3 Ergebnisse und Diskussion

3.1  Auswahl geeigneter Zelllinien

↓63

Da die Untersuchungen an Zellen insbesondere die Membranpassage von Agrostin betreffen, musste bei der Auswahl des Zellmaterials insbesondere auf den Gesichtspunkt der Zellmembranintegrität und deren Barrierefunktion Wert gelegt werden. Generell sind die verwendeten drei Zelllinien unterschiedlicher Herkunft und unterscheiden sich in ihren Eigenschaften:

3.1.1  ECV 304 (hauptsächlich verwendete Zelllinie; ATCC Nr. ACC 310)

Die Zelllinie ECV-304 (Hughes, 1996; Takahashi et al., 1990) wurde 1984 aus der Nabelschnurvene eines neugeborenen japanischen Jungen gewonnen (Abb. 3-2 u. 3-20). Die Zellen wurden lange Zeit für Endothelzellen gehalten, genauere Analysen haben jedoch gezeigt, dass es sich hierbei eigentlich um ein Derivat der humanen Harnblasen-Karzinom-Zelllinie T-24 handelt (Bubenik et al., 1973; Dirks et al., 1999). ECV- Zellen haben ein hohes proliferatives Potential auch in Abwesenheit von Wachstumsfaktoren. Es handelt sich um adhärente Zellen mit einem pflastersteinartigen einschichtigen Wachstum: in der Phasenkontrastmikroskopie erscheinen ECV 304-Zellen flach mit einer endothelialen Morphologie. Sie bilden dichte konfluente Monolayer ohne erkennbare Lücken. Die endotheltypischen Proteine Thrombomodulin, ICAM, VCAM, CD 51 und Vimentin konnten bereits in ECV 304-Zellen nachgewiesen werden. Sie besitzen ein dichtes Netz subplasmalemmaler Aktinfilamente in Kolokalisation mit Cadherinen und stress-fibers, sie nehmen acetyliertes LDL über den scavenger Rezeptor intrazellulär auf und setzen Endothelin, PAI-1 und VEGF frei. Sie exprimieren jedoch das epitheliale E-Cadherin, während ihnen das endotheliale VE-Cadherin fehlt, sie haben die Fähigkeit zur polaren Proteinexpression und reagieren auf Calciumentzug mit EGTA mit einer (reversiblen) Öffnung der Zellkontakte. Sie bilden Maculae adherentes (Desmosomen) mit den epitheltypischen Zytokeratinen 8 und 18, allerdings sind sie nicht wie bei Epithelzelllinien Bestandteil geordneter Kontaktkomplexe in direkter, morphologisch-funktioneller Beziehung zu den Zonulae occludentes (tight junctions).

3.1.2 HaCat (für den Amidoschwarz-Assay verwendete Zelllinie)

Adulte immortalisierte humane Keratinocyten-Zelllinie: Diese Zelllinie besitzt den von allen bekannten epidermalen Zelllinien den höchsten Differenzierungsgrad. Dieser wird als Indikator für eine Ausbildung biotransformierender Enzyme angesehen. Die Zellen entstammen ursprünglich einer histologisch normalen Gewebeprobe eines Melanompatienten. Die heute verwendete Zelllinie verdankt ihre Etablierung unter anderem dem Einsatz eines Nährmediums mit geringem Calciumgehalt und einer leicht erhöhten Inkubationstemperatur. In ihrer Initialphase ist die Entwicklung der HaCaT-Zellen sehr stark von Calciumkonzentration und Temperatur abhängig, nach ca. zehn Passagen sind sie relativ unempfindlich gegenüber veränderten Wachstumsbedingungen. Die Zelllinie ist aus diesem Grund und wegen ihrer gleichbleibenden Replikations- und Proliferationsraten einfach zu handhaben (Boukamp et al., 1988).

3.1.3 SK-N-SH (Vergleichszelllinie für ECV 304, ATCC Nr. HTB 11)

↓64

Diese Zelllinie ist eine immortalisierte humane Neuroblastom-Zelllinie, gewonnen aus den Knochenmarksmetastasen eines vierjährigen Mädchens und diente als Vergleichszelllinie neben der ECV 304-Zelllinie.

3.2 Zytotoxizitätsassays

In einem Zytotoxizitätstest kann die Wirkung eines Toxins auf einen Zellverband bestimmt werden. In der Regel wird auf unterschiedliche Weise die Zellproliferation gemessen und aus diesen Daten das Ausmaß der Toxizität bestimmt. Während für die Zellzählung mit dem CASY-Zellzählgerät die Stoffwechselaktivität der Zellen keine Voraussetzung darstellt, ist sie entscheidend für den MTT-Test. Zur Etablierung einer optimierten Bestimmungsmethode wurden die in den folgenden Abschnitten dargestellten Parameter berücksichtigt.

3.2.1  Bestimmung der Inkubationszeit

Nach ca. 16 h Inkubationszeit im Brutschrank waren die Zellen adhärent. Es waren mindestens drei Verdoppelungen innerhalb einer Inkubationszeit von 72 h möglich (die Verdoppelungszeit beträgt ca. 24 h nach initialer lag-Phase). Nach einer Wachstumsphase von 24 h, sowie einer Inkubationszeit von 72 h nach Zugabe des Toxins (20 µl/ well) wurde die Zytotoxizitätsmessung durchgeführt. Die MTT-Konzentration wurde so eingestellt, dass nach einer Inkubationszeit von 2 h die Extinktion der 100%-Kontrolle < 1.0 war. Nach Optimierung dieser Parameter wurde anhand einer Eichgerade die Beziehung zwischen der Zellzahl und der daraus resultierenden Absorption ermittelt.

3.2.2 Definition der Zelldichte

↓65

Um den Zellen zur Zytotoxizitätsmessung während der Inkubationszeit eine ausreichende Wachstumskapazität zu gewährleisten, wurde in allen Experimenten eine Ausgangszelldichte von 5 * 103 Zellen/ well (V[Medium]= 100 µl) gewählt. Für eine hohe Durchsatzrate wurden die beschriebenen Assays in 96 well-Platten durchgeführt; die gewünschte Zelldichte wurde in einem Volumen von 100 µl Kulturmedium ausgesät. Eine optimierte Zellzahl pro well ist Voraussetzung für reproduzierbare Messergebnisse, da es bei einer zu gering ausgesäten Zellzahl zu einer Bildung von Plaques bzw. Inseln kommt und die erforderliche Konfluenz der Zellen nicht gewährleistet werden kann. Eine zu hohe Zelldichte führt ebenfalls zu einer verminderten Messqualität, da der Boden des wells zu schnell bedeckt ist und man zum Messzeitpunkt nicht mehr von einem Monolayer ausgehen kann. Zusätzlich kann es bei der Messung mit dem CASY-Zellzählgerät zur Bildung von störenden Zellaggregaten kommen, die die Homogenität der Zellsuspension verringern und dadurch den Durchfluss durch die Messkapillare erschweren.

3.2.3 Einfluss der Zelllinie

Da jede Zelllinie andere Eigenschaften besitzt, musste bei jeder Messung mit dem CASY-Zellzählgerät darauf Rücksicht genommen werden. Eine optimale Zellgrößenverteilung entsprechend einer Gaußschen Normalverteilung ergäbe einen klar definierbaren Messbereich. Unterschiedliche Zellgrößenverteilungen erfordern jedoch eine Anpassung durch eine individuell einstellbaren Cursorfunktion. Hier besteht ein Vorteil der MTT-Methode darin, dass lediglich die metabolisierenden, also lebenden Zellen erfasst werden. Zusätzlich musste insbesondere bei ECV-Zellen die Vereinzelung sehr schonend verlaufen, da sie sehr empfindlich auf mechanische Einflüsse reagieren. Die zu messenden Zellen wurden

unter standardisierten Bedingungen abgelöst, in der Messlösung suspendiert und vor jeder Messung gleichmäßig verteilt. Jede Zellzählung wurde als Dreifachmessung durchgeführt und der Mittelwert bestimmt.

3.3 Einfluss von DMSO auf die Zytotoxizität

↓66

Um eine mögliche Beeinflussung von DMSO (insbesondere als Lösungsmittel für verschiedene Triterpensaponine verwendet) auf das Ergebnis der Zytotoxizitätsmessung bzw. auf die Zellkultur ausschließen zu können, wurde eine Untersuchung der Zytotoxizität von DMSO auf ECV 304-Zellen durchgeführt (siehe Tab. 3-1). Es wurden fünf DMSO-Konzentrationen gewählt und nach Auswertung der Ergebnisse eine Obergrenze von 0.1 % DMSO festgelegt.

Tab. 3-1: Einfluss von DMSO auf die Zellproliferation (Mittelwert ± SD, n=3)

Konzentration DMSO [%]

0.0

0.1

0.5

0.75

1.0

Zellproliferation [%]

100.0

± 0.35

97.1

± 1.21

78.3

± 0.48

64.9

± 0.37

53.2

± 0.46

↓67

Methode:

MTT-Assay

Ausgangszellzahl:

103 Zellen/Well

Inkubationszeit:

72 h

Zelllinie:

ECV 304

3.4 Zytotoxizität von Agrostemma-Rohextrakten

Abb. 3-1: Zytotoxizität eines wässrigen, eines methanolisch-wässrigen (50 %) Extraktes und des Hauptsaponins (AS 1) der Kornrade (Mittelwert ± SD, n=3).

Methode:

MTT-Assay

Ausgangszellzahl:

5 x 103 Zellen/Well (24 well-Platte)

Inkubationszeit:

72 h

Zelllinie:

ECV 304

↓68

Abb. 3-2: Morphologische Veränderungen der ECV 304-Zelllinie nach Extraktinkubation

Ausgangspunkt der Zytotoxizitätsuntersuchungen des Samenmaterials von Agrostemma githago L. war die Beobachtung, dass die Zytotoxizität eines wässrigen Kornradesamenextraktes (IC50 0.3 ± 0.1 µg/ml) die eines methanolisch-wässrigen (IC50 6.5 ± 1.1 µg/ml) Extraktes und die der reinen Agrostemmasaponine (IC50 [AS 1] 6.4 ± 1.5 µM bzw. 10.1 ± 2.35 µg/ml; IC50 [AS 2] 6.2 ± 1.5 µM bzw. 10.5 ± 2.55 µg/ml) deutlich übertraf. Aufgrund dieser Ergebnisse (siehe Abb. 3-1) wurde das Samenmaterial im weiteren Verlauf der Untersuchungen insbesondere hinsichtlich weiterer wasserlöslicher Verbindungen neben den Saponinen untersucht. Zur Klärung der Ursache dieser hohen Toxizität des wässrigen Extraktes wird im Folgenden die Isolation des Toxins, sowie das toxische Prinzip des Samenmaterials anhand verschiedener Trennmethoden und Darstellungsverfahren bearbeitet und, soweit möglich, geklärt.

3.5 Isolierung aktiver Agrostemma-Fraktionen

3.5.1  Fraktionierung durch Größenausschluss-Membranfiltration

Durch die Molekülsiebfiltration ließ sich der wässrige Extrakt in Fraktionen (je 400 µl/ Filtereinheit) definierter Molekülgrößenbereiche aufreinigen.

↓69

Folgende Filtereinheiten fanden Verwendung:

  1. NMWL (nominal molecular weight limit) 5 kDa; 400 µl
  2. NMWL (nominal molecular weight limit) 10 kDa; 400 µl
  3. NMWL (nominal molecular weight limit) 30 kDa; 400 µl
  4. NMWL (nominal molecular weight limit) 100 kDa; 400 µl

Tab. 3-2: IC50-Werte von Fraktionen der Mikrozentrifugenfiltration

Proteinfraktion

(Mr entsprechend der Ausschlussgrenze einer Membraneinheit)

IC 50

< 5.0 kDa

> 15.0 µg/ml

< 10.0 kDa

> 15.0 µg/ml

< 30.0 kDa

0.3 ± 0.1 µg/ml

< 100.0 kDa

wässriger Extrakt aus Agrostemma githago L.

0.4 ± 0.1 µg/ml

0.3 ± 0.1 µg/ml

(Mittelwert ± SD, n=3)

↓70

Methode:

MTT-Assay

Ausgangszellzahl:

5 x 103 Zellen/Well (24 well-Platte)

Inkubationszeit:

72 h

Zelllinie:

ECV 304

Neben der Fraktionierung entsprechend der relativen Molekülmasse der Inhaltsstoffe verschiedener Fraktionen konnte mit dieser Methode durch eine begleitende Zyto-toxizitätsmessung (Tab. 3-2) und SDS-PAGE vom Proteinmuster der toxischen Fraktionen auf deren Beitrag zur Toxizität zurückgeschlossen werden. Nach Auswertung dieser Ergebnisse lag die Vermutung nahe, dass wasserlösliche Substanzen, vermutlich Proteine, mit einer Masse über 10.0 kDa verantwortlich für die Toxizität sind. Reine, definierte Proteinfraktionen wurden in den folgenden Schritten isoliert und hinsichtlich ihrer Zytotoxizität untersucht (siehe Abschnitt 3.5.2 u. 3.5.3).

