2 Material und Methoden

2.1  Patienten MF / SPP

38

Es wurden Haut- und Blutproben von zwei Patientengruppen als Untersuchungsmaterial verwendet:

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Gruppe 1: Zwischen 1997 und 2001 wurden von MF-Patienten aus der Dermatologischen Klinik der Charité, Berlin, Krankheitsverlauf und Therapie dokumentiert; es wurden pro Patient bis zu 18 Blutproben (PBMC) und zeitgleich oder getrennt Hautbioptate entnommen. Einschlusskriterien für die Patienten waren, dass die Diagnose MF histologisch gesichert und klinisch mit großer Wahrscheinlichkeit oder mit Sicherheit gestellt werden konnte und dass die Patienten in der TCR-γ- oder TCR-β-PCR mindestens eine monoklonale Hautprobe aufwiesen. Ausschlusskritierien waren eine gleichzeitige Erkrankung an angioimmunoblastischer Lymphadenopathie oder anderen lymphoproliferativen Erkrankungen, außerdem waren posttransplantäre und immundefiziente Patienten ausgeschlossen.

Gruppe 2: Zwischen 1996 und 1999 wurden bei Erstdiagnose zeitgleich von 14 SPP-Patienten Hautbioptate und Blutproben entnommen, Krankheitsverlauf und Therapie wurden dokumentiert. Einschlusskriterien waren, dass die Patienten sowohl histologisch als auch klinisch die Diagnosekriterien für eine Small Plaque Psoriasis erfüllten. Diagnosekriterien für SPP waren das Auftreten ovaler, leicht schuppiger und atrophischer Flecken mit grosser Monomorphie und mit einem Durchmesser von weniger als 5 cm am lateralen Oberkörper oder auf den Innenseiten von Armen und Beinen zusammen mit dem histologischen Nachweis bandartiger, lymphohistiozytärer Infiltrate in der oberen Dermis, epidermaler Spongiose, einer geringen Anzahl von epidermotropen Zellen und die Abwesenheit von Pautrier´schen Mikroabszessen und atypischen Zellen. Die Ausschlusskriterien waren mit Gruppe 1 identisch.

Als Negativkontrolle wurden PBMC von gesunden Probanden, als Positivkontrolle Zellen aus der monoklonalen Jurkat-Zelllinie verwendet.

2.2  Material

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2.2.1  Chemikalien

2.2.2 Software

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2.3 Genotypisierung

2.3.1  DNA-Isolation

Von in Paraffin konserviertem Gewebe (Hautbioptat) wurden 10 Schnitte (zu jeweils 10 µm) angefertigt. Mittels zweimaligen Waschens in 1 ml Xylol, gefolgt von 1 ml Ethanol (96%ig) wurden die Biopate deparaffinisiert. Nach Trocknen im Vakuum wurde die DNA wie unten beschrieben isoliert.

Aus 20 ml heparinisiertem Blut wurden PBMC mittels Zentrifugation (20 min bei 2400 U/min) durch einen Ficoll-Gradienten gewonnen. Nach der Reinigung der abgetrennten Zellen durch zweimalige Zentrifugation (10 min, 1800 U/min) in PBS und Verwerfen des Überstands wurde das Zellsediment in 200 µl PBS gelöst und der DNA-Präparation zugeführt.

42

Die als klonale Positivkontrolle verwendeten Zellen aus der Jurkat-Zelllinie wurden abzentrifugiert und durch zweimalige Zentrifugation (10 min, 1800 U/min) in PBS gereinigt. Nach Bestimmen der Zellzahl in einer Zählkammer wurden 107 Zellen wie unten beschrieben weiterverarbeitet.

