Institut für Pharmazie

Dissertation

Untersuchungen zum Synergismus von Saponinen und Toxinen bei in vitro kultivierten Säugetierzellen

Zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)

eingereicht an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Johann Philipp Hebestreit

Dekan: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Thomas Buckhout, Ph.D.

Gutachter:
1. Prof. Dr. M. F. Melzig
2. PD Dr. K. Jenett-Siems

eingereicht: 15.07.2004

Datum der Promotion: 10.12.2004

Inhaltsverzeichnis

• 1  Einleitung
  • 1.1  Arbeitshypothesen
  • 1.2 Membranfluss (Endo- und Exozytose)
    • 1.2.1  Rezeptorvermittelte Endozytose
    • 1.2.2 Endozytose durch Caveolae
  • 1.3 Intrazellulärer Transport von Proteinen
  • 1.4 Zellzyklus und Apoptose
• 2 Material und Methoden
  • 2.1  Allgemeine Hinweise
  • 2.2  Geräte
    • 2.2.1  Zellkultur
    • 2.2.2  Zentrifugen
    • 2.2.3 Elektrophorese
    • 2.2.4 Sonstige Geräte
  • 2.3 Verbrauchsmaterialien
    • 2.3.1  Untersuchungsmaterial
    • 2.3.2 Zellkultur
  • 2.4 Chemikalien
  • 2.5 Untersuchte Triterpensaponine
    • 2.5.1  Bisdesmoside
      • 2.5.1.1 Reinsubstanzen
      • 2.5.1.2 Rohsaponine und isolierte Hauptkomponenten
    • 2.5.2 Monodesmosid
    • 2.5.3 Aglykon
  • 2.6 Antikörper
  • 2.7 Proteine, Toxine, Enzyme und Nucleotide
  • 2.8 Sonstiges Verbrauchsmaterial
  • 2.9 Material für die Chromatographie
  • 2.10 Reagenziensätze und Molekulargewichtsmarker
  • 2.11 Zelllinien
  • 2.12 Pufferlösungen
    • 2.12.1  Puffer zur Gelelektrophorese
  • 2.13 Zellbiologische Methoden
    • 2.13.1  Anforderungen der Zellen an das Milieu
    • 2.13.2 Passagieren der Zellen
    • 2.13.3 Kultivierung von ECV 304-Zellen
    • 2.13.4 Kultivierung von SK-N-SH-Zellen
    • 2.13.5 Kultivierung von HaCat-Zellen
    • 2.13.6 Einfrieren und Auftauen von Zellen
    • 2.13.7 Hämatoxylin-Färbung von Zellkulturen
  • 2.14 Immunologische Methoden
    • 2.14.1  Immunfluoreszenzmikroskopie
    • 2.14.2 Immunodiffusion nach Ouchterlony
  • 2.15 Proteinchemische Methoden
    • 2.15.1  Konzentrationsbestimmung von Proteinen
      • 2.15.1.1 Bradford Assay
      • 2.15.1.2 BCA Assay
    • 2.15.2 Zentrifugationsgetriebene Molekülsiebfiltration
    • 2.15.3 Dialyse von Proteinlösungen
    • 2.15.4 Lyophilisierung von Proteinlösungen
    • 2.15.5  Proteinfällungen
      • 2.15.5.1 Fraktionierte Ammoniumsulfatfällung
    • 2.15.6 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
      • 2.15.6.1 Lösungen für die Gelfärbung, die Gelentfärbung und das LMW-calibration-kit
      • 2.15.6.2  Färben mit Coomassie Blau
      • 2.15.6.3 Entfärben der Gele
      • 2.15.6.4 Trocknen der Gele
      • 2.15.6.5 Proteinmarkierung mit dem Farbstoff Alexa Fluor 488
  • 2.16  Fluoreszenzmikroskopie mit Alexa Fluor 488-markiertem Agrostin
  • 2.17  Toxinspezifische Methoden
    • 2.17.1  Toxizitätsassays
      • 2.17.1.1 Zytotoxizitätsuntersuchung unter Verwendung des CASY-Zellzählgerätes
      • 2.17.1.2 MTT Assay (für ECV-Epithelzelllinie und SK-N-SH-Neuroblastomzelllinie)
      • 2.17.1.3 Amidoschwarz-Assay (für HaCat-Keratinozytenlinie)
    • 2.17.2 Proteolytische Spaltung von Diphtheriatoxin
    • 2.17.3 Isolierung der eingesetzten Toxine und ihrer Spaltprodukte
    • 2.17.4 Isolierung der aktiven Domäne (DTA) des Diphtheriatoxins
