mit dem in [126] beschriebenen Phänotyp überein. Nicht konstant beobachtet werden konnte im hier verwendeten System die Ausbildung von langen, dünnen, aktinreichen Zellprotrusionen unter der Wirkung von RhoD. Lediglich in Abb. 3-12 c,d weist die sehr stark transfizierte Zelle einige filiforme Fortsätze auf. Die beobachteten Abweichungen im Vergleich zu [126] können auf eine Vielzahl von Faktoren zurückgeführt werden, darunter auf den verwendeten Zelltyp, die Transfektionsmethode und das erreichte Expressionsniveau. Die zentrale Aussage, daß der Phänotyp mit rhoD transfizierter Zellen deutlich vom Aspekt mit rhoA/B/C transfizierter Zellen abzugrenzen ist, konnte hier jedoch uneingeschränkt bestätigt werden.
Sowohl das konstitutiv aktive RhoAG14V, dessen Fähigkeit zur Hydrolyse von GTP herabgesetzt ist [56], als auch das konstitutiv inaktive RhoAT19N [99], welches in GDP-gebundener Form vorliegt [96], werden bei der Zellinvasion durch Shigella wie RhoA rekrutiert (Abb. 3-16 a-f). Das Translokationsphänomen erwies sich somit überraschenderweise als vom „Schaltzustand“ der GTPase unabhängig: Ausgehend von der bekannten Aktivität von RhoGDI, mit GDP-gebundenem Rho einen zytosolischen Komplex zu bilden, hätte man RhoAT19N eher diffus im Zytoplasma verteilt als an der Membran konzentriert erwartet [80, 155]. Für die Rekrutierung während der bakteriellen Invasion scheint es jedoch ohne Bedeutung zu sein, ob RhoA mit GTP oder mit GDP komplexiert vorliegt. Hieraus läßt sich folgern, daß die Konformationsänderungen, die beim Übergang zwischen GDP- und GTP-gebundenem Zustand auftreten [79], nicht mit den Mechanismen interferieren, die die Rekrutierung von RhoA vermitteln.
Es mag zunächst überraschen, daß bei Überexpression einer konstitutiv inaktiven Mutante die Ausbildung der typischen Shigella-Eintrittsstellen nicht unterbunden wird (Abb. 3-16 a-c), wie dies bei Inhibition von Rho durch C3-vermittelte ADP-Ribosylierung der Fall ist [3]. Der fluoreszenzoptische Aspekt der Aktin-„Blüte“ ist bei transfizierten und nichttransfizierten Zellen nicht unterscheidbar. Übereinstimmend damit unterscheiden sich auch Zellen, die nicht mit Shigella infiziert, jedoch mit RhoAT19N-DNS transfiziert wurden, nicht von nichttransfizierten Kontrollzellen, die nur über endogenes Rho verfügen (Abb. 3-11 c-d). Der Grund dafür liegt wahrscheinlich in der Einstellung experimenteller Parameter: Da in erster Linie die Rekrutierung beurteilt werden sollte, wurde das Expressionsniveau aller Konstrukte bewußt niedrig gehalten. Somit stand intrazellulär möglicherweise zu wenig RhoAT19N zur Verfügung, als daß die Mutante eine dominant negative Wirkung hätte entfalten können. Der Bestand an endogenem Rho würde nach dieser Vorstellung immer noch ausreichen, um die typischen Aktinrearrangements induzieren zu können.
Die CaaX-Gruppe der Isoformen RhoA, B und C ist für die Rekrutierung an sich zwar essentiell (B. Bohm und T. Adam, unveröffentlichte Ergebnisse), determiniert aber nicht das differentielle Rekrutierungsmuster (Abb. 3-18a-i).
Die verschiedenen Isoformen weisen Unterschiede in der posttranslationalen Isoprenylierung bzw. Palmitoylierung auf. Während RhoB an Cys189 und Cys192 palmitoyliert und an Cys192 und Cys193 geranylgeranyliert bzw. farnesyliert werden kann [4], werden RhoA und RhoC weder farnesyliert noch palmitoyliert, sondern lediglich an Cys190 geranylgeranyliert [83]. Die Sequenz der CaaX-Gruppe scheint das Modifikationsmuster nur eingeschränkt zu beeinflussen. Während bei Ha‑Ras die Mutation des C‑terminalen Ser189 zu Leu (CaaS zu CaaL) zur Folge hat, daß das Protein in vivo und in vitro geranylgeranyliert statt farnesyliert wird [90], kann RhoB trotz des terminalen Leuzins auch farnesyliert werden. Auch die beiden „aliphatischen“ („aa“) Aminosäuren spielen hier offenbar keine bestimmende Rolle. Selbst wenn RhoB durch Mutation von Lys194 zu Leu eine RhoA-CaaX-Gruppe erhält, ändert sich sein Prenylierungsmuster nicht [4].