PBMC der SPP-Patienten wurden einer Auftrennung der T-Zellen nach CD4- bzw. CD8-Zellmarkern mit Hilfe des CD4+ bzw. CD8+ T cell Isolation Kits unterzogen. Nach Suspension in 80µl Puffer/ 107 Zellen wurde die Mischung mit 20µl Hapten-Antikörper-Cocktail für 10 min bei 6-12°C inkubiert und anschliessend zweimal mit Puffer mittels Zentrifugation für eine Minute bei maximaler Geschwindigkeit und Verwerfen des Überstandes gewaschen. Auf die Zugabe von 20µl MACS Anti-Hapten Microbeads folgten eine weitere 15-minütige Inkubation bei 6°C und eine Waschung. Mit 500µl Puffer gemischt wurde die Zellsuspension in die sogenannte LS+/VS+-Säule des Midi-Macs gegeben. Nach Anlage des Magnetfeldes wurden die magnetisch nicht markierten Zellen getrennt und konnten als CD4- bzw. CD8-angereicherte Fraktion gesammelt werden. Nach Extraktion der DNA wurde diese mit den patientenspezifischen Primern der SPP-Patienten nochmals in einer klonspezifischen PCR eingesetzt.

Die aus Blut gewonnenen Zellen (peripheral blood mononuclear cells, PBMC), das deparaffinisierte Gewebe und die gewaschenen Jurkat-Zellen wurden jeweils nach Aufnahme in Extraktionspuffer, unter Zusatz von 40 µg Proteinase K, 16 Stunden bei 55 °C inkubiert. Anschließend erfolgte die Inaktivierung des Enzyms durch thermische Denaturierung (15 min bei 95 °C). 5 µl des Ansatzes, d.h. etwa 250µg DNA, wurden in der PCR eingesetzt.

2.3.2 TCR-β-PCR

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Es wurden zwei PCR-Runden durchgeführt. In der ersten wurde Vb cons mit einer Mischung aus Jb I (2) und Jb II(2), in der zweiten 2 Vol% aus der ersten Runde mit den Primern Vb cons und Jb I(1) und Jb II(1) eingesetzt (Primer s.Tab. 5) (61,67). Die PCR-Bedingungen waren 1 Minute Denaturierung bei 92°C, 40 Sekunden Annealing bei 50°C und 30 Sekunden Extension bei 72°C für 40 Zyklen. Die erste Denaturierung und die letzte Extension wurden auf 5 Minuten ausgedehnt. Die Produktlänge betrug zwischen 240 und 290 Basenpaaren. Im PCR-Ansatz waren die Primer jeweils in einer Konzentration von 0,5 µM, MgCl2 von 2,5 bis 4mM und 2,1 µl eines Stammansatzes enthalten.

2.3.3 TCR-y-PCR

Die TCR-γ-PCR wurde in 3 verschiedenen Reaktionsansätzen durchgeführt. Primerbindungsstellen und Sequenzen (80,106) sind in Tab. 5 dargestellt. Die PCR-Produktlänge betrug ca. 260 Basenpaare:

TCR-γ-1-PCR

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Primer: V g cons und J g cons

In den Reaktionsgemischen (75µl) enthalten waren Promega-PCR-Puffer, in Endkonzentration 4 mM MgCl2 , 200 µM je dNTP, 0,67 µM je Primer, 3 U Taq Polymerase und 5 µl, d.h. 0,2 bis 0,5 µg der isolierten DNA. Initial wurde jedes Gemisch im Thermocycler 5 min bei 95 °C denaturiert, gefolgt von 40 Zyklen mit jeweils 1 min Denaturierung bei 93 °C, 1 min Anlagerung (annealing) bei 58 °C und 1 min Extension bei 72 °C. Abschließend wurde 4 min eine Extension bei 72 °C durchgeführt.

TCR-γ-2-PCR

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Primer: Vg 2, VG 9 und J cons

Hier enthielten die Reaktionsgemische (75 µl) Promega-PCR-Puffer, in der Endkonzentration 2,5 mM MgCl2 , 200 µM je dNTP, 0,5 µM je Primer, 2 U Taq Polymerase und 5 µl DNA.

Die Reaktionsbedingungen waren mit denen der TCR-γ-1-PCR identisch.