      • 2.17.4.1 Überprüfung der Aktivität von Diphtheriatoxin A (DTA)
    • 2.17.5 Isolierung der enzymatisch aktiven A-Kette (RTA) von Ricin
  • 2.18 Chromatographische Methoden
    • 2.18.1  Gelfiltrationschromatographie
    • 2.18.2 Kationenaustauschchromatographie
    • 2.18.3 Dünnschichtchromatographie
    • 2.18.4 Isolation von Agrostemmasaponin-Rohsaponingemischen
    • 2.18.5  Isolierung der Hauptkomponenten von Saponinum album
    • 2.18.6 Identifizierung von Gypsogenin durch saure Hydrolyse
  • 2.19 Biophysikalische Methoden
    • 2.19.1  Electric Cell-Substrate Impedance Sensing (ECIS)
• 3 Ergebnisse und Diskussion
  • 3.1  Auswahl geeigneter Zelllinien
    • 3.1.1  ECV 304 (hauptsächlich verwendete Zelllinie; ATCC Nr. ACC 310)
    • 3.1.2 HaCat (für den Amidoschwarz-Assay verwendete Zelllinie)
    • 3.1.3 SK-N-SH (Vergleichszelllinie für ECV 304, ATCC Nr. HTB 11)
  • 3.2 Zytotoxizitätsassays
    • 3.2.1  Bestimmung der Inkubationszeit
    • 3.2.2 Definition der Zelldichte
    • 3.2.3 Einfluss der Zelllinie
  • 3.3 Einfluss von DMSO auf die Zytotoxizität
  • 3.4 Zytotoxizität von Agrostemma-Rohextrakten
  • 3.5 Isolierung aktiver Agrostemma-Fraktionen
    • 3.5.1  Fraktionierung durch Größenausschluss-Membranfiltration
    • 3.5.2 Proteinfraktionierung durch Ammoniumsulfatfällung
    • 3.5.3 Proteinisolierung durch Gelfiltrationschromatographie
      • 3.5.3.1 MPLC-Proteinisolierung ( Medium Pressure Liquid Chromatography)
      • 3.5.3.2 FPLC-Proteinisolierung (Fast-Protein Liquid Chromatography)
  • 3.6 Zytotoxizitätsuntersuchungen an Isolationsprodukten aus Agrostemma
    • 3.6.1  Ermittlung der IC₅₀ von Saponinum album
    • 3.6.2 Bestimmung der Zytotoxizität von Saponinen bei konstanter Agrostinkonzentration
    • 3.6.3 Zytotoxizitätsuntersuchung von Agrostin mit unterschiedlichen Saponinen
  • 3.7 Untersuchungen zur Spezifität der Wirkung von Agrostin und Saponin
    • 3.7.1  Untersuchungen zum Wirkungsmechanismus an HaCat-Zellen
    • 3.7.2 Vergleich der Zytotoxizität von Agrostin an ECV 304- und SK-N-SH-Zellen
    • 3.7.3 Getriggerte Toxizität
  • 3.8 Struktur-Wirkungsbeziehungen unterschiedlicher Triterpensaponine in Kombination mit RIPs
    • 3.8.1  Zytotoxizitätsuntersuchung mit Gypsogenin
  • 3.9 Versuche zur Hemmung der Toxizität von Saponin und Agrostin
    • 3.9.1  Einfluss von Neuraminidase und EGTA auf den toxischen Effekt
      • 3.9.1.1 Präinkubation von Neuraminidase (EC 3.2.1.18)
      • 3.9.1.2 Präinkubation von EGTA (Ethylenglykoltetraacetat)
    • 3.9.2 Temperaturabhängigkeit des getriggerten toxischen Effektes
    • 3.9.3 Untersuchung der Wirkung von unterschiedlichen Zuckern auf die Zytotoxizität von Agrostin und Saponin
    • 3.9.4 Untersuchung des Effektes von Latrunculin A auf die Toxizität von Agrostin und Saponin
  • 3.10 Untersuchung zur direkten chemischen Wechselwirkung von Saponin und Agrostin/ HSA
  • 3.11 Untersuchungen unterschiedlicher Toxine in Kombination mit Gypsophilasaponin
    • 3.11.1  Zytotoxizität von Proteintoxinen in Kombination mit Saponin
  • 3.12  Immunfluoreszenzmikroskopie
    • 3.12.1  Immunfluoreszenzfärbung
  • 3.13 ECIS-Untersuchungen
• 4 Schlussfolgerung
• 5 Zusammenfassung
• Abkürzungsverzeichnis
• Literaturverzeichnis
• Publikationsverzeichnis
• Lebenslauf
• Danksagung
• Eidesstattliche Erklärung

