Einleitung

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Ein wichtiger Bestandteil der Evolution und ein probates Mittel in der Natur ist die Verwendung von Chemikalien zur Verteidigung oder als Angriffswaffen. Gifte finden sich in fast allen Klassen von Organismen, von Bakterien bis zu Säugetieren. Im Hinblick auf ihre chemischen Strukturen als auch auf ihre biologischen Wirkungen ist die Varianz der natürlichen Gifte besonders groß. Pflanzliche Toxine können neben dem Fraßschutz auch zur Abwehr von Mikroorganismen dienen. Eine Einteilung nach dem Wirkort ist kaum möglich, da die Giftwirkung häufig durch ein komplexes Gemisch unterschiedlicher Inhaltsstoffe verursacht wird. Bisher wurden synergistische Wirkungsverstärkungen mehrerer Inhaltsstoffe zumeist den tierischen Giften zugeschrieben. Besonders nach der von Paracelsus (1493-1514) erhobenen Forderung, die Wirkstoffe von Arzneipflanzen zu isolieren, wurde eine Vielzahl toxischer Naturstoffe isoliert: im Jahre 1772 die Oxalsäure aus dem Sauerklee (Oxalis acetosella L.TT); 1846 das Capsaicin aus dem Cayenne-Pfeffer (Capsicum annuum L.TT), 1867 das Digitoxin aus dem roten Fingerhut (Digitalis purpurea L.TT); 1887 das Ephedrin aus EphedraTT-Arten, 1896 das Muscarin aus dem Roten Fliegenpilz (Amanita muscaria [L. ex Fr.] HookerTT), 1937 die Phallotoxine aus dem Knollenblätterpilz (Amanita phalloides [Vaill.] Secr.TT) und 1961 die Aflatoxine aus dem Schimmelpilz Aspergillus flavusTT, auch bekannt als „Fluch der Pharaonen“.

Das erste isolierte Triterpensaponin war die Glycyrrhizinsäure, die bereits 1809 aus der Wurzel des Süßholzes, Glycyrrhiza glabra L., erhalten wurde. Digitonin, ein Steroidsaponin, wurde erstmals 1875 aus den Samen des Roten Fingerhutes (Digitalis purpurea L.) gewonnen. Zu den bekanntesten Beispielen toxischer Saponinpflanzen gehören die Kermesbeere (Phytolacca americana L.TT) und die Kornrade (Agrostemma githago L.TT) (Teuscher & Lindequist, 1994). Obwohl Saponine schlecht resorbiert werden, kann es durch lokale Schleimhautreizungen zu einer Erhöhung der Mukosapermeabilität kommen. Nach systemischer Applikation wirken Saponine in erster Linie hämolytisch.

Der Begriff Toxin wurde ursprünglich für filtrierbare (subzelluläre) Stoffe benutzt, die Krankheiten auslösen. Als erstes wurde Diphtheriatoxin als ein von Bakterien produziertes Gift erkannt (E. Roux & A. Yersin, Institute Pasteur 1888). Heute sind hunderte Toxine bekannt, deren Gemeinsamkeit die tödliche Wirkung auf lebende Zellen ist. Alle schädigen Zellmembranen bzw. ihre Komponenten oder überwinden deren Schutzfunktion, um im Zellinneren Schaden anzurichten. Aufgrund ihrer komplexen Proteinstruktur haben sie spezifische Wirkorte. Sie können in einige Gruppen eingeteilt werden: porinähnliche Toxine permeabilisieren Zellmembranen, so dass der Ionenhaushalt der betroffenen Zellen gestört wird und sie Nährstoffe und Energieträger verliert; Toxine mit intrazellulärem Wirkort bilden in der Zellmembran Strukturen (Kanäle) aus, die die Einschleusung einer enzymatisch wirksamen Komponente erlauben, welche ihrerseits Zellfunktionen ausschalten; eine weitere Gruppe bindet an oder modifiziert vorhandene Ionenkanäle und stört damit z. B. Reizleitun-gen. Auch Bacteriocine (bei E. coli: Colicine) gehören funktionell zu den Toxinen, sie dienen der Bekämpfung der Bakterien untereinander und wirken hochspezifisch (Pappenheimer, 1937; Lindgren, 2000).

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Im Rahmen dieser Arbeit, deren Gegenstand die Wechselwirkung unterschiedlicher Naturstoffe hinsichtlich ihrer Toxizität ist, sind neben den Saponinen insbesondere zwei Toxintypen interessant, die auf ähnliche Weise mit der Zellmembran interagieren (Griffiths et al., 1994): A-B Toxine und Lectine.

A-B Toxine sind aus zwei Komponenten aufgebaut: eine bindende Domäne B sorgt dafür, dass eine enzymatisch aktive A-Domäne in die Zielzelle transportiert wird (siehe Abb. 1-1). Die aktive Domäne wird zur Freisetzung ins Zellinnere von dem Gesamtprotein abgespalten oder es handelt sich von vornherein um separate Proteine. Zu den A-B Toxinen gehören z. B. folgende bekannte Toxine: Diphtheriatoxin modifiziert eine seltene Aminosäure (Diphtamid) im Elongationsfaktor 2 und blockiert damit die Proteinsynthese; Cholera- und Pertussis-Toxin adenylieren ein Regulationsprotein der Adenylatcyclase. Shigella-Toxin und pflanzliche Toxine wie Ricin, Abrin, Nigrin b, Saporin und Agrostin sind N-Glykosidasen (ribosomeninaktivierende Proteine, RIPs), die eine essentielle Base (Adenin-4324) der ribosomalen 28S rRNA abspalten (Barbieri et al., 1997). Bakterielle Toxine entfalten im Inneren der Zielzelle eine enzymatische Aktivität. Für den Eintritt solcher Toxine in die Zielzelle spielt der Transport durch Membranen eine wichtige Rolle. Dies gilt z.B. für Cholera-, Diphtherie- und Anthrax-Toxin (D´Silva & Lala, 2000). Dabei benötigt das Toxin immer die Hilfe anderer Proteine oder Polysaccharide, die auf bisher nicht verstandene Art und Weise die Aufnahme in die Zielzelle erleichtern. Für diese Art des Proteintransports ist keine direkte Kopplung an einen energieverbrauchenden Transporter nötig. Damit unterscheidet sie sich sehr stark vom üblichen, weitgehend energieabhängigen Proteintransport. Entweder sind es die genannten Toxine selbst, welche den Transport durch die Membran hindurch bewirken, oder es sind andere Proteine, die dem Toxin beim Durchdringen der Membran helfen und die vom Bakterium entweder zusammen mit dem Toxin oder separat abgegeben werden. Beispiele für die erste Möglichkeit sind das Cholera- und das Diphtherie-Toxin (Abb. 1-1): hier ist es die so genannte Primärsequenz des Toxinmoleküls, die den Transport bewerkstelligt (Brooke et al., 1998). Sie kann währenddessen enzymatisch abgespalten werden oder auch erhalten bleiben. Im zweiten Fall geben die Bakterien nicht nur das Toxin (A-Kette), sondern zusätzlich noch ein so genanntes Bindeprotein (B-Kette) ab. Beispiel hierfür ist das C2-Toxin von Clostridium botulinum, welches das Zytoskelett seiner Zielzellen zerstört. RIPs wie Agrostin und Saporin besitzen keine zellbindende Domäne und werden als sog. Typ I RIPs klassifiziert (Barbieri et al., 1993).