Während das (primäre) Vorhandensein der vier Aminosäuren der CaaX-Gruppe also eine Grundvoraussetzung sowohl für die posttranslationale Modifikation [67, 83] als auch für die Rekrutierung der Proteine während der Shigelleninvasion darzustellen scheint, enthält dieser Sequenzabschnitt für keinen der beiden Vorgänge die vollständige Information. Besondere Beachtung verdient, daß das RhoB/C-Rekrutierungsmuster von der Art der posttranslational angefügten Lipide unabhängig zu sein scheint. RhoB zeigt trotz unterschiedlicher Modifikation das gleiche Verteilungsmuster wie RhoC, während RhoC und RhoA trotz offenbar identischer Isoprenylierung mit Geranylgeranyl verschieden rekrutiert werden. Die Abhängigkeit des Rekrutierungsphänomens vom Vorhandensein der CaaX-Gruppe ist, mit den morphologischen Daten zusammengenommen, ein Indiz dafür, daß der Zielort der Translokation der Rho-Isoformen nicht nur der membrannahe Bereich, sondern die Zytoplasmamembran selbst ist.
Erstmals wurde hier das Translokationsverhalten von RhoD während der Epithelzellinvasion durch Shigella untersucht (Abb. 3-14 a-c). Es konnte gezeigt werden, daß auch RhoD rekrutiert wird und dabei ein Verteilungsmuster aufweist, das – nach lichtmikroskopischer Beurteilung – dem von RhoB und RhoC gleicht.
RhoD läßt sich anhand der Primärstruktur innerhalb der Rho-Familie deutlich von den drei „Geschwistern“ RhoA, B und C abgrenzen. Dennoch teilen RhoD und RhoB Eigenschaften, in denen sich diese zwei Moleküle gemeinsam von RhoA und RhoC unterscheiden. Es wurde gezeigt, daß sowohl RhoD als auch RhoB hauptsächlich an frühen Endosomen lokalisiert sind, während sich nur ein kleiner Anteil an der Plasmamembran findet [5, 126]. Entsprechend finden sich auch in der Zusammensetzung des C‑Terminus Parallelen. So liegt unmittelbar vor der CaaX-Box jeweils noch ein zweiter Zysteinrest (bei RhoB noch ein dritter), und der C‑terminale Bereich ist länger als bei RhoA und RhoC. Bei RhoB sind drei, bei RhoD fünf zusätzliche Aminosäuren eingefügt. Allerdings endet die Aminosäuresequenz von RhoD im Gegensatz zu RhoA, B und C mit Threonin statt mit Leuzin. Über die Art der posttranslationalen Modifikation von RhoD liegen keine Angaben vor, es erscheint aber aufgrund der genannten Gemeinsamkeiten nicht unwahrscheinlich, daß RhoD das gleiche Prenylierungsmuster aufweist wie RhoB. Der Austausch der CaaX-Gruppe von RhoD gegen die entsprechende Sequenz von RhoA läßt das Rekrutierungsverhalten unberührt (Abb. 3-18 k-m). Ausgehend von der Hypothese, daß RhoD wie RhoB modifiziert wird, kann überdies spekuliert werden, daß, ähnlich wie für RhoB gezeigt [4], der Austausch der CaaX-Gruppe auch das Prenylierungsmuster von RhoD unberührt läßt.
Aus dem Vergleich mit RhoC drängt sich jedoch die Hypothese auf, daß die beschriebenen Rekrutierungsmuster während der bakteriellen Invasion von anderen Merkmalen determiniert werden als die Lokalisation von RhoB und RhoD in der nichtinfizierten Zelle: RhoC wird, obgleich intrazellulär zunächst anders verteilt als RhoB und RhoD [5, 126], in gleicher Weise in die Membranprotrusionen rekrutiert. Immerhin ist denkbar, daß sich die Rekrutierungsmuster von RhoB, C und D in Feinheiten unterscheiden, die mit den benutzten Methoden nicht aufgedeckt werden konnten.
Ser188 von RhoA, das von der cAMP-gesteuerten Proteinkinase A (PKA) phosphoryliert wird [97], ist für die Ausprägung des RhoA-typischen Rekrutierungsmusters nicht notwendig (Abb. 3-20 a-c). Somit spielt PKA in ihrer Funktion als Kinase keine Rolle für die Rekrutierung von RhoA an die Bakterieneintrittsstelle. Dem Ser188 scheint vielmehr die Rolle eines „Aus“-Schalters zuzukommen: GTP-RhoA wird durch die Phosphorylierung und durch das dann erleichterte Komplexieren mit Rho-GDI von der Zellmembran, einem wahrscheinlichen Aktionsort, entfernt [97]. In menschlichen Neuroblastomzellinien konnte auch gezeigt werden, daß PKA durch die Phosphorylierung die biologische Aktivität von RhoA antagonisiert, möglicherweise durch Verringerung der Affinität zur Rho-Kinase ROKα [45]. Nimmt man an, daß RhoA während der Shigelleninvasion zur Membran hin rekrutiert wird und dort im aktivierten Zustand vorliegen muß, könnte die PKA der Rekrutierung sogar entgegenwirken.
Es fällt auf, daß die zweifache Substitution von Lysin (RhoA) durch Arginin (RhoC) einen konservativen Austausch darstellt. Beide Aminosäuren tragen hydrophile, basische, unter physiologischen Bedingungen positiv geladene Reste, wobei der positive Ladungscharakter der Argininseitenkette etwas stärker augeprägt ist als der des Lysinrests. Es erscheint nicht sehr wahrscheinlich, daß es durch Austausch dieser beiden Aminosäuren zu einer wesentlichen Beeinflussung der Konformation des C‑Terminus von Rho kommen könnte. Interessanterweise ähnelt RhoC an dieser Stelle von der Ladungsverteilung her (polybasischer Abschnitt) viel mehr RhoA als dem „Rekrutierungszwilling“ RhoB, der zwischen Arg182 und dem C‑terminalen Zystein keine positiv geladenen Aminosäuren aufweist. Möglicherweise vermittelt also eine andere Eigenschaft von Lysin als die Ladung seiner Seitenkette den Einfluß auf das Rekrutierungsmuster.
