2 Material und Methoden

2.1  Allgemeine Hinweise

↓18

In der Arbeit verwendete, geschützte Warenzeichen werden nicht als solche gekennzeichnet. Eine fehlende Kennzeichnung bedeutet folglich nicht, dass ein entsprechender Produktname frei von Rechten Dritter ist. Alle Puffer und Lösungen werden- falls nicht anders angegeben– mit bidestilliertem Wasser aus einer Destillationsanlage hergestellt. Die verwendeten Materialien für die Zellkultur und für die molekularbiologischen Methoden sind entweder vom Hersteller steril verpackte Einmalartikel oder sie werden vor ihrer Verwendung in einem Autoklaven bei 121°C 20 min dampfsterilisiert. Sofern bei einigen der folgenden Methoden und Inkubationsschritte keine Temperatur angegeben wird, so wird bei Raumtemperatur gearbeitet.

2.2  Geräte

2.2.1  Zellkultur

2.2.2  Zentrifugen

2.2.3 Elektrophorese

↓19

2.2.4 Sonstige Geräte

2.3 Verbrauchsmaterialien

2.3.1  Untersuchungsmaterial

↓20

Das Samenmaterial der Kornrade, Agrostemma githago L. var. githago, hat die Sortiments-Nr. „AGRO 26/80“ der Genbank in Gatersleben. Es wurde an der Bundesanstalt für Züchtungsforschung an Kulturpflanzen in Quedlinburg kultiviert. Die in Mitteleuropa ehemals verbreiteten Sippen der Kornrade sind tetraploid mit 2n = 4x = 48 Chromosomen.

2.3.2 Zellkultur

↓21

Sterile Einwegware, wie Pipetten, Schraubdeckelröhrchen, Zentrifugenröhrchen und Gefäße für die Zellkultur wurden von den Firmen Nunc (Wiesbaden), Roth (Wiesbaden), Merck (Darmstadt) und Greiner (Nürtingen) bezogen.

2.4 Chemikalien

↓22

Weitere Chemikalien wie z. B. NaCl wurden von der Carl Roth GmbH, Karlsruhe, der Merck AG (Darmstadt), Serva (Heidelberg) oder Sigma (Deisenhofen) bezogen.

2.5 Untersuchte Triterpensaponine

2.5.1  Bisdesmoside

2.5.1.1 Reinsubstanzen

Saponine aus Arenaria juncea M.Bieb. (M.A. Lacaille-Dubois, Université de Bourgogne)

↓23

(Abbildung der Strukturformeln der Saponine: siehe Tab. 2-1)

2.5.1.2 Rohsaponine und isolierte Hauptkomponenten

↓24

2.5.2 Monodesmosid

Go B; MA Lacaille-Dubois, Université de Bourgogne

2.5.3 Aglykon

Gypsogenin (Astrantiagenin D), Referenzsubstanz (Hiller et al., 1976)

↓25

Tab. 2-1: Struktur der Triterpensaponine

Gypsogenin

R1

R2

AsA

AsB

AsD

ArjA

ArjC

ArjD

AS 1

AS 2

Gypsosid

Gypsophilasaponin 3

Gypsophilasaponin 4

GoB

Quillajasäure

(= 16 α-Hydroxygypsogenin)

AsE

ArjE

Gypsophilasaponin 1

Gypsophilasaponin 2

DS 1

QS 21

QS 18

Echinocystsäure

Helianthosid 2

2.6 Antikörper

2.7 Proteine, Toxine, Enzyme und Nucleotide

↓26

Zur chemischen Struktur und den Eigenschaften der Toxine, sowie pharmakologischen sowie biochemischen Erläuterungen: siehe Abschnitt 3.11.

2.8 Sonstiges Verbrauchsmaterial

2.9 Material für die Chromatographie

↓27

2.10 Reagenziensätze und Molekulargewichtsmarker

2.11 Zelllinien

2.12 Pufferlösungen

↓28

Dulbecco-PBS-Puffer

1.5 mM KH2PO4, 8 mM Na2HPO4, 35 mM NaCl,
2.7 mM KCl, 0.9 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, pH 7.4

PBS-Puffer

150 mM NaCl, 8.33 mM Na2HPO4, 1.67 mM KH2PO4,
pH 7.4

Sörensen-Phosphatpuffer

150 mM NaCl, 8.3 mM Na2HPO4, 1.83 mMNaH2PO4,
pH 7.4

Tris-HCl-Puffer

20 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7.4

2.12.1  Puffer zur Gelelektrophorese

Running buffer

0.4 M Tris-HCl, 0.02 M Natriumacetat, 2 mM EDTA,
0.2 % SDS, pH 8.0

Laemmli sample buffer

25 mM Tris-HCl, 192 mM Glycin, 0.1 % SDS, pH 8.3

LMW-Kit-buffer

10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 2.5 % SDS, 5 % ß- Mercaptoethanol, pH 8.

2.13 Zellbiologische Methoden

2.13.1  Anforderungen der Zellen an das Milieu

Alle Zelllinien wurden im Brutschrank unter 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit bei einer Temperatur von 37 °C kultiviert. Sämtliche Arbeiten erfolgten unter einer sterilen Werkbank (laminar flow).

2.13.2 Passagieren der Zellen

↓29

Im ersten Schritt wurde einmal mit Dulbecco-PBS gewaschen und anschließend Trypsin-EDTA-Lösung (2.5 ml) zugegeben. In Abhängigkeit von der Beschaffenheit der Zelllinie wurde so lange inkubiert (2-6 min), bis man im Lichtmikroskop eine deutliche Abkugelung der Einzelzellen beobachten konnte. Nach vollständiger Entfernung der Trypsin-EDTA-Lösung wurden die Zellen durch leichtes Klopfen vom Boden des Zellkulturgefäßes gelöst und nach Zugabe von frischem Medium (5 ml) durch mehrfaches pipettieren suspendiert und vereinzelt. Die suspendierten Zellen wurden in einer 1:15-Verdünnung ausgesät. Im Falle der Aussaat einer definierten Anzahl Zellen wurde die Zelldichte mit Hilfe des CASY-Zellzählgerätes bestimmt und auf die erforderliche Zellkonzentration eingestellt.

2.13.3 Kultivierung von ECV 304-Zellen

Kulturmedium: 90 % Medium 199 (mit HEPES-Puffer und Earle`s Salzen)+10 % fetales Kälberserum; kein Antibiotkazusatz. Die Kultivierung der adherenten ECV-304-Zellen erfolgte in 5 ml Medium in sterilen Zellkulturgefäßen (50 ml).

2.13.4 Kultivierung von SK-N-SH-Zellen

Kulturmedium: MEM-Earle`s + 2 mM Glutamin + 10 % fetales Rinderserum (FCS). Die Kultivierung der adherenten SK-N-SH-Zellen erfolgte in 5 ml Medium in sterilen Zellkulturgefäßen (50 ml).

2.13.5 Kultivierung von HaCat-Zellen

↓30

Kulturmedium: Gibco`s Keratinocyte Serum Free Medium (SFM) + BPE (25 µg/ml, Rinderhypophysenextrakt) + rEGF (0.1-0.2 ng/ml, rekombinanter epidermaler Wachstumsfaktor). Die Kultivierung der adherenten HaCat-Zellen erfolgte in 5 ml Medium in sterilen Zellkulturgefäßen (50 ml).

