1  Einführung

• 1.1 Bakterielle Dysenterie, Shigella und Zellinvasion

  • 1.1.1 Alle vier Shigella-Spezies sind Erreger der Dysenterie beim Menschen

  • 1.1.2 Die bakterielle Dysenterie ist eine entzündliche Erkrankung des Dickdarms

  • 1.1.3 Die Epithelzellinvasion durch Shigella ist ein notwendiger Schritt bei der Pathogenese der dysenterischen Kolitis

  • 1.1.4 Von Shigella induzierte Rearrangements des Wirtszell-Aktinzytoskeletts führen zur Internalisierung des Pathogens

  • 1.1.5 Eine effiziente Epithelkolonisierung wird durch intra- und interzelluläre Beweglichkeit von Shigella ermöglicht

  • 1.1.6  Die Fähigkeit zur Epithelinvasion ist auf einem Plasmid kodiert

  • 1.1.7 Zellinvasion durch Shigella ist abhängig von einem Protein der Wirtszelle, der kleinen GTPase Rho

  • 1.1.8  Aspekte der Invasionsstrategien von Salmonella und Listeria

• 1.2 Rho gehört zur Superfamilie der Ras-ähnlichen kleinen GTPasen

  • 1.2.1 GTPasen teilen ein gemeinsames Funktionsprinzip

  • 1.2.2 Ras ist der Prototyp der Superfamilie der kleinen GTPasen

  • 1.2.3 Die Rho-Proteine bilden eine eigene Subfamilie kleiner GTPasen

  • 1.2.4 Die kleinen GTPasen der Rho-Familie sind Regulatoren des Aktinzytoskeletts

  • 1.2.5 Rho-GTPasen werden posttranslational modifiziert

• 1.3 Der „Schalter“ Rho wird von Steuerungsproteinen kontrolliert

  • 1.3.1 GEFs, GAPs und GDIs

  • 1.3.2 GEFs versetzen Rho in den aktivierten Zustand

  • 1.3.3 GAPs erhöhen die GTP-Hydrolyserate von Rho

  • 1.3.4 RhoGDI inhibiert die Trennung von GDP und Rho

• 1.4 Rho steuert das Aktinzytoskelett über vielfältige Angriffspunkte

  • 1.4.1 Das Aktinzytoskelett reguliert Gestalt und Bewegung von Zellen

  • 1.4.2 Rho, Rac und Cdc42 spielen bei der Steuerung des Zytoskeletts abgrenzbare Rollen

  • 1.4.3 Rho reguliert Fokalkomplexe und Streßfilamente

  • 1.4.4 Rho beeinflußt Zell-Zell-Kontakte

  • 1.4.5  Rho interagiert in komplexer Weise mit Ezrin, Radixin und Moesin

  • 1.4.6 RhoD – und möglicherweise RhoB – regulieren die Dynamik von Endosomen

  • 1.4.7 Mit der Funktion von Rho assoziierte Zytoskelettbestandteile sind an der Zellinvasion durch Shigella beteiligt

• 1.5 Rho-Isoformen haben unterschiedliche biologische Eigenschaften

  • 1.5.1 Rho-Isoformen unterscheiden sich in ihrer intrazellulären Lokalisation

  • 1.5.2 Rho-Isoformen werden während der Shigelleninvasion differentiell rekrutiert

  • 1.5.3 Primärstrukturen der Rho-Isoformen

• 1.6 Fragestellung

2  Methodik

• 2.1 DNS-Präparation

  • 2.1.1 Bakterienkultur

  • 2.1.2 Miniprep

  • 2.1.3 Maxiprep

  • 2.1.4 Phenol/Chloroform-Extraktion

  • 2.1.5 Ethanolpräzipitation

  • 2.1.6 Messen der DNS-Konzentration

• 2.2 Klonieren und Sequenzieren

  • 2.2.1 Klonierungsvektoren

  • 2.2.2  Schneiden von DNS mit Restriktionsenyzmen

  • 2.2.3 Dephosphorylierung

  • 2.2.4 Agarose-Gelelektrophorese

  • 2.2.5 Isolierung von DNS-Fragmenten durch Gelelektrophorese

  • 2.2.6 DNS-Extraktion aus Agarosegelen

  • 2.2.7  PCR

  • 2.2.8 Oligonukleotide (Oligos)