Ein oder mehrere Lysinreste von RhoA könnten Ort einer noch zu definierenden posttranslationalen Modifikation sein, welche Konformation, Membranbindungseigenschaften oder Protein-Protein-Bindung beeinflußt. Der eukaryotische Initiationsfaktor 5A (eIF‑5A) enthält beispielsweise die Aminosäure Hypusin, die durch posttranslationale Modifikation eines Lysinrests entsteht. Allerdings ist der Initiationsfaktor das einzige bekannte Protein, das diese Modifikation enthält [87]. Lysinreste können auch acetyliert werden, wodurch gleichzeitig die positive Ladung neutralisiert wird [102]. Derartige Modifikationen sind für kleine GTPasen bisher jedoch nicht beschrieben worden.
Die Lysinreste 186 und/oder 187 könnten für das Zustandekommen einer spezifischen Bindung von RhoA an ein Regulator- oder Effektorprotein oder ein Membranphospholipid oder für die Aktivierung eines Interaktionspartners notwendig sein. Es sind eine Reihe von Fällen bekannt, in denen der Austausch von Lysin zu Arginin die spezifische Interaktion zwischen Proteinen behindert oder unmöglich macht. Für die Tyrosinkinase pp60v-src wurde gezeigt, daß der Austausch von drei nahe benachbarten N‑terminalen Lysinen gegen Arginin die Bindung an einen membrangebundenen Rezeptor verhindert [163]. Substitution eines einzelnen Lysins durch Arginin im Penizillinbindenden Protein 5 von E. coli beeinträchtigt dagegen zwar nicht die Komplexbildung mit Penizillin, wohl aber die Carboxypeptidaseaktivität des Proteins [107]. Ein entsprechendes Modell mit erhaltener Bindung bei Verlust der enzymatischen Interaktion ließe sich auch für die Wechselwirkung von RhoAS188P mit PKA konstruieren: Das Lysinpaar, das RhoA von den Isoformen B und C sowie von RhoD unterscheidet, ist Bestandteil einer potentiellen Konsensussequenz für die Interaktion mit PKA [97]. Auch wenn Phosphorylierung von Ser188 für die Rekrutierung keine Rolle spielt, wäre es vorstellbar, daß PKA allein durch eine (hypothetische) Bindung an RhoA das Rekrutierungsmuster beeinflußt. Auch die S188P-Mutante wäre in diesem Modell in der Lage, an PKA zu binden, obwohl die katalytische Aktivität der Kinase blockiert wäre. Der Phosphorylierung könnte schließlich auch im Rahmen der Shigelleninvasion die Rolle eines Abschaltsignals zukommen. Allerdings kann dies anhand der vorliegenden Daten nicht beurteilt werden. Möglicherweise konnte dieser hypothetische Mechanismus in den hier durchgeführten Experimenten auch von vorn herein nicht zum Tragen kommen, da der Invasionsprozeß frühzeitig artifiziell unterbrochen wurde.
Wie aber ist zu erklären, daß die anderen drei untersuchten Proteine, RhoB, C und D, die zwar alle nicht über die Lysinreste von RhoA verfügen, deren Sequenzen sich aber untereinander deutlich unterscheiden, bei fluoreszenzoptischer Darstellung identischen Rekrutierungsmustern zu folgen scheinen? Man könnte sich eine Interaktion mit einem Partnermolekül vorstellen, das eine ausreichend große Toleranz besäße, um RhoB, C und D gleichermaßen, RhoA jedoch trotzdem nicht zu erkennen. Andererseits erscheinen die Sequenzunterschiede zwischen den C‑Termini von RhoD und RhoC mindestens so groß wie zwischen RhoA und RhoC. Möglicherweise bilden RhoB, C und D am Carboxyende jedoch eine ähnliche Tertiärstruktur aus, die sie von RhoA unterscheidet und für eine spezifische Interaktion hinreichend ist. Denkbar ist ebenfalls, daß RhoA, B, C und D gleichermaßen zu der Interaktion fähig sind, die dem „RhoC“-Muster zugrundeliegt, und daß Rho an dieser Wechselwirkung mit einem Sequenzabschnitt teilnimmt, der allen drei Isoformen und RhoD gemeinsam ist. RhoA könnte nach dieser Vorstellung, ähnlich wie im Zusammenhang mit PKA spekuliert wurde, in einer ausschließlich für diese Isoform spezifischen Interaktion gebunden werden, dadurch in der charakteristischen Art und Weise rekrutiert werden und so für die „gemeinsame“ Interaktion nicht mehr zur Verfügung stehen. Schließlich wurde bereits darauf hingewiesen, daß die Rekrutierungsmuster von RhoB, C und D in mit den hier verwendeten Methoden nicht erkennbaren Details differieren könnten und somit an eine Interaktion mit für jedes der drei Proteine jeweils spezifischen Bindungspartnern gedacht werden müßte.
