Ergebnisbeschreibung

Um Sequenzabschnitte einzugrenzen, die das differentielle Rekrutierungsmuster von Rho-Isoformen während der Zellinvasion durch Shigella determinieren, wurde eine Reihe von rho-Hybridkonstrukten mit Hilfe PCR-vermittelter Mutagenese hergestellt, in Vektoren kloniert und im HeLa-Zell-Modell analysiert. Bei den exprimierten Hybridkonstrukten war ein kurzer Abschnitt der Aminosäuresequenz durch den entsprechenden Bereich einer anderen Isoform ersetzt. Damit konnte der Einfluß dieser Abschnitte auf das Rekrutierungsverhalten untersucht werden. Durch einen N‑terminal angebrachten vsv-Peptid-tag wurde eine einfache Markierung mit antikörpergekoppelten Fluoreszenzfarbstoffen ermöglicht. An den beiden Enden jedes Konstrukts und zwischen rho-Sequenz und vsv-tag-Sequenz wurden Schnittstellen für definierte Restriktionsenzyme eingefügt.

HeLa Zellen wurden mit rho-Konstrukt-DNS transient transfiziert und fixiert. Das exprimierte Konstrukt sowie F-Aktin wurden spezifisch angefärbt, um die Wirkung der Konstrukte auf das Aktinzytoskelett zu beobachten. In weiteren Experimenten wurden die Zellen zusätzlich mit S. flexneri SC301 infiziert. Nach Fixierung und Färbung wurde so eine Momentaufnahme des Invasionsprozesses erhalten. Die mutierten Rho-Proteine konnten dann hinsichtlich ihres Verteilungsmusters in der Zelle untersucht werden.

PCR-vermittelte gezielte Mutagenese PCR-Strategie für alle Konstrukte

Die Molekülregionen, die variiert werden sollten, befanden sich nahe am 5'‑ oder 3'‑Ende der rho-DNS (Kodons 14, 19, sowie die letzten 4 (RhoB,D) bzw. 13 (RhoA, C) Kodons). Daher ließen sich Mutationen durch PCR mit modifizierten Oligonukleotiden vergleichsweise einfach einführen. Verwendet wurden Pwo-Polymerase, die Oligonukleotide aus Tab. 2-5, sowie DNS-Matrizen aus Tab. 2-6. Die Reaktionsbedingungen wurden zuvor unter Verwendung der preisgünstigeren Taq-Polymerase optimiert. Mit Hilfe der Oligos wurde die rho-Sequenz auch mit Schnittstellen für Restriktionsenzyme versehen.

Die Matrizenplasmide wurden mit dem Miniprep-Kit aus E. coli-Wirtsstämmen präpariert und durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolpräzipitation gereinigt.

Konstrukte auf der Basis von rhoA, B oder C

Benutzt wurden die Matrizen Temp1-4, sowie alle Oligos außer Nr. 65-69. Alle 5'-Primer enthielten eine KpnI-Schnittstelle, alle 3'-Primer eine PstI-Schnittstelle. (Schema: Abb. 3-1)

Abb. 3 - 1 PCR-Schema für RhoA/B/C-Konstrukte

Die PCRs zur Herstellung der einzelnen Konstrukte wurden nach Tab. 2-4 durchgeführt. Abweichungen vom Standardprotokoll sind in Tab. 3-1 aufgeführt.

Konstrukt

RhoA^G14V

RhoA^T19N

RhoABB

RhoBBA

RhoCCA

RhoA^S188P

RhoCAC

5'-Oligo

60

61

7

5

25

7

25

3'-Oligo

6

6

64

62

63

70

79

DNS-Matrize (template)

rhoA
(Temp1)

rhoA
(Temp1)

rhoA
(Temp1)

rhoBdel
(Temp2)

rhoC
(Temp3)

rhoA
(Temp1)

rhoC
(Temp4)

Matrizen-DNS-Menge / pmol (gesamt)

0,36

0,36

0,36

0,54

0,36

0,18

0,18

Zahl der Ansätze

2

2

2

3

2

2

2

Zahl der Zyklen

10

13

13

13

13

13

16

Abweichungen von der Standard-Anlagerungstemperatur für Primer und DNS-Matrize (50°C)

2.-16. Zyklus: 55°C

Tab. 3 - 1 PCR-Reaktionsbedingungen für RhoA/B/C-Konstrukte

Konstrukte, die auf rhoD basieren
Für die PCR wurden die Oligos 65-67 sowie die Matrize Temp5 verwendet. Alle 5'‑Primer enthielten eine EcoRI-Schnittstelle, alle 3'‑Primer eine XbaI-Schnittstelle (Schema: Abb. 3-2). Für das Konstrukt RhoD wurden lediglich Schnittstellen angefügt, die Sequenz blieb ansonsten unverändert. Reaktionsbedingungen für die RhoD-Konstrukt-PCRs sind in Tab. 2-4 und 3-2 angegeben.