3.5.2 Proteinfraktionierung durch Ammoniumsulfatfällung

Erste Proteinfraktionen wurden durch Ammoniumsulfatfällung isoliert. Die Protein/ Agrostin enthaltenden Fraktionen wurden durch UV- Spektroskopie (A280) und SDS-PAGE (siehe Abb. 3-3 und 3-4) identifiziert (Stirpe, 1983). Durch Kontrolle der Effektivität der durchgeführten Reinigungsschritte (Zentrifugation und Dialyse mit 6.1 % BaCl2 [m/v]) konnte eine Verunrei-nigung der Extrakte mit Sulfatresten ausgeschlosssen werden. Sämtliche aufgereinigte Fraktionen aus der Ammoniumsulfatfällung zeigten eine äußerst geringe Zytotoxizität (IC50 50/ 60/ 70 % (NH4)2SO4 > 45.8 µg/ml; n = 3). Anschließend wurde eine Gelfiltration der Agrostin enthaltenden Fraktionen mit Sephadex G 75 (MPLC) und eine Kationenaustausch-chromatographie zur Isolation des Agrostins durchgeführt.

3.5.3 Proteinisolierung durch Gelfiltrationschromatographie

3.5.3.1 MPLC-Proteinisolierung ( Medium Pressure Liquid Chromatography)

↓71

Die Gelfiltrationschromatographie mittels MPLC diente der Aufreinigung und der systematischen Fraktionierung des lyophilisierten Materials aus der Ammoniumsulfatfällung. Es kamen Sephadex G 75 (Fraktionierungsspektrum 3-80 kDa) und G 50 (Fraktionierungs-spektrum 1.5-30 kDa) zum Einsatz. Die Kalibrierung der Sephadex-Säulen erfolgte durch Cytochrom C (Sigma, Mr 12.4 kDa; zur Gelfiltrationschromatographie).

Abb. 3-3: Darstellung der aus der Gelfiltrationschromatographie (Sephadex G 75) gewonnenen Proteinfraktionen (qualitativ gegen LMW-Kit).

Elektrophorese:

Vertikal-2-D-System Mini Protean II

Gelkassette:

BioRad-Fertiggele 10-20 % Tris-Glycin; 10 well

MW-Marker:

low-molecular weight-standard, Pharmacia

Laufzeit:

1.35 h

Laufpuffer:

Tris-Glycin-Laufpuffer

Färbung:

Coomassie blue (7 % in AcOH); 30 min

↓72

Anhand der SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese wurden sämtliche Proteine klassifiziert. Ein LMW (low molecular weight)-Calibration Kit diente der Emittlung einer Kalibriergerade zur Proteingrößenbestimmung (De Klerk & Engelen, 1985). Jede der dargestellten Protein-fraktionen wurde mittels Bradford-Assay (Proteingehalt der Fraktionen: 35-60 % [m/m]) quantifiziert und einem Zytotoxizitätsassay unterzogen. Es zeigte sich eine sowohl qualitativ (auch das kommerziell erhältliche Agrostin wurde getestet), als auch quantitativ äußerst gerin-ge Toxizität an ECV 304 Zellen (IC50 beider Agrostinuntersuchungen > 50.0 µg/ml; n = 3).

3.5.3.2 FPLC-Proteinisolierung (Fast-Protein Liquid Chromatography)

Aufgrund der Ergebnisse der Mikrozentifugenfiltration wurde versucht, die in der Elektrophorese erscheinenden Proteine der toxischen Fraktionen mit einer relativen Molekülmasse unter 30.0 kDa chromatographisch zu trennen. Hierzu wurde am FMP (Forschungsinstitut für Molekulare Pharmakologie, Berlin) eine FPLC Fast-Protein-Liquid-Chromatography) durchgeführt. Die FPLC diente dazu, neben dem Agrostin (27.0 kDa) andere Proteinfraktionen eines Molekulargewichtes unter 30.0 kDa zu isolieren und aufzurei-nigen, um die aus der Molekülsiebfiltration erhaltenen Toxizitätswerte eingehender untersu-chen zu können. Es wurden zwei Proteine mit einem Molekulargewicht von 23.0 kDa (Pro-teinfraktion E) und 15.0 kDa (Proteinfraktion F; Abb. 3-3) isoliert und lyophilisiert. Nach Dialyse, Lyophilisierung und Quantifizierung der in den Fraktionen elektrophoretisch detektierten Proteine wurde ihre Toxizität getestet.

Abb. 3-4: Darstellung der aus der Gelfiltrationschromatographie (Sephadex; FPLC: HiLoad Superdex 75) und der Ammoniumsulfatfällung gewonnenen Proteinfraktionen und des Agrostins (Kationenaustauschchromatographie, CM-Cellulose; qualitativ gegen LMW-Kit).

↓73

Elektrophorese:

Vertikal-2-D-System Mini Protean II

Gelkassette:

BioRad-Fertiggele 10-20 % Tris-Glycin; 10 well

MW-Marker:

low-molecular weight-standard, Pharmacia

Laufzeit:

1.35 h

Laufpuffer:

 

Färbung:

Coomassie blue (7 % in AcOH); 30 min

Sechs deutlich erkennbare Proteinfraktionen wurden ausgemessen:

1. Protein A: 67.5 kDa*

2. Protein B: 32 kDa*

3. Protein C: 29 kDa*

4. Protein D: 27 kDa* = Agrostin**

5. Protein E: 23 kDa*

6. Protein F: 15 kDa*

↓74

*Alle Molekulargewichtsangaben entsprechen dem Ergebnis aus der Bandenlage im Vergleich mit dem LMW-Standard. Sie sind keine exakten Molekulargewichts-bestimmungen.
**Das Agrostin, ein Glykoprotein, war die einzige als Reinsubstanz erhältliche Substanz.

Die untersuchten Extrakte zeigten eine starke Zytotoxizität, wenn elektrophoretisch ein bestimmtes dargestelltes Proteinmuster und Saponin per DC nachgewiesen werden konnte (IC50 0.1-0.3 ± 0.1 µg/ml; n = 3; Abb. 3-3). Proteine, die in Kombination mit dem Agrostemma-Saponingemisch toxisch wirkten, würden entsprechend der Ergebnisse aus der Größenausschluss-Membranfiltration in einem Größenbereich über 10 kDa liegen (Tab. 3-2). Mit Hilfe einer systematischen elektrophoretischen Darstellung der durch die Gelfiltrationschromatographie und die FPLC isolierten Proteine konnte Agrostin als das für die Toxizität entscheidende Protein identifiziert werden (Abb. 3-4).

3.6 Zytotoxizitätsuntersuchungen an Isolationsprodukten aus Agrostemma

3.6.1  Ermittlung der IC50 von Saponinum album

Abb. 3-5: Untersuchung der Zytotoxizität und Ermittlung der IC50 von Saponinum album aus Gypsophila paniculata (Merck) an ECV 304-Zellen (Mittelwert ± SD, n=3).

↓75

Methode:

MTT-Assay (Messung bei 580 nm)

Ausgangszellzahl:

103 Zellen/Well

Inkubationszeit:

72 h

Zelllinie:

ECV 304

Anhand der Werte wurde eine Regressionsanalyse durchgeführt, die zu einer IC50 (Saponinum album) von 13.14 µg/ml führte.

Aufgrund der ermittelten IC50 wurde mit einer Festlegung der Saponinum album-Konzentration auf 3.0 µg/ml bei allen weiteren Untersuchungen eine mögliche Toxizität oder eine Beeinflussung der Zellintegrität ausgeschlossen (siehe Abb. 3-5).

3.6.2 Bestimmung der Zytotoxizität von Saponinen bei konstanter Agrostinkonzentration

↓76

Abb. 3-6: Untersuchung der Zytotoxizität von Saponinum album bei konstanter Agrostinkonzentration [30 ng/ml].

Methode:

MTT-Assay

Ausgangszellzahl:

103 Zellen/Well

Inkubationszeit:

72 h

Zelllinie:

ECV 304

(U-Test nach Wilcoxon; Mittelwert ± SD; n=3; p<0.05)

Nach linearer Regression ergibt sich der Wert für die IC50 wie folgt:

↓77

Saponinum album [3.0 µg/ml] und Agrostin [30 ng/ml]

y = -0.3395x + 1.193

R2 = 0.9912

IC50: 2.04 µg/ml

Die IC50 für Saponinum album mit gleichzeitiger Agrostininkubation lag bei ca. 2.0 µg/ml, die IC80 dieses Rohsaponingemisches bei gleichzeitiger Agrostininkubation lag bei 3.0 µg/ml Saponinum album (siehe Abb. 3-6).

Die Bestimmung der IC50 von Saponinum album bei konstanter Agrostinkonzentration diente der Optimierung der einzusetzenden Saponinkonzentration, da in diesem Diagramm die Grenzkonzentration des zur Zytotoxizität führenden Saponins bestimmt wird. Bei verwendeten Konzentration von 3 µg/ml Saponin (IC50 Saponinum album > 11 µg/ml) kann eine Eigentoxizität ausgeschlossen, sowie eine ausreichende Aktivität gewährleistet werden.

3.6.3 Zytotoxizitätsuntersuchung von Agrostin mit unterschiedlichen Saponinen

↓78

Abb. 3-7: Untersuchung der Zytotoxizität und Ermittlung der IC50 von Agrostin mit konstanten Konzentrationen (3.0 µg/ml) von Saponinum album, Helianthussaponin 2 und Agrostemmasaponin 1 (Mittelwert ± SD, n=3).

Aus diesen Daten wurden IC50-Werte für Agrostin mit den jeweiligen Saponinen ermittelt (siehe Tab. 3.3).

Methode:

MTT-Assay

Ausgangszellzahl:

103 Zellen/Well

Inkubationszeit:

72 h

Zelllinie:

ECV 304

Aus diesen Daten wurden IC50-Werte für Agrostin mit den jeweiligen Saponinen ermittelt (siehe Tab. 3.3).

Tab. 3-3: Darstellung der IC50-Werte von Agrostin mit Saponinen (Mittelwert ± SD, n=3)

Agrostin und Agrostem-masaponin 1a

y = -13126x + 124.85

R2 = 0.9379

IC50: 5.7 ± 1.7 ng/ml

Agrostin und Saponinum albuma

y = -13383x + 118.39

R2 = 0.8701

IC50: 5.1 ± 1.5 ng/ml

Agrostin und Helianthus- saponin 2a

y = -13,587Ln(x) + 28.43

R2 = 0.8915

IC50: 204 ± 90 ng/ml

a Saponinkonzentration 3.0 µg/ml (U-Test nach Wilcoxon; Mittelwert ± SD; n = 3; p < 0.05)

↓79

Durch lineare Regression konnten die IC50-Werte des Agrostins bei gleichzeitiger Gabe der erwähnten Saponine bestimmt werden. Die IC50 des Agrostins, eines Ribosomen-Inaktivierenden Proteins vom Typ I, lag bei über 1.8 * 103 mM, da es aufgrund seiner strukturellen Voraussetzungen nicht zu einer Zellmembrandurchdringung befähigt ist. Es besteht lediglich aus einem Effektomer, das über keine zweite Kette wie z.B. Ricin und Abrin aus der Gruppe der Typ II-RIPs verfügt. Dementsprechend konnte für dieses Toxin keine IC50 ermittelt werden. Sobald eine subtoxische Konzentration des nativen Agrostemmasaponins oder des ebenfalls aktiven Saponinum album (jeweils 3.0 µg/ml) inkubiert wurde, konnte ein Toxizitätssprung auf 2.1 * 10-7 mM Agrostin (entspr. 5.7 ng/ml Agrostin und 3.0 µg/ml Agrostemmasaponin 1), bzw. 1.9 * 10-7 mM Agrostin (entspr. 5.1 ng/ml Agrostin und 3.0 µg/ml Saponinum album) festgestellt werden. Helianthussaponin 2, ein ebenfalls triterpenoides Bisdesmosid mit ähnlichem Molekulargewicht und Echinocystsäure als Aglykon (siehe Tab. 2-1), zeigte eine wesentlich geringere Toxizität mit einer IC50[Agrostin] von 0.2 µg/ml.

Die für Agrostin in Kombination mit Agrostemmasaponin 1 (3.0 µg/ml) ermittelte IC50 von 5.7 ng/ml (Abb. 3-7, Tab. 3-3) liegt in der Größenordnung der im Retikulozytenlysattest ermittelten IC50 von 0.018 µg/ml (Stirpe et al., 1983). Die hämolytischen Indices der inkubierten Saponine, welche über eine erhöhte Oberflächenaktivität die Zellwandpermeabi-lität erhöhen, korrelieren nicht mit der ermittelten Toxizität, auch die Eigentoxizität der Saponine ist zu gering, um eine Erklärung der ermittelten Toxizität zu liefern (Seeman, 1974). Auf der Basis der vorgestellten Ergebnisse wird in dieser Arbeit die These einer kooperativen Toxizität zwischen Agrostin und dem sauren, bisdesmosidischen Agrostemmasaponin postuliert (Hebestreit & Melzig, 2003).

3.7 Untersuchungen zur Spezifität der Wirkung von Agrostin und Saponin

3.7.1  Untersuchungen zum Wirkungsmechanismus an HaCat-Zellen

Abb. 3-8: Einfluss der Inkubationszeit eines wässrigen Agrostemma-Samenextraktes auf die Zellproliferation von HaCat-Zellen (Mittelwert ± SD, n=3).

Untersuchte Agrostemmaextrakt-konzentrationen: 0.1-100 µg/ml.