Nach den vorangegangenen Überlegungen zur Primärstruktur verspricht die Gegenüberstellung experimenteller Daten mit dreidimensionalen Strukturmodellen von Rho eine weitere Annäherung an ein Verständnis des Rekrutierungsphänomens. Erste Hinweise auf die funktionelle Architektur von Rho ergaben sich aus der Analyse der Wirkung von bakteriellen Toxinen. Gleich mehrere Toxine greifen Rho an und nehmen dadurch Einfluß auf die Funktion der GTPase. Clostridium botulinum C3-Transferase ADP-ribosyliert RhoA‑C an Asn41. ADP-ribosyliertes Rho ist konstitutiv inaktiv, wobei der Mechanismus der Inaktivierung des Moleküls noch nicht schlüssig geklärt ist [160]. Toxin B von Clostridium difficile glycosyliert RhoA an Thr37. RhoA (und andere GTPasen der Rho-Familie) werden dadurch konstitutiv inaktiv. Die funktionelle Inaktivierung resultiert wahrscheinlich aus einer Inhibition der Interaktion mit Effektorproteinen [160]. Cytotoxic necrotizing factor 1 (CNF1) von uropathogenen E. coli [49, 158] und Dermonekrotisierendes Toxin von Bordetella bronchiseptica [76] deamidieren Gln63 von Rho zu Glutamat. Dadurch wird die GTP-Hydrolyse behindert, auch GAP wird wirkungslos: Rho wird konstitutiv aktiv.
Mit dem Yeast-Two-Hybrid-Verfahren konnten Regionen von Rho eingegrenzt werden, welche für die Interaktion mit Effektorproteinen wie Rho-Kinase und PKN wichtig sind [52]. Innerhalb von zwei Abschnitten, As 23‑40 und As 75‑92, liegen demnach Aminosäuren, die die spezifische Bindung mit Effektoren vermitteln. Die Primärstrukturen von RhoA und RhoC sind in den bezeichneten Abschnitten identisch; RhoB weicht in jedem der beiden Abschnitte an nur einer Position ab, wobei unbekannt ist, ob diese beiden Aminosäuren für die Protein-Protein-Interaktionen eine essentielle Rolle spielen.
Anhand von Kristallstrukturanalysen von RhoA war es möglich, die Konformationsänderungen während des GTPase-Zyklus zu beschreiben und die Aminosäurereste zu definieren, die für die GTPase-Funktion und die Interaktion mit GAP von Bedeutung sind [79, 145, 185]. Abschnitte, deren Position sich in Abhängigkeit vom „Schaltzustand“ am deutlichsten ändert, erstrecken sich demnach zwischen Asp28 und Pro36 im Bereich der „Schalter‑I-Region“ (As 28‑38) und zwischen Gly62 und Leu69 am Anfang der „Schalter‑II-Region“ (As 61‑78). Aminosäuren, die möglicherweise für Bindung und Hydrolyse von GTP notwendig sind, finden sich in der sogenannten phosphatbindenden Schleife (As 13‑20), im Bereich von Schalter I und unmittelbar vor Schalter II, sowie an den Positionen 116‑121 und 160‑162. Aminosäuren, die an der Interaktion mit GEF teilnehmen, sind ebenfalls im Bereich der Schalter I und II lokalisiert. Alle genannten Sequenzabschnitte sind bei RhoA und RhoC identisch; RhoB weicht nur an einzelnen Positionen ab.
Keines der veröffentlichten dreidimensionalen Rho-Strukturmodelle enthält den bei dieser Arbeit im Mittelpunkt stehenden C‑Terminus nach As 181. Auch die verwandte GTPase Ras konnte nur ohne das Carboxyende kristallisiert werden [136]. Der Grund dafür liegt offenbar darin, daß der C‑Terminus stark beweglich ist und keine feste Konformation annimmt [29]. Über Zusammenhänge zwischen Molekülstruktur und der Rolle des C‑Terminus bei der Bestimmung des Rekrutierungsmusters kann somit wenig Konkretes gesagt werden. Die Kenntnis der Stelle, an der das bewegliche Carboxyende im Molekül „verankert“ ist (Ala181), kann jedoch als Grundlage für gezielte Spekulationen dienen.
Betrachtet man Rho-Strukturmodelle (
Die Oberflächensegmente von Rho, die für die Interaktion mit Effektorproteinen notwendig und hinreichend sind, sind weniger präzise definiert, und es ist hier nur eine grobe Orientierung möglich [52]. Der Abschnitt von As 23‑40 beinhaltet den Schalter I, und liegt somit dem C‑Terminus gegenüber. Die zweite Region, innerhalb derer für die Interaktion mit Downstream-Effektoren wichtige Reste vermutet werden, läßt sich in drei Bereiche unterteilen. As 79‑84 verlaufen als β‑Faltblatt verdeckt im Inneren des Proteins und sind somit für Protein-Protein-Interaktionen nicht von unmittelbarem Interesse. As 85‑92 liegen oberflächlich in einer Mulde, deren Rand unter anderem von Resten des Schalters I gebildet wird, dem Carboxyterminus vermutlich diametral entgegengesetzt. As 75‑78 sind dagegen auf der Seite lokalisiert, auf der auch der C‑Terminus aus dem Molekül herausragt. Ob sich daraus Interferenzen zwischen Protein-Protein-Interaktionen und Funktionen des C‑Terminus ergeben, hängt unter anderem davon ab, welches die möglichen Konformationen des C‑Terminus sind und ob die As 75‑78 überhaupt eine Rolle für die Vermittlung von Bindungen mit Effektormolekülen spielen.