2.13.6 Einfrieren und Auftauen von Zellen

Eine Konservierung von Kulturzellen kann durch Einfrieren der Zellen in flüssigem Stickstoff bei -196°C erfolgen. So eingefrorene Zellen sind jahrelang haltbar und nach Bedarf jederzeit wieder auftau- und kultivierbar. Nach Zugabe von Trypsin-EDTA-Lösung wurden die Zellen einer konfluent bewachsenen Gewebekulturplatte (Durchmesser 100 mm, ca. 5 x 106 Zellen) abgelöst und in frischem Medium resuspendiert. Durch Zentrifugation (200 x g, 7 min) wurden die Zellen anschließend pelletiert und in 1.0 ml Einfriermedium (Medium, 10 % (v/v) FCS, 10 % DMSO) resuspendiert. Die erhaltene Zellsuspension wurde in Kryoröhrchen überführt und innerhalb von 2 Tagen im Nalgene Cryo Freezing Container in Isopropanol kontinuierlich auf –80°C abgekühlt. Für eine längere Lagerzeit wurde flüssiger Stickstoff verwendet. Das Auftauen der Zellen erfolgte in einem Wasserbad. Schrittweise wurden sie in Medium (8 ml, 4°C) resuspendiert. Nach schonender Zentrifugation (200 x g, 7 min) wurden die Zellen erneut in Medium resuspendiert. Zum vollständigen Auswaschen des aus dem Einfriermedium stammenden DMSO wurde dieser Vorgang erneut wiederholt und konnte zur ersten Passage mit Medium, dem 20 % FCS zugesetzt wurde, kultiviert werden.

2.13.7 Hämatoxylin-Färbung von Zellkulturen

Durchführung (saures Hämatoxylin nach Ehrlich zur Anfärbung der Zellkerne):

↓31

  1. Waschen mit PBS, 5 min
  2. Fixieren mit 4 % Formalin-Lsg.(pH 7.2) in PBS, 20 min
  3. Waschen mit PBS, 3-4 mal jeweils 5 min
  4. Hämatoxylin-Färbung (unverd. Anzuwenden) u. 3x waschen mit PBS/ Aqua dest.
  5. Deckgläschen in Glycerol, 1 Tr. auf Objektträger (fixiert zur Ansicht im Mikroskop)

2.14 Immunologische Methoden

2.14.1  Immunfluoreszenzmikroskopie

Bei der hier verwendeten indirekten Immunfluoreszenz-Methode bindet ein unmarkierter Primärantikörper an das Antigen. Anschließend wird ein zweiter, fluoreszenzmarkierter Antikörper (Sekundärantikörper), der gegen den Primärantikörper gerichtet ist, eingesetzt (stammt der Primärantikörper, wie im vorgestellten Fall, aus einem Kaninchen, muss der Sekundärantikörper gegen Kaninchen-Immunglobulin gerichtet sein). Diese Methode erlaubt mehr Flexibilität, da eine Vielzahl von Primärantikörpern mit den gleichen markierten Zweitantikörpern kombiniert werden können. Außerdem ist diese Methode um ein Vielfaches empfindlicher, da verschiedene Zweitantikörper mit den verschiedenen Epitopen des Primärantikörpers reagieren können. Es gibt unterschiedliche Fixative, wobei die Auswahl von dem jeweiligen Antigen bzw. Antikörper abhängig ist. Organische Lösungsmittel wie Methanol und Aceton lösen hydrophobe Wechselwirkungen innerhalb der Proteinstruktur auf und fällen so die Proteine aus. Quervernetzende Substanzen wie Paraformaldehyd, Formaldehyd und Glutaraldehyd bilden intermolekulare Brücken (meist zwischen freien Aminogruppen) aus und schaffen somit ein Netzwerk von verbundenen Proteinen. Vernetzende Fixative erhalten in der Regel den Gewebekontext besser, können jedoch Proteine durch die Quervernetzung unzugänglich machen.

Fluoreszenzmarkierung von Zellorganellen in situ: Durch direkte Fluoreszenzmarkierung sollten ausschließlich solche Zellorganellen und Cytoskelettkomponenten der ECV-304-Zellen dargestellt werden, welche vom mit Fluoreszenzfarbstoff gekoppelten Agrostin erreicht werden. Es wurden jeweils unterschiedlich fixierte Zellen untersucht. Es wurde der an Kaninchen-IgG gekoppelte Fluoreszenzmarker FITC verwendet (siehe Abb. 3-20 und 3-21).

↓32

Reagenzien:

  1. Absättigungslösung: 1 % Nullserumverdünnung in PBS, pH 7.4
  2. Methanol zur Sterilisierung der Deckgläschen
  3. Methanol-HCl (20 %) zum Entfetten der Objektträger und Deckgläschen
  4. Einbettmedium: Glycerol
  5. Ethanol/ Eisessig 95/ 5, RT
  6. Waschpuffer: PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4, 10 x konz.

Lösung zum Fixieren der Zellen:

↓33

  1. Formaldehyd, 1 % in PBS, pH 7.4, RT
  2. Formaldehyd, 4 % in PBS, pH 7.4, RT
  3. Aceton, -20°C
  4. Methanol, 4°C

Material:

  1. Brenner zur Sterilisierung der Deckgläschen
  2. Deckgläschen, steril
  3. Färbeküvette zum Waschen der Objektträger

↓34

  1. Filterpapier
  2. Nagellack/ Paraffin zur Fixierung der Deckgläschen
  3. Objektträger
  4. Petrischalen mit Deckel (als feuchte Kammern)
  5. Uhrmacherpinzetten

Bei allen folgenden Arbeitsschritten musste insbesondere darauf geachtet werden, dass die Zellen nicht austrocknen.

Durchführung: ECV-304 Zellen wurden auf sterilisierten Deckgläschen in einer Petrischale oder einer 6-well Gewebekulturplatte kultiviert (jeweils Zugabe von 1.5 ml Medium nach Anhaftung der Zellen auf dem Deckgläschen). Zur optimalen Vorbereitung der Zellen sollte auf eine gut vereinzelte Aussaat geachtet werden. Die Kultivierungsdauer betrug drei Tage. Es wurden sowohl Kontrollen ohne Toxininkubation verwendet, als auch mit Agrostin und Saponin vorinkubierte Zellen (Inkubationszeit: 0.5 h, 1 h, 2 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h, 72 h). Im ersten Schritt wurde das Kulturmedium vorsichtig mit einer Pasteurpipette abgesaugt. Danach wurden die adherenten ECV-Zellen zweimal mit PBS, pH 7.4, (1x konz., ca. 1,5 ml/ Schale) gewaschen. Generell wurden die Deckgläschen, sowie die Objektträger mit Methanol/ HCl entfettet, mit Ethanol oder Methanol gewaschen und ggf. zum Sterilisieren abgeflammt.

↓35

  1. Formaldehydfixierung: 4 % Paraformaldehydlösung, pH 7.4, wurde zupipettiert (1-2 ml/Schale), 20 min bei Raumtemperatur fixiert und danach 3x mit PBS gewaschen und luftgetrocknet. Im folgenden Schritt konnte (optional) eine Hämatoxylinfärbung vorgenommen werden. Zur späteren Verwendung wurden während der Waschphasen Antikörperverdünnungen hergestellt und in Eis aufbewahrt.
  2. Methanolfixierung: Die adherenten Zellen wurden durch Zugabe von Methanol (15 min bei 4°C) fixiert und danach 3x mit PBS gewaschen und luftgetrocknet.
  3. Acetonfixierung: Die adhärenten Zellen wurden durch Zugabe von Aceton (10 min bei -20°C) fixiert und danach 3x mit PBS gewaschen und luftgetrocknet.
  4. Fixierung mit Aceton/ Eisessig:

