4 Diskussion

4.1  Methodendiskussion

4.1.1  Validität der Ergebnisse der PCR mit Konsensusprimern und Auftrennung mittels TGGE

78

Die Klonalitätsdiagnostik mittels PCR spielt in der Diagnostik von CTCL-Erkrankungen zusammen mit Histologie und Klinik eine entscheidende Rolle. Wir haben Haut- bzw. Blutproben von MF- und SPP-Patienten mittels PCR und TGGE analysiert und die monoklonalen Rearrangements sequenziert.

Die Keimbahnsequenz der T-Zell-Rezeptoren umfasst 4 TCR-Ketten. Die Verwendung von für die α-Kette spezifischen Primern wäre wegen der Notwendigkeit zahlreicher PCR-Ansätze sehr aufwendig, die Verwendung von für das TCR-δ-Gen spezifischen Primern nicht möglich gewesen, da dieses während des Rearrangements der α-Gens herausgeschnitten wird (27).

Die TCR-γ-Kette dagegen besteht aus 14 V-Segmenten und 5 J-Segmenten. Die Subfamilie I (Vγ1-8) zeigt eine ausgeprägte Sequenzhomologie. Da bei einem Grossteil der MF-Patienten die T-Zellen ein klonales Rearrangement der VγI- und Jγ1/2-Segmente aufweisen, wählten wir zur PCR-Analyse die von Volkenandt et al. (107) für Vγ1-8 und Jγ 1/2 entworfenen Konsensusprimer aus, womit 60 bis 80% der TCR-γ-Rearrangements erfasst werden. Bei polyklonalem Ergebnis wurden die Proben mittels der von Muche et al. (79) entworfenen Primer für die Segmente Vγ 9-11 und Jγ P1/2 untersucht.

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War die Entwicklung eines klonspezifischen Primers mittels TCR-γ-PCR nicht möglich, wurden die Hautproben der MF-Patienten auch mittels TCR-β-Primern untersucht. Die TCR-β-Sequenz besteht aus 65 V–Segmenten mit 30 Subfamilien. Die von Kneba et al. (61) entwickelten degenerierten Vβ- Primer sind spezifisch für einen Genort mit einer Sequenzhomologie der Vβ-Kette von 88-100%.

Die PCR-Produkte wurden mit Hilfe der TGGE längen- und sequenzabhängig aufgetrennt.

Um falsch-positive Ergebnisse durch Kontamination auszuschliessen, wurden die von uns gefundenen Sequenzen mit Sequenzen anderer Patienten und von Positivkontrollen in unserer Datenbank verglichen.

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Der sampling error beschreibt die Tatsache, dass bei niedriger Menge an Ziel-DNA für einen Primer die Wahrscheinlichkeit wächst, dass einzelne, expandierte Rearrangements überrepräsentiert werden und zu einem falsch-positivem Ergebnis führen (71). Dies könnte eine Rolle spielen bei den für Vγ9-11 spezifischen Primern, die insgesamt nur an 20-40% der Rearrangements spezifisch binden. Auch bei der TCR-β-PCR wäre dies neben der Gefahr der Bildung unspezifischer PCR-Produkte aufgrund von zahlreichen Mismatches möglich.

Zur Erhöhung der Spezifität wurde deshalb die Identität der ermittelten V-Segmente mittels Sequenzierung überprüft.

Bei der hier verwendeten TCR-γ-PCR in Kombination mit der TGGE konnte eine Sensitivität von 0,1 – 1% in 106 polyklonalen Zellen gefunden werden (69).

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Neben Patienten mit CTCL wurde auch in Hautproben von Patienten mit benignen Dermatosen ein monoklonales Amplifikat gefunden (31). Im Blut wurden klonale Zellen neben Lymphompatienten auch bei Personen mit Autoimmunerkrankungen, anderen Hautkrebsarten (74) und mit erworbenen oder angeborenen CD4-Lymphozytopenien nachgewiesen (11,101). Eine Erkrankung der von uns untersuchten Patienten an einer der oben genannten Entitäten wurde durch histologische und klinische Untersuchung ausgeschlossen. Trotzdem zeigt dies, dass der Nachweis von Monoklonalität nicht zwingend das Vorhandensein neoplastischer Zellen bedeutet. Umgekehrt stellt sich die Frage, ob die maligne entarteten Zellen bei CTCL klonal proliferieren. Einen Hinweis gibt der Nachweis oligo- und später monoklonaler Zellen während der Entwicklung eines CTCL (55,72). Des Weiteren konnten bei klonalen Zellen klonale, chromosomale Aberrationen gesehen werden (78), was die Tatsache untermauert, dass die malignen Zellen klonal wachsen.