Abb. 3 - 2 PCR-Schema für RhoD-Konstrukte

Konstrukt

RhoD

RhoDDA

5'-Oligo

65

3'-Oligo

66

67

DNS-Matrize (template)

rhoD (Temp5)

Matrizen-DNS-Menge / pmol (gesamt)

0,18

Zahl der Ansätze

2

Zahl der Zyklen

13

Abweichungen von der Standard-Anlagerungstemperatur für Primer und DNS-Matrize (50°C)

40°C für Zyklen 1-3

Tab. 3 - 2 PCR-Reaktionsbedingungen für RhoD-Konstrukte

Präparation der Klonierungsvektoren
Die durch die PCR gewonnenen, veränderten rho-DNS-Moleküle wurden zunächst in den Standardvektor pUC19, von dem die vollständige Sequenz bekannt ist, kloniert und sequenziert. Zur Expression in HeLa-Zellen wurden die Konstrukte dann in den eukaryotischen Expressionsvektor pKC3 umkloniert. Die Konstrukte wurden nicht direkt, d.h. ohne den Umweg über pUC19, in pKC3 kloniert, weil die bei den RhoA/B/C-Konstrukten zwischen vsv-tag und rho-Sequenz angebrachte Schnittstelle KpnI in pKC3 außerhalb der Klonierungsstelle noch einmal vorkommt.
pUC19 für auf rhoA, B oder C basierende Konstrukte
Das pUC19-Plasmid „P1“ (Tab. 2-1) mit dem Insert „EcoRI – vsv – KpnI – rhoA 1‑193 – Stop – PstI“ wurde mit Hilfe des Miniprep-Kits präpariert. Die DNS wurde dreimal mit KpnI und PstI geschnitten und dephosphoryliert, um eine Religation der Fragmente zu verhindern. Nach jedem dieser drei Zyklen wurde die DNS mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. So ergab sich ein für die PCR-Produkte geeigneter Klonierungsvektor, mit dem gleichzeitig N‑terminal die Nukleinsäuresequenz für den vsv-Peptid-tag angefügt werden konnte. Der Vektor wird im folgenden als V1 bezeichnet (Abb. 3-3).

Abb. 3 - 3 Schema des Klonierungsvektors V1
pKC3 für auf rhoA, B oder C basierende Konstrukte
Das Plasmid „P2“ (Tab. 2-1) wurde zweimal mit EcoRI und PstI geschnitten, an den Enden dephosphoryliert und jeweils gereinigt. In den resultierenden offenen Vektor V2 (Abb. 3-4) konnten die kompletten Konstrukte einschließlich des vsv-tag kloniert werden.

Abb. 3 - 4 Schema des Klonierungsvektors V2
pUC19 für auf rhoD basierende Konstrukte
Ein „leerer“ pUC19 Vektor (Plasmid P3, Tab. 2-1) wurde mit dem Miniprep-Kit präpariert, zweimal mit EcoRI und XbaI geschnitten und dephosphoryliert. Nach jedem Reaktionszyklus wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Es ergab sich ein für die auf rhoD basierenden PCR-Produkte geeigneter Klonierungsvektor, ohne vsv-Peptid-tag. Er erhielt die Bezeichnung V3 (Abb. 3-5).

Abb. 3 - 5 Schema des Klonierungsvektors V3
pKC3 für auf rhoD basierende Konstrukte
Um die rhoD-Sequenzen mit dem vsv-Peptid-tag zu versehen, wurde ein pKC3-Vektor entsprechend vorbereitet: Ein pKC3-Plasmid mit dem Insert EcoRI – Sendai-tag – KpnI – rhoB – XbaI wurde mit EcoRI und PstI geschnitten. Dies ergab drei Fragmente, weil rhoB eine interne PstI-Schnittstelle enthält. Da ein nicht phosphoryliertes DNS-Molekül mit dem Vektor ligiert werden sollte, durften die Enden der Vektor-DNS nicht dephosphoryliert werden. Deshalb wurde das Vektorfragment über ein Agarosegel von den beiden kleinen Insertfragmenten isoliert, aus dem Gel extrahiert und durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolpräzipitation gereinigt.

Die Oligos 68 und 69 wurden zu folgendem DNS-Doppelstrang hybridisiert:

Dieses Oligo-Insert wurde mit dem präparierten pKC3-Vektor ligiert und zur Transformation von E. coli DH₅ _α eingesetzt. Am 5'‑Ende des Inserts war eine unvollständige, offene EcoRI-Schnittstelle angebracht, die eine Ligation mit dem EcoRI-geschnittenen Vektor zwar ermöglichte, danach aber nicht mehr von EcoRI erkannt werden konnte. Somit wurde die andere, im Insert nach dem vsv-tag angebrachte, EcoRI-Sequenz zur einzigen EcoRI-Schnittstelle. Zwischen die EcoRI- und die XbaI-Schnittstelle des pKC3-Plasmids konnten nun die modifizierten rhoD-Sequenzen kloniert werden. Das Plasmid wurde zweimal mit EcoRI und XbaI geschnitten und an den Enden dephosphoryliert. Es erhielt die Bezeichnung V4 (Abb. 3-6).

