4 Schlussfolgerung

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Die dargestellten Untersuchungen zur Manipulierung der Aufnahme des Agrostins in das Zytosol deuteten auf den Mechanismus einer rezeptorvermittelten Endozytose hin. Durch die immunfluoreszenzmikroskopischen Experimente konnte bei gleichzeitiger Saponininkubation endozytotisch aufgenommenes Agrostin bereits nach zwei Stunden Inkubationszeit im Zytosol dargestellt werden. Die ECIS-Untersuchungen zeigten, dass es sich nicht, wie es z. B. bei Saponinen der Fall ist, um einen direkten toxischen Effekt handelt, sondern um einen getriggerten Toxizitätsmechanismus, der erst nach ca. 24 h Inkubationszeit auftritt.

Wie bei den Proteinen (Agrostin aus Agrostemmae semen und Saporin aus Saponariae semen, beides Caryophyllaceae) besteht offenbar auch bei den Saponinen (die hier vorgestellten aktiven Saponine wurden ebenfalls aus Caryophyllaceae isoliert) eine Analogie zwischen ihrer chemotaxonomischen Zugehörigkeit und der unterschiedlichen Wirksamkeit. Dies führte zu einer synergistischen Toxizität einer Kombination dieser Substanzen. Erstmals wurde ein stärkerer zytotoxischer Effekt der Kombination von Saporin mit Gypsophilasaponin im Vergleich zu reinem Diphtheriatoxin beobachtet (Heisler et al., 2004).

Die Kenntnis des Transportschrittes durch die Zellmembran ist für eine Verwendung der RIPs z.B. zur Therapie von Tumoren von entscheidender Bedeutung (Kreitman & Pastan, 1998). Nach Operation, Strahlen- und oftmals mehrfacher Hochdosis-Chemotherapie besteht eine direkte Beziehung zwischen der Anzahl immer noch überlebender Tumorzellen und der Überlebensrate von Tumorpatienten. Eine Verlängerung der Überlebenszeit kann heute durch eine Chemotherapie nur etwa zur Hälfte erreicht werden. Demzufolge stellen Tumorzellen, die durch eine lokale Behandlung nicht vollständig entfernt werden können, ein erhebliches Problem in der Tumortherapie dar. Diese Zellen können durch eine Immuntherapie zerstört werden, z. B. auch durch sogenannte Immunotoxine: Immunotoxine sind komplexe Makro-moleküle mit 2 unterschiedlichen Komponenten (Barbieri et al., 2000).

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Eine Komponente dient der Bindung an die Zielzelle. Dies wird zumeist durch monoklonale Antikörper, Zytokine oder lösliche Rezeptormoleküle erreicht. Die andere Komponente enthält das Toxin, das die Tumorzelle zerstören soll. Wünschenswert ist, dass das Immunotoxin von der Tumorzelle aufgenommen, anschließend die Toxinkomponente intrazellulär freigesetzt wird und nicht in die Blutbahn dissoziiert. Monoklonale Antikörper gegen zelluläre Oberflächenantigene stellen die am häufigsten verwendeten Bindungsstrukturen zur Herstellung von Immunotoxinen dar. Da noch keine ausschließlich tumorspezifischen Antigene beschrieben sind, werden die Zielstrukturen auch auf normalen menschlichen Geweben exprimiert. Daher ist der Ausschluss von Kreuzreaktivitäten mit lebenswichtigen menschlichen Organen eine der wichtigsten Voraussetzungen bei der Entwicklung neuer Immunotoxine. Insbesondere Antigene auf soliden Tumorzellen sind häufig auf anderen menschlichen Zellen vorhanden, so dass sich der Schwerpunkt der Immunotoxinforschung bisher auf Leukämien und Lymphome konzentrierte, da bei diesen Erkrankungen zur Zeit spezifischere Liganden zur Verfügung stehen. Wird ein Zytokin, ein löslicher Rezeptor oder ein Antikörperfragment gegen einen löslichen Rezeptor als Bindungsstruktur verwendet, muss berücksichtigt werden, dass die löslichen komplementären Moleküle des Patienten die Aktivität des Immunotoxins kompetitiv inhibieren und daraus reduzierte in vivo-Effekte resultieren können.