  • 2.2.9 DNS-Matrizen (templates) für die PCR

  • 2.2.10 DNS-Hybridisierung

  • 2.2.11 Ligation

  • 2.2.12 Präparation von kompetenten E. coli (DH_{5 α}, TG1, ZK501)

  • 2.2.13 Transformation von kompetenten E. coli

  • 2.2.14 Sequenzieren

  • 2.2.15 Sequenzanalyse

  • 2.2.16 Vorhandene, in Transfektionsexperimenten verwendete Rho-Konstrukte

• 2.3  Shigella flexneri SC301

  • 2.3.1 Bakterienstamm

  • 2.3.2 Bakterienkultur

• 2.4 HeLa-Zellen

  • 2.4.1 Zellkultur

• 2.5 Vorübergehende Expression von Rho-Konstrukten in HeLa-Zellen

  • 2.5.1 Transiente Transfektion von HeLa-Zellen

• 2.6 Infektionsexperimente mit Shigella flexneri SC301

  • 2.6.1 Infektion von HeLa-Zellen

• 2.7 Immunfluoreszenzmikroskopie

  • 2.7.1 Behandlung der infizierten HeLa-Zellen

  • 2.7.2  Antikörper und Farbstoffe

  • 2.7.3 Mikroskopie

  • 2.7.4 Mikrofotografie

  • 2.7.5 Digitale Bildbearbeitung: MetaMorph, epr-Algorithmus

3  Ergebnisbeschreibung

• 3.1 PCR-vermittelte gezielte Mutagenese

  • 3.1.1 PCR-Strategie für alle Konstrukte

  • 3.1.2 Konstrukte auf der Basis von rhoA, B oder C

  • 3.1.3 Konstrukte, die auf rhoD basieren

• 3.2 Präparation der Klonierungsvektoren

  • 3.2.1 pUC19 für auf rhoA, B oder C basierende Konstrukte

  • 3.2.2 pKC3 für auf rhoA, B oder C basierende Konstrukte

  • 3.2.3 pUC19 für auf rhoD basierende Konstrukte

  • 3.2.4 pKC3 für auf rhoD basierende Konstrukte

  • 3.2.5 Übersichtstabelle über die Klonierungsvektoren

• 3.3 Klonieren und Sequenzieren der auf rhoA, B oder C basierenden  DNS-Konstrukte

  • 3.3.1 Isolierung der PCR-Produkte

  • 3.3.2 Klonieren der PCR-Produkte in pUC19

  • 3.3.3 Sequenzierung

  • 3.3.4 Umklonieren der Konstrukte in pKC3

• 3.4 Klonieren und Sequenzieren der auf rhoD basierenden Konstrukte

  • 3.4.1 Klonieren der PCR-Produkte in pUC19

  • 3.4.2 Abweichung der DNS-Sequenz von rhoD gegenüber der publizierten Sequenz

  • 3.4.3 Umklonieren der Konstrukte in pKC3

• 3.5 Übersicht über die hergestellten Konstrukte

• 3.6  Übersichtstabelle über die transformierten E. coli-Stämme

• 3.7 Expression der Konstrukte in HeLa-Zellen

• 3.8 Zytoskelettdarstellung von nichtinfizierten, aber mit mutierten rho-Konstrukten transfi­zierten HeLa-Zellen

  • 3.8.1 Auf rhoA, B oder C basierende Konstrukte

  • 3.8.2 Auf rhoD basierende Konstrukte

• 3.9 Rekrutierungsverhalten der mutierten Rho-Proteine während der HeLa-Zellinvasion durch Shigella flexneri SC301