Lectine (Typ II-RIPs) wie das Ricin aus Ricinus communis L. sind zuckerbindende A-B Toxine mit der Eigenschaft, Zellen zu agglutinieren und/ oder Glykokonjugate (Polysaccharide, Glykoprotein, Glykolipide u.a.) zu präzipitieren. Diese heterogene Proteinklasse unterscheidet sich insbesondere strukturell von Immunglobulinen (Antikörper), die auch Zuckerstrukturen binden können.

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Abb. 1-1: Schematische Darstellung der Proteintoxine von Diphtheriatoxin (DT) und Ricin (RT).

Wie Agrostin und Saporin sind RT und DT ebenfalls durch eine A-B-Struktur gekennzeichnet. Die blauen Abschnitte stellen die katalytisch aktive Domäne (A-Kette) dar. Die restlichen Abschnitte vermitteln die Zielerkennung und die Rezeptorbindung. Die Toxine sind so dargestellt, wie sie aus den entsprechenden Herkunftsorganismen isoliert werden können. RT liegt bereits getrennt in A-und B-Kette vor, während bei DT durch das Dreieck die Position der physiologischen Spaltstelle gekennzeichnet ist. Nach der Spaltung (siehe auch 2.17.4) werden die beiden Polypeptidketten jeweils über die der Spaltstelle benachbarte Disulfidbrücke zusammengehalten. Weiterhin sind die für derartige Proteine typischen Disulfidbrücken dargestellt (Keller & Fuchs, 2002; Umata & Mekada, 1998).

Die Fähigkeit von pflanzlichen Lectinen an Zucker zu binden und Aggregation zu induzieren ist schon seit Jahrhunderten bekannt.Da sie ursprünglich nur aus Pflanzenextrakten isoliert worden sind und zur Agglutination von Blutzellen (Erythrozyten) eingesetzt wurden, sprach man zunächst von Phytohaemagglutininen. Später stellte es sich heraus, dass sie auch aus tierischen Organen (vornehmlich der Invertebraten) zu gewinnen sind und dass keineswegs alle an Erythrozyten binden. W. C. Boyd und E. Slapeigh führten daher 1954 den Begriff Lectin (lat.: legere = auswählen) ein. Lectine besitzen mindestens zwei Zuckerbindungs-stellen, sonst wäre ihr Agglutinations-/Präzipitationsvermögen nicht erklärbar. In der Tat bestehen die meisten von ihnen aus zwei, vier oder mehr meist gleichartigen Untereinheiten. Ihre Spezifität wird durch jenes Mono- oder Oligosaccharid definiert, welches das Agglutinationsvermögen kompetitiv inhibiert. Die Affinität eines Lectins zu Zellen oder Makromolekülen (Liganden) liegt um Größenordnungen über der zu einzelnen Zuckern. Daraus wurde geschlossen, dass es bei der Bindung der Liganden nicht nur auf die Kohlenhydratanteile ankommt, sondern dass zusätzliche, unspezifische Protein-Protein-Wechselwirkungen (schwache Bindungen) den Komplex stabilisieren. Man kennt beispielsweise eine Reihe von Lectinen, z. B. RCA (Ricinus communis L. Agglutinin), PNA (Peanut, bzw. Arachis hypogaea L. Agglutinin) oder SBA (Sojabohnen-, bzw, Glycine max [L.] Merr.-Agglutinin) mit einer Affinität zu β-D-Galaktosylresten, doch findet man deutliche Unterschiede in ihrem Bindungsvermögen zu bestimmten Zellen oder Glykoproteinen (Olsnes, 1987). Einen großen Einfluss übt die sterische Lage der Kohlenhydrate an der Molekül- oder Zelloberfläche aus; sie müssen für das Lectin zugänglich sein (Abb. 1-2). Wegen der strukturellen Komplexizität der Liganden werden die lectinbindenden Moleküle üblicherweise als Lectinrezeptoren bezeichnet. Trotz gewisser Unsicherheiten bezüglich ihrer chemischen Charakterisierung wurden Lectine in den letzten Jahrzehnten in steigendem Umfang in der medizinischen Grundlagenforschung eingesetzt (Frankel et al., 2000), denn sie eignen sich, um bestimmte Zelltypen oder Zellfragmente (z. B. Membrantypen) zu charakteri-sieren, Zellen in verschiedenen Entwicklungsstadien zu erkennen, normale von Tumorzellen zu unterscheiden, die verschiedenen Phasen des Zellzyklus zu markieren und verschiedene Zelltypen affinitätschromatographisch voneinander zu trennen. Viele der Lectine sind intrazellulär lokalisiert, zum Teil kommen sie dort in beträchtlichen Mengen vor, doch welche Bedeutung ihnen zukommt, ist weitgehend unbekannt. Sie reagieren mit Speicherproteinen, wobei die Affinität zum arteigenen Speicherprotein weit höher ist als zu einem artfremden. Hieraus wurde geschlossen, dass sie die Proteine komplexieren und sie so in eine kompakte unlösliche Form überführen, in der sie in der Zelle besser lagerfähig sind als in gelöstem Zustand (Basha & Roberts, 1981). Viele Lectine sind toxisch und bieten der Pflanze möglicherweise einen Schutz vor Fressfeinden. Zum Beispiel wirkt das kaum toxische Lectin der Gartenbohne (Phaseolus vulgaris L.) auf den Käfer Callosobruchus maculatus F. letal. Das Ricinus communis L. Agglutinin (RCA) enthält eine für alle Tiere und den Menschen hochgiftige Komponente, das Ricin (Katzin et al., 1991). Im Experiment mit tierischen Zellen wurde gezeigt, dass einige Lectine in geringen Konzentrationen zellteilungsfördernd wirken; daher auch die Bezeichnung Mitogene. Inwieweit das für die Pflanzen von Bedeutung ist, bleibt zu klären.