Die adherenten Zellen wurden durch Zugabe von Ethanol/ Eisessig, 95 % (v/v) (10 min bei RT) fixiert und danach 3x mit PBS gewaschen und luftgetrocknet. Nach der Lufttrocknung waren die Zellen lagerfähig, sobald sie mit Glycerol auf einem Objektträger fixiert wurden. Während der Fixierung wurde eine feuchte Kammer (z. B. Petrischale) hergestellt: In dieser platzierte man ein passendes Stück Filterpapier und befeuchtete es. Die Deckgläschen wurden mit Paraffin, Nagellack o.ä. auf dem gereinigten, fettfreien Objektträger fixiert. Die Rehydratisierung erfolgte in PBS, pH 7.4 für 20 min. Die hydratisierten Zellen wurden mit 1 % Nullserum inkubiert (30 min, 4°C). Zur Optimierung wurden verschiedene Antikörper-verdünnungen fertiggestellt und in Eis aufbewahrt: 1:10, 2:100, 1:100, 1:200, 1:400 (v/v in PBS). Nach erneutem Waschen erfolgte die Antikörperzugabe in die Mitte des Deckgläschens (1-2 Tropfen. Die Inkubation erfolgte erneut in der feuchten, geschlossenen Petrischale für 30 min, 4°C). Anschließend wurde, nach dreimaligem Waschen der Zellen in einer Färbeküvette, die Anti-Antikörperlösung (2.5 % in PBS) inkubiert und erneut dreimal mit PBS gewaschen. Zur Vorbereitung der Lagerung, sowie der Beobachtung im Fluoreszenzmikroskop wurde das Deckgläschen umgekehrt (Zellen nach unten!) mit den präparierten Zellen auf einen Tropfen Glycerol-Hydrogencarbonat-Puffer auf einen Objektträger gelegt (luftblasenfrei!) und angedrückt. Zuletzt wurden die Präparate getrocknet, sowie lichtgeschützt und kühl gelagert.

2.14.2 Immunodiffusion nach Ouchterlony

Bei diesem Verfahren werden Reaktionen von Antigenen und Antikörpern ausgenutzt, um ein Protein zu identifizieren und falls erforderlich semiquantitativ zu bestimmen. Als Antigen dient dabei entweder ein Proteingemisch, wie zum Beispiel Proteine, die in einem Pflanzen-samen vorhanden sind, oder, wie in diesem Fall, ein einzelnes, vorher durch Chromatographie gereinigtes Protein, das Agrostin. Im vorgestellten Fall wurden Kaninchen-Antiagrostin-antikörper (61. Immunisierungstag) sowie ein Nullserum (1. Immunisierungstag) verwendet. Im ersten Schritt wurde das Agarosegel hergestellt (1.5 % m/V in 0.1 M Trispuffer pH 7.4). Es wurde kurz in einem Mikrowellengerät zum Sieden erhitzt, durch Rühren homogenisiert und auf einen Objektträger aufgebracht. Dieser musste vorher mit Aluminiumfolie so präpariert werden, dass das einer ca. 3 mm dicken Schicht entsprechende Volumen Agarosegel in die vorbereitete Vertiefung gegossen werden konnte. Anschließend wurden jeweils drei Löcher (ca. 2x2 mm) in jedes Gel gestanzt und die Antiseren sowie eine Agrostinlösung (1 mg/ml 0.1 M Trispuffer pH 7.4) und ein aufgereinigter Agrostinextrakt (1 mg/ml 0.1 M Trispuffer pH 7.4) in die Vertiefungen des Agarosegels eingebracht (jeweils ca. 8 µl). Das zu untersuchende Antigen bzw. die Agrostinlösung wurde in eine Vertiefung in der Mitte und die Antiseren (Antiserum und Nullserum) in die beiden äußeren Vertiefungen eingebracht. Dabei diente das Nullserum (1. Immunisierungstag) als Negativkontrolle. Alle so vorbereiteten Objektträger wurden in eine feuchte Kammer überführt und über Nacht im

↓36

Kühlschrank bei 4-8°C inkubiert. Nach Diffusion der Antikörper und der Antigene in das Gel überlagern sie sich und an einer Stelle mit optimaler Konzentration der beiden Reaktionspartner (Antiserum und Antigen, bzw. Agrostinlösung) kommt es zur Bildung eines Präzipitats, das nach 2 Tagen Inkubationszeit als Schliere im Gel mit bloßem Auge gut sichtbar wurde (siehe Abb. 2-2).

2.15 Proteinchemische Methoden

2.15.1  Konzentrationsbestimmung von Proteinen

2.15.1.1 Bradford Assay

Bei der Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford wird der Farbstoff Coomassie-Brillantblau G 250 verwendet. In Gegenwart von Proteinen verschiebt sich das Absorptionsmaximum dieses Farbstoffs im sauren Milieu von 465 auf 595 nm aufgrund einer Komplexbildung der unprotonierten Sulfonat-Form des Farbstoffs mit dem Protein. Die Farbstoffbindung verläuft unspezifisch an hydrophobe, kationische Seitenkettten des Proteins. Zur Herstellung der Stammlösung wurden 100 mg Brillantblau in 50 ml Ethanol (95 %; w/v) gelöst. Nach Zugabe von 100 ml Phosphorsäure (85 %; w/v) wurde mit Aqua bidest. auf 600 ml aufgefüllt und filtriert. Nach Zugabe von 100 ml Glycerol wurde mit Aqua bidest. auf 1000 ml aufgefüllt. Die Lösung war nach 24 h einsetzbar (Bradford, 1976).

Durchführung: 0.1 ml der Eichlösung (Herstellung aus Humanserumalbumin) bzw. der Proteinlösung wurden mit 5 ml Farbreagens versetzt und gemischt (3 min, Ika-Minishaker). Nach 5 min. (max. 20 min) Reaktionszeit wurde die Absorption bei 595 nm gegen einen Blindwert (100 µl Aqua bidest. anstelle der Eichlösung) am Fotometer (Ultrospec II LKB Biochrom) gemessen. Anhand der ermittelten Kalibrierkurve (5 – 100 µg ad 100 µl Aqua bidest.) erfolgte die quantitative Bestimmung des Proteins.

2.15.1.2 BCA Assay

↓37

Die Proteinquantifizierung mit Hilfe der BCA-Methode beruht darauf, dass Kupferionen im alkalischen Milieu durch Proteine reduziert werden (Cu2+→ Cu+). Cu+ bildet anschließend mit 2,2´-Bicinchoninsäure (BCA) einen violetten Komplex, dessen Absorption bei 562 nm mit Hilfe eines Mikroplattenreaders (Tecan Spectra Fluor) gemessen wird (Smith et al., 1985).

Durchführung: Auf einer 96-well-Mikroplatte wurden per Dreifachbestimmung jeweils 10 µl Probe einer Proteinlösung mit 200 µl des frisch hergestellten Reagens (entsprechend den Herstellerangaben) versetzt. Nach einer Inkubationszeit von 35 min bei 37 °C wurde die Absorption gemessen und die Proteinkonzentration anhand einer Kalibrierkurve mit BSA bestimmt.

2.15.2 Zentrifugationsgetriebene Molekülsiebfiltration

Mit Hilfe der Molekülsiebfiltration lassen sich die Proteinlösungen entsprechend der relativen Molekülmasse (Mr) fraktionieren. Hierzu wurden Mikrozentrifugenfilter (Sigma, low-protein-binding) mit Membranen definierter Porengröße (MWCO.: 5/ 10/ 30/ 100 kDa; ) und einer Kapazität von 400 µl verwendet. Es wurde ein wässriger Extrakt (Konz.: 1 mg/ml, phosphatgepuffert, pH 7.2) eingesetzt und jeweils 30 min. bei 8000 rpm zentrifugiert (Biofuge, Heraeus).

2.15.3 Dialyse von Proteinlösungen

↓38

Proteinlösungen geringer Volumina (zwischen 5 u. 10 ml) wurden mit Spectra/Por-CE (Celluloseester) oder mit Membranen aus regenerierter Cellulose dialysiert. Hierzu wurde zuerst das die Membran konservierende Natriumazid durch dreimaliges Waschen mit Aqua bidest. (3x10 min) entfernt. Anschließend wurde gegen die 300fache Menge eines geeigneten Puffers unter Eiskühlung über 24 h dialysiert. Proteinlösungen größerer Volumina wurden mit Hilfe von geeigneten Dialyseschläuchen umgepuffert. Anschließend wurde gegen die 300fache Menge Puffer unter Eiskühlung und mehrfachem Pufferwechsel über 24 h dialysiert.