4.1.2  Validität der quantitativen PCR

4.1.2.1 Sensitivität und Spezifität der klonspezifischen PCR

Klonspezifische Primer wurden zuerst bei Patienten mit T-ALL zum Nachweis der minimal residual disease von Tycko et al. (103) entwickelt. Die Methode wurde später von Volkenandt et al. (106) zum Nachweis klonaler Zellen bei CTCL-Patienten übernommen.

Durch Bindung der Primer an unspezifische Bindungsstellen und die Bildung von Primer-Dimern und Haarnadelstrukturen können unspezifische PCR-Produkte entstehen.

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Mit Hilfe der OLIGO-Software wurden die Primer so entworfen, dass deren 3´-Ende an die N-Sequenz binden konnte, aber keine Primer-Dimer, Haarnadelstrukturen oder unspezifische Bindungen mit Beteiligung des 3´-Endes gebildet wurden. War dies aufgrund der Kürze der N-Sequenz nicht möglich, wurde mittels Veränderung von MgCl2-Konzentration und Annealingtemperatur versucht, die Bildung unspezifischer Produkte zu verhindern.

In den in der Literatur existierenden Studien zur Anwendung klonspezifischer TCR-γ-Primer (105,107) zeigte sich, dass die Spezifität häufig nicht ausreichend hoch ist. Als Ursache werden die zu geringe Länge der N-Sequenz der TCR-γ-Kette und die Interferenz mit dem polyklonalen Hintergrund aufgrund der hohen Sequenzhomologie der V- und –J-Segmente genannt (34,105,107). Auch uns war aufgrund der geringen Länge der N-Sequenz nur bei wenigen Patienten die Entwicklung eines klonspezifischen TCR-γ-Primers möglich.

Wir haben 50 TCR-γ-Sequenzen bestimmt, bei denen wir eine mittlere Länge der N-Sequenz von 6,4 Bp fanden. Aufgrund einer Länge von 0-2 Basenpaaren wurde bei 11 Sequenzen auf die Entwicklung eines klonspezifischen Primers verzichtet.

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Für 24 der übrigen Sequenzen war die Entwicklung eines spezifischen Primers nicht möglich. Dabei war für 5 Sequenzen die Entwicklung eines klonspezifischen Primers wegen Schmelztemperaturunterschieden grösser 10°C zwischen diesem und dem V-Primer, für 3 wegen der Bildung von Primer-Dimern mit zu hoher Stabilität und für eine Sequenz wegen falscher Bindungsstellen des klonspezifischen Primers unmöglich. 7 Sequenzen, für die die Entwicklung eines klonspezifischen Primers nicht gelang, hatten eine N-Sequenz-Länge von 3 bis 5 Basenpaaren. Die minimale Länge der N-Sequenz, für die ein Primer entwickelt werden konnte, betrug 5 Basenpaare. Die Studien von Volkenandt und Tycko (103,107) nennen mit 6 Basenpaaren ähnliche Zahlen, Nakao et al. (81) berichten dagegen von N-Sequenzen mit einer Länge von 3 Bp, für die klonspezifische Primer entworfen wurden, was hier nicht nachvollziehbar war.

Vergleicht man die Sequenzen, für die die Entwicklung eines klonspezifischen Primers möglich war, mit den übrigen, fällt ein Unterschied der mittleren Länge der N-Sequenz von 11,2 gegenüber 6,5 Basenpaaren auf. Für die Spezifität der Primerbindung ist eine Häufung von Adenosin und Thymin am 3´-Ende des Primers vorteilhaft. Betrachtet man den GC-Anteil der N-Sequenzen, war der Wert der Sequenzen mit klonspezifischem Primer sogar höher als bei den übrigen. Aufgrund der Kürze der N-Sequenz war jedoch die Entwicklung eines Primers mit einem hohen AT-Anteil am 3´-Ende und GC-Anteil am 5´-Ende nicht immer möglich. Die von uns entworfenen TCR-γ-Primer besassen am 3´-Ende einen AT-Anteil von durchschnittlich 60%, die TCR-β-Primer von 37%. Je länger die N-Sequenz ist, umso eher ist also die Entwicklung eines klonspezifischen Primers mit einer Häufung von Adenosin und Thymin am 3´-Ende möglich.