Abb. 1-2: links: Auf der Oberfläche der Zelle lokalisierte Zucker. Abb. rechts: rasterelektronenmikroskopische Aufnahme der Glykokalix), die in der kohlehydrat-assoziierten Zielerkennung und Rezeptorbindung z. B. von Lectinen eine Rolle spielen ( http://wong.scripps.edu ).

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Saponine sind eine im Pflanzenreich weit verbreitete Naturstoffgruppe, die wegen ihrer physikalisch-chemischen sowie physiologischen Eigenschaften in einer Gruppe sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe zusammengefasst werden. Saponine sind häufig bitter schmeckende, oberflächenaktive, glykosidische Verbindungen, die durch saure oder enzymatische Hydrolyse in Sapogenine und Zucker gespalten werden. Die Aglyka bestehen aus einem Steroid- oder Triterpenteil, dem so genannten Sapogenin, wobei die Mehrzahl der Saponine eine Triterpenstruktur besitzt (Tab. 2-1). An das Aglykon sind verschiedene Zuckermoleküle gebunden, die aus Ketten mehrerer Monosaccharide (meistens D-Glucose, D-Galaktose, D-Fucose, L-Rhamnose, D-Xylose, L-Arabinose und D-Glucuronsäure) bestehen können. Der Zuckerrest ist an einer Position (monodesmosidische Saponine) oder über zwei Positionen (meist am C3 und am C28: bisdesmosidische Saponine) glykosidisch/ verestert an das Aglykon gebunden. Die Anwesenheit polarer (Zucker) und unpolarer (Steroide oder Triterpene) Gruppen bedingt die starke Oberflächenaktivität der Saponine. Für die meisten pflanzlichen Lebensmittel liegt der Saponingehalt im Bereich von 0,1–1,0 % der Trockenmasse. Ihre Bedeutung als Waschmittel in früheren Zeiten zeigt der vom lateinischen sapo = Seife stammende Begriff. Die Toxizität für Fische, eine charakteristische Eigenschaft der Saponine, ergibt sich aus ihrer Eigenschaft, die Permeabilität des Kiemenepithels zu erhöhen und kleinmolekulare Bestandteile aus dem Blut auszuwaschen.

Viele Saponindrogen werden als Phytopharmaka verwendet, z. B. als Expektorantien (Primulae radix, Hedera helicis folium, Polygalae radix), Antiexsudativa (Hippocastani semen), Tonika (Ginseng radix), Immunadjuvantien (Quillajae cortex) und Diuretika (Herniariae herba) (Bader, 1994). Innerhalb der Europäischen Gemeinschaft sind saponinreiche Extrakte aus der Rinde des Panama- oder Seifenrindebaumes (Quillaja saponaria Mol.) als Lebensmittelzusatzstoffe (E999) zugelassen und werden u. a. als Schaum-bildner eingesetzt. Die Rinde dieses Baumes enthält bis zu 5 % Saponine. In Deutschland sind Quillaja-Extrakte als Zusatzstoff für alkoholfreie, aromatisierte Erfrischungsgetränke auf Wasserbasis zugelassen (200 mg/l wasserfreier Extrakt).

Oral aufgenommene Saponine werden durch saure Hydrolyse, intestinale Enzyme sowie im Dickdarm durch die Mikroflora in Zucker und Sapogenine gespalten (Price et al., 1987). Das absorbierte Aglykon wird an Serumalbumin gebunden transportiert und durch Bindung an Glucuronsäure in eine wasserlösliche, leicht über die Nieren ausscheidbare Form umgewandelt.Die physiologischen Wirkungen der Saponine stehen in direktem Zusammenhang mit ihrer individuellen chemischen Struktur (Lacaille-Dubois, 2000). Antibiotische Wirkungen von Saponinen richten sich in erster Linie gegen Pilze. Die antifungale Wirkung wird über eine Komplexbildung von Saponinen mit Sterinen der Pilzmembran erklärt (Francis et al., 2002). Durch Zugabe von Cholesterol lässt sich diese Wirkung aufheben, da Saponine mit Cholesterol komplexieren (Allayee et al., 2000). Diese Beobachtung führte zu eingehenden Untersuchungen hinsichtlich der Wirkung von Saponinen auf biologische Membranen (Bangham & Horne, 1962; Glaueri et al., 1962; Gogelein & Huby, 1984). Aufgrund der ausgeprägten Affinität zu Cholesterol werden Saponine auch therapeutisch zur Senkung des Cholesterinspiegels verwendet.

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Die immunologischen Wirkungen der Saponine können in zwei Gruppen eingeteilt werden, eine Adjuvans- sowie eine immunstimulierende Wirkung (Plohmann et al., 1997).