↓80

Methode:

Amidoschwarz-Assay

Ausgangszellzahl:

5 x 103 Zellen/Well

Inkubationszeit:

24 h/ 48 h/ 72 h

Zelllinie:

HaCat-Keratinozyten

Untersuchte Agrostemmaextrakt-konzentrationen: 0.1-100 µg/ml.

Erste Untersuchungen zum Wirkungsmechanismus wurden an HaCat-Zellen mit Hilfe des Amidoschwarz-Assays durchgeführt (Abb. 3-8). Verschiedene Extraktkonzentrationen (0.1-100 µg/ml) wurden über einen Zeitraum von 24, 48 und 72 h inkubiert und hinsichtlich der Auswirkung auf die Zellproliferation untersucht. Am Verlauf der Wachstumshemmung wurde deutlich, dass kein plötzlicher Zelltod, wie er bei toxisch wirkenden Saponinkonzentrationen aufgrund einer Lyse der Zellmembran auftritt, festzustellen war (siehe Abb. 3-24), sondern eine Toxizität, welche von der Inkubationsdauer abhängig war und nach ca. 72 h ihr Maximum erreichte (siehe Abb. 3-25). Alle weiteren Zytotoxizitätsuntersuchungen wurden aufgrund dieser Ergebnisse mit einer Inkubationszeit von 72 h durchgeführt. Extrakt-konzentrationen >20 µg/ml zeigten eine Kinetik, die vermutlich einer erhöhten, toxischen Saponinkonzentration zuzuschreiben ist. Die ECIS-Methode, deren Ergebnisse diese Untersuchungen bestätigen und die Kinetik der toxischen Wirkung beschreibt, wird in den Abschitten 2.19 und 3.13 vorgestellt.

3.7.2 Vergleich der Zytotoxizität von Agrostin an ECV 304- und SK-N-SH-Zellen

Abb. 3-9: Untersuchung der Zytotoxizität von Agrostin (Konz.: 0.1; 1.0; 10.0; 100.0; 1000.0 ng/ml/) und Saponinum album (Konz.: 3.0 µg/ml) an ECV 304- und SK-N-SH-Zellen.

↓81

Methode:

MTT-Assay

Ausgangszellzahl:

103 Zellen/Well

Inkubationszeit:

72 h

Zelllinie:

SK-N-SH/ ECV 304

(U-Test nach Wilcoxon; Mittelwert ± SD, n=3; p < 0.05; keine signifikanten Zytotoxizitätsunterschiede der beiden Zelllinien)

Um einen Vergleich mit unterschiedlichen Zellkulturen herstellen zu können, wurde eine Neuroblastomzelllinie (SK-N-SH) herangezogen und unter identischen Bedingungen hinsichtlich ihres Verhaltens auf unterschiedliche Agrostinkonzentrationen (0.1 ng-1.0 µg) bei konstanter Saponinum album-Konzentration untersucht. Es konnte kein signifikanter Unterschied hinsichtlich der Zellviabilität festgestellt werden. Somit konnte ein hochspezifischer Mechanismus bezüglich der Toxinaufnahme bei lediglich einer Zellart wie der ECV-304 Zelllinie ausgeschlossen werden (siehe Abb. 3-9).

3.7.3 Getriggerte Toxizität

Die Möglichkeit einer getriggerten Toxizität wurde an ECV-304 Zellen untersucht: Saponinvorkubation (5 min, 3.0 µg/ml) und anschließende Agrostininkubation (1.0 µg/ ml). Das Gemisch wurde jeweils nach unterschiedlichen Inkubationszeiten durch Earle`s Medium ersetzt. Nach weiteren 72 h wurde Zytotoxizitätstest durchgeführt. Diese Ergebnisse belegen zum einen einen raschen Eintritt des Agrostins in das Zytosol (ca. 1 h, siehe auch Immun-fluoreszenzmikroskopische Abbildungen, Abschnitt 3.12), sowie einen langsamen Eintritt des toxischen Effektes, der durch die ECIS-Untersuchungen im Gegensatz zu dieser Methodik online und nichtinvasiv bestätigt werden konnte (siehe Abschnitt 3.13).

↓82

Abb. 3-10: Getriggerte Zytotoxizität; Präinkubation von Saponinum album (3.0 µg/ml) und nach 5 min Inkubationszeit Zugabe von Agrostin (1.0 µg/ml); Mediumwechsel nach 30 min/ 60 min/ 120 min/ 180 min.

Zytotoxizitätsmessung nach 72 h (0: Kontrolle ohne Mediumwechsel; k0: Kontrolle mit Mediumwechsel; test: Messung nach Toxininkubation und Mediumwechsel).

Methode:

MTT-Assay

Ausgangszellzahl:

103 Zellen/Well

Inkubationszeit:

72 h

Zelllinie:

ECV 304

c [Agrostin]

const.: 1.0 µg/ ml

(U-Test nach Wilcoxon; Mittelwert ± SD, n=3; p < 0.05; * signifikant stärkere

Zytotoxizität im Vergleich zur Inkubationszeit von 0.5 h )

Zytotoxizitätsmessung nach 72 h (0: Kontrolle ohne Mediumwechsel; k0: Kontrolle mit Mediumwechsel; test: Messung nach Toxininkubation und Mediumwechsel).

Für die Entstehung der ermittelten Toxizität können verschiedene Aufnahmemechanismen in Betracht gezogen werden, da es sich um einen schnellen, temperaturabhängigen, kooperativen Mechanismus zwischen einem Toxin und einem offensichtlich Endozytose vermittelnden Saponin handelt, der durch ca. dreistündige Vorinkubation getriggert werden kann (Abb. 3-10) und dessen Kinetik aufgrund der unterbundenen Proteinsynthese bei intakter Zellmembran verzögert abläuft (siehe Abschnitt 3.7.1 und 3.13). Durch die Zugabe eines Saponins könnte die Endozytose, z. B. durch LDL- Rezeptoren ausgelöst werden und dadurch das ribosomeninaktivierende Protein in die Zelle gelangen bzw. in Analogie zu den ISCOMS eine bessere Präsentation des Proteins an der Zelloberfläche ermöglicht werden (Rönnberg et al., 1997).

3.8 Struktur-Wirkungsbeziehungen unterschiedlicher Triterpensaponine in Kombination mit RIPs

↓83

Wie bereits dargestellt, konnten sowohl Agrostemma-Saponinfraktionen (siehe Abschnitt 2.18) als auch Gypsophila-Saponinfraktionen durch DC und HPLC isoliert werden (Siepmann, 1998). Zusätzlich wurden unterschiedliche Triterpensaponine mit Gypsogenin oder Quillajasäure als Aglykon, die uns freundlicherweise von Mme Lacaille-Dubois (Univesité de Bourgogne) zur Verfügung gestellt wurden, getestet (Gaidi, 2000, 2001, 2002; Lacaille-Dubois, 2000). Alle Saponine wurden in MeOH/ DMSO (50 % v/v) angelöst und aliquotiert. Zur Inkubation konnte auf Sterilfiltration verzichtet und die gelösten Saponine direkt im Medium verdünnt werden. Die Endkonzentration DMSO wurde auf max. 0.1 % (v/v) eingestellt. Jeweils 5 min vor der Agrostininkubation wurden die Zellen mit den Saponinen inkubiert. Die untersuchten Triterpensaponine zeigten bei einer konstanten Agrostinkonzentration von 30.0 ng/ml unterschiedliche Aktivitäten. Während die reinen Saponine AsA, AsD, ArjA, ArjC, ArjD, ArjE bei 6.0 µg/ml eine vergleichbare Aktivität wie die Rohsaponingemische Quillajasaponin und Saponinum album (je 3.0 µg/ml) zeigten, sind die Saponine ArjC, ArjD und ArjE auch bei einer Konzentration von 3.0 µg/ml noch so aktiv wie die Rohsaponine bei gleicher Konzentration. AsB, AsE und das monodesmosidische Saponin GoB zeigen eine deutlich geringere Aktivität bei 3.0 und 6.0 µg/ ml. Offensichtlich besitzen diejenigen Saponine eine geringere Aktivität, welche monodesmosidisch wie GoB sind oder an Position 3 des Aglykons eine geringe Anzahl bzw. weniger als 3 Zuckerreste aufweisen wie AsE und AsB. Eine Verzweigung der Zuckerkette an Position 28 des Aglykons scheint nach diesen Ergebnissen keine notwendige Voraussetzung für die Aktivität eines Saponins zu sein. Ob eine Verzweigung der Zuckerkette an Position 3 ebenfalls eine notwendige Voraussetzung für eine synergistische Toxizität darstellt, konnte im Rahmen dieser Untersuchungen nicht belegt werden (siehe Abb. 3-11).

Die Kombination eines untoxischen Ribosomen-inaktivierenden Proteins wie Agrostin oder Saporin (RIP Typ I) und eines bisdesmosidischen Triterpensaponins mit Gypsogenin oder Quillajasäure als Aglykon erwies sich im Zytotoxizitätstest als ebenso toxisch wie Agrostin im zellfreien System (Retikulozytenlysattest). Das ebenfalls bisdesmosidische Triterpen-saponin aus Helianthus annuus L. mit Echinocystsäure als Aglykon (fehlende Aldehydfunktion an C4) unter identischen Bedingungen zeigte eine wesentlich geringere in vitro-Aktivität. Modifikationen der Zuckerkette an Position C3 des Aglykons haben ebenfalls Auswirkungen auf die Aktivität der Saponine: Monosaccharide an Pos. C3, eine fehlende C3-Glucuronsäure, Monodesmosidische Saponine und das nach Hydrolyse entstandene Aglykon Gypsogenin zeigten eine signifikant geringere kombinatorische Aktivität.

3.8.1  Zytotoxizitätsuntersuchung mit Gypsogenin

Nach der systematischen Untersuchung unterschiedlicher Triterpensaponine erfolgte die Abspaltung der Zuckerketten, bzw. die Darstellung des Aglykons Gypsogenin aus Saponinum album durch saure Hydrolyse. Die Aglyka wurden dünnschichtchromatographisch mit authentischem Material identifiziert und anschließend mit und ohne Zugabe von Agrostin (1.0 µg/ml) durch einen MTT-Test an ECV 304-Zellen auf zytotoxische Aktivität überprüft. Es wurde auch eine Vorinkubation des Aglykons mit Agrostin bei 37°C durchgeführt und auf Zytotoxizität überprüft. Unter diesen Bedingungen und in den getesteten Konzentrationen (bis 25 µg/ml Gypsogenin) konnte für das Aglykon weder eine Eigentoxizität noch eine Toxizität in Kombination mit Agrostin (1.0 µg/ml) festgestellt werden: Agrostin und das durch saure Hydrolyse gewonnene Gypsogenin (3.0-8.0 µg/ml) führten zu keiner ausgeprägten Zytotoxizität (IC50 (Gypsogenin mit/ ohne Agrostin) > 25.3 µg/ml; n = 3). Die Untersuchung der nach Siepmann et al. durch HPLC isolierten Agrostemma-Saponin-Fraktion bestätigte das Ergebnis hinsichtlich einer aktiven Saponinkomponente mit Gypsogenin als Aglykon (DC-Kontrolle mit authentischem Material: Astrantiagenin D = Gypsogenin; Hiller et al., 1973). Im nächsten Schritt wurde die Untersuchung einer Kombination aus dem Ribosomen-inaktivierenden Protein Agrostin und Agrostemmasaponin 1 sowie Helianthussaponin 2 (Helianthosid) durchgeführt (siehe Abb. 3-7).

↓84

Abb. 3-11: Zytotoxizität von verschiedenen Triterpensaponinen (3.0/ 6.0 µg/ml) und Agrostin (30 ng/ml); nähere Erläuterungen umseitig

Methode:

MTT-Assay

Ausgangszellzahl:

103 Zellen/Well

Inkubationszeit:

72 h

Zelllinie:

ECV 304

↓85

(U-Test nach Wilcoxon; Mittelwert ± SD, n=3; p < 0.05;* signifikant geringere Zytotoxizität als die Kombina-tion von Agrostin (30 ng/ml) mit der Saponinum album-Kontrolle bei einer Konzentration von 3 µg/ml)

Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Gypsophila-, Arenaria-, Acanthophyllum- und Agrostemma-Saponine entstammen der Familie der Caryophyllaceae und weisen bestimmte zur Aktivität notwendige Charakteristika auf, die sie gleichfalls für eine Aktivität als Immunadjuvantien benötigen: saure triterpenoide Bisdesmoside mit Glucuronsäure am C3-Zucker und einer Aldehydgruppe am C4 des Agykons (Guo & Kenne, 2000; Marciani et al., 2000). Insbesondere die Quillajasaponine (siehe Tab. 2-1) sind hinsichtlich ihrer Aktivität als Immunadjuvantien gut untersucht (Kamstrup et al., 2000). Ihre Vertreter wie das QS 21 bzw. das semisynthetisch dargestellte hydrolysestabile Derivat GPI-0100 werden heute in Impfstoffen verwendet oder befinden sich in der klinischen Prüfung (So et al., 1997; Barr et al., 1998, Zhang et al., 2003).