  • 3.9.1  Kontrollen: RhoA, RhoB und RhoC

  • 3.9.2 RhoD

  • 3.9.3 RhoA^T19N und RhoA^G14V

  • 3.9.4 RhoAAB, RhoBBA, RhoCCA und RhoDDA

  • 3.9.5 RhoA^S188P

  • 3.9.6  RhoCAC und RhoACA

  • 3.9.7 RhoA^R183K

  • 3.9.8 RhoA^KK186-187RR

  • 3.9.9  Übersicht über das Rekrutierungsverhalten der untersuchten Konstrukte

4  Diskussion

• 4.1 Diskussion der Methoden

  • 4.1.1 System zur fluoreszenzoptischen Darstellung dreidimensionaler Strukturen

  • 4.1.2 Protein-tagging

  • 4.1.3 Replikationstreue der PCR

  • 4.1.4  Eigenschaften des Expressionsvektors

  • 4.1.5 Plasmidpräparation

  • 4.1.6 Transfektion und Infektion

• 4.2 Diskussion der Ergebnisse

  • 4.2.1 Funktionalität der mutierten Proteine in der transfizierten Zelle

  • 4.2.2 Rekrutierungsverhalten von RhoA^G14V und RhoA^T19N

  • 4.2.3 Die Rolle der CaaX-Gruppe

  • 4.2.4 Rekrutierungsverhalten von RhoD

  • 4.2.5 Prä- CaaX-Gruppe von RhoA und RhoC

  • 4.2.6 Mögliche Rollen für die Lysine 186-187 von RhoA

  • 4.2.7 Differentielle Rekrutierung und Strukturmodelle von RhoA

  • 4.2.8 Rekrutierung anderer Proteine während der Zellinvasion durch Shigella

  • 4.2.9 Überlegungen zum Rekrutierungsmechanismus

  • 4.2.10  Shigella als zellbiologisches Werkzeug

  • 4.2.11 Modell und natürliche Verhältnisse

5  Zusammenfassung

Abkürzungsverzeichnis

Literaturverzeichnis

Lebenslauf

Eidesstattliche Erklärung

Danksagung

Tab. 2 - 1 Ausgangsplasmide für Klonierungsvektoren

Tab. 2 - 2 DNS-Lösung für Agarosegelelektrophorese

Tab. 2 - 3 PCR-Ansatz mit Taq-Polymerase

Tab. 2 - 4 PCR-Ansatz mit Pwo-Polymerase

Tab. 2 - 5 Verwendete Oligonukleotide.

Tab. 2 - 6 PCR-Matrizen.

Tab. 2 - 7 Reaktionsansatz für DNS-Hybridisierung

Tab. 2 - 8 Reaktionsansatz für Ligation

Tab. 2 - 9 Primer für die Sequenzierung der DNS-Konstrukte

Tab. 2 - 10 Reaktionsbedingungen für Sequenzierung

Tab. 2 - 11 Zusammensetzung eines 5,5%-igen Sequenziergels

Tab. 2 - 12 In der Studie verwendete Rho-Konstrukte, die zu Beginn der Arbeit bereits vorhanden waren.

Tab. 2 - 13 Antikörper und Farbstoffe

Tab. 2 - 14 Mikroskopobjektive

Tab. 2 - 15 Filtersätze für Immunfluoreszenzmikroskopie

Tab. 3 - 1 PCR-Reaktionsbedingungen für RhoA/B/C-Konstrukte

Tab. 3 - 2 PCR-Reaktionsbedingungen für RhoD-Konstrukte

Tab. 3 - 3 Übersichtstabelle über die Klonierungsvektoren

Tab. 3 - 4 Im Rahmen der vorliegenden Studie hergestellte Konstrukte

Tab. 3 - 5 Im Rahmen der vorliegenden Studie transformierte und asservierte Stämme von E. coli

Tab. 3 - 6 Zusammenfassung der Ergebnisse aus den Transfektions-Infektions-Experimenten