Während diese Arbeit geschrieben wurde, wurde berichtet, daß das Shigella-Invasin IpaC die Aktivierung der kleinen GTPasen Cdc42 und (nachfolgend) Rac induziert [174]. Es wurde gezeigt, daß auch Cdc42 und Rac in einem Muster, das dem von RhoA ähnelt, an die Bakterieneintrittsstelle rekrutiert werden [63] und für die Epithelzellinvasion durch Shigella ebenfalls essentiell zu sein scheinen [122]. Das Klasse‑IX-Myosin und GAP myr5 weist dagegen ein Rekrutierungsmuster auf, das sich lichtmikroskopisch mit demjenigen von RhoC deckt [63].
Ob Rekrutierungsmuster und -mechanismus von RhoA/Cdc42/Rac einerseits und RhoB/C/D/myr5 andererseits identisch oder lediglich sehr ähnlich sind, ist unklar. Die Vorstellung einer Aktivierungskaskade von Cdc42 über Rac zu RhoA [130] läßt an ein identisches Verteilungsmuster dieser drei GTPasen denken. Während für jedes dieser Proteine spezifische Rekrutierungsmechanismen nicht ausgeschlossen werden können, erscheint es möglich, daß die in dieser Arbeit untersuchten prä-C‑terminalen Sequenzabschnitte von RhoA und RhoC – Aa 181 bis 188 – Prototypen zweier das jeweilige Rekrutierungsmuster bestimmender Peptidmotive darstellen, die sich auch in den anderen entsprechend rekrutierten Proteinen wiederfinden. Nachdem gezeigt werden konnte, daß auch Cdc42 und Rac im wesentlichen dem Rekrutierungsmuster von RhoA folgen [63], wird es interessant sein zu untersuchen, ob für das RhoA-Rekrutierungsmuster eine Konsensussequenz bei kleinen GTPasen der Rho-Familie definiert werden kann und ob eine solche Konsensussequenz gegebenenfalls auch bei Nicht-Rho-Proteinen mit ähnlichem Rekrutierungsmuster zu finden ist. Schließlich ist von Interesse, ob die Proteinfaltung und damit mögliche intramolekulare Interaktionen der C‑terminalen Region eine Rolle spielen für die Determinierung des Rekrutierungsmusters. Dazu wird das C‑terminale Motiv derzeit im Labor Adam mit Nicht-Rho-Proteinen fusioniert. Damit soll geklärt werden, ob das hier beschriebene C‑terminale Rekrutierungsmotiv allein ausreicht, um ein beliebiges Protein nach Induktion durch invasive Shigellen in spezifischer Weise in den bakteriellen Invasionskomplex zu rekrutieren. Weitere offene Fragen sind, ob auch der Austausch nur eines der beiden Lysine 186/187 von RhoA gegen Arginin ausreichend ist, um ein Rekrutierungsmuster des RhoC-Typs zu erhalten, ob umgekehrt die Substitution der beiden Arginine 186/187 von RhoC durch Lysin hinreichend ist, um das Rekrutierungsverhalten zu ändern, oder ob weitere Positionen im Bereich der As 181‑188 essentiell sind für die Bestimmung des Rekrutierungsmusters von RhoA.
Durch den bakteriellen Invasionsreiz müssen an der Invasionsstelle in oder an der Plasmamembran „Verankerungspunkte“, also integrale Membranproteine, Lipide oder andere Moleküle, mit denen die rekrutierten Proteine direkt oder indirekt über weitere Mittlermoleküle interagieren können, in einem Muster angeordnet und/oder zugänglich gemacht werden, das dem beobachteten Rekrutierungsmuster entspricht. Mindestens zwei Typen von „Verankerungspunkten“ scheinen für die beiden bekannten Muster erforderlich zu sein. Ob Rho und die anderen rekrutierten Proteine am „Zielort“ mit weiteren Proteinen, oder – vermittelt durch den lipophilen C‑Terminus – mit Membranlipiden, oder mit beiden interagieren, ist nicht geklärt.
In der Plasmamembran enthaltene Phosphoinositide können an zwei Stellen spezifisch mit Rho-GTPasen interagieren: an der Insertionsregion (As 124‑136 von RhoA [185]) und dem C‑Terminus [118] und sind somit mögliche Determinanten der differentiellen Rekrutierung. 3,4,5‑PIP3 und 3,4‑PIP2 binden an Rac1 und RhoA, nicht aber an Cdc42, während 4,5‑PIP2 mit Cdc42 stärker interagiert als mit den anderen beiden GTPasen. Es läßt sich spekulieren, daß auch zwischen RhoA einerseits und RhoB, C und D andererseits Unterschiede hinsichtlich der Interaktion mit verschiedenen Phosphoinositiden bestehen, welche das Phänomen der differentiellen Rekrutierung erklären könnten.