Kensil et al. führten im Jahr 1991 Modifizierungen der C4-Aldehydfunktion mit Periodat durch, die ebenfalls zum Wirkungsverlust führten; auf die entscheidende Bedeutung der Aldehydfunktion am C4 des Aglykons und die Rolle der glykosidisch am C3 vorhandenen Glucuronsäure wurde man bei der Impfstoffentwicklung aufmerksam (Soltysik et al., 1995). ISCOMs (immune stimulatory complexes) sind Adjuvantien, die die Immunantwort verstärken und eine MHC-Klasse 1-abhängige T-Zellreaktion ermöglichen indem sie Peptide bzw. Proteine ins Zytoplasma einer antigenpräsentierenden Zelle transportieren (Morein, 1988). Von dort können sie in das endoplasmatische Retikulum gelangen, wo sie an neue MHC-Klasse-1-Moleküle gebunden und dann als Peptid-MHC-Klasse-1-Komplex an die Zelloberfläche transportiert werden (Sjolander et al., 1998). Die ISCOMs sind Mizellen und bestehen im Wesentlichen aus einer Matrix der als Detergens wirkenden Quillajasäure mit Phospholipiden und Cholesterol sowie sich darin befindenden antigen wirksamen Proteinen. Aufgrund der angenommenen Verschmelzung dieser Mizellen mit der antigenpräsentierenden Zelle gelangt das Antigen in das Zytosol und löst dort Reaktionen aus, die das infizierende Virus selbst in der Zelle verursachen würde (Barr et al., 1998). Aufgrund eingehender Untersuchungen möglicher ISCOM-Trägermoleküle mit dem Ziel einer verbesserten Immunisierung beim Menschen wurde rein empirisch die Quillajasäure als optimaler Bestandteil der ISCOM-Matrix bewertet und ist bis heute ihr Hauptbestandteil. Die chemische Modifizierung der Aldehydfunktion und der Glucuronsäure der Quillajasäure haben Soltysik et al. untersucht und herausgefunden, dass jegliche Veränderung der Aldehydgruppe zu einer Verminderung der Wirksamkeit als Adjuvans führte (Soltysik et al., 1995).

↓86

Die in Abb. 3-11 dargestellten Saponine, die in Kombination mit Agrostin untersucht wurden, zeigen eine Korrelation zwischen dem untersuchten zytotoxizitätsinduzierenden und dem in der Literatur beschriebenen immunstimulierenden Potential für Saponine mit Gypsogenin/ Quillajasäure als Aglykon (Higuchi et al., 1987; Marciani et al., 2000). Marciani et al. untersuchten insbesondere ein Qillajasäurederivat, das QS-21, nach Deacylierung des Terpenesters an der Fucose des C28-Zuckers (DS-1), da QS-21 nahe bzw. unter der CMC (kritische mizellenbildende Konzentration) von 40-60 µg/ml zur Hydrolyse neigt. Sie beobachteten zuerst eine verminderte Zytotoxizität und stellten ebenfalls fest, dass eine Aldehydgruppe die notwendige Voraussetzung für immunstimulatorische Wirksamkeit ist, da die DS-Saponine, ähnlich wie Polysaccharid-Immunmodulatoren, ihre Oligosaccharid-vermittelte Affinität zu Antigen-präsentierenden Zellen bewahrten (Bohn et al., 1995). DS-1 zeigte eine veränderte IgG-Antwort (gute IgG 1, schlechtere IgG2a/b-Antwort). Die Deacylierung führte von einer Th1- zu einer Th2 Immunstimulierung, möglicherweise aufgrund einer veränderten sterischen Lage der Aldehydgruppe oder aufgrund einer schwächeren Affinität zur Lipid-Doppelschicht (Marciani et al., 2001). Erwähnenswert sind hier die Parallelen zwischen der Fc-Rezeptor-vermittelten Phagozytose eines (opsonierten) Antigens als entscheidender Prozess einer Immunreaktion und der rezeptorvermittelten Endozytose als Voraussetzung einer Toxinaufnahme.

Neben der Aldehydgruppe an Pos. 4 und der Glucuronsäure an Pos. 3 des Aglykons spielt offensichtlich auch die Größe, die Azidität und der Grad der Verzweigung der Zuckerketten an C3 und C28 eine entscheidende Rolle, da Oligosaccharidketten eine Affinität zu entsprechenden Rezeptoren auf der Zelloberfläche von Macrophagen besitzen (Bomford et al., 1992). Diesbezüglich ist die Beobachtung wichtig, dass die in vitroTT-Aktivität des glykosylierten Saporin-3 im Vergleich zum nicht-glykosylierten Saporin-6 wesentlich aktiver war, was für eine entscheidende Bedeutung einer Kohlehydrat-Interaktion des Intoxikations-mechanismus spricht. In Analogie zu den Arbeiten von Bomford et al. stehen Beobachtungen zu zwei Hauptsaponinen aus Gypsophila paniculata L. (siehe Abschnitt 2.18: 2 Banden auf der DC detektiert, eine DC-Bande mit authentischer Referenz als Gypsosid identifiziert), die eine ähnliche Adjuvans-Aktivität bzw. in unseren Untersuchungen ähnliche Enhancereigen-schaften für Agrostin wie das Saponinum album zeigten. Diese Ergebnisse im Zusammenhang mit den Zytotoxizitätsuntersuchungen strukturell definierter bisdesmosidischer Triterpensaponine, Quillajasaponin und Saponinum album (Abb. 3-11) schließen eine mögliche Funktion anderer aktiver Substanzen im Gypsophilasaponin aus. Für die Interaktion des Saponins mit dem Cholesterol der Plasmamembran einer Zielzelle und der anschließenden Aggregation der Kohlehydratketten wird eine Neuordnung der Phospholipiddoppelschicht und die Bildung von Poren und die Notwendigkeit einer Anzahl von mindestens 3 Monosacchariden am C3 des Aglykons diskutiert (Armah et al., 1999). Diese Saponine besitzen eine wesentlich geringere hämolytische Aktivität; Saponine mit Monosacchariden am C3 des Aglykons sind am stärksten hämolytisch aktiv (Francis et al., 2002). Demzufolge scheint der in dieser Arbeit beschriebene Effekt des Saponins auf einem anderen Mechanismus zu beruhen. Die Saponine AsB (Gypsogenin-Derivat) und AsE (Quillajasäurederivat) unterscheiden sich jeweils nur in der Position 16 des Aglykons, sind jedoch- vermutlich aufgrund des Monosaccharids an Pos. C3 des Aglykons- bei 3 µg/ml inaktiv und zeigen auch bei 6 µg/ml keine signifikante Toxizität in Kombination mit Agrostin. Das Monodesmosid GoB besitzt am C3 ein glykosidisch gebundenes Trisaccharid und zeigt eine signifikant niedrigere Aktivität als die Bisdesmoside (Abb. 3-11), während die Abspaltung beider Zuckerketten zum kompletten Wirkungsverlust des gebildeten Hydrolyseproduktes Gypsogenin führt (siehe Abschnitt 3.8.1).

In niedrigen Konzentrationen beschädigen die untersuchten Saponine die Membran einer Zelllinie nicht, sondern führen zu einer in vitro-Proliferationssteigerung (Abb. 3-5 u. 3-8) sowie zu einer reversiblen Permeabilisierung der Zellmembran (Melzig et al., 2001) und zur Vesikelbildung innerhalb des Zytoplasmas, was zu einer unspezifischen Tendenz einer Zelllinie führen kann, Makromoleküle und Toxine wie das Agrostin leichter aufzunehmen (Sung et al., 1995). Die spezifische chemische Struktur der Saponine scheint der entschei-dende Faktor für eine kooperative Zytotoxizität zu sein: im Gegensatz zu den toxizitäts-induzierenden Saponinen steht das Helianthosid, ein aus einer Asteraceae gewonnenes neutrales bisdesmosidisches Triterpensaponin mit Echinocystsäure als Aglykon (Hiegemann et al., 1995). Es besitzt eine weitaus geringere Aktivität (siehe Tab. 3-3 und 3-5). Dem Helianthosid fehlt die C4-Aldehydgruppe und das saure Trisaccharid an Position C3 des Aglykons. Trotz einer ansonsten hohen strukturellen Ähnlichkeit zu den aktiven Saponinen in Kombination mit dem Agrostin zeigt es eine wesentlich geringere Toxizität: IC50[Kombination mit Helianthussaponin]: 0.3 µg/ml, IC50[Kombination mit Agrostemma-Saponin]: 5.7 ng/ml (Abb. 3-7 u. Tab. 3-3). Eine weitere spezifische und synergistische Wechselwirkung wird dem Isochinolinalkaloid Tetrandrin, einem natürlichen Calciumantagonisten, in Kombination mit Quillajasaponin (QS) zugeschrieben, eine Wir-kungsverstärkung, die mit einer Porenbildung aufgrund einer Cholesterol-Saponin Komplex-bildung in der Zellmembran erklärt wird (Leung et al., 1997). Möglicherweise ist die fehlende Funktion der B-Kette (Haptomer) der RIPs vom Typ I, eine Anhaftung an der Zielzelloberfläche zu ermöglichen, in unserem Modell durch das Saponin vermittelt worden. Allerdings ist eine kovalente Bindung zwischen Saponin und Protein (z.B. über eine Aldiminbindung zwischen einer Protein-Aminogruppe als Schiff-Base und Saponin-Aldehydfunktion) wie bei den Lectinen zwischen A-und B-Kette (über eine Disulfidbrücke) auszuschließen, denn zum einen zeigten die gefällten saponinfreien Proteinfraktionen äußerst schwache Toxizitätswerte im Bereich einer IC50 von über 20 µg/ml, zum anderen war es uns nicht möglich, eine Schiff-Basenreaktion bzw. eine kovalente Bindung z. B. zum Aldimin zwischen Agrostin und Saponin durchzuführen (siehe Abschnitt 3.9). Derartige Wechselwirkungen im Zusammenhang mit T-Zellen und Antigen-präsentierenden Zellen sind in der Immunologie bekannt (Rhodes, 1989; Rhodes et al., 1995). Eine hypothetische stabile intramolekulare Verbindung des Saponins mit Agrostin, die sowohl die toxischen, als auch die antigenpräsentierenden Eigenschaften modifiziere, erscheint auch deshalb unwahrscheinlich, weil unter Bedingungen, die eine Schiff-Basenreaktion begünstigt hätten, nach Dialyse der Lösung weder eine Zytotoxizität gemessen, noch per DC Saponine identifiziert werden konnten. Allerdings war die Zytotoxizität wiederherstellbar, sobald das Lyophilisat mit Saponin kombiniert wurde (siehe Abschnitt 3.10, Abb. 3-16).

3.9 Versuche zur Hemmung der Toxizität von Saponin und Agrostin

3.9.1  Einfluss von Neuraminidase und EGTA auf den toxischen Effekt

↓87

Abb. 3-12: Versuch der Inhibition des toxischen Effektes durch Vorinkubation mit EGTA [1.0 mM], bzw. Neuraminidase [50 mU] und nach 1 h Inkubation von Saponin und Agrostin für weitere 2 h. Es konnte keine signifikante Toxizitätshemmung festgestellt werden.

Methode:

MTT-Assay

Ausgangszellzahl:

103 Zellen/Well

Inkubationszeit:

72 h (Vorinkubation: 3 h)

Zelllinie:

ECV 304

c [Agrostin]

1.0 µg/ ml

c [Saponin]

3.0 µg/ml

c [EGTA]

1.0 mM

c [Neuraminidase]

50 mU

(U-Test nach Wilcoxon; Mittelwert ± SD, n=3; p < 0.05)

3.9.1.1 Präinkubation von Neuraminidase (EC 3.2.1.18)

Neuraminidase ist ein aus dem Bakterium Clostridium perfringens (C. welchii) isoliertes Enzym, das terminale N-Acetylneuraminsäure (Sialinsäure) von diversen Glykoproteinen auf Oberflächenrezeptoren von Eukaryontenzellen hydrolytisch abzuspalten vermag (Cassidy et al., 1965). Die Gruppe der Sialinsäure bindenden Siglecs ist ein Beispiel Neuraminidase-sensitiver Toxine. Auch das Influenza-Virus bindet über viruseigene Lectine, die Hämagglutinine, an terminale Sialinsäureeinheiten von Membranglykoproteinen und ermöglicht so die Invasion in die Wirtszellen. Dabei spaltet 1 U Neuraminidase 1.0 µmol N-Acetylneuraminsäure je Minute bei pH 5.0 und 37 °C ab (Cassidy et al., 1965). Das Enzym hat ein pH-Optimum von 5.0; bei pH <5.0 und pH > 8.0 ist es inaktiv. Generell wird dieses Enzym aufgrund dieser Eigenschaften als Rezeptor-zerstörendes Enzym bezeichnet. Für diese Untersuchungen war entscheidend, ob die Neuraminidase bestimmte Glycoproteine der Oberflächenrezeptoren der Zielzelle anzugreifen vermag, die verantwortlich für die Aufnahme des RIP I sind. Wie in Abb. 3-12 zu sehen ist, bleibt die Toxizität mit und ohne Vorinkubation von Neuraminidase unverändert; offensichtlich läuft der Toxinadhäsionsschritt unterschiedlich zu dem der üblichen, kohlehydratassoziierten Lectine ab (siehe Abschnitt 3.9.3).