46

TCR-γ-3-PCR

Primer: Vg cons, Vg 2, Vg9 und JgP 1/2

Die Reaktionsgemische sowie die PCR-Bedingungen entsprachen der TCR-γ-2-PCR.

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Tab. 5: Primer, Spezifität und Sequenzen (Quelle der Primersequenzen in Klammern)

Primer

Quelle

Spezifität für

Sequenz (5´=> 3`)

Jg P 1/2

(80)

JGP 1 u. JGP 2

CTTGAGCYTAGCCCTT

Jg 12 MM

(80)

JG 1 u. JG 2

TgTTgTTCCACTgCCAAA

Jg cons

(107)

JG 1 u. JG 2

CAACAAgTgTTgTTCCAC

Vg 18 MM

(80)

VG 1-8

GgTCATCWgCTgWAATCAC

Vg 2

(80)

VG 10, 11, A und B

CACTggTACKKgCAgAAAC

Vg 9

(80)

ATTggTATCgAgAgAgAC

Vg cons

(107)

VG 1-8

CTACATCCACTggTACCT

Vg seq

VG 1-8

AGRCCCCACAGCATCTTC

Vg 9T

ggAAAggAATCTggCATTCCg

Vg 10T

CACTggTACCggCAgAAACTCC

Vg 11T

gCTCAAgATTgCTCAggTggg

JbI-1

(61)

WgAgYCIRgTYCCIIIICCAAA

JbI-2

(61)

ACIgWgAgYCIRgTYCC

JbII-1

(61)

TSAgCCKIgTgCCIgSICCgAA

JbII-2

(61)

ACIgTSAgCCKIgTgCC

Vb cons

(67)

TgTAYCTCTgTgCCAgCAg

Vb 1

gCTCCCCTAggTCTggAgACCTCTCT

Vb 10

gAAgAAgAgCTCAAgTTTTTggTTTACTTT

Vb 11

TgATATCACCTCATCCACTATTCCTATggA

Vb 12

gACAgAggATTTCCTCCTCACT

Vb 13

CACTgCggTgTACCCAggATATgA

Vb 14

gggCTCggCTTAAggCAgACCTAC

Vb 15

ggCCTACggTTgATCTATTACTCCTT

Vb 16

TgTgACCCAATTTCTggACATgATAAT

Vb 17

gAACAgAATTTgAACCACgATgCC

Vb 18

AgCCCAATgAAAggACACAgTCAT

Vb 19

ACCCCCgAAAAAggACATACTTTT

Vb 2

CCACATACgAgCAAggCgTCgA

Vb 20

gAgggAACATCAAACCCCAACCTA

Vb 21

gATTCACAgTTgCCTAAggA

Vb 22

gTCCCCATCTCTAATCACTTATACT

Vb 23

TCCAggTCAggACCCCCAgTT

Vb 24

TggTACCAgCAgAAgTCAAgT

Vb 3

TCCAggATATggACCATgAAAATATgTTC

Vb 4

CAACCTggACAgAgCCTgACA

Vb 5

CTgATCAAAACgAgAggACAgCA

Vb 6

CAggTgCTggAgTCTCCCAg

Vb 7

ACCggAgCTCATgTTTgTCTACA

Vb 8

TCTggTACAgACAgACCATgAT

Vb 9

ACCTAAATCTCCAgACAAAgCT

2.3.4 Agarosegelektrophorese

Das Überprüfen einer erfolgreichen Amplifikation erfolgte mit Hilfe eines 2%igen Agarosegels im Agarosegelsystem (Micro Bio Tec Brand). 8 µl des PCR-Produktes wurden nach Zusatz von 2 µl Ladepuffer aufgetragen und in 1 x TBE-Puffer bei 60 V eine Stunde aufgetrennt. Als Produktlängenmarker wurde Hinc III-Lambda-Grössenstandard eingesetzt.

In der Agarose darstellbare PCR-Produkte wurden mittels TGGE analysiert.