Tabellen

• Tab. 2-1: Struktur der Triterpensaponine
• Tab. 3-1: Einfluss von DMSO auf die Zellproliferation (Mittelwert ± SD, n=3)
• Tab. 3-2: IC50-Werte von Fraktionen der Mikrozentrifugenfiltration
• Tab. 3-3: Darstellung der IC₅₀-Werte von Agrostin mit Saponinen (Mittelwert ± SD, n=3)
• Tab. 3-4: Einfluss der Monosaccharide auf die Zytotoxizität von Agrostin und Saponin
• Tab. 3-5: Zusammenstellung der wichtigsten IC₅₀-Werte

Bilder

• Abb. 1-1: Schematische Darstellung der Proteintoxine von Diphtheriatoxin (DT) und Ricin (RT).
• Abb. 1-2: links: Auf der Oberfläche der Zelle lokalisierte Zucker. Abb. rechts: rasterelektronenmikroskopische Aufnahme der Glykokalix), die in der kohlehydrat-assoziierten Zielerkennung und Rezeptorbindung z. B. von Lectinen eine Rolle spielen ( http://wong.scripps.edu ).
• Abb. 1-3: Abbildung der Kornrade (Agrostemma githago L.) und des Kornradesamens (Abb. links: Köhlers Atlas der Medizinalpflanzen).
• Abb. 1-4: Beispiel einer rezeptorvermittelten Endo- und Exozytose: der Transferrinzyklus (Abb. links aus: http://www.egbeck.de).
• Abb. 1-5: links: Elektronenmikroskopische Abbildung der Innenseite eines Fibroblasten.
• Abb. 2-1: Reduktion von MTT zu Formazan (Mosmann, 1983).
• Abb. 2-2: Ouchterlony-Immunodiffusionstest
• Abb. 2-3: ADP-Ribosylierungsassay: Schematische Darstellung der ADP-Ribosylierung von EF II; die Markierung mit Biotin-17- NADPP+PP ist in Punktform dargestellt (Langer, 1996; Keller, 2002).
• Abb. 2-4: ADP-Ribosylierungsassay: Durch die enzymatische Aktivität der DTA-Kette wird die ADP-Ribosylierung von Elongationsfaktor II vermittelt und im Immunoblot bei ca. 100 kDa detektiert. (Zhang, 1997).
• Abb. 3-1: Zytotoxizität eines wässrigen, eines methanolisch-wässrigen (50 %) Extraktes und des Hauptsaponins (AS 1) der Kornrade (Mittelwert ± SD, n=3).
• Abb. 3-2: Morphologische Veränderungen der ECV 304-Zelllinie nach Extraktinkubation
• Abb. 3-3: Darstellung der aus der Gelfiltrationschromatographie (Sephadex G 75) gewonnenen Proteinfraktionen (qualitativ gegen LMW-Kit).
• Abb. 3-4: Darstellung der aus der Gelfiltrationschromatographie (Sephadex; FPLC: HiLoad Superdex 75) und der Ammoniumsulfatfällung gewonnenen Proteinfraktionen und des Agrostins (Kationenaustauschchromatographie, CM-Cellulose; qualitativ gegen LMW-Kit).
• Abb. 3-5: Untersuchung der Zytotoxizität und Ermittlung der IC50 von Saponinum album aus Gypsophila paniculata (Merck) an ECV 304-Zellen (Mittelwert ± SD, n=3).
• Abb. 3-6: Untersuchung der Zytotoxizität von Saponinum album bei konstanter Agrostinkonzentration [30 ng/ml].
• Abb. 3-7: Untersuchung der Zytotoxizität und Ermittlung der IC50 von Agrostin mit konstanten Konzentrationen (3.0 µg/ml) von Saponinum album, Helianthussaponin 2 und Agrostemmasaponin 1 (Mittelwert ± SD, n=3).
• Abb. 3-8: Einfluss der Inkubationszeit eines wässrigen Agrostemma-Samenextraktes auf die Zellproliferation von HaCat-Zellen (Mittelwert ± SD, n=3).
• Abb. 3-9: Untersuchung der Zytotoxizität von Agrostin (Konz.: 0.1; 1.0; 10.0; 100.0; 1000.0 ng/ml/) und Saponinum album (Konz.: 3.0 µg/ml) an ECV 304- und SK-N-SH-Zellen.