Die Adjuvans-Wirkung der Saponine wurde bereits zu Beginn der 50er Jahre festgestellt und findet heute in Veterinärvakzinen als ISCOM (Immune stimulating Complex) Verwendung (Barr et al., 1998). Werden Antigene in Kombination mit Saponinen verabreicht, so kommt es zu einer stärkeren Immunantwort gegen das Antigen als ohne Saponine (Kensil, 1996). Saponine als Adjuvanzien erhöhen die Antikörperbildung und induzieren bei T-Lymphozyten antikörperspezifische Gedächtniszellen und die Lymphozytenproliferation sowie die B- und T-Zellen-Kooperation bei der Antikörperbildung (Behboudi et al., 1997). Experimentell wurde bereits eine verstärkte saponinvermittelte Adjuvanswirkung einer antigenspezifischen Immunantwort auf HIV-1 Impfstoffe festgestellt (Wu et al., 1992). Die immunstimulierende Wirkung von Saponinen und saponinreichen Extrakten ist in vitro in zahlreichen Experimenten belegt worden (Bomford et al., 1992).

Die Toxizität ist häufig nicht mit hochgereinigten Saponinen ermittelt worden, sondern mit ungereinigten Extrakten. Daher liegen wenige Informationen zur Toxizität einzelner Saponine vor. Die Toxizität zahlreicher Pflanzen, zu denen z. B. die Kornrade (Agrostemma githago L.), die Kermesbeere (Phytolacca americana L.) und das Alpenveilchen (Cyclamen europaeum L.) zu rechnen sind, wird in der Literatur den Triterpensaponinen zugeschrieben, obwohl bis heute kaum Studien existieren, die sich mit dem Zusammenhang zwischen der gastrointestinalen Absorption und der Toxizität der Saponine befassen. Bei oraler Saponinaufnahme wird für Warmblüter eine LD50 von 50–1000 mg/kg Körpergewicht angegeben, was als niedrig einzuschätzen ist. Einzelne Saponine besitzen in vitro und nach intravenöser Applikation eine starke hämolytische Wirkung (Zerstörung der Erythrozytenzellmembran mit anschließendem Hämoglobin-Austritt), weshalb Saponine lange generell als toxisch bezeichnet wurden. Allerdings besteht kein Zusammenhang zwischen der Hämolyseaktivität und einer therapeutischen Wirksamkeit (Lacaille-Dubois & Wagner, 2000). Aufgrund der geringen Bioverfügbarkeit besteht nur ein sehr geringes Risiko, dass es beim Menschen durch den Verzehr saponinreicher Lebensmittel zur Hämolyse kommen könnte. Unklar ist jedoch bis heute, inwieweit im Intestinaltrakt vorhandene Nährstoffe, sekundäre Pflanzenstoffe oder Toxine in Anwesenheit von Saponinen vermehrt absorbiert werden (Tschesche & Wulff, 1973).

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Ein bisher kaum untersuchter, ehemals heimischer Vertreter der Giftpflanzen ist die Kornrade, Agrostemma githago L.. In der vorliegenden Arbeit wurde der Samen der Kornrade, in der sowohl ein AB-Toxin, das Agrostin, als auch ein Triterpensaponingemisch enthalten sind, in vitroTT-toxikologisch untersucht.

Im Jahr 1837 traten in Frankreich Intoxikationen von Hühnern auf, die sich durch kornradehaltiges Futter vergifteten (Lewin, 1928). Erst massiv auftretende Intoxikationen im russischen Heer führten Ende des 19. Jahrhunderts dazu, dass die Kornrade toxikologisch untersucht wurde (Kruskal, 1891). Auf der Grundlage dieser Arbeit wurde schließlich ein neuer Grenzwert für den Gehalt von Kornradesamen im Mehl festgelegt. Insbesondere im chemischen- und pharmakologischen Teil der Dissertationsarbeit von Nikolai Kruskal finden sich Hinweise darüber, dass schon im 19. Jahrhundert nach tierexperimentellen Versuchen nicht klar war, ob das reine Saponin das toxische Prinzip des Kornradesamens darstelle. Diesbezüglich wird R. Böhm zitiert:„...Die Verunreinigungen des Kornrade-Saponins riefen dagegen bedeutende Verlangsamung der Herzbewegung, sowie nach Verlauf einer Stunde Lähmung und Tod des Frosches hervor“. Noch konkreter, wenn auch sicherlich unbewusst, wird durch folgendes Zitat aus dieser Arbeit auf die eigentlich toxische Substanz im Samen hingewiesen: „Lehmann und Mori gelang es nun durch Rösten des Mehles, ohne jeden Zusatz, ....die Samen vollkommen ungiftig zu machen“. Mit dem heutigen Wissen über die Inhaltsstoffe und die Thermolabilität des Proteins Agrostin liegt der Schluss nahe, dass das toxische Protein (als Bestandteil der o.a. „Verunreinigung“?) durch das Rösten denaturiert und dadurch das Samenmaterial entgiftet wurde (Hebestreit et al., 2003). Durch Saatgutverunreinigung entstandene Vergiftungen traten immer wieder auf, bis Ende des 19. Jahrhunderts im Zuge des modernen Ackerbaus die maschinelle Saatgutreinigung Einzug fand. So wurden speziell zum Aussieben der Kornradesamen sogenannte „Radenfänger“ oder „Ausreuter“ entwickelt, die schließlich zur vollständigen Ausrottung dieses ehemaligen Getreideunkrautes und damit auch zum Ende des öffentlichen Interesses an dieser ehemals weltweit verbreiteten Pflanze führten.