Abb. 3 - 6 Schema des Klonierungsvektors V4
Übersichtstabelle über die Klonierungsvektoren

Bez.

Vektortyp

Ursprungsplasmid (vgl. Tab. 2-1)

Geöffnete Klonierungsstelle

Dephosphorylierte Enden

V1

pUC19

P1

—EcoRI – vsv – KpnI

PstI—

ja

V2

pKC3

P2

—EcoRI

PstI—

ja

V3

pUC19

P3

—EcoRI

XbaI—

ja

V4

pKC3

P4

—SalI – vsv – EcoRI

XbaI—

nein

Tab. 3 - 3 Übersichtstabelle über die Klonierungsvektoren

Klonieren und Sequenzieren der auf rhoA, B oder C basierenden
DNS-Konstrukte Isolierung der PCR-Produkte
Um die DNS aus dem PCR-Ansatz in möglichst reiner Form zu erhalten, wurde zunächst eine Phenol/Chloroform-Extraktion mit anschließender Ethanolpräzipitation durchgeführt. Darauf wurden die PCR-Produkte von den Matrizenplasmiden elektrophoretisch getrennt. Um eine gleichmäßige Wanderungsgeschwindigkeit der Plasmide zu erreichen, wurden sie zuvor mit PstI geschnitten und damit linearisiert. Dadurch wurde gleichzeitig je ein Ende der PCR-Produkte für die Klonierung präpariert. Die Banden mit den PCR-Produkten wurden aus dem Gel ausgeschnitten, und die DNS wurde extrahiert. Durch Schneiden der DNS mit KpnI wurde auch das jeweils andere Ende der PCR-Produkte zum Klonieren in den pUC19-Vektor (V1) vorbereitet.
Klonieren der PCR-Produkte in pUC19
Die PCR-Produkte wurden mit dem offenen Vektor V1 ligiert (Abb. 3-7), und die resultierenden Plasmide wurden zur Transformation von kompetenten E. coli DH₅ _α eingesetzt. Die transformierten Stämme wurden asserviert und bei –80°C gelagert.

Abb. 3 - 7 Klonieren der rhoA/B/C-PCR-Produkte in pUC19
Sequenzierung
Um die PCR-Produkte auf eventuelle Replikationsfehler zu überprüfen, wurden die in pUC19 klonierten DNS-Konstrukte einschließlich des vsv-tag sequenziert und mit den ursprünglichen rho-Sequenzen sowie den verwendeten Primern verglichen. Alle Konstrukte waren fehlerfrei.
Umklonieren der Konstrukte in pKC3
Um die kompletten vsv-Rho-Konstrukte in HeLa-Zellen exprimieren zu können, wurde die DNS in den eukaryotischen Expressionsvektor pKC3 umkloniert. Die pUC19-Plasmide mit den rho-Sequenzen wurden aus dem transformierten Wirtsstamm E. coli DH₅ _α präpariert und mit EcoRI und PstI geschnitten. Die Inserts wurden vom pUC19-Vektor elektrophoretisch getrennt, mit Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolpräzipitation gereinigt und mit dem offenen pKC3-Vektor V2 ligiert (Abb. 3-8). Mit den kompletten Plasmiden wurden kompetente E. coliDH₅ _α transformiert. Die transformierten Stämme wurden bei –80°C eingefroren.

Abb. 3 - 8 Klonieren der kompletten vsv-rhoA/B/C-DNS-Konstrukte in pKC3

Klonieren und Sequenzieren der auf rhoD basierenden Konstrukte
Es wurde analog zu Abschnnitt 3.3 verfahren. Im folgenden wird daher nur auf Besonderheiten eingegangen.
Klonieren der PCR-Produkte in pUC19
Die mit den Restriktionsenzymen EcoRI und XbaI geschnittenen PCR-Produkte wurden mit dem offenen Vektor V3 ligiert; die resultierenden Plasmide (Abb. 3-9) wurden zur Transformation von kompetenten E. coli ZK501 eingesetzt. Die Verwendung dieses Stamms erwies sich als notwendig, da sich auf dem nichtkodierenden Strang der rhoD-Konstrukte am Übergang zur XbaI-Schnittstelle die Dam-sensitive Sequenz 5'‑GATC‑3' ergab. Die Dam-Methylase erkennt dieses Sequenzmotiv spezifisch und modifiziert die DNS an dieser Stelle durch Methylierung von Adenin [57, 148]. In dam-positiven Stämmen wie DH₅ _α wird dadurch die XbaI-Erkennungssequenz TCTAGA für das Restriktionsenzym unkenntlich, und das Molekül kann an dieser Stelle nicht geschnitten werden. ZK501 ist dagegen dam-negativ. Die transformierten Stämme wurden asserviert und bei —80°C gelagert.