2.15.4 Lyophilisierung von Proteinlösungen

Nach abgeschlossener Dialyse wurde die Proteinlösung (maximale Kapazität: 3 x 150 ml) auf –80°C vorgekühlt und 24 h zur Trockne lyophilisiert. Nachfolgend musste aufgrund der gestiegenen Salzkonzentration erneut dialysiert werden.

2.15.5  Proteinfällungen

2.15.5.1 Fraktionierte Ammoniumsulfatfällung

Die Ammoniumsulfatfällung hat gegenüber der Acetonfällung den Vorteil, dass keine irreversible Denaturierung der Proteine erfolgt und ist demzufolge die Methode der Wahl, um mit den gewonnenen Fraktionen mit intaktem Protein Zytotoxizitätstests durchführen zu können. Zunächst wurde bei RT eine gesättigte Ammoniumsulfat ((NH4)2SO4)-Lösung hergestellt: unter Rühren wurde eine 50, 60, sowie eine 70 % ige (w/v), gesättigte wässrige Lösung herstellt, bis ein Niederschlag auftrat. Diese Lösungen wurden, beginnend mit der geringsten Konzentration, im Verhältnis 2:1 zur Proteinlösung gegeben und 1 h unter Rühren und Eiskühlung inkubiert. Anschließend wurden die ausgefällten Proteine abzentrifugiert (15000 x g, 10 min), in Puffer aufgenommen und gegen den entsprechenden Puffer dialysiert, um das restliche Ammoniumsulfat zu entfernen. Entsprechend wurde die Fällung mit den beiden nächsthöher konzentrierten (NH4)2SO4 -Lösungen durchgeführt. Die drei erhaltenen Fraktionen wurden nach erfolgter Dialyse lyophilisiert.

2.15.6 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

↓39

Pufferlösungen für die Gelelektrophorese:

1.

4 x SDS-Probenpuffer:

250 mM Tris/ HCl, pH 6.8, 8 % (w/v) SDS, 40 % (v/v)

Glycerol, 0.04 % (w/v) Bromphenolblau, 8 % (v/v) ß-Mercaptoethanol

2.

10 x Elektrophoresepuffer:

20 mM Tris/ HCl, 192 mM Glycin, 0.1 % (w/v) SDS

3.

Fertiggelpuffer:

1.5 M Tris/ HCl, pH 8.8, 0.4 % (w/v) SDS

Die Auftrennung von Proteinen unter denaturierenden Bedingungen wurde durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) im diskontinuierlichen Puffersystem nach Lämmli (Lämmli, 1970) unter Verwendung der Mini-Protean II Elektrophorese-Apparatur (Biorad) durchgeführt. Es wurden grundsätzlich diskontinuierliche Gele verwendet (10-20 % oder 4-20 % (v/v) Acrylamid, 10 wells, 30 µl). Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde im Rahmen dieser Arbeit zur Bestimmung der Protein-Molekulargewichte eingesetzt. Das exakte Molekulargewicht eines Proteins erhält man erst nach Aufspaltung der globulären Proteine und Lösen ihrer Tertiär-und Sekundärbindungen (Erhitzen der Probe auf 95°C mit einem Überschuss von SDS), sowie unter reduktiven Bedingungen (z. B. β-Mercapto-ethanol), die zur Aufspaltung von Schwefelbrücken führen und die Proteine zu ellipsoiden Aminosäureketten aufspalten. Es lassen sich also nur die Molekulargewichte von Untereinheiten exakt bestimmen. Da Glykoproteine langsamer laufen als nicht-glykosylierte Proteine (sie werden mit weniger SDS beladen), wurde für das zu isolierende Agrostin immer ein Agrostin-Standard (Sigma) verwendet. Im Rahmen dieser Arbeit ist die Aussage über die relative Molekülmasse im Vergleich zum jeweiligen Standard ausreichend. Das Polyacrylamid-Fertiggel wurde im ersten Schritt in eine Elektrophoresekammer eingespannt, der Elektrodenpuffer eingefüllt und die in Laemmli-sample buffer gelösten Proben in die Taschen des Gels pipettiert. In jedes Gel wurde als Referenz der LMW-Molgewichtsmarker aufgetragen (siehe Abschnitt 3.4.3). Die Trennung der Proteingemische wurde in Elektrophoresepuffer über 45-95 min bei einer Stromstärke von 120/ 200 V und 40 mA durchgeführt.

2.15.6.1 Lösungen für die Gelfärbung, die Gelentfärbung und das LMW-calibration-kit

↓40

Coomassielösung:

0.1 % (w/v) Coomassie Blue R-250, 10 % (w/v) Eisessig, 40 % (v/v) Methanol, filtriert (alternativ: 1 x Coomassie stain solution, Biorad)

Entfärbelösung:

7.5 % (v/v) Essigsäure, 20 % (v/v) Ethanol (alternativ: 1 x Coomassie R-250 destain solution, Biorad)

LMW-Standard

vorgefärbter low-molecular-weight-Standard zur Kalibrierung der Elektrophorese (Pharmacia):

Phosphorylase b

97.4 kDa

Rinderserumalbumin

66.2 kDa

Ovalbumin

45.0 kDa

Trypsin-Inhibitor

21.5 kDa

α-Lactalbumin

14.4 kDa

2.15.6.2  Färben mit Coomassie Blau

Das zu färbende Polyacrylamidgel wurde der Gelkassette entnommen und mind. 30 min in 75 ml frisch hergestellter Coomassie-Färbelösung inkubiert. Dadurch wurden die Proteine zugleich angefärbt und fixiert.

2.15.6.3 Entfärben der Gele

↓41

Anschließend wurde das Gel unter mehrfachem Wechsel so lange auf dem Schüttler entfärbt, bis die Hintergrundfärbung weitgehend entfernt war. Zur weiteren Lagerung wurde das Gel in Aqua dest. überführt. Mit dieser Methode lassen sich ca. 0.1 µg Protein pro Bande nachweisen.

2.15.6.4 Trocknen der Gele

Nach Beendigung aller Färbe- und Entfärbeschritte wurde das Gel mit Aqua dest. äquilibriert und mit 25 ml Gel Dry-Trocknungslösung (LC 4025) pro Gel 20 min zusammen mit vorge-quollener (2 min in Gel Dry Lösung) Cellophanfolie abgedeckt geschüttelt. Anschließend wurde das Gel luftblasenfrei in die vorgequollene Cellophanfolie eingeschlagen und zwischen Filterpapier im Geltrockner langsam auf 80°C (90 min) erwärmt und getrocknet. Das Gel wurde nach diesem Schritt digitalisiert und über einen längeren Zeitraum gelagert.

2.15.6.5 Proteinmarkierung mit dem Farbstoff Alexa Fluor 488

Die Kopplung von Proteinen mit Alexa Fluor 488 gehört wie der Fluoreszenzfarbstoff FITC zu den gebräuchlichsten Methoden, um ein Protein oder ein Antigen zu markieren und fluoreszenzmikroskopisch darzustellen. Der Vorteil dieser Methode besteht zum einen in der größeren Stabilität des Farbstoffs in einem pH-Spektrum von pH 4 bis pH 10; zum anderen bietet diese Methode die Möglichkeit, sowohl in fixierten als auch in lebenden Zellen den Weg des markierten Agrostins in das Cytosol zu verfolgen, da hier im Gegensatz zum immunologisch gekoppelten FITC bereits vor der Inkubation eine Proteinmarkierung durchgeführt wird. Das Alexa Fluor 488 - markierte Protein hat ein Absorptionsmaximum von 494 nm sowie ein Fluoreszenzemissionsmaximum von 519 nm. Der hier verwendete Fluoreszenzfarbstoff ist ein 2, 3, 5, 6-Tetrafluorophenylester, der sich insbesondere in gelöster Form durch eine höhere Stabilität auszeichnet als der früher gebräuchliche Succinimidylester.