Wie gelangen die rekrutierten Moleküle an die Bakterieneintrittsstelle? Prinzipiell denkbar scheint, daß sie durch ungerichtete Brown’sche Molekülbewegung unter anderem an die Invasionsstelle diffundieren und dort spezifisch konzentriert werden, indem sie an „ihre“ lokalen „Verankerungspunkte“ binden. Ebenso könnten sie spezifisch mit Komponenten an der Oberfläche von verschiedenen Vesikeln interagieren, deren differentielle Rekrutierung zur Invasionsstelle durch Shigella ausgelöst wird. Theoretisch denkbar wäre in diesem Zusammenhang auch, daß das Pathogen die Expression von Membranproteinen induziert, die rekrutierten Moleküle bereits am endoplasmatischen Retikulum an diese Proteine binden und dann gemeinsam mit ihnen an die vom Bakterium definierte Region der Plasmamembran transportiert werden. Allerdings ist die Zeit von wenigen Minuten, innerhalb derer die Invasion abläuft, für einen derartigen Prozeß wahrscheinlich nicht ausreichend.
Fraglich ist ebenfalls, ob Rho-GTPasen allein rekrutiert werden oder im Komplex mit einem oder mehreren weiteren Proteinen. Es ist bekannt, daß Rho im Zytoplasma mit RhoGDI komplexiert vorliegt [80, 94]. Der Rho/RhoGDI-Komplex könnte von einem oder mehreren hypothetischen „Rekrutierungsfaktoren“ spezifisch erkannt, daraufhin gespalten werden, und Rho würde allein an die Membran rekrutiert. Für die kleine GTPase Rab und RabGDI wurde ein solcher Rekrutierungsmechanismus nachgewiesen [133]; allerdings unterscheiden sich RhoGDI und RabGDI hinsichtlich Größe und Aminosäuresequenz beträchtlich [84]. Man könnte andererseits spekulieren, daß Rho-GTPasen und RhoGDI gemeinsam bis an die Membran rekrutiert werden und der Komplex erst unmittelbar am Zielort gespalten wird. Das ähnliche Rekrutierungsmuster von RhoA, Rac und Cdc42 könnte mit diesem Modell erklärt werden. RhoGDI bindet Rho-GTPasen über eine hydrophobe Tasche, welche die C‑terminal angefügte Prenylgruppe von posttranslational modifiziertem Rho aufnimmt, sowie über eine Protein-Protein-Interaktion, die wahrscheinlich C‑terminale Aminosäuren von Rho involviert. Die Protein-Protein-Interaktion ist alleine für die Komplexbildung nicht ausreichend, könnte der Bindung aber Spezifität verleihen [62, 75, 84]. Die Bindungsenergie von RhoGDI für Cdc42 beträgt etwa 12kcal/mol und liegt damit im selben Bereich wie die Bindungsenergie für geranylgeranyliertes und carboxymethyliertes Zystein an Lipidmembranen [62, 164]. Dies deutet darauf hin, daß sehr feine regulatorische Impulse genügen, um das Verhältnis von membrangebundenen zu zytosolischen RhoGTPasen substantiell zu verändern. Mögliche Regulatoren der Rho/RhoGDI-Bindung sind Membranphospholipide wie Phosphatidat und Phosphoinositide, für die gezeigt werden konnte, daß sie einen Komplex aus RhoGDI und Rac spalten [37]. Verschiedene Phosphoinositide könnten somit gleichzeitig sowohl das Überspringen von Rho-GTPasen an die Membran steuern als auch die Spezifität der Rekrutierung bestimmen, ohne daß dafür unterschiedliche GDIs notwendig wären. Nach Trennung von Rho und RhoGDI könnte der – GEF-gesteuerte – Austausch von GDP zu GTP erfolgen, und das Protein befände sich schließlich am richtigen Ort im erforderlichen Aktivitätszustand.
Eine Fülle von Proteinen, die mit RhoA in vitro und in vivo interagieren können, sind beschrieben worden. Oft wurde in diesen Studien nur RhoA untersucht, oder es konnten zwischen den Isoformen RhoA, B und C keine Unterschiede gefunden werden. Aufgrund der fast vollständigen Übereinstimmung in den relevanten Molekülregionen kann man davon ausgehen, daß viele Rho-Effektorproteine von allen drei Isoformen aktiviert werden können. Ob eine Interaktion wirklich stattfindet und welche Folgen sie hat, hängt aber letztendlich von der gleichzeitigen Präsenz der beiden Partner an einem genau bestimmten Ort innerhalb der Zelle ab. Durch das Shigella-Invasionsmodell ergibt sich eine Möglichkeit, die Rolle des Ortsaspekts für die Wirkung von Proteinen innerhalb von Zellen näher zu untersuchen. Kürzlich konnte so die Relevanz des Rekrutierungsphänomens für die Selektion eines aus mehreren biochemisch möglichen Interaktionspartnern in vivo am Beispiel von myr5 gezeigt werden: Myr5 reagiert in vitro in ähnlicher Weise mit RhoA‑C, kolokalisiert während der Shigelleninvasion aber nur mit RhoC und nicht mit RhoA [63]. So scheint der tatsächliche Reaktionspartner von myr5 in der Zelle durch die spezifische Rekrutierung bestimmt zu werden. Auch anhand von metastasierenden Tumorzellen wurde unlängst ein Unterschied der Funktionen von RhoA und RhoC in vivo aufgezeigt [39]. Ob dieser Unterschied durch Interaktion mit verschiedenen Effektoren oder ebenfalls durch ein Rekrutierungsphänomen (oder durch beide Mechanismen) erklärt werden kann, ist jedoch noch unklar.