Abb. 3 - 9 Klonieren der rhoD-PCR-Produkte in pUC19
Abweichung der DNS-Sequenz von rhoD gegenüber der publizierten Sequenz
Die in pUC19 klonierten auf rhoD basierenden DNS-Konstrukte wurden ebenfalls zur Kontrolle sequenziert. Kodon 27 von rhoD wich von der publizierten Sequenz [126] in einer Base ab. Die publizierte Sequenz ist „GGG“ (Glyzin), während die in dieser Studie gefundene Sequenz „GTG“ (Valin) lautet. Dieser Unterschied zeigte sich beim Sequenzieren in beiden Richtungen und bei beiden RhoD-Konstrukten (RhoD und RhoDDA).
Umklonieren der Konstrukte in pKC3
Die pUC19-Plasmide mit den von rhoD abgeleiteten Konstrukten wurden präpariert und mit den Restriktionsenzymen EcoRI und XbaI geschnitten. Die Inserts wurden vom pUC19-Vektor elektrophoretisch getrennt, gereinigt und mit dem offenen Vektor ligiert. Somit wurden vollständige Konstrukte mit vsv-tag erhalten, die in HeLa-Zellen exprimiert werden konnten (Abb. 3-10).

Mit den kompletten Plasmiden wurden kompetente E. coli DH₅ _α transformiert. Dam-Methylierung spielte jetzt keine Rolle mehr, da das DNS-Molekül nicht mehr geschnitten werden mußte. Die transformierten Stämme wurden bei –80°C eingefroren.

Übersicht über die hergestellten Konstrukte

Name des Konstrukts

Länge ohne vsv-tag

As von RhoA

As von RhoB

As von RhoC

As von RhoD

CaaX-Gruppe von

bp

As

RhoD

633

210

1-210

RhoD

RhoA^G14V

582

193

1-13, 15-193

RhoA

RhoA^T19N

582

193

1-18, 20-193

RhoA

RhoAAB

582

193

1-189

193-196

RhoB

RhoBBA

591

196

190-193

1-193

RhoA

RhoCCA

582

193

190-193

1-189

RhoA

RhoDDA

633

210

190-193

1-206

RhoA

RhoA^S188P

582

193

1-187, 189-193

RhoA

RhoCAC

582

193

181-188

1-180, 189-193

RhoC

Tab. 3 - 4 Im Rahmen der vorliegenden Studie hergestellte Konstrukte

Übersichtstabelle über die transformierten E. coli-Stämme

Konstrukt

Beschreibung des Inserts

Vektor

Wirtstamm

(E. coli)

Stamm Nr.

(Klonierungsvektor für vsv-rhoD / DDA)

SalI – vsv-tag – EcoRI – XbaI – PstI

pKC3

DH₅ _α

S 333

RhoD

EcoRI – Eco32I – rhoD – stop – XbaI

pUC19

DH₅ _α

S 321

ZK 501

S 356

vsv-RhoD

[Vektor von S333 + rhoD von S356]
SalI – vsv – EcoRI – Eco32I – rhoD – stop – XbaI

pKC3

DH₅ _α

S 334

vsv-RhoA^G14V

EcoRI – vsv – KpnI – rhoA ^G14V – stop – PstI

pUC19

DH₅ _α

S 313

pKC3

DH₅ _α

S 326

vsv-RhoA^T19N

EcoRI – vsv – KpnI – rhoA ^T19N – stop – PstI

pUC19

DH₅ _α

S 312

pKC3

DH₅ _α

S 327

vsv-RhoAAB

EcoRI – vsv – KpnI – rhoAAB – stop – PstI

pUC19

DH₅ _α

S 309

pKC3

DH₅ _α

S 323

vsv-RhoBBA

EcoRI – vsv– KpnI – rhoBBA – stop – PstI
Kodon 180 von rhoB: CAG => CAA, um PstI-Schnittstelle zu eliminieren (vgl. Temp2)

pUC19

DH₅ _α

S 310

pKC3

DH₅ _α

S 324

vsv-RhoCCA

EcoRI – vsv – KpnI – „CAT“ – rhoCCA – stop – PstI

pUC19

DH₅ _α

S 311

pKC3

DH₅ _α

S 325

RhoDDA

EcoRI – Eco32I – rhoDDA – stop – XbaI

pUC19

DH₅ _α

S 322

ZK 501

S 357

vsv-RhoDDA

[Vektor von S333 + rhoDDA von S357]
SalI – vsv – EcoRI – Eco32I – rhoDDA – stop – XbaI

pKC3

DH₅ _α

S 335

vsv-RhoA^S188P

EcoRI – vsv – KpnI – rhoA ^S188P – stop – PstI

pUC19

DH₅ _α

S 337

pKC3

DH₅ _α

S 336

vsv-RhoCAC

EcoRI – vsv – KpnI – „CAT“ – rhoCAC – stop – PstI

pUC19

DH₅ _α

S 353

pKC3

DH₅ _α

S 354

Tab. 3 - 5 Im Rahmen der vorliegenden Studie transformierte und asservierte Stämme von E. coli