3.9.1.2 Präinkubation von EGTA (Ethylenglykoltetraacetat)

↓88

Viele physiologische Prozesse einer Eukaryontenzelle sind Ca2+-abhängig, z.B. diejenigen, welche von drei verwandten Zelloberflächen-Glykoproteinen, die man zusammen als Cadherine (Cadherin E/ N/ P) bezeichnet, abhängig sind. Bei Fehlen von Ca2+ machen die Cadherine eine Konformationsänderung durch und werden rasch von proteolytischen Enzymen abgebaut. Zwischen den Zellen befinden sich interzelluläre Verbindungen wie tight junctions, adherens junctions, Desmosomen und Gap junctions, die das apikale Kompartement vom basalen trennen. Diese intrazellulären Verbindungen unterliegen in ihrem Aufbau und Erhalt einer Calciumabhängigkeit (Teng & Wilkinson, 2000). Neben einem veränderten Verhalten der Tight Junctions (TJs) und E-Cadherin, einem Protein der Adherens Junctions (AJs), ändert sich während kurzfristigem Ca2+-Entzug auch die endozytotische Aktivität. Zu diesem Zweck verwendeten wir die “Calcium Chelation” Methode, bei welcher Ca2+ durch den Chelatkomplexbildner EGTA komplexiert wird, was eine schnelle, reversible Hemmung der Endo-und insbesondere der Exozytoserate hervorruft (Teng & Wilkinson, 2003). Die Klasse der C-Typ-Lectine sind Ca2+-abhängig. Die C-Typ Lectine liegen entweder membrangebunden oder sezerniert vor. C-Typ Lectine sind Ca2+-abhängig und haben eine oder mehrere CRDs (Carbohydrate Recognition Domains). Man hat nach heutigem Stand um die 50 endogene C-Typ-Lectine identifiziert. Alle besitzen eine Ca2+-abhängige Bindungsdomäne und ein hydrophobes Zentrum. Im vorliegenden Versuch zeigte sich unabhängig von der pysiologischen Ca2+-Abhängigkeit der Endozytose eine kaum veränderte Zytotoxizität nach extrazellulärer Calciumkomplexierung durch Vorinkubation mit EGTA (siehe Abb. 3-12). Calcium-assoziierte Effekte scheinen beim toxischen Effekt der Kombi-nation von Saponin und Agrostin keine Rolle zu spielen.

3.9.2 Temperaturabhängigkeit des getriggerten toxischen Effektes

Bei Vorinkubation von Saponin (3 µg/ml) und Agrostin (1µg/ml) und Mediumwechsel nach 2 h war nach 72 h bei einer konstanten Inkubationstemperatur von 37°C eine deutliche Abnahme der Zellproliferation zu beobachten (Abb. 3-13), die bei Verringerung der Temperatur auf 6°C beinahe aufgehoben war. Die starke Verringerung der Zytotoxizität auf eine beinahe unveränderte Zellproliferationsrate deutet darauf hin, dass der Agrostin-Aufnahmemechanismus in einer temperaturabhängigen, rezeptorvermittelten Endozytose besteht, die wesentlich schneller abläuft als z.B. eine Phagozytose oder Pinozytose (Fittipaldi, 2003). Dieser Mechanismus wird auch als verzögerte Endozytose beschrieben, da die internalisierten, Klathrin-umhüllten Vesikel vorübergehend in einem „fixierten“ Stadium, nahe der Plasmamembran, verweilen und bei Temperaturerhöhung auf RT wieder in den Zellzyklus eingebunden werden. Desweiteren bestätigen diese Untersuchungen die These, dass die Temperaturabhängigkeit dieses endozytotischen Mechanismus reversibel ist (Teng & Wilkinson, 2000).

Abb. 3-13: Inhibition des getriggerten toxischen Effektes. Es wurde eine zweistündige Vorinkubation von Saponin und Agrostin bei 37°C, sowie bei 6°C durchgeführt, 2 h vorinkubiert, mit Medium substituiert und nach 72 h die Zytotoxizität ermittelt.

↓89

Methode:

MTT-Assay

Ausgangszellzahl:

103 Zellen/Well

Inkubationszeit:

72 h (Vorinkubation: 2 h)

Zelllinie:

ECV 304

c [Agrostin]

1.0 µg/ ml

c [Saponin]

3.0 µg/ml

(U-Test nach Wilcoxon; Mittelwert ± SD, n=3; p < 0.05; * signifikante

Toxizitätserhöhung im Vergleich zur Vorinkubation bei 6 °C)

3.9.3 Untersuchung der Wirkung von unterschiedlichen Zuckern auf die Zytotoxizität von Agrostin und Saponin

Lectine besitzen eine individuelle Affinität zu verschiedenen Zuckern auf der Oberfläche (Glykokalix) der Zellmembran. Bei gleichzeitiger Inkubation von entsprechenden zur Wechselwirkung mit dem Lectin befähigten Monosacchariden lässt sich der erste Schritt, die Anheftung der B-Kette des Lectinmoleküls an die Zielzelle, verhindern und dadurch die Toxizität aufheben.

Nach Stirpe unterscheidet man zwischen Typ 1- und Typ 2-RIP, wobei Agrostin zum Typ 1-RIP gezählt werden muss, da es keine die Zellanhaftung vermittelnde B-Kette, wie z.B. die Lectine der Samen von Ricinus communis L. oder Abrus precatorius L., besitzt (Stirpe et al., 1983).

↓90

Die B-Kette bindet an bestimmte Monosaccharide, Aminozucker oder Oligosaccharide eines Makromoleküls und vermittelt so die Anhaftung des Lectins an lebende Zellen und ermöglicht die endozytotische Aufnahme eines durch Disulfidbrücken gebundenen Toxomers (A-Kette). Durch reduktive Spaltung dieser Disulfidbrücke im Zytoplasma wird die toxische A-Kette freigesetzt. Der Wirkungsmechanismus der A-Kette eines Lectins entspricht der eines Typ 1-RIP: RIPs sind enzymatisch wirkende Proteine, zumeist Glykoproteine, die eine hochspezifische N-Glykosidase-Aktivität besitzen, durch die ein Adenin-Molekül aus der rRNA abgespalten und dadurch der gesamte Translationsapparat inaktiviert wird.

Entscheidende Voraussetzung für die Toxizität eines RIP sind zum einen die Bindung an die Zelloberfläche, zum anderen die dadurch ausgelöste Endozytose. Die Translokation durch die Membran eines intrazellulären Kompartiments, die für den Eintritt in das Zytosol erforderlich ist, ist der am wenigsten erforschte Transportschritt im gesamten Zellintoxikationsprozess, allerdings muss man davon ausgehen, dass eine Anhaftung eines Toxins an die Zelloberfläche den entscheidenden Impuls für eine Endozytose und damit für eine toxische Wirkung auslöst. Eine diesbezüglich untersuchte Inaktivierung des Agrostins durch die spezifisch lectinbindenden Monosaccharide D-Glucose, D-Mannose, D-Galaktose, L-Fucose, N-Acetyl-D-Galaktosamin, N-Acetyl-D-glucosamin und Sialinsäure in einer Konzentration von 1.0 mg/ml war nicht möglich. Auch eine Neuraminidase-Vorinkubation, die mögliche Kohlehydratwechselwirkungen unterbinden könnte, erbrachte keine Hemmung des toxischen Effektes. Eine rezeptorvermittelte Endozytose läuft innerhalb ca. einer Stunde ab; die durch die ECIS-Ergebnisse dargestellte Kinetik der Toxinaufnahme (siehe Abschnitt 3.13) und ihre Temperaturabhängigkeit (siehe Abschnitt 3.9.2) deuten dementsprechend auf eine rezeptorvermittelte Endozytose hin (Fittipaldi, 2003).

Tab. 3-4: Einfluss der Monosaccharide auf die Zytotoxizität von Agrostin und Saponin

Präinkubiertes Monosaccharid

Eingesetzte Konzentration

Wachstumshemmung [%]

D-Glucose

1.0 mg/ ml

95.3 ± 3.5 [n.s.]

D- Glucuronsäure

1.0 mg/ ml

94.9 ± 5.2 [n.s.]

D-Mannose

1.0 mg/ ml

95.7 ± 2.8 [n.s.]

D-Galaktose

1.0 mg/ ml

95.1 ± 5.7 [n.s.]

L-Fucose

1.0 mg/ ml

95.3 ± 4.9 [n.s.]

N-Acetyl-D-Galaktosamin

1.0 mg/ ml

97.2 ± 3.1 [n.s.].

N-Acetyl-D-glucosamin

1.0 mg/ ml

95.3 ± 4.8 [n.s.]

Sialinsäure

1.0 mg/ ml

96.6 ± 3.8 [n.s.]

↓91

Methode:

MTT-Assay

Ausgangszellzahl:

103 Zellen/Well

Inkubationszeit:

72 h (Vorinkubation: 2 h)

Zelllinie:

ECV 304

c [Zucker]

1.0 mg/ ml

c [Agrostin]

30 ng/ ml

c [Saponin]

3.0 µg/ml

(U-Test nach Wilcoxon; Mittelwert ± SD, n=3; p < 0.05; n.s.: nicht signifikant im Vergleich mit der Zytotoxizität von Agrostin und Saponin ohne Präinkubation eines Zuckers)

Es wurden acht Monosaccharide (D-Glucose, D- Glucuronsäure, D-Mannose, D-Galaktose, L-Fucose, N-Acetyl-D-Galaktosamin, N-Acetyl-D-glucosamin und Sialinsäure) in einer Konzentration von 1.0 mg/ ml getestet, welche aufgrund ihrer chemischen Struktur und der Konfiguration zur spezifischen Wechselwirkung mit den meisten Lectinen befähigt sind (Olsnes, 1987). Keiner dieser zur Bindung und Inaktivierung einer Vielzahl von Lectinen befähigten Zucker konnte im MTT-Assay an ECV 304-Zellen die saponinvermittelte Toxizität des Agrostins unterbinden. Auch eine Präinkubation von Glucuronsäure, die eine entscheidende Rolle bezügl. der Struktur-Wirkungs-Beziehungen des Saponins spielt, hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Zytotoxizität.

3.9.4 Untersuchung des Effektes von Latrunculin A auf die Toxizität von Agrostin und Saponin

Ein potenter Inhibitor der Phagozytoseaktivität von ruhenden und aktivierten Makrophagen ist Latrunculin A.

↓92

Latrunculin A, ein Actin-bindendes Toxin (Mr: 421.6 D) des Seeschwammes Latruncula magnifica aus dem Roten Meer, hemmt die Actin-Polymerisierung in vitro (Morton et al., 2000) und in vivo (De Oliveira, 1988; Spector et al., 1983).

Abb. 3-14: Struktur des Actin-bindenden Toxins Latrunculin A aus Latruncula magnifica (De Oliveira, 1996).

Das Latrunculin A wurde in einer Konzentration eingesetzt, in der die Phagozytose gehemmt wird und keine direkte Toxizität auf die Zellkultur ausgeübt wird (De Oliveira et al., 1988). Erst nach einer Inkubationszeit von 100 min findet eine signifikante Hemmung im Vergleich zur Kontrolle statt (Abb. 3-15). Allerdings wird auch nach einer Inkubationszeit von 140 min keine vollständige Aufhebung der getriggerten Toxizität erreicht, was für einen alternativen endozytotischen Effekt spricht, der nicht vollständig durch eine Präinkubation mit Latrunculin A gehemmt wird (Morton et al., 2000).

↓93

Abb. 3-15: Hemmung der getriggerten Toxizität durch 40 min. vorinkubiertes Latrunculin A (60 nM): Inkubation von 3 µg/ml Saponin und 1 µg/ ml Agrostin über einen Zeitraum von 20/ 40/ 60/ 80/ 100/ 120 und 140 min, anschließend Mediumwechsel und Toxizitätstest nach 72 h.

Methode:

MTT-Assay

Ausgangszellzahl:

103 Zellen/Well

Inkubationszeit:

72 h

Zelllinie:

ECV 304


(U-Test nach Wilcoxon; Mittelwert ± SD, n = 3; p < 0.05; *signifikante Hemmung der Zytotoxizität im Vergleich zur Kontrolle)

3.10 Untersuchung zur direkten chemischen Wechselwirkung von Saponin und Agrostin/ HSA

↓94

Die Untersuchung zur direkten chemischen Wechselwirkung des Saponins und des Agrostins wurde in 5 mM Sörensen-Phosphatpuffer (Konz. Saponinum album: 1 mg/ml; Konz. Agrostin: 100 µg/ml, Konz. Humanserumalbumin: 1 mg/ ml; VGes.: 10 ml; Reaktionszeit: 24 h; 37°C; pH 8.6) durchgeführt, unter Bedingungen, die eine Schiff-Basenbildung begünstigen und eine Bildung einer kovalenten Bindung zwischen der C4-Aldehydgruppierung des Triterpens mit freien Aminogruppen des Agrostins ermöglichen würden (Soltysik et al., 1995; Rhodes et al., 1989). Eine Dialyse mit mehrfachem Mediumwechsel (Dialysiermembran: MWCO.: 25000) diente der Entfernung überschüssigen Saponins. Nach 24 h Dialyse unter Eiskühlung wurde lyophilisiert und 1 mg des Lyophilisates zur Toxizitätsmessung verwendet. Nach 180 min Inkubationszeit wurde ein Mediumwechsel und nach weiteren 3 Tagen ein Zytotoxizitätstest durchgeführt. Weder im Humanserumalbumin noch im Agrostin konnten in der DC nach erschöpfender Dialyse Saponinreste im Lyophilisat nachgewiesen werden: Die qualitative dünnschichtchromatographische Überprüfung des Lyophilisats auf Saponine war negativ. Die Zytotoxizitätsuntersuchungen bestätigten dieses Resultat (siehe Abb. 3-16).