Bei den MF-Patienten war aufgrund einer mittleren N-Sequenzlänge von 6,4 Bp nur für 15 TCR-γ-Sequenzen die Entwicklung eines klonspezifischen Primers möglich. Für die SPP-Patienten konnte dagegen aufgrund einer durchschnittlich längeren N-Sequenz von 10,2 Bp für 6 von 9 TCR-γ-Sequenzen ein patientenspezifischer Primer entworfen werden.

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Eine Alternative zu den TCR-γ-Primern bildete die Entwicklung klonspezifischer Primer für die TCR-β-Sequenz. Aufgrund der durchschnittlichen Länge der N-Sequenz von 14 Basenpaaren war für 5 von 7 TCR-β-Sequenzen das Design eines Primers möglich. Einen Nachteil gegenüber der TCR-γ-PCR stellt die Notwendigkeit der Durchführung einer nested PCR im Rahmen der TCR-β-PCR mit Konsensusprimern vor Sequenzierung dar. Ein weiteres Problem zeigte sich bei der TCR-β-PCR von Hautproben. Aufgrund der geringen Spezifität der TCR-β-Primer ist dazu der Einsatz von DNA hoher Qualität notwendig, deren Gewinnung aus Paraffinschnitten schwierig ist.

Die klonspezifischen Primer wurden mittels Amplifikation polyklonaler Proben anderer Patienten getestet. Die PCR-Bedingungen wurden schrittweise so verändert, bis nur in der monoklonalen Probe ein PCR-Produkt in der erwarteten Länge sichtbar blieb.

Zur Prüfung der Spezifität wurde von den Patienten BÄ und ZO PCR-Produkt kloniert. Die dadurch gewonnene DNA jedes Klons wurde in zwei Fraktionen aliquotiert. Eine Fraktion wurde in einer klonspezifischen PCR mit dem für Patient ZO klonspezifischen Primer Zl1 eingesetzt, das Ergebnis wurde mittels Sequenzierung der anderen Fraktion überprüft (s. Tab. 9). In 18/20, d.h. 90 % der Fälle, stimmten die Ergebnisse der klonspezifischen PCR mit den aufgrund der Sequenzierung erwarteten Rearrangements überein. 2/20 Ergebnisse waren falsch positiv. Eine Erklärung dafür könnte eine Kontamination mit dem klonalen Rearrangement aus der ZO-Probe oder die Entstehung eines unspezifischen Produktes aufgrund der hohen Sequenzhomologie der TCR-γ-Sequenz sein. Dies bedeutet, dass mit den klonspezifischen Primern zwar falsch-positive aber keine falsch-negativen Ergebnisse bis zum Sensitivitätslimit der Primer zu erwarten sind.

85

Durch Einsatz von DNA aus einer Verdünnungsreihe von Jurkat-Zellen in PBMC eines gesunden Probanden wurde die Sensitivität der klonspezifischen PCR untersucht. Mit Hilfe des klonspezifischen Primers Ju3 war die Detektion von 10 Kopien des gesuchten Rearrangements vor einem Hintergrund von 106 polyklonalen Rearrangements möglich. Tycko et al. (103) fanden eine Sensitivität von 1 monoklonaler Zelle in 105 bis 106 polyklonalen Zellen verdünnt, womit die von uns gefundene Nachweisgrenze im Bereich der in der Literatur angegebenen Sensitivitäten liegt. Eine Untersuchung klonspezifischer Primer mit Hilfe der TaqMan-Probe durch van der Velden et al. (105) zeigte, dass die Sensitivität der Primer nicht vom verwendeten Vγ-Segment, sondern von der Länge der N-Sequenz und der Zahl der deletierten Nukleotide und damit auch von der Spezifität des Primers abhängt.