Expression der Konstrukte in HeLa-Zellen
Die pKC3-Plasmide mit den klonierten rho-Konstrukten wurden mit dem Maxiprep-Kit präpariert, um für die Transfektionsexperimente ausreichende Mengen an DNS zur Verfügung zu haben. Die so erhaltene DNS wurde zusätzlich durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolpräzipitation gereinigt. Verwendet wurden sowohl die in Tab. 3-4 aufgeführten Konstrukte als auch die im Labor bereits vorhandenen Konstrukte aus Tab. 2-12. Alle analysierten rho-DNS-Konstrukte ließen sich mit der oben beschriebenen Transfektionsmethode in HeLa-Zellen einführen und wurden von den Zellen exprimiert. Wurden die exprimierten Proteine, wie beschrieben, mit einem vsv-Antikörper und einem farbstoffkonjugierten Sekundärantikörper markiert, erschienen große Teile des Zytoplasmas transfizierter Zellen intensiv gefärbt.

Innerhalb eines Experiments wurden die Zellen in den verschiedenen Löchern der Kulturplatten immer mit unterschiedlichen Konstrukten transfiziert, um die Möglichkeit des unmittelbaren Vergleichs zu haben. Grundsätzlich wurden Kontrollzellen mit rhoA einerseits und rhoB oder rhoC andererseits transfiziert. Außerdem dienten nicht transfizierte Zellen als Kontrollen für die Spezifität der verwendeten Antikörper.

Zytoskelettdarstellung von nichtinfizierten, aber mit mutierten rho-Konstrukten transfizierten HeLa-Zellen
Da gleichzeitig mit den mutierten Rho-Proteinen auch F‑Aktin fluoreszenzmarkiert wurde, konnten benachbarte transfizierte und nichttransfizierte Zellen hinsichtlich ihres Aktinzytoskeletts verglichen werden. Paare von Fotografien in einer einzigen Ebene, die denselben Bildausschnitt zeigen, wurden mit dem 40er-Objektiv und der CCD-Kamera mit den Filtersätzen I und II (Tab. 2-15) aufgenommen. Der epr-Algorithmus fand hier keine Anwendung. Für alle gezeigten Bilder gilt: Rho-Proteine sind rot, F‑Aktin ist grün eingefärbt.
Auf rhoA, B oder C basierende Konstrukte
Zellen, die mit auf rhoA, B oder C basierenden Konstrukten transfiziert waren, zeigten ein im Vergleich zu nicht transfizierten Kontrollzellen deutlich verändertes Aktinzytoskelett
(Abb. 3-11 a-u). Die Menge an F‑Aktin war vermehrt. Ein dichtes Netz von Streßfaserbündeln war sichtbar, das über das gesamte Zytoplasma verteilt war, während der Zellkern typischerweise als Aussparung in diesem Fasernetz erschien. Die beiden bereits bekannten Rho-Mutanten RhoA^G14V (Abb. 3-11 a,b) und RhoA^T19N (Abb. 3-11 c,d) dienten als Positiv- bzw. Negativkontrolle: Zellen, die das konstitutiv aktive RhoA^G14V exprimierten, zeigten ein im Vergleich zu nichttransfizierten Zellen sehr dichtes Netz von Streßfilamenten. Zellen, die das konstitutiv inaktive RhoA^T19N enthielten, konnten dagegen weder morphologisch, noch aufgrund ihres Gehalts an F‑Aktin von nichttransfizierten Nachbarzellen unterschieden werden.

Abb. 3 - 11 Expression der auf rhoA, B oder C basierenden Konstrukte in HeLa-Zellen. Für alle Bildpaare gilt: Rho-Proteine sind rot, F‑Aktin ist grün angefärbt. Nach Transfektion mit entsprechenden Konstrukten exprimierten die Zellen folgende mutierte Rho-Proteine: RhoA^G14V (a,b – Positivkontrolle), RhoA^T19N (c,d – Negativkontrolle), RhoAAB (e,f), RhoBBA (g,h), RhoCCA (i,k), RhoACA (l,m), RhoCAC (n,o), RhoA^S188P (p,q), RhoA^R183K (r,s) und RhoA^KK186-187RR (t,u). Vgl. Tab. 2-12 und 3-4.
Auf rhoD basierende Konstrukte
Die beiden auf rhoD basierenden Konstrukte RhoD und RhoDDA unterschieden sich in ihrer Wirkung auf das HeLa-Zytoskelett von den anderen Rho-Isoformen. Transfizierte Zellen konnten aufgrund der Morphologie ihres Zellgerüsts entweder nicht sicher von Kontrollzellen abgegrenzt werden (Abb. 3-12 a,b; e,f), oder sie zeigten eher dezente Veränderungen: F‑Aktin war in manchen Zellen, die RhoD-Konstrukte überexprimierten, leicht vermehrt, erschien aber mehr diffus verteilt und war nur vereinzelt in Form von Streßfilamenten organisiert (Abb. 3-12 c,d; g,h). Zwischen RhoD und RhoDDA konnte hier kein Unterschied festgestellt werden.