2.3.5 TGGE

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7 µl PCR-Produkt und 2 µl Ladepuffer wurden in einer Temperaturgradientenelektrophorese aufgetrennt. Die Separation erfolgte in einem 1 mm starken Polyacrylamidgel mit einem Gradienten von 33 °C bis 55 °C bei 300 V und 2:40 h Laufzeit im TGGE-System von Diagen (86).

Die Gele wurden zweimal je 3 min in 10 % Ethanol und 0,5 % Essigsäure fixiert, danach 10 min mit 0,1%iger Silbernitratlösung gefärbt und 25 min in 1,5 % Natriumhydroxid, 0,01% Natriumborhydrit, 0,15% Formaldehyd entwickelt. Nach 5 min Behandlung in 0,75% Natriumcarbonat konnten sie getrocknet, in Folien konserviert und fotografiert werden. Nach jedem Arbeitsschritt wurden die Gele mit Aqua bidest. gewaschen (86).

2.3.6 Sequenzierung

Von den SPP-Patienten wurden die Blutproben mit monoklonalen TCR-γ-Rearrangements, von den MF-Patienten die diagnostischen Hautbioptate, die ein monoklonales Ergebnis der TCR-γ- oder -β-PCR gezeigt hatten, zur Sequenzierung weiterverarbeitet.

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Zum Vorbereiten der Sequenzierung wurden die monoklonalen Banden aus dem TGGE-Gel ausgeschnitten und das entsprechende Polyacrylamidstück über Nacht in 30 µl 1x-PCR-Puffer inkubiert. Nach kurzem Abzentrifugieren wurden 2 bzw. 4 µl des Überstandes in einer Re-PCR eingesetzt, bei der die Konzentration der Reagenzien und die PCR-Bedingungen mit denen des ersten PCR-Schrittes übereinstimmten.

Rearrangierte TCR-β-DNA wurde mit den Primern Vb cons und JbI-1 und Jb II-1 amplifiziert (61). Bei Proben, die ein monoklonales Ergebnis in der TCR-γ-1-PCR zeigten, wurde Vg seq und Jg cons als Primer eingesetzt, bei Proben mit monoklonalem Ergebnis in TCR-γ-2- bzw. –3-PCR Vg 9T, Vg 10T oder Vg 11T mit Jg cons bzw. Jg P 1/2.

Das oben gewonnene PCR-Produkt wurde mit Hilfe des QIAquick PCR Purification Kits aufgereinigt und 3 – 6 µl davon in einem Reaktionsgemisch aus 5 µl Premix und 1,5 µl von einem der beiden in der Re-PCR verwendeten Primer, 1 : 12 verdünnt, eingesetzt. Mit Aqua dest. wurde auf 20 µl aufgefüllt. Initial wurde jedes Gemisch 30 s bei 96 C denaturiert, gefolgt von 25  Zyklen mit jeweils 30 s Denaturierung bei 96 C, 15 s Anlagerung bei 50 C und 4 minExtension bei 60 C.

50

Nachdem die mit 2 µl 3M Na-Acetat und 50 µl 95 %igen Ethanol gemischte Probe 10 min auf Eis inkubiert und 20 min zentrifugiert worden war, wurde das Pellet mit 250 µl 70%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und nach Zugabe von 4 µl einer Mischung aus Formamid, EDTA und Dextran-Blau im Verhältnis 5:1:1 zwei Minuten bei 90°C denaturiert.

Die Probe wurde auf einem 4,75 %igen Polyacrylamidgel in 1 x TBE bei 1 500 V im 373-A ABI DNA-Sequenzer nach der Taq Cycle-Sequencing-Methode mit Hilfe der „Data Collection“-Software gescannt.

Mittels Abgleichs der gewonnenen TCR-γ- und -β-Gensequenzen mit der EMBO- und NCBI-Datenbank (82) wurden die patientenspezifischen N-Sequenzen bestimmt.