Eine praktische Begrenzung der Sensitivitätsprüfung liegt darin, dass in einem PCR-Ansatz die DNA von maximal 105 Zellen, d.h. ca. 0,4 bis 0,5 µg DNA eingesetzt werden kann. Soll eine monoklonale Zelle in 106 polyklonalen Zellen nachgewiesen werden, wäre pro zehn Ansätzen höchstens eine Zelle im PCR-Ansatz. Da die Anwesenheit geringer Kopienzahlen einer Poisson-Verteilung unterliegt, beträgt nach Berechnungen Wangs et al. (109) ausserdem die Wahrscheinlichkeit nur 36,8%, dass die DNA von einer Zelle in dem Ansatz vorhanden ist. Es müssten also mindestens 30 PCR-Ansätze angefertigt werden, um die Anwesenheit einer klonalen Zelle im PCR-Ansatz sicherzustellen. Hinzu kommen Fehlermöglichkeiten bei der Erstellung einer Verdünnungsreihe. Die ermittelte Sensitivität war also auch aus technischen Gründen limitiert.

4.1.3 Validität der quantitativen PCR

Von MF-Patienten, für deren klonales Rearrangement ein klonspezifischer Primer entwickelt werden konnte und von denen mehr als 5 Blutproben vorhanden waren, wurde die Frequenz der klonalen Rearrangements im Blut im Verlauf mittels LightCycler untersucht. Zur Quantifizierung wurde der an doppelsträngige DNA bindende Farbstoff SYBR-Green I verwendet.

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Nach Einstellen aller Blutproben auf die gleiche Menge pro µl DNA eingesetzte T-Zellrearrangements, wurde der Anteil der klonalen DNA mittels klonspezifischer Primer bestimmt.

In der ersten PCR-Runde wurden die Primer Vcons und Jcons verwendet, die an Rearrangements der VγI- und Jγ1/2-Familien spezifisch binden. Durch die Amplifikation von 60-80% der Rearrangements konnte damit der maximale Anteil der T-Zellrearrangements erfasst werden. Da es um die Bestimmung der Grössenordnung im Zehnerpotenzbereich ging, erschienen uns die 20-40% nicht detektierten Rearrangements vernachlässigbar. Einen Sonderfall stellt der Patient FI dar, dessen klonales T-Zellrearrangement nicht Jγ1/2, sondern JγP2 beinhaltet. Die Annahme, dass 60-80% aller T-Zellen VγI/Jγ1/2 rearrangieren, ist nur richtig, solange die Menge VγI-Jγ1/2 rearrangierender Zellen viel grösser als die Zahl der klonalen Zellen ist. Bei diesem Patienten betrug der Anteil der klonalen Rearrangements maximal 9%, d.h. die Zahl der klonalen Zellen hat die Gesamtzahl der T-Zellen nur um maximal 9% erhöht, was uns vernachlässigbar erschien.

4.1.3.1 Wahl der Quanitifizierungsmethode

Der Verlauf einer PCR kann in 3 Phasen unterteilt werden: Der lag-Phase, in der das durch das PCR-Produkt erzeugte Fluoreszenzsignal kleiner als das „Hintergrundsignal“ der PCR-Reagenzien ohne DNA-Einsatz ist, folgt die log-Phase, während derer die DNA exponentiell vervielfältigt wird. Anschliessend geht die PCR in die Plateauphase über, in der die Menge des PCR-Produkts nicht weiter zunimmt.

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Von der Produktmenge kann nur auf die eingesetzte DNA-Menge geschlossen werden, falls die Effizienz (E) konstant bleibt. Dies ist nur während der log-Phase der Fall. Beim Übergang in die Plateauphase nimmt E ab, eine Quantifizierung ist nicht mehr möglich. Die Zahl der Zyklen, nach denen die PCR in die Plateauphase übergeht, ist abhängig von der DNA-Konzentration und der Menge der PCR-Reagenzien. Die Zyklenzahl, in denen sich die PCR in der log-Phase befindet, wird auf 4-10 geschätzt (87).

Mittels Auftrennung des PCR-Produktes bei einer Endpunkt-PCR im Agarosegel ist allenfalls eine semiquantitative Abschätzung der PCR-Produktmenge möglich. Vorteile sind die technische Einfachheit und der geringe Zeitaufwand, Nachteile die niedrige Validität durch eine hohe Untersucherabhängigkeit. Da die PCR in der Plateauphase beendet wird, ist ausserdem die Vergleichbarkeit von zwei Produktmengen nicht gewährleistet. Zur Beendigung in der log-Phase wären mehrere PCR-Ansätze mit verschiedener Zyklenzahl notwendig.