Abb. 3 - 12 Expression der auf rhoD basierenden Konstrukte in HeLa-Zellen. Für alle Bildpaare gilt: Rho-Proteine sind rot, F‑Aktin ist grün eingefärbt. Die Zellen exprimierten nach Transfektion RhoD (a,b; c,d) und RhoDDA (e,f; g,h). Vgl. Tab. 3-4.

Rekrutierungsverhalten der mutierten Rho-Proteine während der HeLa-Zellinvasion durch Shigella flexneri SC301
Mit rho-Konstrukten transfizierte HeLa-Zellen wurden mit S. flexneri SC301 infiziert (vgl. 2.6.1). Die mit dem vsv-tag versehenen Rho-Proteine und F‑Aktin wurden wie beschrieben (2.7) angefärbt. Alle Experimente wurden mindestens dreimal reproduziert.

Die Bakterieneintrittsstellen an transfizierten Zellen wurden am Mikroskop mit dem 100er-Objektiv betrachtet und mit der CCD-Kamera fotografiert. Jeder Bildausschnitt (eine Ebene eines Bilderstapels) wird hier in drei verschiedenen Ansichten gezeigt: Die einfarbigen Bilder zeigen entweder das Verteilungsmuster des jeweiligen mutierten Rho-Proteins (rot) oder die Architektur des F‑Aktin-Zytoskeletts (grün). In der dritten Ansicht sind die beiden monochromen Bilder übereinander projiziert, um die Lagebeziehung der einzelnen Bildkomponenten darzustellen.
Kontrollen: RhoA, RhoB und RhoC
Abb. 3 - 13 Rekrutierungsverhalten von RhoA (a-c; d-g), RhoB (h-k) und RhoC (l-n). Rot: Rho. Grün: F‑Aktin. Blau (f,g): DNS (Zellkern und Bakterien). Abb. (c), (g), (k) und (n) setzen sich aus den monochromen Bildern der jeweiligen Zeile zusammen.

Das Rekrutierungsverhalten von RhoA (Abb. 3-13 a-g), RhoB (Abb. 3-13 h-k) und RhoC (Abb. 3-13 l-n) war bereits bekannt [3] und diente als Ausgangspunkt für die vorliegende Studie. Um einen Vergleichsmaßstab für die Rekrutierungsmuster der einzelnen hier untersuchten Mutanten zu haben, mußte das Verhalten der drei Isoformen mit der neuen, hier benutzten Technik jedoch nochmals dokumentiert werden. Die beobachteten Rekrutierungsmuster bestätigten die publizierten Ergebnisse: RhoA akkumulierte hauptsächlich in unmittelbarer Nähe der eindringenden Bakterien, während RhoB und RhoC im wesentlichen in die Spitzen der F‑Aktin-reichen, bakteriell induzierten, zellulären Protrusionen rekrutiert wurden. Das RhoA-Präparat in Abb. 3-13 d-g wurde zusätzlich mit DAPI gefärbt, wodurch sowohl der Zellkern als auch die Bakterien markiert wurden. Hier wird die für RhoA typische Akkumulation um die Bakterien herum besonders deutlich.
RhoD
Bei RhoD galt das Interesse vornehmlich der Frage, ob sich auch hier ein bakterieninduziertes Rekrutierungsphänomen beobachten läßt und welches Muster dabei gegebenenfalls auftritt. Da RhoD auf der Primärstrukturebene mit RhoA, B und C deutlich geringere Homologie aufweist als die drei Isoformen untereinander, war es im voraus kaum möglich, über den Ausgang dieses Experiments zu spekulieren. Es zeigte sich, daß das mit dem vsv-tag versehene RhoD, ähnlich wie RhoB und RhoC, hauptsächlich in die von Shigella induzierten aktinreichen zellulären Protrusionen rekrutiert wird (Abb. 3-14).

Abb. 3 - 14 Rekrutierungsverhalten von RhoD (a-c). Rot: Rho. Grün: F‑Aktin. Abb. (c) setzt sich aus (a) und (b) zusammen.
RhoA^T19N und RhoA^G14V
Um die mögliche Auswirkung von Mutationen, die die Funktion von RhoA alterieren, auf das Rekrutierungsverhalten zu untersuchen, wurden die beiden Konstrukte RhoA^T19N (Abb. 3-15 a, 3-16 a-c) und RhoA^G14V (Abb. 3-15 b, 3-16 d-f) hergestellt und im HeLa-Zell-Modell analysiert. Beide Proteine, die die konstitutiv inaktive Mutation Thr19Asn [99] bzw. die konstitutiv aktive Mutation Gly14Val [56] tragen, wurden während der Zellinvasion durch Shigella rekrutiert. Die subzelluläre Verteilung beider Moleküle ließ sich dabei nicht vom klassischen RhoA-Verteilungsmuster unterscheiden.

Abb. 3 - 15 Schematische Darstellung der Konstrukte RhoA^T19N (a) und RhoA^G14V (b).