• Abb. 3-10: Getriggerte Zytotoxizität; Präinkubation von Saponinum album (3.0 µg/ml) und nach 5 min Inkubationszeit Zugabe von Agrostin (1.0 µg/ml); Mediumwechsel nach 30 min/ 60 min/ 120 min/ 180 min.
• Abb. 3-11: Zytotoxizität von verschiedenen Triterpensaponinen (3.0/ 6.0 µg/ml) und Agrostin (30 ng/ml); nähere Erläuterungen umseitig
• Abb. 3-12: Versuch der Inhibition des toxischen Effektes durch Vorinkubation mit EGTA [1.0 mM], bzw. Neuraminidase [50 mU] und nach 1 h Inkubation von Saponin und Agrostin für weitere 2 h. Es konnte keine signifikante Toxizitätshemmung festgestellt werden.
• Abb. 3-13: Inhibition des getriggerten toxischen Effektes. Es wurde eine zweistündige Vorinkubation von Saponin und Agrostin bei 37°C, sowie bei 6°C durchgeführt, 2 h vorinkubiert, mit Medium substituiert und nach 72 h die Zytotoxizität ermittelt.
• Abb. 3-14: Struktur des Actin-bindenden Toxins Latrunculin A aus Latruncula magnifica (De Oliveira, 1996).
• Abb. 3-15: Hemmung der getriggerten Toxizität durch 40 min. vorinkubiertes Latrunculin A (60 nM): Inkubation von 3 µg/ml Saponin und 1 µg/ ml Agrostin über einen Zeitraum von 20/ 40/ 60/ 80/ 100/ 120 und 140 min, anschließend Mediumwechsel und Toxizitätstest nach 72 h.
• Abb. 3-16: Präinkubation des Agrostin-Saponin-Lyophilisats mit Mediumwechsel nach 180 min und Zytotoxizitätsmessung nach 72 h.
• Abb. 3-17: Diagramm der 3-D Struktur des Saporins (SO6). Durch die Buchstaben A-H werden die acht α-Helices dargestellt.
• Abb. 3-18: Struktur des Heptapeptides Microcystin LR aus Microcystis aeruginosa.
• Abb. 3-19: Zytotoxizität (IC50-Werte) der Protein-/ Peptidtoxine Diphtheriatoxin, Nigrin b, Microcystin, Agrostin, (his-) Saporin und Ricin-Toxin A (RTA) in Kombination mit Saponin (3.0 µg/ml Saponinum album, bzw. Agrostemmasaponin).
• Abb. 3-20: a), b) Hämatoxylinfärbung von ECV 304-Zellen  c), d) Visualisierung des Agrostins durch FITC-Anti-Antikörpermarkierung
• Abb. 3-21: a), b) Visualisierung des Agrostins durch FITC-Anti-Antikörpermarkierung  c), d) Visualisierung des Agrostins durch AlexaFluor-Kopplung
• Abb. 3-22: Abb. links: Modell von drei Zellen auf einer Goldelektrode mit den daraus resultierenden drei Parametern Rb, α und Cm die sich durch das Verhalten der Zellen als Isolatoren ableiten lassen (s.u.). Abb. rechts: einige fixierte und angefärbte NIH 3T3-Zellen.
• Abb. 3-23: Die Zellen werden in einem 8-well-Kulturgefäss auf einem Elektrodenarray in jedem Well ausgesät (links). Abb. rechts: Stromfluss durch einen Zellmonolayers auf einer Goldelektrode (Durchmesser: 250 µm) im Mikromaßstab.
• Abb. 3-24: ECIS-Untersuchungen nach Inkubation einer zytotoxischen Saponinkonzentration von 50 µg/ml.
• Abb. 3-25: Zeitliche Entwicklung a) der Kapazität Cm (40 kHz)/ nF, die in Abhängigkeit von der Inkubationszeit die Spreitung des Zellmonolayers darstellt (links). und b) des Widerstands Rb (400 Hz)/ kΩ, der ein Maß für die Eigenschaft des gesamten Monolayers als Barriere ist.