2.4 Klonspezifische PCR

2.4.1  Entwicklung eines N-spezifischen Primers

51

Der Primer wurde so entworfen, dass das 3`-Ende des Primers spezifisch an der N-Sequenz binden sollte.

Die Entwicklung der Primer erfolgte mit Hilfe des Programms OLIGO 5.0 Primer Analysis Software.

Die für die einzelnen Analysen notwendigen Parameter wurden gemäss den in OLIGO 5.0 für eine hochstringente Primersuche festgelegten Parametern gewählt. Das 3´-Ende umfasste dabei die letzten 5 Basenpaare:

52

Desweiteren wurde die Schmelztemperatur der einzelnen Oligonukleotide berechnet und verglichen. Grundlage hierfür waren die Verfahren nach Breslauer (20) ( 2(A+T)°+4(G+C))°-Methode und Wetmur (111) (Nearest-Neighbor-Method). Als maximale Differenz der Schmelztemperaturen wurden 10°C festgelegt. Bei Unterschieden der mit den beiden Verfahren berechneten Differenzen wurde für dieBewertung das Ergebnis nach der Nearest-Neighbor-Method zugrunde gelegt.

2.4.2 Optimierung der Bedingungen der klonspezifischen PCR

53

Als Negativkontrollen wurden von je 4 mono- bzw. polyklonalen PBMC-Proben anderer Patienten, als Positivkontrolle 5µl der klonalen Patienten-DNA aus der PCR, in der das monoklonale Rearrangement gezeigt werden konnte, eingesetzt und das Produkt, wie oben beschrieben, auf einem 2 %igen Agarosegel aufgetrennt.

Dabei wurden sukzessive die Schmelztemperatur erhöht und die dNTP- und MgCl2 –Konzentrationen reduziert, bis

  1. das PCR-Produkt in der zu erwartenden Größe nur in der den Klon enthaltenden Patienten-DNA amplifiziert wurde und
  2. im Agarosegel mit der Patienten-DNA als Template keine unspezifischen Produkte mehr erkennbar waren.

54

Die so gefundenen PCR-Bedingungen wurden in der klonspezifischen PCR beibehalten.

Von SPP-Patienten wurden 5µl aus Haut- und Blutproben gewonnener DNA mit den N-spezifischen Primern in einer klonspezifischen PCR eingesetzt und mit Hilfe eines 2%igen Agarosegels aufgetrennt. Aus den mit Hautproben von SPP-Patienten durchgeführten Reaktionen wurden 2µl des PCR-Produkts in einer klonspezifischen Re-PCR mit Vseq und dem klonspezifischen Primer eingesetzt und in einem Agarosegel getrennt.

2.5 Quantifizierung mittels SYBR-Green

Vor Einsatz im LightCycler wurde die DNA mit Hilfe des High Pure PCR Template Preparation Kit nochmals gereinigt. Die DNA wurde danach in 200µl Elutionspuffer gelöst.

55

Zum Herstellen eines klonspezifischen Standards wurden jeweils 5 µl, d.h. 250µg DNA aus der diagnostischen Hautprobe in einer klonspezifischen PCR eingesetzt. Nach Auftrennen der PCR-Produkte in einem 2%igen Agarosegel wurde die monoklonale Bande ausgeschnitten und mittels High Pure PCR Product Purification Kit aufgereinigt. Zur Quantifizierung wurden verschiedene Mengen des gereinigten PCR-Produktes und des Markers Hinc III Lambda auf einem 2 %igen Agarosegel aufgetrennt. Unter Zuhilfenahme der Software Wincam Version 2.2 konnte bei bekannter Markerkonzentration auf die Konzentration des Standards geschlossen werden.

PCR im LightCycler

Die im LightCycler eingesetzten Reaktionsgemische (20 µl) enthielten 1x Puffermischung aus SYBR Green I-Farbstoff und Hot-Start-Taq-Polymerase, 4 mM MgCl2, je 0,5 µM der Primer Vg cons und Jg cons und 2 µl DNA.