Abb. 3 - 16 Rekrutierungsverhalten von RhoAT19N (a-c) und RhoAG14V (d-f). Rot: Rho. Grün: F-Aktin. Abb. (c) und (f) setzen sich aus den monochromen Bildern der jeweiligen Zeile zusammen.
RhoAAB, RhoBBA, RhoCCA und RhoDDA
Birgit Bohm, ebenfalls Doktorandin im Labor, hatte bereits vor Beginn dieser Studie klar zeigen können, daß die CaaX-Region für die Rekrutierung eine wesentliche Rolle spielt: Deletionsmutanten von RhoA, B und C, denen die letzten vier Aminosäuren fehlten, verloren die Fähigkeit, während der Shigelleninvasion rekrutiert zu werden und blieben diffus im Zytoplasma verteilt. Das Vorhandensein der CaaX-Region ist also eine notwendige Bedingung dafür, daß das Rekrutierungsphänomen überhaupt auftreten kann. Da sich die Primärstrukturen der CaaX-Boxen der verschiedenen Isoformen unterscheiden, bot es sich an zu untersuchen, ob diese Region auch das differentielle Rekrutierungsmuster bestimmt.

Abb. 3 - 17 Schematische Darstellung der Konstrukte RhoAAB (a), RhoBBA (b), RhoCCA (c) und RhoDDA (d).

Von diesen Voraussetzungen ausgehend wurden die Hybridproteine RhoAAB (Abb. 3-17 a), RhoBBA (Abb. 3-17 b), RhoCCA (Abb. 3-17 c) und RhoDDA (Abb. 3-17 d) konstruiert, bei denen die ursprüngliche CaaX-Gruppe gegen diejenige einer anderen Isoform ausgetauscht wurde: RhoA erhielt die CaaX-Box von RhoB, während bei RhoB, RhoC und RhoD die letzten vier Aminosäuren gegen die entsprechende Sequenz von RhoA ausgetauscht wurden. Wenn die CaaX-Gruppe das Verteilungsmuster bestimmte, wäre zu erwarten gewesen, daß das Rekrutierungsverhalten der Hybridproteine sich nach ihr richtete. Es zeigte sich aber, daß trotz der „fremden“ CaaX-Gruppen das ursprüngliche Muster auftrat. RhoAAB wurde wie RhoA rekrutiert (Abb. 3-18 a-c), RhoBBA wie RhoB (Abb. 3-18 d-f), RhoCCA wie RhoC (Abb. 3-18 g-i) und RhoDDA wie RhoD (Abb. 3-18 k-m). Die das Rekrutierungsmuster bestimmenden Aminosäuren mußten also auf einem anderen Abschnitt des Moleküls liegen.

Abb. 3 - 18 Rekrutierungsverhalten von RhoAAB (a-c), RhoBBA (d-f), RhoCCA (g-i) und RhoDDA (k-m). Rot: Rho. Grün: F‑Aktin. Abb. (c), (f), (i) und (m) setzen sich aus den monochromen Bildern der jeweiligen Zeile zusammen.
RhoA^S188P
Es lag nahe, als nächstes die Region unmittelbar vor der CaaX-Region zu untersuchen: Der gewählte prä-C‑terminale Abschnitt, der bei RhoA und C neun Aminosäuren umfaßt (As 181‑189), bei RhoB 12 (As 181‑192) und bei RhoD 14 (As 193‑206), stellt eine Region starker Heterogenität zwischen den Isoformen dar. Durch seine räumliche Nachbarschaft zu der für die Rekrutierung an sich notwendigen CaaX-Gruppe gewann dieser Bereich zusätzlich an Interesse. Aufgrund der größeren Ähnlichkeit zwischen RhoA und RhoC, insbesondere der besseren Vergleichbarkeit der präterminalen Region, wurde der Sequenzabschnitt anhand dieser beiden Isoformen weiter untersucht.

Innerhalb der prä-CaaX-Region wurde zuerst die Rolle des Ser188 von RhoA betrachtet. Serin kommt bei den anderen Isoformen an vergleichbarer Position nicht vor. Es ist bekannt, daß membrangebundenes RhoA am Ser188 von PKA phosphoryliert und dadurch die Translokation ins Zytosol induziert wird [97]. Bei RhoA^S188P wurde die PKA-vermittelte Phosphorylierung dadurch verhindert, daß Ser188 durch Prolin ersetzt wurde (Abb. 3-19). Das Rekrutierungsverhalten änderte sich dadurch nicht: RhoA^S188P akkumulierte wie RhoA vorwiegend um die eindringenden Bakterien (Abb. 3-20 a-c).

Abb. 3 - 19 Schematische Darstellung des Konstrukts RhoA^S188P.

Abb. 3 - 20 Rekrutierungsverhalten von RhoA^S188P (a-c). Rot: Rho. Grün: F‑Aktin. Abb. (c) setzt sich aus (a) und (b) zusammen.
RhoCAC und RhoACA
Abb. 3 - 21 Schematische Darstellung der Konstrukte RhoCAC (a) und RhoACA (b).