Die Kornrade gehört seit dem 16. Jahrhundert zum Arzneischatz: Im New Kreüterbuch von Leonhart Fuchs aus dem Jahr 1543 findet man sowohl eine Abbildung der Pflanze, als auch Angaben über ihre medizinische Verwendung (Hebestreit et al., 2003). Im Jahr 1753 erhielt die Kornrade (Abb. 1-3), eine Caryophyllacee, von Carl von Linnaeus den Gattungsnamen Agrostemma.Vermutlich sind im Namen Agrostemma githago L. var. githago die griechischen Begriffe agros = Acker und stemma = Kranz, Krone miteinander verknüpft. Dieser heute nur noch selten zu findende Archäophyt war ehemals ein weit verbreitetes Getreideunkraut, das schon vor Hippokrates bekannt war und medizinisch verwendet wurde (Hoffmann-Bohm, 1992). Der deutsche Name, der den Begriff „Rad“ enthält, deutet auf die Form der oberen Teile der fünf Kronblätter hin, die an ein Wagenrad erinnern. Allerdings werden mit der Bezeichnung Rade (althd.: ratan) auch andere Ackerunkräuter belegt, wie z. B. Lolium temulentum L. oder Nigella arvensis L.(Marzell, 1943). Die Kornrade gehört zur sog. Ackerbegleitflora und war bis in die sechziger Jahre neben vielen anderen Wildkräutern eine häufig auftretende Pflanze im Wintergetreide. Ihr Vorkommen erstreckte sich von Süd- und Mitteleuropa bis nach Asien. Ihre größte Verbreitung bis nach Nord- und Südamerika, Afrika und Australien erlangte sie mit Beginn des Getreideanbaus. Durch die moderne Ackerbautechnik, maschinelle Saatgutreinigung und den Gebrauch von Herbiziden ist die Kornrade heute entweder ausgestorben oder zählt zu den stark gefährdeten Arten, sog. "Rote-Liste-Arten". Besondere Popularität erlangte sie erst wieder, als man erkannte, dass kornradehaltiges Mehl verantwortlich für aufgetretene Intoxikationen war. Dementsprechend groß wurde das Interesse an Untersuchungen zur Ursache dieser Toxizität, deren Symptome zunächst anhand vieler Tierversuche beschrieben wurden (Kruskal, 1891). Seit dem 19. Jahrhundert wird in Anlehnung an bekannte, toxische Saponine von einem „Sapotoxin“ gesprochen, das für die Toxizität verantwortlich gemacht wird (Lewin, 1928). Als das Problem der Intoxikation durch Kornradesamen mit der nahezu vollständigen Ausrottung der Pflanze uninteressant geworden war, verlor man auch das naturwissenschaftliche Interesse, das toxische Prinzip der Kornrade weiter zu erforschen und hielt sich weiterhin daran, dass ein toxisches Saponin oder ein Gemisch verschiedener derartiger Saponine im Samen der Kornrade verantwortlich für ihre hohe Toxizität seien (Lewin, 1928). Auch der im reifen Samen gefundenen, seltenen Aminosäure Orcylalanin wurde die Toxizität zugeschrieben; diese Hypothese erwies sich jedoch ebenfalls als falsch (Blöcher, 1982). Sehr unterschiedliche Symptome und Empfindlichkeiten zeigten verschiedene Tierarten nach dem Verzehr des Samens (Hoffmann-Bohm, 1992). Beim Menschen wird die nach chronischer Anwendung auftretende Symptomatik als Githagismus bezeichnet, dem Githagosid entsprechend, welches als Hauptsaponin der Pflanze angesehen wird.

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Die bekannten Inhaltsstoffe der Kornradesamen sind insbesondere bisdesmosidische Triterpensaponine diverser Struktur (siehe Tab. 2-1). Bis heute sind aus dem Samen der Kornrade drei Triterpensaponine mit Gypsogenin (= Githagenin, 3β-Hydroxy-23-oxo-Δ12-oleanen-28-Säure) als Aglykon isoliert worden: ein monodesmosidisches Tetraglykosid (= Githagosid) und die Agrostemmasaponine 1 und 2, beides Bidesmoside des Gypsogenins (Tschesche & Schulze, 1974; Siepmann et al., 1998). Als Nebensaponinaglykon ist auch Quillajasäure (3β, 16 α-Dihydroxy-23-oxo-Δ12-oleanen-28-Säure) zu finden (Hoffmann-Bohm, 1992). Neben den erwähnten Saponinen sind weitere Inhaltsstoffe der reifen Samen 0,4 % Orcylalanin (2,4-Dihydroxy-6-methylphenylalanin), ca. 6 % fettes Öl und das ribosomeninaktivierende Protein (RIP 1) Agrostin mit einer rel. Molekülmasse (Mr) von 27 kDa (De Klerk & Engelen, 1985). Aussagen über das toxische Prinzip waren bisher zumeist spekulativ und stützten sich auf ein „Sapotoxin“, ein toxisches, im Samen enthaltenes Saponin bzw. eine hohe Konzentration der vermeintlich toxischen Saponine. Ende der neunziger Jahre untersuchten Siepmann et al. den Gesamtsaponingehalt des Samenmaterials, welcher wesentlich geringer als der in der Literatur angegebene Wert von 5-7 % [m/m] ausfiel (Siepmann et al., 1998). Aufgrund dieser widersprüchlichen Ergebnisse sowie der erheblich höheren Toxizität des wässrigen Samenextraktes im Vergleich mit dem methanolisch-wässrigen Extrakt und der Agrostemma-Saponine (siehe Abb. 3-1) wurde im Rahmen einer Diplomarbeit der wässrige Extrakt neben den Saponinen hinsichtlich potentiell toxischer Saponine und Proteine (RIPs), die vermutlich für die Pflanze einen Abwehrmechanismus gegen Viren und andere Pathogene darstellen, untersucht (Barbieri et al., 1993).

Abb. 1-3: Abbildung der Kornrade (Agrostemma githago L.) und des Kornradesamens (Abb. links: Köhlers Atlas der Medizinalpflanzen).

Mit der Isolierung der Saponine der Kornradesamen beschäftigten sich Siepmann et al. an der Humboldt-Universität in Berlin (Siepmann et al., 1998). Anschließend wurden Zytotoxizitätsuntersuchungen der isolierten Agrostemmasaponine im Verhältnis zuRohextrakten von Kornradesamen durchgeführt (Hebestreit, 1999). Die Ergebnisse dieser Arbeiten deuten erstmals darauf hin, dass das toxische Prinzip im Samen der Kornrade nicht allein auf deren Saponine zurückgeführt werden kann, da die Toxizitätswerte des wässrigen Gesamtextraktes sowohl die des methanolisch-wässrigen Gesamtextraktes als auch die entsprechende Konzentration der darin enthaltenen Saponine in seiner Toxizität weit übertreffen (Hebestreit & Melzig, 2003).