↓42

Markierung des Agrostins mit Alexa Fluor 488:

Zunächst wurde eine 1 M Natriumbicarbonat-Lösung (pH 9) hergestellt. Die Proteinkon-zentration wurde anhand des BCA-Assays auf 2 mg/ml (1.0 mg/ 0.5 ml Agrostin) eingestellt und ggf. aufgereinigt, da primäre Amine und Ammoniumsalze die Reaktion stören. Anschließend wurden 0.5 ml der Proteinlösung und 50 µl der Natriumbicarbonat-Lösung zugesetzt, da der TFP Ester effizienter im alkalischen Milieu mit dem Protein konjugiert werden kann. Diese Lösung wurde der auf RT erwärmten Farbstofflösung zugesetzt und eine Stunde bei RT mit Hilfe eines Magnetrührers gemischt.

Isolierung des markierten Agrostins:

↓43

Nach Herstellung des Elutionspuffers (PBS, 10 ml) wurde die Säule vorbereitet und beladen (PBS, pH 7.2, 2 mM Natriumazid). Um die Zone des markierten Proteins zu erkennen, wurde die Säulenchromatographie unter Zuhilfenahme einer UV-Lampe durchgeführt. Die obere farbige Zone der Säule entsprach dabei der des nicht gekoppelten Farbstoffs, die untere war die zu sammelnde mit dem Alexa Fluor 488-konjugieten Agrostin. Zur Sicherheit wurden die anderen Fraktionen ebenfalls gesammelt, um für den Fall eventuell auftretender, geringer Trennschärfe, die Fraktionen mit nicht markiertem Protein wiederverwenden zu können. Zuletzt wurde die fluoreszenzmarkierte Proteinlösung (in PBS, pH 7.2 und 2 mM Natriumazid) aliquotiert und bei 6°C gelagert bzw. für eine längere Lagerung bei –20°C eingefroren.

2.16  Fluoreszenzmikroskopie mit Alexa Fluor 488-markiertem Agrostin

Material:

  1. Brenner zur Sterilisierung der Deckgläschen
  2. Deckgläschen, steril
  3. Filterpapier
  4. Objektträger, steril
  5. sterile 6-well-Gewebekulturplatten
  6. Uhrmacherpinzetten

↓44

Bei allen folgenden Arbeitsschritten musste insbesondere darauf geachtet werden, dass die Zellen nicht austrocknen. Generell wurden die Deckgläschen und die Objektträger mit Methanol/ HCl entfettet, mit Ethanol oder Methanol gewaschen und ggf. zum Sterilisieren abgeflammt.

Durchführung: ECV-304 Zellen wurden auf sterilisierten Deckgläschen in einer 6-well Gewebekulturplatte kultiviert (jeweils Zugabe von 2.0 ml Medium nach Anhaftung der Zellen auf dem Deckgläschen). Zur optimalen Vorbereitung der Zellen wurde auf eine gut vereinzelte Aussaat geachtet. Die Kultivierungsdauer betrug 24 h. Es wurden sowohl Kontrol-len ohne Toxininkubation verwendet als auch mit markiertem Agrostin und Saponin vorinkubierte Zellen (Inkubationszeit: 0.5, 1, 2, 3, 12, 24, 48h). Zusätzlich ist ein Zytotoxizitätsassay durchgeführt worden, in dem die Aktivität des markierten Agrostins überprüft wurde, um eine mögliche Inaktivierung des Agrostins durch die Kopplung mit dem Farbstoff auszuschließen. Im ersten Schritt wurde das Kulturmedium vorsichtig mit einer Pasteurpipette abgesaugt. Danach wurden die adherenten ECV-Zellen zweimal mit PBS, pH 7.4, (1x konz., ca. 1,5ml/ Schale) gewaschen.

Formaldehydfixierung: Nach zweimaligem Waschen mit PBS-Puffer wurde 4 % Paraformaldehydlösung, pH 7.4, zupipettiert (2 ml/well), für 20 min bei Raumtemperatur fixiert und danach 3x mit H20 gewaschen. Im folgenden Schritt kann (optional) eine Hämatoxylinfärbung vorgenommen werden. Zur Vorbereitung der Lagerung, sowie der Beobachtung im Fluoreszenzmikroskop wurde das Deckgläschen umgekehrt (Zellen nach unten!) mit den präparierten Zellen auf einen Tropfen Glycerol-Hydrogencarbonat-Puffer (pH 8.0) auf einen Objektträger gelegt. Zuletzt wurden die Präparate getrocknet und lichtgeschützt und kühl gelagert (siehe Abb. 3-20 und 3-21).

2.17  Toxinspezifische Methoden

2.17.1  Toxizitätsassays

2.17.1.1 Zytotoxizitätsuntersuchung unter Verwendung des CASY-Zellzählgerätes

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Das Zellzählgerät (CASY; Schärfe System GmbH) diente der Erstellung eines Zellprolifera-tionsassays. Das Prinzip der Messung beruht auf der Partikelmesstechnik mit Widerstands-messung. Die Pulsflächenanalyse dient der Signalauswertung. Zur Messung werden die Zellen in einem schwachen Elektrolyten suspendiert und mit konstanter Strömungs-geschwindigkeit durch eine Kapillare definierter Geometrie gesaugt. In einer Präzisions-messpore wird eine konstante Spannung angelegt, die einen definierten elektrischen Widerstand ergibt. Beim Durchtritt durch die Kapillare verdrängen die Zellen eine ihrem Volumen entsprechende Menge der Elektrolytlösung. Da Zellen in erster Näherung als Isolator betrachtet werden können, kommt es zu einer Widerstandserhöhung, die ein Maß für das Volumen der Zellen ist. Voraussetzung für eine Messung ist, dass die Zellen die Kapillare einzeln passieren. Nach Durchführung der Einzelmessungen wird das Integral des Messsignals (Pulsflächenanalyse) und aus der volumenlinearen Originalverteilung eine durch-messerlineare Größenverteilung berechnet sowie alle weiteren Parameter auf der Basis dieser Verteilung ermittelt.

Durchführung:

In einer 24-well-Platte wurden 5x104 Zellen pro Well ausgesetzt und nach 3 Tagen Kultivierung die Zellzahl ermittelt. Der Überstand wurde entfernt und die Zellschicht am Boden des Gefäßes mit einer Trypsin/ EDTA-Lösung abgelöst, aufgenommen und umgehend mit Hilfe des CASY-Systems ausgezählt. Die Proliferationsrate wurde sowohl für die Kontrollen (unbehandelte Zellen), als auch für die mit Extrakt behandelten Zellen bestimmt.

2.17.1.2 MTT Assay (für ECV-Epithelzelllinie und SK-N-SH-Neuroblastomzelllinie)

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Das Prinzip der MTT-Methode (Mosmann, 1983) beruht auf der Reduktion des schwach gelb gefärbten, wasserlöslichen Tetrazoliumsalzes MTT (4,5-Dimethylthiazplyl-2-)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid zum tiefblau-schwarz gefärbten, wasserunlöslichen Formazan. Dieser enzymatisch katalysierte Reduktionsschritt findet in den Mitochondrien statt, in denen sich der Farbstoff anreichert. Die Färbung innerhalb der Zellen ist sowohl visuell als auch mikroskopisch gut zu erkennen. Durch die Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln ist es möglich, das im Zellinneren kristallin abgelagerte Formazan in saurem Isopropanol in Lösung zu bringen. Die Menge des extrahierten, reduzierten Farbstoffes entspricht der Metabo-lisierungsaktivität der Zellkultur und es kann anhand einer Eichgerade auf die Zellzahl zurückgeschlossen werden. Es handelt sich um einen kolorimetrischen, nicht-radioaktiven Test, der auf der Reduktion des gelben Tetrazoliumsalzes zu Formazankristallen durch zelluläre Dehydrogenasen beruht. Die Absorption des entstandenen Formazans wurde spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 550-600 nm bestimmt, bei der MTT nicht absorbiert. Da Dehydrogenasen nur in lebenden Zellen aktiv sind, dient die Umwandlung von MTT als Maß für die Viabilität der Zellen (Mosmann, 1983). Aus den Absorptionswerten der einzelnen Wells mit unbehandelten Zellen (Zellkontrolle) wurde der Mittelwert berechnet und dieser als 100 % festgelegt.