Alle Ergebnisse wurden an einem Zellkulturmodell mit HeLa-Zellen gewonnen, in welche die genetische Information für die untersuchten Proteine künstlich eingeführt wurde. Was die Invasion von Shigella unter natürlichen Verhältnisse betrifft, entsteht eine Reihe von neuen Fragen, die mit dem hier benutzten experimentellen System nicht ohne weiteres beantwortet werden können. RhoA und RhoC sind in Säugetiergeweben weit verbreitet, das Expressionsniveau variiert allerdings in Abhängigkeit vom Gewebetyp. Während RhoA in allen untersuchten Geweben detektiert werden konnte, wurde RhoC z. B. in Muskel und Milz nicht nachgewiesen [51]. RhoB wird in vielen Zelltypen nicht konstitutiv exprimiert, sondern muß zunächst induziert werden [81]. RhoD ist im Gewebe von Mäusen weitverbreitet [126]. Darmgewebe wurde jedoch in keiner der Arbeiten über Expression von Rho untersucht. Man muß annehmen, daß nur konstitutiv exprimiertes Rho für die Regulierung der bakteriellen Invasion zur Verfügung stehen kann, da der Invasionsprozeß in einem Zeitraum (wenige Minuten) abgeschlossen ist, in dem wahrscheinlich keine ausreichende De-novo-Proteinsynthese stattfinden kann. Welche Rho-GTPasen in menschlichen Enterozyten tatsächlich exprimiert werden, ist zum jetzigen Zeitpunkt nicht bekannt.
Es ist gezeigt worden, daß Rho für die Epithelzellinvasion durch Shigella notwendig ist, indem HeLa- [3] und eine Reihe anderer kultivierbarer Zellen [183] mit C3-Exoenzym bzw. Clostridium difficile Toxin B behandelt wurden. Da diese Toxine nicht spezifisch für einzelne Isoformen sind [160], bleibt ungeklärt, ob alle Rho-Isoformen für die Invasion essentiell sind, oder nur einzelne. Diese Frage stellt sich vor allem für die Rho-Isoformen B und C, sowie für RhoD, für die mit den hier verwendeten Methoden kein Unterschied im Rekrutierungsmuster festgestellt werden konnte. Können sich diese drei GTPasen während der Internalisierung des Pathogens funktionell gegenseitig vertreten, oder nehmen sie unterschiedliche Funktionen wahr? Um entsprechende Antworten zu finden, müßten Enterozyten auf ihren Gehalt an Rho-Isoformen untersucht, und andererseits durch selektive Blockierung einzelner Isoformen deren Rollen im Invasionsprozeß determiniert werden. Durch die Identifizierung von Aminosäuresequenzabschnitten, die das differentielle Rekrutierungsmuster definieren, ergibt sich ein Ansatzpunkt für eine solche isoformspezifische Blockierung. Die weitere Aufdeckung des komplexen Zusammenspiels zwischen Shigella und der Darmepithelzelle im Rahmen der Epithelzellinvasion ist somit von hohem bakteriologischem, zellbiologischem und pathophysiologischem Interesse und verspricht ein vertieftes Verständnis bakterieller Pathogenitätsmechanismen.
Shigella ist der Erreger der bakteriellen Dysenterie (Ruhr), einer entzündlichen Erkrankung des Dickdarms. Notwendige Bedingung für die Pathogenese der Krankheit ist die Invasion von Darmepithelzellen durch den Erreger. Durch Sekretion von Invasionsproteinen (Ipa) induziert das Bakterium dabei seine eigene Aufnahme in Zellen, die normalerweise keine phagozytische Aktivität aufweisen. Shigella löst in der Wirtszelle Rearrangements des Aktinzytoskeletts aus, die zum Auswachsen von Plasmamembranprotrusionen und zur Bildung einer blütenkelchähnlichen Struktur führen. Innerhalb dieser Struktur wird das Pathogen schließlich internalisiert.
Die Umbauvorgänge am Aktinzytoskelett sind abhängig von der Funktion eines Wirtszellproteins, der kleinen GTPase Rho. Rho bildet zusammen mit weiteren verwandten Proteinen wie Rac und Cdc42 eine Gruppe (Rho-Familie) innerhalb der Superfamilie der Ras-ähnlichen kleinen GTPasen und funktioniert als molekularer Schalter: Im GTP-gebundenen Zustand ist das Molekül in der Lage, Effektoren zu aktivieren, nach Hydrolyse von GTP zu GDP befindet sich das Protein dagegen im „Aus“-Zustand. Drei Isoformen von Rho (A, B und C) sind beschrieben, deren Sequenzen zu etwa 90% identisch sind und die sich auch von ihren biochemischen Eigenschaften her weitgehend ähneln. Daher konzentrierte sich das wissenschaftliche Interesse bislang vorwiegend auf eine Isoform, RhoA. Allerdings wurden in der Art der posttranslationalen Modifikation und in der intrazellulären Lokalisation schon frühzeitig Unterschiede zwischen RhoB einerseits und RhoA und C andererseits aufgezeigt. Im Laufe der Zellinvasion durch Shigella werden Rho-Isoformen differentiell an die Bakterieneintrittsstelle rekrutiert, wobei sich lichtmikroskopisch zwei Muster definieren lassen, anhand derer sich RhoA gegen RhoB und RhoC abgrenzen läßt: RhoA akkumuliert vorwiegend um die eindringenden Bakterien herum, während sich RhoB und RhoC hauptsächlich in den bakterieninduzierten Membranprotrusionen konzentrieren.