Mit der Entwicklung neuer, vor allem molekularbiologischer Methoden gewannen in den letzten Jahren rekombinante Fusionsproteine an Bedeutung (Heisler et al., 2003). Dadurch können die Proteotoxine modifiziert werden und als Liganden neben natürlichen Proteinen wie Interleukin 2, Transferrin (Ippoliti et al., 1995) und vollständigen Antikörpern auch Antikörperfragmente (Fab, Fv) eingesetzt werden (Keller & Fuchs, 2002).

Bei toxikologischen Untersuchungen unterschiedlicher Toxinkonjugate wurde eine synergistische Wirkung bei der Kombination verschiedener Komponenten festgestellt, bei dem die eingesetzten Toxine im Zytosol offensichtlich bisher unbekannte Wege beschreiten (Ippoliti et al., 1998). Mittlerweile hat bereits ein Fusionsprotein, OntakTM, die Zulassung erhalten, andere werden bereits in klinischen Studien Phase III getestet. Trotz dieser positiven Entwicklung existieren noch immer Probleme, z.B. die unspezifische Wirkung bzw. Schädigung normal differenzierter Zellen und eine nicht ausreichend effiziente Aufnahme der Fusionsproteine in die Zielzelle.

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Beide Probleme könnten nun durch ein neues Verfahren gelöst werden: eine Kombinationstherapie, bei der Ligand-tragende Wirkstoffe wie Immunotoxine (Typ 1 RIP Saporin-3, epidermal growth factor (EGF) und ein molekularer Adapter in Kombination mit Triterpensaponinen (Gypsophilasaponin) verabreicht werden. Agrostin und das strukturver-wandte Saporin, ebenfalls ein RIP vom Typ I aus den Samen einer Caryophyllacee (Saponaria officinalis L.; Stirpe et al., 1983), zeigten im dargestellten Beispiel den gleichen Synergismus.

Die Ergebnisse der Untersuchungen mit Saporin führten im Frühjahr 2004 zu weitergehenden in vitro-Experimenten mit rekombinant hergestelltem his-Saporin 3 gekoppeltem Immuno-adaptertoxin in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Dr. Fuchs an der Charité. Im Vordergrund dieser Untersuchungen stand die Überlegung, eine Anwendbarkeit der Saponine als Enhancer für Immunotoxine in der Krebstherapie zu überprüfen, da diese häufig mit Typ I-RIPs wie Saporin oder der enzymatisch aktiven A-Kette des Ricins (RTA) gekoppelt werden (Barbieri et al., 2000). Das große Potential von Saponinen als Kombinations-therapeutika, im hier dargestellten Fall mit tumortherapeutischen Fusionsproteinen, wird durch in vitro-Untersuchungen belegt, die zu einem Synergismus von Saponinen mit auf Saporin basierenden Immunotoxinen führten (Heisler et al., 2004).

Durch ein 2004 patentiertes Verfahren, einer Kombination von Gypsophilasaponin mit auf Saporin (RIP I) basierenden Immunoadaptertoxinen, ist in vitro eine Wirkungsverstärkung um vier Zehnerpotenzen realisiert worden, was eine erhebliche Dosisverringerung bei gleicher Wirksamkeit und vermindertem Nebenwirkungsspektrum gewährleistet.

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Es wird die Aufgabe weiterer Untersuchungen sein, den Transportmechanismus des Toxins in die Zelle zu beschreiben, sowie die Struktur des Agrostins aufzuklären, um die Wechselwirkungen mit bestimmten Strukturmerkmalen von Saponinen und die Affinität zu Oberflächenrezeptoren der Zielzelle besser erklären zu können.


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07.11.2006