Abb. 2-1: Reduktion von MTT zu Formazan (Mosmann, 1983).

Im einzelnen umfasst die Durchführung dieses Testes folgende Schritte:

↓47

2.17.1.3 Amidoschwarz-Assay (für HaCat-Keratinozytenlinie)

Der Amidoschwarz-Assay (Schulz et al., 1994) beruht auf der Anfärbung der noch anhaftenden Zellen (Messwellenlänge: 620 nm am SLT- Mikrotiterplattenreader). Eine Dif-ferenzierung zwischen intakten und geschädigten, aber noch anhaftenden Zellen ist nicht möglich. Bei diesem Assay kamen 96 well-Platten zum Einsatz. Da dieser Assay eine relativ unspezifische Methode ist, dessen Prinzip auf der Anhaftung noch am Kulturgefäß anhaf-tender, gefärbter Zellen beruht, ist bei diesem Test keine Differenzierung von abgestorbenen, geschädigten und intakten Zellen möglich.

verwendete Lösungen:

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Arbeitsschritte:

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Alle Reaktionsansätze wurden als Vierfachbestimmungen ausgeführt und die Versuche mindestens einmal wiederholt. Der U-Test nach Wilcoxon diente der statistischen Ermittlung der aus den Zellzählungen erhaltenen Daten. Die Mittelwerte der Zellzahlen dienten als Grundlage für die Berechnungen. Als Streuungsmaß wurde die Spannweite verwendet. Bei jedem Versuchsansatz wurden jeweils vier 100 %-Kontrollen mitgeführt. Die 100 %-Kontrollen umfassen die jeweiligen Ansätze, bei denen keine Substanz zugegeben wird, bei denen das Zellwachstum also unbeeinflusst bleibt. Das relative Zellwachstum wurde be-stimmt, indem man die Differenz der Ausgangszellzahl von 5*104 Zellen mit der nach drei Tagen bestimmten Zellzahl bildete. Die prozentuale Zellproliferationsrate bezieht sich auf diese Werte. Diejenige Toxizität, die zur Unterschreitung der Ausgangszellzahl führte, bzw. bei der keine lebensfähigen Zellen erfasst werden konnten, wurde als IC100 definiert. Anhand einer Eichgerade wurde das Verhältnis zwischen der prozentualen Zellproliferationsrate und der aus dem MTT-Test resultierenden Absorptionen bestimmt.

Geradengleichung: y = 139.96x + 1,946 (R = 0.9303)

Der prozentuale Überlebensindex (SI) wurde folgendermaßen bestimmt:

↓50

Test [Mittelwert (Absorption Versuchswert)] A [Mittelwert (Absorption Leerwert)] = Absorption (Versuchsansatz)

B [Mittelwert (Absorption 100%-Kontrolle ohne Toxin)] A [Mittelwert (Absorption Leerwert)] = Absorption (100%-Kontrolle)

Daraus ergibt sich für die Zellproliferationsrate SI (%) =

Test - A

x 100

B - A

↓51

Ermittlung der Werte für die IC50:

Die berechneten Werte für die relativen zellproliferationshemmenden Aktivitäten [%] wurden in Diagrammen, in denen die Abhängigkeit der Zellproliferation [%] von der eingesetzten Extraktkonzentration unter halblogarithmischer Skalierung dargestellt wird, zusammengefasst. Nach Einengung der Regressionsgrenzen auf einen linearen Anstiegsbereich wurde die lineare Regression zur Ermittlung der IC50-Werte genutzt.

2.17.2 Proteolytische Spaltung von Diphtheriatoxin

Die enzymatische Spaltung von Diphtheriatoxin (DT) mit Trypsin erfolgte nach einem Verfahren von Moskaug (Moskaug et al., 1989). Hierzu wurde DT (100 µg) mit Trypsin (1 µg) versetzt und für 30 min bei 37 °C inkubiert, bis die Reaktion durch Zugabe von Trypsininhibitor aus Sojabohnen gestoppt wurde (2 µg, 37 °C, 10 min). Anschließend wurde der Ansatz mit 5 %(v/v) ß-Mercaptoethanol versetzt und für 10 min in einem kochenden Wasserbad erwärmt. Bei diesem Schritt fiel die instabile B-Kette des Toxins aus und konnte anschließend abgetrennt werden (20000 x g, 10 min). Der Überstand wurde gegen Wasser dialysiert. Die Bestimmung der Aktivität der A-Kette von Diphtheriatoxin erfolgte durch einen ADP-Ribosylierungsassay (Zhang, 1997), der auf der enzymatischen Aktivität des Toxins beruht, in Gegenwart von NAD+ den Elongationsfaktor II (EF II) unter Freisetzung von Nicotinamid mit ADP zu ribosylieren (Langer et al., 1996; Keller, 2002).

2.17.3 Isolierung der eingesetzten Toxine und ihrer Spaltprodukte

↓52

Die Isolierung des Agrostins erfolgte nach Aufreinigung des Extraktes (siehe Abschnitt 3.4) mittels Kationenaustauschchromatographie (CM-Cellulose) und einem 0.1-0.3 M NaCl-Gradienten nach einem Verfahren von Stirpe et al. (Hebestreit & Melzig, 2003; Stirpe et al., 1983). Zur Identifizierung des Agrostins wurde neben dem Vergleich mit einer authentischen Probe per SDS-PAGE (siehe Abb. 3-3 und 3-4) ein Ouchterlony-Immunodiffusionstest durchgeführt (siehe Abb. 2-2). Die Quantifizierung des Agrostins erfolgte durch den BCA-Assay und einen semiquantitativen Ouchterlony-Immunodiffusionstest. Die Konzentration des Agrostin-Lyophilisats (Sigma) beträgt ca. 30 % (ermittelt durch Lowry-Assay), die Konzentrationsbestimmung des selbst isolierten Agrostins beträgt ca. 14 % (ermittelt durch BCA-Assay).

Abb. 2-2: Ouchterlony-Immunodiffusionstest

A) Identitätsuntersuchung des Agrostins im Agrostemma-Rohextrakt: Präzipitat zw. Agrostin-Antiserum (61. Immunisierungstag) und dem Rohextrakt.
B) Identitätsuntersuchung des isolierten Agrostins: Präzipitat zw. Agrostin-Antiserum (61. Immunisierungstag) und dem isolierten Agrostin.

2.17.4 Isolierung der aktiven Domäne (DTA) des Diphtheriatoxins

Kommerziell erhältliches Diphtheriatoxin (Sigma) diente zum einen als Positivkontrolle für die Zytotoxizitätsuntersuchungen, zum anderen als Ausgangsmaterial zur Darstellung der aktiven Domäne DTA (siehe Abb. 1-1). Die Isolierung der katalytischen Domäne (A-Kette) von Diphtheriatoxin erfolgte auf proteinchemischem Weg durch eine enzymatische Spaltung mit Trypsin nach einem Verfahren von Moskaug et al.. Diphtheriatoxin verfügt über eine natürliche Spaltstelle innerhalb einer protease-sensitiven Schleife. Diese wird normalerweise im Rahmen der intrazellulären Aktivierung eines solchen Toxins von furinähnlichen Enzymen umgesetzt (Moskaug et al., 1989).