Abb. 3-16: Präinkubation des Agrostin-Saponin-Lyophilisats mit Mediumwechsel nach 180 min und Zytotoxizitätsmessung nach 72 h.

Methode:

MTT-Assay

Ausgangszellzahl:

103 Zellen/Well

Inkubationszeit:

72 h (180 min Präinkubation und Mediumwechsel)

Zelllinie:

ECV 304

↓95


(U-Test nach Wilcoxon; Mittelwert ± SD, n = 3; p < 0.05; * signifikante stärkere Zytotoxizität im Vergleich zum Lyophilisat/ der Kombination aus Lyophilisat und Agrostin)

Sowohl das Lyophilisat selbst, als auch dessen Kombination mit 1 µg/ml Agrostin zeigt keine Toxizität, hingegen ist die Toxizität mit Saponinkombination vergleichbar mit den bereits bekannten Toxizitätsmessungen zwischen Saponin und Agrostin (siehe Tab. 3-5).

Offensichtlich entsteht unter Bedingungen, die eine Schiff-Basenbildung begünstigen, keine kovalente Bindung zwischen Agrostin und Saponin, die Substanzen scheinen auf einem alternativen, bisher unbekannten Weg zu interagieren.

3.11 Untersuchungen unterschiedlicher Toxine in Kombination mit Gypsophilasaponin

↓96

Die zu untersuchenden Toxine sollten sich sowohl durch ihre strukturelle Verwandtschaft zum Agrostin auszeichnen, als auch unfähig sein, die Zellmembran von Eukaryonten selbständig zu durchdringen. Darüber hinaus sollten die Toxine einen Wirkungsmechanismus aufweisen, der in möglichst ähnlicher Weise wie Ribosomen-inaktivierende Proteine die Proteinsynthese unabhängig vom Zelltyp noch in äußerst geringer Konzentration inhibiert.

Besonders geeignet erschienen folgende Gruppen:

1. N -Glykosidasen (systematische Bez.: rRNA N-Glykohydrolase; EC 3.2.2.22), die spezifisch die Abspaltung des Adenin-4324 (u.a. verantwortlich für die EF-I/II-Bindung an das Ribosom; siehe Abschnitt 1) der 28S-rRNA von Ratten abspalten (Endo & Tsurugi, 1987; Barbieri et al., 1997). Dadurch blockieren diese Toxine den Elongationsschritt der Proteintranslation. RIPs (ribosomeninaktivierende Proteine) werden in zwei bzw. neuerdings in drei Klassen unterteilt: Typ I (Mr: 26-31 kDa) (Roncuzzi & Gasperi-Campani, 1996), Typ II (zwei disulfidverbundene Polypeptid-ketten, eine entspricht einem Typ I RIP, die andere einem Lectin) und Typ III (nicht-toxische Typ II-RIPs wie Ebulin und Nigrin b; Barbieri et al., 1993). In beiden Fällen ist das aktive Zentrum des Toxins eine purinreiche Region, die sog. α-Sarcin-Schleife (Endo et al., 1988). In einer aktuellen Publikation wird berichtet, dass die Toxizität der Typ 2 RIPs unabhängig von ihrer enzymatischen Aktivität auf Nukleinsäuren und Ribosomen ist (Barbieri et al., 2004). Man nimmt an, dass ein Molekül Toxin im Zytosol ausreicht, um eine Zelle zu töten. Allerdings ist die biologische Bedeutung der RIPs im Organismus noch unbekannt, vermutlich besteht ihre Aufgabe in der Abwehr von Virus- oder Pilzinfektionen (Park et al., 2002).

↓97

Agrostin, ein glykosyliertes Typ 1-RIP aus den Samen von Agrostemma githago L. (siehe Einleitung; Stirpe et al, 1983; Hebestreit & Melzig, 2003). Die chemische Struktur des Agrostins ist bis heute noch nicht aufgeklärt worden.

Saporin (SO 6, siehe Abb. 3-17), ein unglykosyliertes Typ 1-RIP aus den Samen von Saponaria officinalis L., sowie rekombinant hergestelltes His-Saporin (Sap-3) binden spezifisch an α-Macroglobulin- und Megalinrezeptoren (Ippoliti, 1992; Cavallaro et al., 1995).Saporin-6 wird heute als DNA/ RNA/ Poly(A) N-Glycosidase (RNA-N-Glykosidase, DNA-Adenosin-Glykosidase) klassifiziert (Barbieri, 1997). Saporin gehört zusammen mit Luffin zu RIPs vom Typ I mit HIV-1 Integrase-Inhibitor-Aktivität (Au, 2000). Saporin bindet an den α2-Makroglobulin Rezeptor (Ippoliti et al., 2000), der auch als „low-density lipoprotein receptor-related protein“ (LRP) bekannt ist, allerdings nicht, wie früher angenommen, nur an diesen Rezeptor, was aktuelle Untersuchungen an rekombinant hergestelltem Saporin-5 und 6 belegen (Bagga et al., 2003).

Abb. 3-17: Diagramm der 3-D Struktur des Saporins (SO6). Durch die Buchstaben A-H werden die acht α-Helices dargestellt.

Diese Struktur ist typisch für alle RIPs, die in der C-terminalen Region ihr aktives Zentrum und vermutlich ebenfalls die Erkennungsmerkmale für das Substrat besitzen (Savino et al., 2000).

↓98

Ricin (RTA: A-Kette des Ricins, siehe Abb. 1-1) aus den Samen von Ricinus communis L.
Ricin (RIP II; Mr: 64 kDa) besteht aus zwei Polypeptidketten, die durch eine Disulfidbrücke verbunden sind. Die B-Kette (262 Aminosäuren, Mr 34 kDa, Haptomer), ein Lectin (lat.: legere = auswählen) oder Phytohämagglutinin, heftet sich auf Grund ihres Zucker bindenden Potentials an Galaktose- beziehungsweise Mannosereste der Zelloberfläche (Katzin B J, 1991, Montford W, 1987). Dies führt zur Endozytose des gesamten Toxin-Rezeptor-Komplexes. Die A-Kette (267 Aminosäuren, Mr 32kDa, Effektomer), eine hoch spezifische N-Glucosidase, wirkt als Ribosomen-inaktivierendes Protein (RIP): Sie spaltet von der 28S ribosomalen RNA einen Adeninrest ab. Diese Abspaltung verhindert die Bindung eines Elongations-faktors (siehe Abschnitt 1), die Proteinsynthese wird angehalten und die Zelle stirbt. Toxine dieser Art verfügen in der Regel über einen eigenständigen zellulären Aufnahmemechanismus, deshalb sind sie sowohl in zellfreien Aktivitätsassays als auch gegenüber kultivierten Zellen sehr potent. Wahrscheinlich genügt ein einziges Molekül, um eine Zelle abzutöten. Das früher als einheitliche Verbindung betrachtete Ricin ist nach neueren Untersuchungen aus einem Komplex aufgebaut, der aus zwei Lectinen (RCL I und II) und zwei Toxinen (RCL III [Ricin D] und IV) besteht (siehe Abb 1-1; Olsnes, 1987).

Nigrin b aus der Rinde von Sambucus nigra L.(Mr: 58.0 kDa)
Dieses im Gegensatz zum Ricin weniger toxische RIP II (=RIP III) besteht ebenfalls aus zwei Ketten, einer durch Disulfidbrücken verbundenen A-Kette (Mr: 26.0 kD und einer B-Kette (Mr: 32.0 kDa). Nigrin b hat keinerlei Einfluss auf die pflanzliche oder bakterielle Proteinsynthese, besitzt jedoch stark hemmende Wirkung auf die Proteinsynthese von Säugetierzellen in vitro (Citores et al., 1996; Vandenbussche, 2004). Dieses Toxin ist eine rRNA N-Glycosidase der rRNA intakter Säugerzellen (Battelli et al., 1996; Girbes et al., 1996).

2. ADP-ribosylierende Enzyme, die den eukaryontischen Elongationsfaktor EF II am Diphthamid-715 (modifiziertes Histidin) verändern (siehe Abschnit 1).

↓99

Diphtheriatoxin (DT) aus Corynebacterium diphtheriae (siehe Abb. 1-1):
Diphtheriatoxin wird von Corynebacterium diphtheriae als Protein von 535 Aminosäuren Länge ausgeschieden. Codiert wird es von einem Phagen (wenn die Bakterien nicht lysogeniert sind, entsteht bei Infektion keine Diphtherie, sondern eine „normale“ Halsentzündung). Das Protein gehört zu den A-B-Toxinen, bei denen das aktive Fragment nach der Bindung an die Zielzelle proteolytisch abgespalten wird (Ariansen et al., 1993; Drazin et al., 1971). Im nativen Protein können drei verschiede-ne Domänen unterschieden werden (Collier & Kandel, 1971; Yamaizumi, 1978).

3. Peptidtoxine:

Microcystin LR (siehe Abb. 3-18), ein kommerziell erhältliches Heptapeptid (Mr: 995.2 D) und Protein-Phosphatase 1 und 2 A-Inhibitor aus dem Cyanobakterium Microcystis aeruginosa, einem Einzeller, der in Süßwasser oder in der Ostsee lebt und neben Blaualgen einen wesentlichen Faktor der sog. Wasserblüte darstellt. Mit Ausnahme von Hepatozyten ist dieses Peptid nicht zellmembranpermeabel und hat keinen Effekt auf Proteinkinasen (Chong et al., 2000). Microcystine inhibieren Enzyme der Zellregulation (Proteinphosphatasen) und fördern das Tumorwachstum.
Sie verursachen bei oraler Aufnahme in leichteren Fällen Übelkeit und Durchfall, sonst akuten und chronischen Leberschaden, vermutlich auch Leberkrebs. Heute sind über 60 verschiedene Microcystine bekannt.

↓100

Abb. 3-18: Struktur des Heptapeptides Microcystin LR aus Microcystis aeruginosa.

4. Ein ebenfalls kommerziell erhältliches Peptid, ein Apoptoseinduktor (zur Apoptose: siehe Abschnitt 1.4) wurde getestet:

FAS-C-terminales Tripeptid: Ac-Ser-Leu-Val-OH (Mr: 359.42 Da)
Dieses Tripeptid mit der C-terminalen Sequenz des humanen Fas (CD 95/ APO-1, apoptosevermittelnder Oberflächenrezeptor) hemmt die Interaktion des humanen Fas mit der Fas-assoziierten Phosphatase-1 (FAP-1). Direkte Microinjektion dieses Tripeptides in das Zytoplasma führt zur Induzierung Fas-assoziierter Apoptose einer Kolon-Zelllinie, die Fas und FAP-1 exprimiert (Scheller et al., 2002; Yanagisawa et al., 1997).

3.11.1  Zytotoxizität von Proteintoxinen in Kombination mit Saponin

↓101

Abb. 3-19: Zytotoxizität (IC50-Werte) der Protein-/ Peptidtoxine Diphtheriatoxin, Nigrin b, Microcystin, Agrostin, (his-) Saporin und Ricin-Toxin A (RTA) in Kombination mit Saponin (3.0 µg/ml Saponinum album, bzw. Agrostemmasaponin).

(Student t-test; Mittelwert ± SD; n=3; p < 0.05)
(* signifikant erhöhte Zytotoxizität im Vergleich zu Nigrin b/ Microcystin ohne Saponininkubation)

Methode:

MTT-Assay

Ausgangszellzahl:

103 Zellen/Well

Inkubationszeit:

72 h

Zelllinie:

ECV 304

c [Saponinum album]

const.: 3.0 µg/ ml

(Student t-test; Mittelwert ± SD; n=3; p < 0.05)
(* signifikant erhöhte Zytotoxizität im Vergleich zu Nigrin b/ Microcystin ohne Saponininkubation)

Unter den gleichen Bedingungen wurde auch das Fas-Tripeptid (siehe Abschnitt 3.11) in Kombination mit Gypsophilasaponin in vitro-toxikologisch untersucht. Es wurden Konzentrationen von 50/ 100/ 500 nmol und 1/ 10/ 50 µmol und in einer zweiten Versuchsreihe von bis zu 100 µmol eingesetzt. Weder das Tripeptid allein noch in Kombination mit Gypsophilasaponin (3.0 µg/ml) konnte eine signifikante Zytotoxizität unter den unten angegebenen Bedingungen auslösen (IC50 [Fas-Tripeptid und Gypsophilasaponin] > 100 µM, n = 3).

↓102

Für Agrostin, (his-) Saporin und RTA konnte ohne gleichzeitige Saponininkubation aufgrund zu geringer Eigentoxizität keine IC50 ermittelt werden. Diphtheriatoxin diente als Positivkontrolle (IC50: 1.27 * 102 pM). Diejenigen Saponine und Proteintoxine, die der gleichen Pflanzenfamilie (Caryophyllaceae) und chemischen Struktur (Triterpensaponine und RIPs) angehören, zeigen dies am deutlichsten: saure bisdesmosidische Triterpensaponine mit einer Formylgruppierung am C4 des Aglykons, einem verzweigten Zuckerrest am C3 und C28 des Aglykons scheinen optimale Voraussetzungen für eine kooperative Toxizität in diesem Modell zu bieten. Im Falle des Agrostins und des strukturell verwandten (his-) Saporins ist diese Analogie zwischen botanischer Abstammung und der Wirksamkeit der jeweils kombinierten Inhaltsstoffe offenkundig.