1.1  Arbeitshypothesen

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Bis heute wurden aus den Samen von Agrostemma githago L. var. githago drei Saponine mit dem Aglykon Gypsogenin (=Githagenin, 3β-hydroxy-23-oxo-Δ12-oleanen-28-säure) als Hauptsapogenin und Quillajasäure (3β, 16α-Dihydroxy-23-oxo-Δ12-oleanen-28-säure) als Nebensapogenin isoliert: Githagosid, ein monodesmosidisches Tetraglykosid (Tschesche & Schulze, 1974) und die Agrostemmasaponine 1 und 2, beides 3, 28-Bisdesdesmoside mit Gypsogenin als Aglykon (Siepmann et al., 1998). Entsprechend der bereits untersuchten Agrostemma-Extrakte wurde die These einer kooperativen Toxizität zwischen Saponinen und Toxinen wie dem Agrostin aufgestellt (Hebestreit & Melzig, 2003). Insbesondere wurden Triterpensaponine aus Caryophyllaceen untersucht (siehe Tab. 2-1) und in subtoxischen Konzentrationen eingesetzt, die in vitro eine Proliferationsförderung auslösen (Abb. 3-8). Die meisten der eingesetzten Toxine waren funktionell oder strukturell verwandt mit dem Agrostin. Es war die Aufgabe dieser Dissertation, die zur Aktivität notwendigen Einzelkomponenten und ihren Wirkungsmechanismus zu charakterisieren.

Daraus ergaben sich die folgenden Arbeitsaufgaben:

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Zum Verständnis eines möglichen Toxinaufnahmemechanismus ist es erforderlich, den Membranfluss einer Zelle darzustellen:

1.2 Membranfluss (Endo- und Exozytose)

Nach der Kompartimentierungsregel kann man die Endozytose als Aufnahme von extrazellulärem Raum interpretieren, der durch aktive Vorgänge der Zelle so verändert wird, dass er von der Zelle „kontrolliert“ werden kann. Die Aufnahme erfolgt durch Abschnürung der Zellmembran in das Zytoplasma. Ursprünglich wurde der Prozess in die Aufnahme ganzer Partikel (Phagozytose, von griech. phagein = fressen) und die Aufnahme von Flüssigkeit (Pinozytose von griech. pinein = trinken) unterteilt. Es wird angenommen, dass der Vorgang der Endozytose evolutionär aus dem Nahrungsaufnahmemechanismus in frühen einzelligen Organismen entstanden ist. Die Funktion der Endozytose hat sich jedoch im Lauf der Entwicklung zu höheren Lebewesen immer mehr spezialisiert und nur in bestimmten Fällen dient sie noch der Internalisierung von Substanzen mit Nahrungscharakter, wie z.B. bei der Endozytose von Transferrin zur Aufnahme von Eisen (siehe Abb. 1-4), oder bei der LDL-Endozytose zur Rekrutierung von Cholesterin (Allayee et al., 2000; Simons & Ikonen, 2000). Die Aufnahme der meisten Nährstoffe erfolgt bei Säugetierzellen durch transmembranen Transport von niedermolekularen energiereichen Verbindungen aus dem Blut bzw. dem Extrazellularraum. Der Endozytosemechanismus als Methode zur Nahrungsaufnahme wurde mit der Zeit von den Zellen für verschiedenste Aufgaben adaptiert, z. B. für die Interaktion mit anderen Zellen, für Immunreaktionen, zur Regulation zellulärer Prozesse über Wachstumshormone, zur Eliminierung körperfremder Zellen oder zum Abbau extrazellulärer Makromoleküle. Die Zelle benötigt diesen besonderen Mechanismus, um große, hydrophile Moleküle wie Proteine, die sie nicht auf klassische Weise durch Diffusion, Membranporen oder Ionenkanäle aufzunehmen bzw. auszuscheiden vermag, durch die Zellmembran zu transportieren (Haines, 1994). Dabei umfließt die Membran das Material und schließt sich zu einem Bläschen (Vesikel), das nun durch die Zellen diffundiert. Allgemein entstehen bei der Endozytose Vesikel (membranumhüllte Bläschen), dieman Endosomen nennt. Auf die gleiche Weise, nur umgekehrt, werden Stoffe auch aus der Zelle ausgeschieden. Hier spricht man von Exozytose (exo = hinaus). Bei all diesen Vorgängen sind das ER, der Golgi-Apparat und die Lysosomen beteiligt.

1.2.1  Rezeptorvermittelte Endozytose

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Ein Beispiel für eine rezeptorvermittelte Endozytose ist der Transferrinzyklus (Abb. 1-4). Dabei werden in wachsenden Zellen durch ein Transportprotein (= Transferrin) Eisen III+-Ionen in die Zelle transportiert. Bei niedrigem pH im Endosom entlädt das Eisentransportprotein die Eisenionen ins Zytoplasma und diffundiert wieder an die Zelloberfläche, wo es durch Exozytose ausgeschleust wird (Ippoliti et al., 1995). Bei der rezeptorvermittelten Endozytose wird Klathrin in die Membran eingelagert und ein „coated pit“ (= ummantelte Grube) gebildet (Abb. 1-4). Klathrinbedeckte Vesikel vermitteln den selektiven Transport von Transmembranproteinen (z.B. M6P-Rezeptor aus dem trans-Golgi-Netz) und befördern lösliche Moleküle, die an die Rezeptoren gebunden sind oder sich im Vesikellumen befinden. Klathrin besteht aus drei großen und drei kleinen Polypeptidketten, die zusammen eine dreibeinige Struktur, das Triskelion, bilden. Diese Klathrin-Triskelions lagern sich zu einem käfigähnlichen, konvexen Netz aus Fünf- und Sechsecken zusammen, die auf der Membranoberfläche die coated pits bilden. Ein weiteres wichtiges Hüllprotein in diesen Vesikeln ist das Adaptin. Es wird benötigt, um den Klathrinbelag an die Membran zu binden und Transmembran-Rezeptorproteine zu greifen, die wiederum dazu dienen, bestimmte Frachtmoleküle selektiv in die Vesikel aufzunehmen.

Abb. 1-4: Beispiel einer rezeptorvermittelten Endo- und Exozytose: der Transferrinzyklus (Abb. links aus: http://www.egbeck.de).