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Experimentell erfolgte die Spaltung von A- und B-Kette mit Hilfe von Trypsin sowie Trypsininhibitor zur Beendigung der Reaktion. Die instabile B-Kette wurde nachfolgend durch Hitze denaturiert und abgetrennt. Die A-Kette von DT (DTA; Mr: 21 kDa) wurde nach diesem Verfahren mit einer Ausbeute von 20-25 % isoliert. Die ADP-Ribosylierungsaktivität blieb auch nach der Aufreinigung der A-Kette erhalten.

2.17.4.1 Überprüfung der Aktivität von Diphtheriatoxin A (DTA)

Diphtheriatoxin (DT u. DTA: siehe Abb. 1-1) diente als Positivkontrolle (IC50: 1.27 * 10-7 mM, siehe Tab. 3-5 und Abb. 3-19). DT ist als bakterielles Proteintoxin in der Lage, den Elongationsfaktor II (EF II) in Anwesenheit von NAD+ an einem modifizierten Histidin durch ADP-Ribosylierung so zu verändern, dass er inaktiviert und die Proteinbiosynthese eingestellt wird. Diese Aktivität fehlt RIPs aus pflanzlichem Ursprung gänzlich, da hier ein anderer Mechanismus der Proteinsynthesehemmung vorliegt. Aufgrund dieser spezifischen Eigenschaft bakterieller Proteintoxine wurde ein zellfreies Testsystem etabliert. Biotinmar-kiertes NAD+ dient dem Aktivitätsnachweis durch Bildung einer EF II-Bande bei ca. 100 kDa im Immunoblot (siehe Abb. 2-4; Collier & Kandel, 1971; Zhang et al., 1997).

Abb. 2-3: ADP-Ribosylierungsassay: Schematische Darstellung der ADP-Ribosylierung von EF II; die Markierung mit Biotin-17- NADPP+PP ist in Punktform dargestellt (Langer, 1996; Keller, 2002).

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Pro Ansatz wurden 10 µl angereicherter EF II mit 5 µl 6-Biotin-17-NAD+ (Endkonzentration 50 µM) versetzt. Die zu testenden Proteinlösungen wurden in Volumina von bis zu 2 µl zugesetzt. Anschließend wurde EF II-Puffer bis auf ein Endvolumen von 25 µl zugegeben und für 1 h bei 37°C inkubiert. Die Verwendung von biotinyliertem NAD+ ermöglichte anschließend durch Auftreten einer mit Anti-Biotin-Antikörper anfärbbaren Bande bei circa 100 kDa eine Detektion des modifizierten EF II im Immunoblot. In der von der Arbeitsgruppe Dr. Fuchs durchgeführten Aktivitätsüberprüfung (Abb. 2-3) trat eine ausgeprägte Bande bei ca. 100 kDa (ein positiver Aktivitätsnachweis des isolierten DTA) auf (Abb. 2-4).

Abb. 2-4: ADP-Ribosylierungsassay: Durch die enzymatische Aktivität der DTA-Kette wird die ADP-Ribosylierung von Elongationsfaktor II vermittelt und im Immunoblot bei ca. 100 kDa detektiert. (Zhang, 1997).

EF II-Puffer: 20 mM Tris / HCl, pH 7.4, 1 mM EDTA, 1 mM DTT

2.17.5 Isolierung der enzymatisch aktiven A-Kette (RTA) von Ricin

Die Exprimierung und Reinigung der enzymatisch aktiven A-Kette des Ricins (siehe Abb. 1-1) wurde von Herrn Dr. Fuchs am UKBF/ Charité in Berlin durchgeführt und uns freundlicherweise zur Verfügung gestellt. Die Proteinkonzentration (RTA) beträgt 75 µg/ml (3 ml; Puffer: 5 mM MES, pH 5.5, NaCl, Leitfähigkeit 30 mS, ca. 300 mM, Reinheit: 90 % (Coomassie). Die Überprüfung der Identität erfolgte über die molare Masse und einen anti-RTA Westernblot. Das Ergebnis des Aktivitätassays ergab eine Freisetzung von 75 pmol Adenin pro pmol RTA pro Stunde.

2.18 Chromatographische Methoden

2.18.1  Gelfiltrationschromatographie

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verwendetes Säulenmaterial:

Die Gelfiltrationen wurden an einer MPLC- Anlage (medium pressure liquid chromatography), sowie an einer FPLC- Anlage (fast protein liquid chromatography) am FMP, dem Forschungsinstitut für Molekulare Pharmakologie, Berlin, durchgeführt. Zunächst wurde die aufzutragende Probe auf ein Volumen von maximal 0.5 ml eingeengt. Die MPLC-Untersuchungen wurden mit 1.5 Säulenvolumina PBS bei einer Flussrate von 1.0 ml/ min eluiert (Sephadex G 75/ G 50 Superfine, Säulenmaße: 4.5 x 40 cm, 190 ml; Elution mit 0.14 M NaCl, 50 mM PBS, pH 7.2; Fraktionsvolumina: 2.0 ml). Die Fraktionen wurden elektrophoretisch auf Agrostin untersucht, lyophilisiert, dialysiert und schließlich der Kationenaustauschchromatographie (CM-Cellulose, s.u.) unterzogen. Die FPLC-Unter-suchungen (Fast-Protein-LC: HiLoad Superdex 75, Partikelgröße: 34 µm; Säulenmaße 2.6 x 60 cm, 320 ml) wurden mit 1.5 Säulenvolumina 20 mM Tris-Puffer und 140mM NaCl bei einer Flussrate von 2 ml/min eluiert.

2.18.2 Kationenaustauschchromatographie

↓56

Säulenmaterial:

CM (Carboxymethyl-) Cellulose

Anhand der unterschiedlichen Ladungen von Proteinen, die in Abhängigkeit vom pH-Wert des Milieus und vom isoelektrischen Punkt variieren können, lassen sich diese säulenchro-matographisch auftrennen. Bei einem Kationenaustausch binden positiv geladene Proteine an eine negativ geladene Säulenmatrix, von der sie anschließend durch Lösungen hoher Salzkonzentration eluiert werden. Die Probe wurde zunächst gegen Startpuffer dialysiert, auf die mit Startpuffer (5 mM Sörensen-Phosphatpuffer, pH 6.5) äquilibrierte Säule aufgebracht und mit der gleichen Pufferlösung durch einen 0.0 - 0.3 M NaCl Gradienten eluiert (Fraktionsvolumina: 2.0 ml, Flussrate 1 ml/min). Die erhaltenen Fraktionen wurden dialysiert, lyophilisiert und sowohl elektrophoretisch als auch immunologisch (siehe Ouchterlony-Immunodiffusionstest) auf das Vorhandensein von Agrostin untersucht.

2.18.3 Dünnschichtchromatographie

Insbesondere zur Prüfung verschiedener Proteinfraktionen auf Saponine kommt die Dünn-schichtchromatographie zum Einsatz. Hierzu wurde aus den lyophilisierten Fraktionen ein methanolischer Extrakt bereitet und mit Hilfe des Auftragegerätes gemeinsam mit der Referenzlösung des jeweiligen Saponins bandenförmig auf eine DC-Platte (Kieselgel 60 F254) aufgetragen.

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Detektionsmittel für Triterpensaponine: Wasser (die Platten wurden mit reichlich Wasser besprüht, bis das Adsorbens vollständig durchtränkt war). Die Auswertung erfolgte im VIS (helle Saponinzonen sichtbar).