Es wurden bereits Untersuchungen hinsichtlich der Enhancereigenschaften des DS-1 (=Quillajasäureanalogon des getesteten ArjC) mit Aminoglykosid-Antibiotika (Recchia, 1995) und Cisplatin (Gaidi et al., 2002) durchgeführt; Insulin wurde bezüglich einer okularen, bzw. einer nasalen Applikationsmöglichkeit untersucht, was zur Entwicklung von Insulin-Nasensprays geführt hat, die sich in klinischer Prüfung befinden (Chao et al., 1998; Pillion, 2000). Auch HIV-Impfstoffe wurden auf eine QS-21-Adjuvanswirkung bei einer intramuskulären- und intranasalen Applikation untersucht (Sasaki et al., 1998).

Mit der hier dargestellten Enhancereigenschaft der beschriebenen Saponine (siehe Tab. 2-1 und Abb. 3-11) in Kombination mit Agrostin, einem Toxin, das von F. Stirpe et al. im Jahre 1983 beschrieben wurde, wird ein toxikologischer Ansatz genutzt, der bereits in vitro erstaunliche Ergebnisse hinsichtlich einer tumortherapeutischen Anwendung in Kombination mit auf RIP I-basierenden Immunotoxinen bietet. In der vorliegenden Arbeit wurde die Zytotoxizität des Agrostins an ECV 304-Zellen getestet. Eine äußerst schwache Zytotoxizität (max. eingesetzte Konz.: 1.85 * 106 pM) konnte bestätigt werden (Tab. 3-5). Dieses Ergebnis korreliert mit toxikologischen Untersuchungen verschiedener RIPs, die Kofaktoren wie ATP zur Aktivierung benötigen (Carnicelli et al., 1997). Alle weiteren isolierten Proteine aus der Kornrade, sowie das ebenfalls aus einer Caryophyllaceae isolierte, nicht glykosylierte Saporin aus Saponaria officinalis L. (max. eingesetzte Konz.: 9.3 * 10-7 mM) und das rekombinant hergestellte, glykosylierte his Sap-3 (max. eingesetzte Konzentration: 9.3 * 10-7 mM), die DTA-Kette aus Diphtheriatoxin (max. eingesetzte Konzentration: 6.05 * 10-6 mM), sowie die RTA-Kette aus dem Ricin (max. eingesetzte Konzentration: 3.45 * 10-5 mM) zeigten kaum Toxizität in vitro (Tab. 3-5). Erst die Kombination mit Saponinen definierter Struktur (siehe Abb. 3-11) wie es z. B. beim Agrostemmasaponin oder dem Gypsosid aus Gypsophila-Arten der Fall ist, führen zu einer eindrucksvollen Zytotoxizität. Durch diese Kombination ist es möglich, die Konzentrationen der Einzelkomponenten so weit abzusenken, dass diese für sich allein im Zellkulturmodell keine Zytotoxizität aufweisen, während die Kombination hochtoxisch ist. Dies beweist auch die synergistische Wirkung einer von der Arbeitsgruppe Fuchs (UKBF, Berlin) durchgeführten Kombination aus Gypsophilasaponin (3 µg/ml) mit a) Saporin, b) Saporin-3 (Sap-3) und c) einem Sap-3 gekoppelten Immunoadaptertoxin mit dem epidermal growth factor (EGF) als Ligand (Abb. 3-19 und Tab. 3-5). Die kombinatorische Wirksamkeit wurde sowohl an ECV-Zellen als auch an NIH-3T3/ HER 14- und MCF-7-Zellen getestet. Erstmals wurde ein stärkerer zytotoxischer Effekt der Kombination von Saporin mit Gypsophilasaponin im Vergleich zu reinem Diphtheriatoxin beobachtet (Heisler et al., 2004). Wie bei den Proteinen besteht offenbar auch bezüglich der Saponine eine Analogie zwischen der systematischen bzw. der chemotaxonomischen Einordnung und ihrer Wirksamkeit bzw. der synergistischen Toxizität einer Kombination beider Substanzen(Agrostin aus Agrostemmae semen und Saporin aus Saponariae semen, beides Caryophyllaceae). Bei Toxinen anderer Herkunft zeigten RTA (Ricin A-Kette, Ricini semen) und das nicht-toxische Typ II RIP Nigrin b (Sambucus nigrae cortex, Adoxaceae) eine schwächere Aktivität. Das Peptidtoxin Microcystin aus der Blaualge Microcystis aeruginosa, Diphtheriatoxin A aus Corynebacterium diphtheriae und das rekombinant hergestellte FAS-Tripeptid sind Toxine mit unterschiedlichem Wirkungsmechanismus und zeigen kaum noch zytotoxische Aktivität in Kombination mit Saponinen.

↓103

Tab. 3-5: Zusammenstellung der wichtigsten IC50-Werte

A: Rohextrakte

B: Reinsubstanzen/ Kombinationen

IC50

A: Rohextrakte

50 % wässrig-methanolischer Extrakt aus den Samen von Agrostemma githago L.

6.5 ± 1.1 µg/ml

wässriger Extrakt aus den Samen von Agrostemma githago

0.3 ± 0.1 µg/ml

B: Reinsubstanzen/ Kombinationen

Positivkontrolle (Diphtheriatoxin)

1.27 * 10-4 µM

Agrostin

n.i. (max. Konz.: 1.85 * 10-3 mM)

Agrostemmasaponin 1 (1)

6.4 ± 1.5 µM

Agrostemmasaponin 2 (2)

6.2 ± 1.5 µM

Agrostin und Agrostemmasaponin 1a

5.7 ± 1.7 ng/ml

Agrostin und Helianthussaponin 2a

300 ± 90 ng/ml

Nigrin b

6.6 * 10-2 µM

Nigrin b und Gypsophilasaponina

8.2 * 10-3 µM

Saporin

n.i. (max. Konz.: 9.3 * 10-4 µM)

Saporin und Gypsophilasaponina

1.8 * 10-5 µM

his-Saporin

n.i. (max. Konz.: 9.3 * 10-4 µM)

his-Saporin und Gypsophilasaponina

1.3 * 10-6 µM

RTA

n.i. (max. Konz.: 3.45 * 10-2 µM)

RTA und Gypsophilasaponina

7.63 * 10-3 µM

DTA

n.i. (max. Konz.: 6.05 * 10-3 mM)

DTA und Gypsophilasaponina

n.i. (max. Konz.: 6.05 * 10-6 mM)

Microcystin

7.4 * 10-2 mM

Microcystin und Gypsophilasaponina

2.3 * 10-2 mM

a Saponinkonzentration 3.0 µg/ml (U-Test nach Wilcoxon; Mittelwert ± SD; n=3; p < 0.05; n.i.: no inhibition)

Methode:

MTT-Assay

Ausgangszellzahl:

103 Zellen/Well

Inkubationszeit:

72 h

Zelllinie:

ECV 304

3.12  Immunfluoreszenzmikroskopie

Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine effektive Methode der Lichtmikroskopie zur Beobachtung von Proteinen innerhalb der Zelle. Es ist dabei z. B. möglich, die subzelluläre Lokalisierung eines Proteins zu bestimmen, die Änderung der Lokalisierung als Antwort der Zelle auf bestimmte Stimuli hin zu untersuchen oder die relative Lokalisierung mehrerer Proteine zueinander zu vergleichen. Unter Verwendung geeigneter Techniken ist es nicht nur möglich, Proteine in fixierten sondern auch in lebenden Zellen nachzuweisen.

↓104

Zur Lokalisierung des Agrostins im Cytosol der ECV-304-Zellen ist eine Vorbehandlung bzw. Fixierung des Materials notwendig, die sowohl die Zellstrukturen als auch die antigenen Eigenschaften des Proteins bestmöglich erhalten soll. Im vorgestellten Fall erwies sich die Fixierung mit Formaldehyd als optimal.

Will man Fixationsartefakte ausschließen, müssen Zellen in lebendem Zustand beobachtet werden. Dies wurde im Rahmen dieser Arbeit durch eine säulenchromatographische Kopplung des Agrostins mit dem Lebendfarbstoff Alexa Fluor 488 realisiert.

3.12.1  Immunfluoreszenzfärbung

Die Visualisierung des FITC-markierten Anti-Kaninchen-Globulins gegen das antikörper-gekoppelte Agrostin im Zytosol der Zellen erfolgte durch die Immunfluoreszenzmikroskopie. In vivo-Untersuchungen erfolgten durch direkte Kopplung des Agrostins mit dem Fluoreszenzfarbstoff AlexaFluor 488 (zur Durchführung siehe Abschnitt 2.14.1 und 2.16). Die Hämatoxylinfärbung diente der Visualisierung der Zellkerne im Zellverband (siehe Abb. 2.13.7 und Abb. 3-20 a & b).

↓105

Abb. 3-20 stellt die morphologische Veränderung eines ECV 304-Monolayers nach 72-stündiger Inkubationszeit der Toxine dar (vergleiche Abb. 3-2). Markiertes Agrostin konnte im perinukleären Bereich des Zytosols, vermutlich an den Ribosomen des rauen ER, lokalisiert werden (Abb. 3-21 c-d). Die Kinetik der Toxinaufnahme, die bereits durch die gertriggerte Zytotoxizität (siehe Abb. 3.10) und später durch die ECIS-Untersuchungen (siehe Abb. 3-25) belegt werden konnte, liegt hier unterhalb 2 h (Abb. 3-21 a - b).

Abb. 3-20: a), b) Hämatoxylinfärbung von ECV 304-Zellen
c), d) Visualisierung des Agrostins durch FITC-Anti-Antikörpermarkierung

↓106

Entscheidend für die Einleitung des am besten untersuchten Endozytosewegs, der rezeptor-vermittelten Endozytose, ist das Klathrin, ein dimeres Protein, das sich zu einem käfigähnlichen Gebilde, einem „coated pit“ zusammenlagert (siehe Abb. 1-4 u. 1-5). Nach der Endozytose zerfallen diese und das Klathrin sammelt sich wieder an der Plasmamembran.

Abb. 3-21: a), b) Visualisierung des Agrostins durch FITC-Anti-Antikörpermarkierung
c), d) Visualisierung des Agrostins durch AlexaFluor-Kopplung

Aktuelle Veröffentlichungen belegen, dass neben der Klathrin vermittelten Endozytose alternative Aufnahmemechanismen existieren, was in vitro am Beispiel von Klathrin- unabhängig und Latrunculin A-unempfindlich aufgenommenem Transferrin dargestellt wird (Moskowitz et al., 2003). Ein weiteres Beispiel liefert eine vergleichende Untersuchung bezüglich der Trichosanthin (TCS)-Toxizität gegenüber zwei Zelllinien: einer TCS-empfindlichen Chorionkarzinomzelllinie (JAR) und einer TCS-unempfindlichen Hepatomzelllinie (H35). Durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie konnte nach kurzer Zeit FITC-markiertes TCS in Coated pits der JAR-Zelllinie nachgewiesen werden, während von der HR35-Zelllinie nur geringe Mengen TCS langsam und unspezifisch aufgenommen wurden (Chan et al., 2003). Auch für ein Dimer zwischen Pro-Urokinase und Saporin wird ein neuer, alternativer Aufnahmemechanismus diskutiert. Der Mechanismus zur Zelladhäsion wird hier mit der Anheftung an den Urokinase-Rezeptor und nachfolgender LRP (low density lipoprotein-related receptor protein) -Bindung, die zur Auslösung einer Endozytose dient. Dies ist ebenfalls ein zweistufiger Prozess, der insofern vergleichbar ist, als das Saponin vermutlich entsprechend die Zelladhäsion vermittelt und erst dadurch die Membranpassage des Toxins ermöglicht (Ippoliti et al., 2000). Der gesamte Endozytoseprozess stellt sich in der gegenwärtigen Diskussion als wesentlich komplexer und differenzierter dar als bisher angenommen (Kirchhausen, 2000; Pelkmans, 2002), was die Untersuchungen der unvollständigen Zytotoxizitätshemmung mit Latrunculin A, sowie die nicht erfolgte Hemmung durch Neuraminidase und EGTA-Präinkubation belegen (siehe Abschn. 3.8.4). Viel spricht derzeit dafür, dass Zelleintritt und Transport der Toxine innerhalb der Zellen nicht toxinspezifisch sind, sondern dass sie den Weg zelleigener Moleküle nutzen (Barbieri et al., 1993). Es wird angenommen, dass die RIPs von den Proteintransportern des Endoplasmatischen Retikulums (ER) ins Zytosol transferiert werden, nachdem sie durch das trans-Golgi-Netzwerk in retrograder Richtung transportiert wurden (siehe Abschnitt 1.2 u. 1.3). Alternativ könnte auch eine Membrandestabilisierung, die infolge einer direkten Lipid-Protein-Wechselwirkung eintritt, einen Translokationsmechanismus darstellen (Schwarze & Dowdy, 2000). Ein Vergleich der Wechselwirkungen verschiedener RIPs mit der Lipiddoppelschicht lässt auch Rückschlüsse auf mögliche Mechanismen zu, derer sich die Lectine bedienen, um die auf dem Weg ins Zytosol befindliche intrazelluläre Membran-barriere zu überwinden.