Dieser Mechanismus spielt bei der Aufnahme von Cholesterol (LDL), Hormonen (Insulin), Toxinen (Diphtheriatoxin), Antikörper (IgG) eine bedeutende Rolle. In der rechten Abbildung wird elektronenmikroskopisch die Bildung eines Klathrin-umhüllten Vesikels dargestellt.
(Abb. links: http://www.sp.uconn.edu; Abb. rechts: Copyright 2002: Thomas M. Terry).

1.2.2 Endozytose durch Caveolae

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Bei dieser Art der Endozytose handelt es sich um einen Klathrin-unabhängigen, Ligand-getriggerten Energie- und temperaturabhängigen Transport. Caveolen (lat. Caveolae - engl. caveols) sind kurze, tubulusartige Einstülpungen in die äußere Membran von Zellen und werden auch als eine spezielle Form der „lipid rafts“ definiert. Lipid rafts, auch als „Caveolae intracellularae“ bezeichnet, werden seit 1988 kontrovers diskutiert (Pelkmans & Helenius, 2002). Caveolae sind dicht gepackte, Cholesterol- und glycosphingolipidreiche Abschnitte höherer Ordnung, die oft nur einige hundert Nanometer in das Zellinnere hinein reichen. Sie werden experimentell durch ihre Unlöslichkeit in nichtionischen Detergenzien wie Triton X-100 charakterisiert (Shogomori & Brown, 2003). Die Caveolae verlaufen dabei typischerwei-se parallel zur Außenmembran in 30-50 nm Abstand zu dieser. Sie erinnern an mikropino-zytotische Bläschen, obwohl sie keinen für endozytotische Bläschen typischen Klathrinmantel aufweisen. Möglicherweise stehen die morphologisch an ein glattes endoplasmatisches Retikulum erinnernden Caveolae mit Zisternen des Golgi-Apparates in Verbindung.

Abb. 1-5: links: Elektronenmikroskopische Abbildung der Innenseite eines Fibroblasten.

Die Caveolen sind typischerweise kleiner als „Clathrin-coated pits“ und machen mehr als 10 % der Membranoberfläche von Endothelzellen aus (siehe Abb. links oben). Die spiralen-förmige Struktur der Caveolen entsteht durch Zusammenlagerung von Caveolin, einem Membranprotein mit einer Molmasse von 22 kDa; rechts: Entstehung eines „coated pit“.
(Abb. aus http://www.heuserlab.wustl.edu; John Heuser, Washington University).

Neben ihrer Rolle in der Signalübertragung und der Transzytose spielen die Caveolen vermutlich auch eine Rolle im Transport zwischen dem Golgi-Apparat und dem ER, in der Potozytose, einem speziellen endozytotischen Mechanismus zur Aufnahme kleinerer Moleküle, sowie in der Cholesterol-Homöostase der Zelle. Im Gegensatz zur Klathrin-vermittelten Endozytose, z. B. Transferrin, das bereits nach 15 min internalisiert wird, läuft die Endozytose durch Caveolae (z. B. Choleratoxin) wesentlich langsamer (10-20 h) ab. Caveolen sind Gegenstand der aktuellen Forschung. Neuere Arbeiten belegen, dass Caveolen eine entscheidende Rolle bei der getriggerten Internalisierung von Membrankomponenten, extrazellulären Liganden, Toxinen und verschiedenen Viren spielen und zur Aktivierung ein komplexer Aktivierungsprozess von Nöten ist (Fittipaldi, 2003).

1.3 Intrazellulärer Transport von Proteinen

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Wege für den Proteintransport:

Transport durch die Kernmembran: Die Kernporenkomplexe bestehen aus ca. 100 Proteinen und haben eine Größe von 125000 kD. Ein Zellkern besitzt in Abhängigkeit von der Transkriptionsaktivität 3000-4000 Poren. Kernproteine werden im Zytosol von freien Ribo-somen synthetisiert. Wasserlösliche Moleküle mit weniger als 5 kD können frei passieren. Das kritische Molekulargewicht, das offenbar nicht mehr passieren kann, liegt bei 60 kD (Mr Agrostin: 27 kDa, Mr Ricin: 64 kDa), der Kanal ist 9 nm im Durchmesser und 15 nm lang. Größere Proteine, wie die aggregierten ribosomalen Proteinkomplexe, werden aktiv trans-portiert.

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Proteintransport: Cytosol Kern: Die Proteine (Fracht) binden dabei über die Lys-Reste an das zytosolische Transportprotein Importin α. Nach Bindung von Importin β dockt der Komplex an die Kernpore an und wird unter Vermittlung und Kontrolle des RanGDP-Proteins durch die Pore geschleust. Durch Bindung eines RanGTP-Proteins im Kern an Importin β wird der trimere Komplex gespalten und das Fracht-Protein frei.

Proteintransport: Kern Cytosol: Die Frachtproteine werden durch Bindung an Transportproteine Exportin, Karyopherin, Transportin gebunden und unter Beteiligung von RanGTP aus dem Kern transportiert.

Protein-Import in das ER (Signalhypothese): Dieser Transporterfolgt kotranslational. Ein SRP (vom engl.: signal recognition particle) bindet an das hydrophobe Signal des neu synthetisierten Proteins und inseriert es an den Rezeptor (SRP-Rezeptor) im ER. Da das ganze noch am Ribosom hängt, entstehen so die Polysomen. Es besteht ein wässriger Kanal unterhalb des SRP-Rezeptors, der in Abwesenheit des Ribosoms verschlossen ist. Das N-terminale Signal verbleibt an der Pore und wird erst von der Signalpeptidaseabgeschnitten, wenn das C-terminale Ende im ER ist. Durch Ausknospung von ER-Membranen entstehen Vesikel, in denen sich der ER-Inhalt (mit Protein) befindet. Die abgeschnürten Vesikel gelangen zum Golgi-Apparat und fusionieren mit der Membran der Golgi-Hohlräume (cis-Zisterne). Damit ergießt sich der Vesikelinhalt in den Zisterneninhalt. Durch Vesikeltransport gelangen die Proteine in die medianen- und trans-Zisternen, in denen sich die Modifizierung der KH-Kette durch aufeinander folgende Anlagerung von Monosacchariden (Fucose, N-Acetylglucosamin, Galaktose, Sialinsäure) fortsetzt. Dadurch entstehen die Signale für den Transport in verschiedene Zellkomarptimente bzw. für die Sekretion. Proteine, bei denen die Phosphorylierung der Mannose der KH-Ketten stattfindet, binden in den trans-Zisternen an ein Mannose-6-Phosphat-Rezeptor-Protein, wodurch sie in die Lysosomen dirigiert werden. Durch Knospung können "leere" Rezeptorproteine wieder zurück zur Membran transportiert werden (Rezeptor-Recycling). Der endozytotische und der sekretorische Weg sind miteinander verbunden. Das Transportprinzip ist der vesikuläre Transport. Lysosomen können mit Endosomen (von der Endozytose), mit Autophagosomen und mit Phagosomen fusionieren. Ein weiterer Weg des vesikulären Transportes ist die Exozytose (siehe Abb. 1-4).