Anisaldehyd-Schwefelsäure-Reagenz (85 ml CH3OH, 10 ml Eisessig, 5 ml konz. H2SO4, 0.5 ml Anisaldehyd-Reagenz); die Platte wurde kräftig besprüht und bei 100 °C 5-10 min auf einer Heizplatte erhitzt, bis die Substanzzonen erschienen; die Auswertung erfolgte im VIS (braune Saponinzonen sichtbar) und im UV365 (Siepmann et al., 1998).

a) Komarowsky-Reagenz:

5 VT p-Hydroxybenzaldehyd (2 % in Methanol)
2 VT H2SO4 (50%)

↓58

Fließmittel für Triterpensaponine:

FM I

CHCl3-CH3OH

9:1.5

FM II

CHCl3-CH3OH-H2O

6:4:0.8

FM III

CHCl3-CH3OH-H2O

6:3:1 (untere Phase)

FM IV

CHCl3-CH3OH-H2O

6:3.5:1

FM V

CHCl3-CH3OH-H2O

7.5:5:1

FM VI

CHCl3-CH3OH-AcOH-H20

15:8:3:2

Fließmittel für Sapogenine:

↓59

FM VII

Toluol-Me2CO

4:1

2.18.4 Isolation von Agrostemmasaponin-Rohsaponingemischen

Für sämtliche Untersuchungen wurde das Samenmaterial des Genotyps „K5“ (Reg. No. AGRO 26/80; 1992) verwendet, welches von der Bundesanstalt für Züchtungsforschung in Quedlinburg zur Verfügung gestellt wurde.

Nach dem Mahlen des Samenmaterials wurde in einer Soxhlet-Apparatur mehrstündig entfettet, zweimal mit 50 % igem Methanol kalt extrahiert und anschließend zentrifugiert. Der Methanol-Extrakt wurde schonend im Vakuumrotationsverdampfer vom Extraktionsmittel befreit. Der so entstandene Methanol-Trockenextrakt wurde anschließend in Wasser aufgenommen und mit n-Butanol (pH 1.5) ausgeschüttelt. Die wässrige Phase wurde entfernt und die n-Butanolphase getrocknet, in Wasser aufgenommen und einer Gelpermeations-chromatographie an Sephadex G 25 unterzogen. Das so erhaltene Rohsaponingemisch wurde schließlich durch Umkehrphasen-HPLC an RP 18 unter Verwendung von Chloroform-Methanol-Wasser weiter aufgereinigt und die Saponine mittels DC durch Detektion mit Wasser/Anisaldehyd-Schwefelsäure nachgewiesen. Die Ergebnisse der DC/HPLC-Chromatogramme wurden schließlich mit denen von Siepmann et al. verglichen (Siepmann et al., 1998) und die Fraktionen jeweils einem Zytotoxizitätstest unterzogen. Zusätzlich wurde eine dünnschichtchromatographische Isolierung von Saponinum album durchgeführt und das isolierte Material sauer hydrolysiert. Das entstehende Aglykon Gypsogenin wurde ebenfalls auf seine Zytotoxizität getestet (siehe Abschnitt 3.8.1).

2.18.5  Isolierung der Hauptkomponenten von Saponinum album

↓60

Zur Isolierung der Hauptkomponenten von Saponinum album (Merck) wurde im ersten Schritt eine Fliessmitteloptimierung für die DC und die SC durchgeführt. Von 8 getesteten Fließmitteln erwies sich das folgende FM-System als optimal:

Chloroform/ Methanol/ Wasser (67.0/ 27.6/ 5.4)

Detektionsmittel: Anisaldehyd-Schwefelsäure Reagenz

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Die säulenchromatographische Trennung wurde mit einer Kieselgel 60-Säule (300 mm x 32 mm; 82.0 g Kieselgel; 0.82 g Saponinum album, Belastung 1:100; Vorlauf: 300 ml) durchgeführt. Adsorptionsmittel: Chloroform/ Methanol/ Wasser (67.0/ 27.6/ 5.4)

Die DC-Überprüfung erfolgte analog der o.a. Vorgabe bei einem Fraktionsvolumen von 30 ml und einer Anzahl von 144 Fraktionen, die im DC 2 Hauptkomponenten aufwiesen, welche im weiteren Verlauf einem Zytotoxizitätsassay unterzogen wurden.

2.18.6 Identifizierung von Gypsogenin durch saure Hydrolyse

Zur Identifizierung von Gypsogenin aus Saponinum album wurde zuerst mit der jeweiligen Saponinlösung (3 mg in 5 ml 2 N wässriger CF3COOH (m/v)) über 3 h eine Rückfluss-kühlung auf einem Wasserbad durchgeführt. Danach wurde das Gemisch mit 15 ml H2O versetzt und schließlich im Scheidetrichter mit CH2Cl2 (3 x 5 ml) extrahiert (Gaidi et al., 2001). Die vereinigten Dichlormethan-Extrakte ergaben durch Vergleich mit authentischem Material (Gypsogenin, bzw. Astrantiagenin D und Quillajasäure) Gypsogenin als Hauptkom-ponente und Quillajasäure als Nebenkomponente des isolierten Rohsaponingemisches (Hiller et al., 1973).

2.19 Biophysikalische Methoden

2.19.1  Electric Cell-Substrate Impedance Sensing (ECIS)

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Die ursprünglich verwendete Zellkultur (MDCK-II) wurde im ersten Schritt durch ECV 304-Zellen ersetzt, um möglichst vergleichbare Bedingungen zu schaffen (Wegener et al., 2000). Bei einer angelegten Frequenz von 40 kHz gilt eine lineare Abhängigkeit zwischen der gemessenen Kapazität und dem Ausmaß der Zellspreitung als notwendige Voraussetzung für weitere Messungen. Die zu untersuchenden Substanzen wurden in PBS-Puffer angelöst, sterilfiltriert und unter Reinraumbedingungen in unterschiedlichen Konzentrationen im Medium (Earle`s 199) gelöst:

  1. c (Saponin): 3.0 µg/ml; 6.0 µg/ml; 12.5 µg/ml; 25.0 µg/ml; 50.0 µg/ml; 100.0 µg/ml
  2. c (Agrostin): 4.0 ng/ml; 20 ng/ml; 100.0 ng/ml; 0.5 µg/ml; 1.0 µg/ml; 5.0 µg/ml

Die Zellen wurden in einem 8 well-Kulturgefäß auf einem Elektrodenarray in jedem Well ausgesät. Der gesamte Aufbau der ECIS-Anlage wurde von Applied Biophysics, Inc. (Troy, NY 12180) erworben. Die ECIS-Untersuchungen wurden in Kooperation mit Dr. Joachim Wegener am Institut für Biochemie der Westfälischen Wilhelms-Universität in Münster durchgeführt. Es wurde bei Frequenzen von 400 Hz und 40 kHz gemessen und sowohl die Kapazität, als auch die Impedanz nach Inkubationszeiten von 0–4000 min ermittelt. Der Stromfluss durch einen Zellmonolayer auf einer Goldelektrode (Durchmesser: 250 µm) ist hier die entscheidende Messgröße. Die bei 40 kHz gemessene Kapazität ist hoch bei einer unvollständig bedeckten Elektrode, zum Beispiel bei nicht ganz gespreiteten Zellen. Bei einer angelegten Frequenz von 40 kHZ sinkt die gemessene Kapazität quasi linear mit fortschreitender Zellspreitung, die Kapazität kann also bei dieser Frequenz als direktes Maß der Zellproliferation und –spreitung auf der Elektrodenoberfläche angenommen werden. Sobald die Elektrode komplett mit einem konfluenten Monolayer belegt ist, sinkt die Kapazität unter einen Wert von 10 nF und der resultierende Widerstand steigt entsprechend. Der Widerstand bei 400 Hz reflektiert die Summe des Widerstandes, der aus dem Zell-Substrat-Kontakt resultiert und dem der durch die Ausbildung von Zell-Zell-Kontakten auftritt. Man kann durch den Vergleich von Kapazität und Widerstand das Wachstum bzw. die Schädigung einer Zellkultur verfolgen. Werden die Membranen permeabilisert, verhalten sich die Zellen nicht mehr wie Isolatorpartikel und der Widerstand bricht zusammen bzw. die Kapazität nimmt Werte an, wie man sie für eine leere Elektrode findet (Wegener et al., 2000).


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07.11.2006