Ziel der vorliegenden Studie war es, einen Abschnitt der Aminosäuresequenz der Rho-Isoformen, der die Art des Rekrutierungsmusters determiniert oder zumindest beeinflußt, näher zu charakterisieren. Darüber hinaus wurde der Frage nachgegangen, ob sich das Rekrutierungsphänomen auf die drei Isoformen RhoA, B und C beschränkt, oder ob auch andere, verwandte kleine GTPasen an die Bakterieneintrittsstelle transloziert werden können. Zu diesem Zweck wurde hier das Rekrutierungsverhalten der kleinen GTPase RhoD, die den drei Isoformen A, B und C auf der Primärstrukturebene nur zu etwa 50% homolog ist, untersucht. Durch die Herstellung einer Reihe mit einem Peptid-tag versehener Rho-(Hybrid-)Konstrukte durch PCR-vermittelte gezielte Mutagenese und Analyse dieser Konstrukte in einem HeLa-Zell-Modell gelang es, Primärstrukturabschnitte einzugrenzen, welche die Ausprägung des einen oder anderen Rekrutierungstyps determinieren. Ebenso wurde eine entsprechende Rolle für andere Abschnitte ausgeschlossen.
Das Vorhandensein der CaaX-Gruppe, Ort der posttranslationalen Isoprenylierung und Carboxymethylierung von Rho, ist zwar – wie bereits bekannt war – eine notwendige Voraussetzung für den Ablauf des Rekrutierungsphänomens an sich, das Motiv leistet aber keinen Beitrag zur Bestimmung des differentiellen Rekrutierungsmusters. Auch die Phosphorylierung von RhoA an Ser188 durch die Proteinkinase A (PKA) scheint im Zusammenhang mit der besonderen Rekrutierung dieser Isoform keine Rolle zu spielen. Dagegen konnte ein prä-C‑terminal gelegener Abschnitt von acht Aminosäuren eingegrenzt werden, der notwendige Informationen für die Expression des jeweiligen Translokationsmusters während der Shigelleninvasion tragen muß: Der Austausch der Aminosäuren 181‑188 zwischen RhoA und RhoC führt zum Wechsel der Rekrutierungsmuster. Nach näherer Untersuchung des präterminalen Abschnitts konnte ein Motiv von zwei Lysinen (Lys186-Lys187) definiert werden, das für die Ausprägung des RhoA-Rekrutierungsmusters essentiell ist.
Erstmals wurde hier nachgewiesen, daß außer RhoA, B und C zumindest noch eine weitere verwandte kleine GTPasen an die Bakterieneintrittsstelle rekrutiert werden kann. Interessanterweise wird auch RhoD, ein Protein, das sich in Funktion und Primärstruktur deutlich von den drei „klassischen“ Isoformen A, B und C abgrenzen läßt, im Laufe der Zellinvasion durch Shigella transloziert und folgt dabei dem bereits bekannten Rekrutierungsmuster von RhoB und RhoC.
Die gezeigten Ergebnisse lenken die Aufmerksamkeit auf die Bedeutung einer präzise definierten subzellulären Lokalisation für die Funktion von Biomolekülen und geben Anlaß zur Spekulation, daß auch biochemisch sehr ähnliche Proteine wie RhoA und RhoC lediglich aufgrund eines unterschiedlichen Verteilungsmusters unterschiedliche Aufgaben erfüllen könnten. Nach Identifizierung der das differentielle Rekrutierungsmuster definierenden Aminosäuren dürfte eine spezifische Blockierung einzelner Isoformen möglich werden. Dieser Ansatz könnte zu einem besseren Verständnis der konkreten Rolle der jeweiligen Isoformen für die Epithelzellinvasion durch Shigella führen.
Ich erkläre hiermit an Eides statt, daß die vorliegende Dissertation von mir selbst und ohne die unzulässige Hilfe Dritter verfaßt wurde, auch in Teilen keine Kopie anderer Arbeiten darstellt und die benutzten Hilfsmittel sowie die Literatur vollständig angegeben sind.
Thomas Haustein
Prof. Dr. Dr. Ulf B. Göbel danke ich für die Möglichkeit, an seinem Institut wissenschaftlich zu arbeiten.
Mein ganz besonderer Dank gilt Dr. Thomas Adam für die Überlassung des Themas und die hervorragende Betreuung meiner Arbeit in seinem Labor. Thomas Adam war stets für mich erreichbar und unterstützte diese Arbeit mit vielen wertvollen Anregungen und konstruktiver Kritik. In zahlreichen Gesprächen vermittelte er mir einen Teil seines umfassenden und vielseitigen Wissens.
Ich danke Anke Friedrich und Dr. Barbara Graf für die angenehme Zusammenarbeit und ihre große Geduld bei der Einweisung in den Laborbetrieb.
Christian Böwe, Jan Eucker, Elmira Far, Veronika Gohlke, Stefan Höhne, Abba Moussa, Indre Offermann, Cord Schlötelburg, Roland Siewerdt und Friedrich von Wintzingerode danke ich für die großartige Arbeitsatmosphäre. Ihnen ist zu einem erheblichen Teil zu verdanken, daß die tagtägliche Arbeit im Labor immer Spaß gemacht hat.
Meinen Eltern Irmgard und Gerhard Haustein bin ich zutiefst dankbar für ihre Unterstützung und ihr Verständnis, mit dem sie meinen Weg begleitet haben.