56

In der Einstell-PCR wurde die Konzentration der TCR-γ I-Rearrangements ermittelt und alle Proben auf den gleichen Wert eingestellt. Als Standard wurde eine 10er-Verdünnungsreihe aus DNA der Jurkat-Zelllinie, wie unter Kapitel 2.3.1 beschrieben gewonnen, eingesetzt. Einer Denaturierung über 10 min bei 95 °C schlossen sich 40 Zyklen mit je 5 Sekunden bei 58°C und 15 Sekunden bei 72°C an, der Fluoreszenzmesspunkt lag bei 79 °C. Zur Schmelzkurvenanalyse wurde während des Erwärmens von der Annealingtemperatur auf 95 °C in Temperaturunterschieden von 0,2 °C gemessen.

In der klonspezifischen PCR wurde die Konzentration der klonalen T-Zell-Rearrangements mittels eines, wie oben beschrieben, hergestellten klonspezifischen Standards bestimmt. Die Reaktionsbedingungen glichen denen der Einstell-PCR, es wurden 0,67 µM der klonspezifischen Primer und die im ersten Schritt bestimmte Menge an DNA eingesetzt. Als Annealingtemperatur und MgCl2-Konzentration wurden die für den klonspezifischen Primer spezifische Temperatur bzw. Konzentration gewählt. Alle Proben wurden doppelt bestimmt.

Auswertung der LightCycler-Daten

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Bei der Auswertung der LightCycler-Daten wurden mittels der second derivate maximum-Methode die Konzentrationen der Ziel-DNA bestimmt. Als Standardkurve wurden 5 Verdünnungsstufen einer 10er-Verdünnungsreihe eingesetzt.

Die für die einzelnen Analysen notwendigen Parameter wurden gemäss den in der LightCycler-Software für eine akkurate Analyse mit externem Standard festgelegt:

2.6 Spezifitätsprüfung

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Zur Überprüfung der Spezifität der klonspezifischen Primer wurde von zwei Patienten Produkt aus der TCR-γ-1-PCR mit Hilfe des „TOPO TA Cloning-Kits“ der Firma Invitrogen kloniert. Dadurch entstand sowohl DNA mit der klonalen Zielsequenz beider Patienten als auch mit davon unterschiedlicher Sequenz aus polyklonalen T-Zellen.

Die Isolation der Plasmid-DNA wurde mit Hilfe des „QIAprep Spin Plasmid Kits“ durchgeführt.

Zur Überprüfung des Ergebnisses der klonspezifischen PCR wurde die Plasmid-DNA in zwei Fraktionen aliquotiert. Ein Teil der Plasmid-DNA wurde, wie oben beschrieben, sequenziert, ein anderer in einer klonspezifischen PCR eingesetzt. Die Ergebnisse der Sequenzierung und klonspezifischen PCR wurden miteinander verglichen. Wurden sowohl in der klonspezifischen PCR als auch in der Sequenzierung die Zielsequenz nachgewiesen, wurde dies als richtig-positiv gewertet. Ein Nachweis der Ziel-DNA mittels klonspezifischer Primer trotz in der Sequenzierung nachgewiesener Verschiedenheit von der Zielsequenz wurde als falsch-positiv gewertet. Der fehlende Nachweis mittels klonspezifischer PCR trotz in der Sequenzierung nachgewiesener Zielsequenz wurde dagegen als falsch-negativ eingeordnet.

2.7 Korrelation zur Klinik

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Mittels der Daten aus der Quantifizierung wurde der prozentuale Anteil der klonalen Zellen an der Gesamtheit der T-Zellen errechnet und im zeitlichen Verlauf dargestellt. Aus den Aufzeichnungen des Krankheitsverlaufs wurden der Hautbefund und der Zeitpunkt der Probenentnahmen ermittelt. Ausserdem wurden das Vorliegen von Lymphadenopathie sowie radiologische und sonographische Befunde und die angewandte Therapie aufgezeichnet und zeitlich mit den quantitativen Daten in Bezug gesetzt.


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08.11.2006