Bei der kompetitiven PCR wird neben der Proben-DNA eine um Primer und PCR-Reagenzien konkurrierende Standard-DNA eingesetzt. Beide DNA besitzen die gleiche Primerbindungsstelle, können aber mittels Unterschieden in der Sequenz oder Länge getrennt werden. Nur wenn sich im Ansatz gleiche Mengen an Standard und Proben-DNA bei gleich effizienter PCR befinden, entsteht gleich viel Produkt und die beiden in einer Gelelektrophorese ermittelten Banden sind gleich stark. Bei dieser Methode spielen tube-to-tube und sample-to-sample Differenzen keine Rolle. Das Verhältnis zwischen Proben- und Standard-DNA bleibt auch nach Erreichen der Plateauphase konstant bei gleichzeitigem Anstieg der Sensitivität (85). Ein Nachteil ist die Notwendigkeit mehrerer PCR-Ansätze mit einer Standardverdünnungsreihe zur Ermittlung des Äquivalenzpunktes beider DNA und die Weiterverarbeitung mittels Gelelektrophorese (89).

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Im LightCycler ermöglicht die Messung der Menge doppelsträngiger DNA nach jedem Zyklus in einem PCR-Lauf die Aufzeichnung der DNA-Menge abhängig von der Zyklenzahl. Betrachtet man die log-Phase dieser Kurve, kann mit Hilfe eines Standards auf die eingesetzte DNA-Menge geschlossen werden.

Wir entschieden uns für diese Methode, da sie zwar gegenüber der kompetitiven PCR kostenintensiver, jedoch weniger zeitaufwendig ist, da sie nicht mehrere PCR-Ansätze benötigt, was den DNA-Verbrauch limitiert. Damit ist ein höherer Probendurchlauf möglich, eine Weiterverarbeitung des Produkts nach der PCR ist nicht notwendig.

Wird DNA mit Hilfe einer Verdünnungsreihe eines externen Standards quantifiziert, gilt für DNA und Standard die Gleichung N=N0*(E)n , wobei N die Produktmenge, N0 die Menge eingesetzter DNA, E die Effizienz und n die Zyklenzahl ist. Leichte Abweichungen der Effizienzen der Standard- und Ziel-DNA können eine starke Verfälschung des quantitativen Ergebnisses bewirken. Beträgt die Differenz z.B. 0,1 bei einer Standardeffizienz von 1,9, so führt dies nach 25 Zyklen zu einer 3,6-fachen Unterschätzung der Menge der Ziel-DNA (87).

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Wir verwendeten als Standard mittels klonspezifischer PCR hergestellte DNA, die aufgrund der gleichen Sequenz theoretisch mit der gleichen Effizienz amplifiziert wird. Um Unterschiede zwischen den Proben aufgrund von Effizienzbeeinträchtigungen durch PCR-Inhibitoren oder unterschiedliche DNA-Qualität auszuschliessen, wurde die Effizienz von Standard und Ziel-DNA mittels Verdünnungsreihen getestet nach der oben genannten Gleichung N=N 0 *E n. Die Effizienzunterschiede lagen bei 0,035 bis 0,05, was theoretisch bei 35 Zyklen eine ca. 3-fache Mengendifferenz zwischen Standard und DNA bewirkte.

Eckert et al. (37) untersuchten mittels TCR-δ-PCR Blutproben von ALL-Patienten und beurteilten den SYBR Green I-Farbstoff als für die Quantifizierung ungeeignet, da der Farbstoff auch an unspezifische PCR-Produkte bindet. In der Negativprobe wurde ein Fluoreszenzsignal nachgewiesen, das nicht wesentlich niedriger als in den Proben war.

Neben dem Einsatz einer optimierten, klonspezifischen PCR umgingen wir dieses Problem durch die Wahl der Messtemperatur. Aufgrund verschiedener Länge und Sequenz weisen unspezifische Produkte von der Ziel-DNA verschiedene Schmelztemperaturen auf, wobei die der erstgenannten meist geringer ist. Die Schmelzkurvenanalyse, in der die Schmelztemperatur der Produkte als unterschiedliche

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Abb. 8: Schmelzkurvenanalyse real time-PCR Patient GL; Schwarz: Standard; Rot: Blutproben; Grün: Negativprobe; Die Blutproben haben einen zweiten Peak bei ca. 81°C.