1.4 Zellzyklus und Apoptose

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Um den Angriffsort von toxischen Lectinen definieren zu können, gibt der folgende Abschnitt einen Überblick über die wichtigsten Schritte der Zelldifferenzierung, der Proteinsynthese und den sog. „programmierten Zelltod“: die Apoptose.

G0-Phase: die meisten ausdifferenzierten Zellen befinden sich in der G0-Phase, d.h. sie teilen sich nicht mehr, wie z. B. Neuronen oder Zellen der Augenlinse, sie haben den Zellzyklus verlassen. Zellen können aus der G0-Phase durch den Einfluss von Wachstumsfaktoren in die G1-Phase übergehen.

G1-Phase: G für gap = Lücke, postmitotische Ruhephase, dauert bei einer sich rasch teilenden menschlichen Zelle (wie z.B. Epithelien) rund 4-10 Stunden. Biochemisch ist sie durch RNA- und Proteinsynthese sowie durch Größenzunahme der Zelle gekennzeichnet. Synthese von Histonen, Enzymen, die in der S-Phase zur Replikation/ Transkription benötigt werden.

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S-Phase: (Synthese-Phase), ca. 8 Stunden, in ihr findet die Synthese von DNA, RNA, Enzymen (Replikation) statt, Bildung des Zentrosoms.

G2-Phase: prämitotische Ruhephase ca. 12 Stunden; es werden die Proteine für die Mitose synthetisiert. Hier wird kontrolliert, ob die gesamte DNA repliziert ist, ansonsten verharrt die Zelle in G2 und tritt nicht in die Mitose ein. G1, S, G2 werden als Interphase zusammen-gefasst. In dieser Phase greifen RIPs wie Agrostin in den Zellzyklus ein. Der wichtigste Schritt der Proteinbiosynthese, welche durch RIPs unterbunden wird, ist der Translationsmechanismus: die Initiation erfordert die Assoziation der Ribosomenuntereinhei-ten. Die mRNA bindet mit einer spezifischen Bindungsstelle an das Ribosom, sie enthält das Startcodon AUG (codiert Methionin). Weiterhin enthält der Initiationskomplex die Starter-tRNA (Methionyl-tRNAf), GTP und mindestens 6 Initiationsfaktoren (eIF, eukaryontischer Initiations-Faktor). Die an der Starter-tRNA gebundene Aminosäure Methionin ist formyliert (N10Formyl-FH4). Damit ist die NH2-Gruppe blockiert, wodurch die Richtung der Protein-Synthese festgelegt ist. EF-2 unterscheidet z. B. zwischen normaler Met-tRNAm und Starter-Methionyl-tRNAf. Diese bindet am Peptidyl-Zentrum auf dem Ribosom. An einer mRNA können mehrere Ribosomen arbeiten (Polysomen). Bei der Elongation wird die nächste, mit der AS beladene tRNA an die dem P-Zentrum benachbarte noch freie Aminoacylbindungs-stelle (A-Zentrum) gebunden (Codon-Anticodon-Wechselwirkung). Hierfür ist der Elonga-tionsfaktor EF-1α notwendig. Die Transpeptidase katalysiert die Knüpfung der Peptidbindung zwischen der NH2-Gruppe der im A-Zentrum sitzenden Aminoacyl-tRNA und der COOH-Gruppe der im P-Zentrum gebundenen Formyl-Methionyl-tRNAf. Die nun nicht mehr beladene Methionin-spezifische tRNAf dissoziiert ab. Anschließend erfolgt die Translokation der Peptidyl-tRNA (mit der mRNA) aus dem A-Zentrum in das P-Zentrum mit Hilfe von EF2. Die Termination erfolgt beim Erreichen eines Stopcodons. Ein Releasingfaktor setzt GTP-abhängig das Protein frei (eRF). Durch eine ADP-Ribosylierung (Inaktivierung) von EF2 hemmt z. B. Diphtheriatoxin den Translationsmechanismus (siehe Abschnitt 3.11; Nurse, 2000).

Apoptose (programmierter Zelltod): Die Zellzahl eines Organs wird durch Proliferation und Zelluntergang reguliert. Die Notwendigkeit einer solchen Regulation besteht in der Entwicklungs- und Umbauphase von Geweben. So ist die Apoptose auch für das Gleichgewicht im Immunsystem notwendig, z. B. für die Selbsttoleranz.

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Apoptose ist die häufigste Form von Zelltod im Organismus. Sie wird durch folgende biochemische und zellbiologische Charakteristika morphologisch definiert (Lincz, 1998):

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Apoptose-auslösende Faktoren sind z. B. Signale von außen: Fas-Ligand, Tumor-nekrose-faktor (TNF, Viren, RIPs und Immunotoxine, oxidativer Stress, etc. (Bolognesi et al., 1996; Utsumi et al., 1991). Die Zytokine binden an Rezeptoren, die eine sog. Todesdomäne besitzen. Die Bindung des Liganden induziert häufig eine Trimerisierung des Rezeptors, was dann intrazellulär eine Kaskade von Effekten auslöst. Der am besten untersuchte Rezeptor ist das Molekül CD95.

Der Unterschied zur Nekrose besteht in Folgendem:


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07.11.2006