Abb. 3 - 22 Rekrutierungsverhalten von RhoCAC (a-c) und RhoACA (d-f). Rot: Rho. Grün: F‑Aktin.
Abb. (c) und (f) setzen sich aus den monochromen Bildern der jeweiligen Zeile zusammen.

In einem nächsten Schritt wurde die gesamte Region der As 181‑188 zwischen RhoA und RhoC ausgetauscht (Konstrukte RhoCAC (3-21 a) und RhoACA (3-21 b)). RhoACA war bereits von Birgit Bohm hergestellt worden, und unter Verwendung eines konventionellen Fluoreszenzmikroskops hatten sich bereits erste Hinweise darauf ergeben, daß dieses Protein anders als RhoA rekrutiert werden könnte. Durch die Darstellung von optischen Schnitten mit der in 2.7.4‑5 beschriebenen Technik gelang es, die Rekrutierungsmuster von RhoCAC und RhoACA eindeutig zu beschreiben: RhoCAC akkumulierte wie RhoA um die Bakterien (Abb. 3-22 a-c) und RhoACA wurde wie RhoC in die Spitzen der zellulären Membranprotrusionen rekrutiert (Abb. 3-22 d-f). Im Bereich dieser 8 Aminosäuren liegen somit notwendige Informationen für das differentielle Rekrutierungsmuster von RhoA und RhoC.
RhoA^R183K
Von diesem Ergebnis ausgehend wurden zwei weitere von Birgit Bohm hergestellte Konstrukte – RhoA^R183K und RhoA^KK186-187RR – untersucht, mit dem Ziel, den für die Bestimmung des Rekrutierungsmusters hinreichenden Abschnitt der Primärstruktur von Rho weiter einzugrenzen. Die ausgetauschten Aminosäuren entsprachen dabei den Stellen, an denen sich RhoA sowohl von RhoC als auch von RhoB unterschied. Bei RhoA^R183K wurde das ursprüngliche Arg183 durch Lys183 von RhoC ersetzt (Abb. 3-23). Dieser Austausch brachte keine Modifikation des subzellulären Verteilungsmusters mit sich. RhoA^R183K konnte in seinem Rekrutierungsverhalten nicht von RhoA unterschieden werden (Abb. 3-24 a-c).

Abb. 3 - 23 Schematische Darstellung des Konstrukts RhoA^R183K.

Abb. 3 - 24 Rekrutierungsverhalten von RhoA^R183K (a-c). Rot: Rho. Grün: F-Aktin. Abb. (c) setzt sich aus (a) und (b) zusammen.
RhoA^KK186-187RR
RhoA^KK186-187RR basiert auf RhoA, wobei Lys186 und Lys187 durch die Aminosäuren Arg186 und Arg187 von RhoC ersetzt wurden (Abb 3-25). Diese Mutante zeigte kein RhoA-typisches Rekrutierungsverhalten, sondern konzentrierte sich wie RhoC in den während der bakteriellen Invasion gebildeten Membranprotrusionen (Abb. 3-26 a-c). Mit diesem Konstrukt konnten zwei Aminosäuren (Lys^186-187) beschrieben werden, deren Austausch allein hinreichend ist, um das RhoC-Muster in ein RhoA-Muster zu konvertieren.

Abb. 3 - 25 Schematische Darstellung des Konstrukts RhoA^KK186-187RR.

Abb. 3 - 26 Rekrutierungsverhalten von RhoA^KK186-187RR (a-c). Rot: Rho. Grün: F‑Aktin. Abb. (c) setzt sich aus (a) und (b) zusammen.
Übersicht über das Rekrutierungsverhalten der untersuchten Konstrukte
Die Ergebnisse der Transfektions-Infektions-Experimente sind in der folgenden Tabelle nochmals zusammengefaßt:

Name des Konstrukts

As von RhoA

As von RhoB

As von RhoC

As von RhoD

CaaX-Gruppe von

Rekrutierungstyp

RhoA

1-193

RhoA

RhoA

RhoB

1-196

RhoB

RhoB /C

RhoC

1-193

RhoC

RhoB /C

RhoD

1-210

RhoD

RhoB /C

RhoA^G14V

1-13, 15-193

RhoA

RhoA

RhoA^T19N

1-18, 20-193

RhoA

RhoA

RhoAAB

1-189

193-196

RhoB

RhoA

RhoBBA

190-193

1-193

RhoA

RhoB /C

RhoCCA

190-193

1-189

RhoA

RhoB /C

RhoDDA

190-193

1-206

RhoA

RhoB /C

RhoA^S188P

1-187, 189-193

RhoA

RhoA

RhoCAC

181-188

1-180, 189-193

RhoC

RhoA

RhoACA

1-180, 189-193

181-188

RhoA

RhoB /C

RhoA^R183K

1-182, 184-193

183

RhoA

RhoA

RhoA^KK186-187RR

1-185, 188-193

186,187

RhoA

RhoB /C

Tab. 3 - 6 Zusammenfassung der Ergebnisse aus den Transfektions-Infektions-Experimenten