3.13 ECIS-Untersuchungen

↓107

Diese erstmals von Ivar Giaever und Charles R. Keese im Jahre 1993 beschriebene Methode erlaubt es, kontinuierlich und nicht invasiv sowohl die Migration als auch morphologische Veränderungen eines konfluenten Monolayers darzustellen. Man verwendet eine kleine (250 µm), sehr dünne, transparente Goldelektrode (Arbeits- oder Messelektrode) sowie eine dreihundertfach größere Bezugselektrode. Dadurch wird die Messelektrode zum Nadelöhr für den Stromfluss und die gemessene Impedanz ist fast ausschließlich abhängig von der Zellschicht auf der Messelektrode. In einem 8-well-array wird der Mittelwert aus 10 Messungen pro well bestimmt, da im verwendeten Gerät zehn über den Boden des Zellkulturgefäßes verteilte Messelektroden gleichmäßig angeordnet sind. Die Elektroden werden so in den Boden des Kulturgefäßes eingearbeitet, dass auf ihnen die Zellen angezüchtet werden können. Dadurch entsteht auf der Elektrodenoberfläche ein konfluenter Monolayer, der sich wie ein Isolator verhält. Dementsprechend kann man bei Anlegen eines Wechselstromes einen plötzlichen Anstieg des Wechselstromwiderstandes (Impedanz) beobachten, sobald die Zellen auf der Oberfläche der Elektroden spreiten und konfluent werden, da die ausgebildete Plasmamembran den Stromfluss vermindert. Die nun auftretenden Schwankungen der Impedanz sind ein Zeichen der vertikalen Bewegungen (micromotions) der Zellen. Die micromotions sind ein Maß für die Morphologie und die Lebensfähigkeit der Zellen (Wegener et al., 1996). In Abhängigkeit der Frequenz des angelegten elektrischen Feldes kann ein Teil des Stromes durch die Zellen, also die Basalmembran, das Zytoplasma und die apikale Plasmamembran (transzellulär) oder um die Zellkörper herum durch den Interzellularspalt und die tight junctions (parazellulär) fließen. Die Menge des transzellulär fließenden Stromes ist abhängig von der Kapazität der Plasmamembran, während der parazellulär fließende Strom abhängig vom Abstand zwischen Zelle und Substrat, sowie vom Widerstand des interzellulären Spaltes ist. Die angelegten elektrischen Felder sind sehr schwach und damit nicht invasiv. Somit kann die Methode bei jedem beliebigen Zellproliferationsstadium angewendet werden, ohne dass das Wachstum oder die Differenzierung der Zellen in irgendeiner Weise behindert werden (siehe Abb. 3-24 und 3-25).

Abb. 3-22: Abb. links: Modell von drei Zellen auf einer Goldelektrode mit den daraus resultierenden drei Parametern Rb, α und Cm die sich durch das Verhalten der Zellen als Isolatoren ableiten lassen (s.u.). Abb. rechts: einige fixierte und angefärbte NIH 3T3-Zellen.

(Abb. aus http://www.biophysics.com )

↓108

Drei Parameter können von diesem Modell abgeleitet werden:

Rb: Widerstand zwischen angrenzenden Zellen (=barrier resistance); er stellt ein Maß für den Widerstand des Monolayers dar.

α: Parameter, der die Impedanz der Zell-Substrat-Berührungszone, sowie die Schwankung des Zell-Substrat- Kontaktes widerspiegelt.

↓109

Cm: quantitatives Maß für die Morphologie der Plasmamembran (membrane capacitance).

Abb. 3-23: Die Zellen werden in einem 8-well-Kulturgefäss auf einem Elektrodenarray in jedem Well ausgesät (links). Abb. rechts: Stromfluss durch einen Zellmonolayers auf einer Goldelektrode (Durchmesser: 250 µm) im Mikromaßstab.

(Abb. aus http://www.biophysics.com )

Abb. 3-24: ECIS-Untersuchungen nach Inkubation einer zytotoxischen Saponinkonzentration von 50 µg/ml.

Die deutliche Zunahme der Kapazität (C in nF) innerhalb ca. 100 min (vgl. Abb. 3-25: 1500 min) deutet auf eine Zerstörung der Zellmembran hin. Da sie linear von der Zellspreitung auf der Elektrodenfläche abhängt, ist die Kapazität am besten geeignet, um die Kinetik dieses toxischen Effektes des Saponinum album darzustellen (Xiao et al., 2002).

↓110

ECIS-Gerät

Applied Biophysics, Inc. (http://www.biophysics.com)

Ausgangszellzahl

103 Zellen/Well (im 8-well-Array)

Zelllinie

ECV 304

Kapazität Cm

(40 kHz)/ nF (Cm= membrane capacitance)

Inkubationszeit

0 min-2000 min (online, nicht invasiv)

Sämtliche ECIS-Untersuchungen wurden in Kooperation mit Dr. Joachim Wegener vom Institut für Biochemie der Universität Münster durchgeführt. Ein 8-well-Elektrodenarray ergibt 8 Messreihen. Es sind jeweils die Elektroden 1-4 und 5-8 zusammengruppiert (Abb. 3-25). Von jedem Experiment ist eine Auftragung der Kapazität bei 40 kHz (Abb. 3-25, links) und des Widerstands bei 400 Hz (Abb. 3-25, rechts) dargestellt. Die Kapazität ist hoch bei einer unvollständig bedeckten Elektrode wie z. B. bei nicht ganz gespreiteten Zellen. Ist die Elektrode komplett belegt, ergibt sich eine Kapazität < 10 nF. Die Kapazität der Elektrode ist flächenabhängig und wird in der Einheit µF/cm² angegeben. Sobald eine Zelle auf der Elektrode adhärent ist, steht der von ihr bedeckte Bereich nicht mehr für einen kapazitiven Stromfluss zur Verfügung, folglich verringert sich die gemessene Kapazität um den gleichen Prozentsatz, dem die bedeckte Fläche relativ zur Gesamtfläche entspricht. Wenn z. B. eine Zelle adhäriert ist, nimmt sie in diesem Zustand eine Fläche von 10 % der gesamten Elektrodenfläche ein. Daraus ergibt sich eine gemessene Kapazität von nur noch 90 % einer völlig zellfreien Elektrode. Bei reinen Adhäsionsexperimenten kann man eine sukzessive Abnahme der Kapazität mit zunehmender Ausspreitung der Zellen auf der Oberfläche beobachten. Der Widerstand bei 400 Hz reflektiert etwa die Summe des Widerstandes, der aus dem Zell-Substrat Kontakt resultiert und dem der durch die Ausbildung von Zell-Zell-Kontakten auftritt. Durch einen Vergleich der Kapazität und des Widerstandes kann man den zeitlichen Verlauf dieser Parameter ableiten (Xiao & Luong, 2003). Werden die Membranen wie im vorgestellten Fall durch eine Saponinkonzentration von 50 µg/ml permeabilisert (siehe Abb. 3-24), sind die Zellen keine Isolatorpartikel mehr und der Widerstand bricht zusammen bzw. die hier dargestellte Kapazität nimmt Werte an, wie man sie für eine leere Elektrode findet (Wegener et al., 2000).

Bei einer Impedanzmessung mit einer angelegten Kapazität von 40 kHz sinkt diese annähernd linear mit steigender Zellspreitung auf der Elektrodenoberfläche (Wegener et al., 1996). Die Diagramme im linken Teil der Abbildung 3-25, auf deren Ordinate als Einheit die Kapazität aufgetragen ist, stellen somit die Hemmung der Zellspreitung in Abhängigkeit von der Zeit (min) dar. Wie bereits die Experimente der getriggerten Toxizität gezeigt haben, ist in den ersten 24 h Inkubationszeit keine Proliferationshemmung festzustellen. Nach ca. 25 h zeichnet sich bezüglich der mit Saponin (3.0 µg/ml) und Agrostin (0.1/ 1.0/ 5.0 µg/ml) behandelten Zellen ein Anstieg der Kapazität ab, bei 20 ng/ml Agrostin ist dieser Effekt erst nach 60 h zu verzeichnen. Da erst nach einer Inkubationszeit von 25 h erste Veränderungen zu verzeichnen sind, entspricht dieses Ergebnis einem verzögerten Wirkungsmechanismus der RIPs.

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Im Gegensatz zu Saponinen, die direkt innerhalb weniger Stunden die Zellmembran angreifen, handelt es sich hier um einen indirekten Zytotoxizitätsmechanismus, der entsprechend des zeitlichen Verlaufs der Proteinsynthese (G1/ S/ G2-Phase der Zelle; siehe Abschnitt 1.6) verläuft. Der Effekt ist entsprechend dieses Verzögerungseffektes im ECIS-Diagramm erst dann zu sehen, wenn die Zellmembran beschädigt ist und die Zelle die zur Aufrechterhaltung der Zellmembran notwendige Proteinproduktion nicht mehr durchführt. Die ECIS-Untersuchungen belegen hier erstmals online und nicht-invasiv, dass der vorgestellte toxische Mechanismus in einem indirekten Angriff der Zelle besteht und kooperativ, also nur bei gleichzeitiger Saponininkubation in subtoxischen Dosen abläuft. Die Saponinkontrolle (3 µg/ml) zeigt über den gesamten Messverlauf keine Veränderung der Kapazität, demzufolge ist mit dieser Methode nachgewiesen worden, dass bei der Saponinkonzentration von 3 µg/ml keine Membrantoxizität besteht (siehe Abb. 3-25).

Abb. 3-25: Zeitliche Entwicklung a) der Kapazität Cm (40 kHz)/ nF, die in Abhängigkeit von der Inkubationszeit die Spreitung des Zellmonolayers darstellt (links). und b) des Widerstands Rb (400 Hz)/ kΩ, der ein Maß für die Eigenschaft des gesamten Monolayers als Barriere ist.

Diese Eigenschaften können von den Impedanzspektren eines intakten, konfluenten Zellmonolayers abgeleitet werden.

ECIS-Gerät

Applied Biophysics, Inc. (http://www.biophysics.com)

Ausgangszellzahl

103 Zellen/Well (im 8-well-Array)

Zelllinie

ECV 304

Widerstand (Rb)

(400 Hz)/ kΩ (Rb=barrier resistance)

Kapazität Cm

(40 kHz)/ nF (Cm=membrane capacitance)

Inkubationszeit

0 min-4000 min (online, nichtinvasiv)

Diese Eigenschaften können von den Impedanzspektren eines intakten, konfluenten Zellmonolayers abgeleitet werden.

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Die von uns ermittelte Zytotoxizität für RIPs des Typs 1 (IC50[Saponin und Agrostin]: 5.7 ± 1.7 ng/ml; siehe Tab. 3-5) liegt in der Größenordnung des zellfreien Systems (IC50 < 18 ng/ml; Stirpe et al., 1983). Dies lässt den Rückschluss zu, dass es sich beim Wirkungsmechanismus tatsächlich um den enzymatischen Prozess eines Ribosomen- inaktivierenden Proteins handelt und dass das Saponin die Funktion eines Haptomers bzw. einer zielzellbindenden Domäne wie der B-Kette des Ricins übernimmt (siehe Abb. 1-1). In diesem Zusammenhang ist es erwähnenswert, dass in der Literatur belegt wird, dass Lectine mit verzweigten Kohlehydratketten eine stärkere Zelladhäsionsfähigkeit/ Zytotoxizität besitzen- Saponine mit verzweigter Kohlehydratkette, insbesondere am C3 des Aglykons weisen ebenfalls eine stärkere Aktivität auf (siehe Abb. 3-11).

Die Kinetik der in Abb. 3-24 und 3-25 dargestellten Abhängigkeit der Inkubationsdauer mit der Proliferationshemmung bestätigt diese Hypothese. Der zeitliche Ablauf der Wachstumshemmung und die Lokalisation des fluoreszenzmarkierten Agrostins in der perinukleären Region des Endoplasmatischen Retikulums entsprechen der Hypothese einer ribosomalen Proteinsynthesehemmung, die in einem Zyklus von 24 h abläuft (siehe Abschnitt 1.4). Diese Kinetik konnte besonders gut durch die ECIS- Methode dargestellt werden, da hier die Kapazität [C] und der Widerstand [R] in direkter Abhängigkeit zur Zellproliferation stehen (Xiao & Luong, 2003) und bei einer toxischen Saponinkonzentration nach ca. 100 min Werte annehmen, wie man sie sonst für eine leere Elektrode findet (siehe Abb. 3-24). Der Widerstand und die Kapazität verhalten sich dabei umgekehrt proportional zueinander. Die Toxizitätsentwicklung ist in verschiedene Phasen gegliedert: eine Resorptionsphase, in der die intakte Zelle das Protein endozytotisch aufzunehmen vermag, nach ca. 24 h durch Ribosomenschädigung erste Biosynthese- und Metabolisierungseinschränkungen (siehe Abb. 3-25: eine steigende Kapazität, bzw. Zytotoxizität ist erst nach ca. 25 h sichtbar), die nach ca. 48 h zu mikroskopisch gut erkennbaren morphologischen Veränderungen und nach 72 h (siehe Abb. 3-2, 3-20 und 3-21) zum Absterben der gesamten Zellpopulation führen.


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07.11.2006