Peaks zu unterscheiden sind, zeigte, dass die Menge unspezifischer Produkte bei einer von uns gewählten Messtemperatur von 79°C vernachlässigbar ist. Eine Ausnahme bildete der GL b-Primer, durch den unspezifische Produkte mit einer Schmelztemperatur von 81°C gebildet wurden (s Abb. 8). Die Messtemperatur wurde zur Verbesserung der Sequenzspezifität auf 83°C erhöht, hier lagen die unspezifischen Produkte bereits als einzelsträngige DNA vor (s.Abb. 9). Bei diesem Vorgehen konnte in den Negativproben in keinem der PCR-Ansätze am Messpunkt ein signifikantes Fluoreszenzsignal nachgewiesen werden.

Abb. 9: Schmelzkurvenanalyse Real time-PCR Blutprobe GL: Der zweite Schmelzkurvenpeak ist bei einer niedrigeren Temperatur als 83°C

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Eine Alternative zu SYBR Green I ist der Einsatz eines spezifischen Oligonukleotids als Hybridisationsprobe. Kommt es zur Bindung zweier mit Fluoreszein markierter Hybridisationsproben an der DNA nebeneinander, entsteht ein sequenzspezifisches Signal (87). Würde der klonspezifische Primer als Hybridisationsprobe mit einem Farbstoff markiert, müsste in unserem Fall die andere Probe innerhalb des V-Segments platziert werden.

Das TaqMan-System ist ein dem LightCycler entsprechendes System der Firma Applied Biosystems. Eine sogenannte TaqMan-Probe, die sich an der DNA zwischen den beiden Primern anlagert, ist mit einem Fluoreszein- und einem Quencher markiert. Im TaqMan-System wird das Signal erfasst, das durch Hydrolyse des Fluoreszenzfarbstoffs mittels Taq-Polymerase während der PCR entsteht. Da sowohl TaqMan- als auch Hybridisationsprobe an einer konservierten V-Sequenz binden müssen, wäre dies zwar aufgrund einer hohen Sequenzhomologie für die TCR-γ-Sequenz möglich, für die β-Sequenz jedoch wäre aufgrund der geringen Homologie (94) das Design einer Probe für jedes Vβ-Segment notwendig. Dies wäre nur bei einem hohen Probendurchsatz rentabel. Für uns wäre sie aufgrund der geringen Zahl der zu untersuchenden Proben aber zu kostenintensiv und aufwendig. Ein weiteres Problem wäre das der Bezugsgrösse für alle TCR-β-Rearrangements, da es keinen TCR- β-Primer gibt, der einen Grossteil aller Rearrangements amplifiziert.

Mittels unterschiedlicher Methoden wird der Crossing-point der Amplifikationskurve Cp bestimmt. Wir verwendeten die second derivate maximum-Methode, da sie gegenüber der fit point-Methode untersucherunabhängig ist. Mit Hilfe der Crossing-points der Standardverdünnungsreihe ist die Erstellung einer Standardkurve möglich, mit deren Hilfe auf die Konzentration der Proben geschlossen werden kann und deren Validität mit der Anzahl der Messpunkte wächst. Es muss also ein Mittelweg zwischen genügender Validität und ausreichendem Probendurchsatz gefunden werden, da im LightCycler nur 32 Ansätze Platz finden. Wir setzten den Standard in 3-4 Zehnerverdünnungsstufen ein, eine Zahl, die mit der von Rasmussen (87) empfohlenen Mindestanzahl übereinstimmt. Wichtig für die Genauigkeit der Quantifizierung ist ausserdem, dass die Menge der Ziel-DNA grösser als die in der grössten Standardverdünnung enthaltene ist. Da sich die Konzentration der Ziel-DNA nahe der Detektionsgrenze des LightCyclers befand, war der Einsatz grösserer Standardverdünnungen nicht möglich.

4.1.3.2 Validität der Quantifizierung

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Um die Validität der Quantifizierungsergebnisse zu erhöhen, wurden alle Messwerte 2- bis 4-fach bestimmt. Zu stark abweichende Werte wurden aus der Messung herausgenommen und wiederholt. Der Variationskoeffizient, der Quotient aus Standardabweichung und algorhithmischem Mittel der Messwerte betrug im Mittel 36,8% mit einem Maximalwert von 110%.

Liegt das Quantifizierungsergebnis einer Unbekannten ausserhalb des Konfidenzintervalls K einer bekannten Probe mit K gleich der 3-fachen Standardabweichung, handelt es sich bei beiden mit 95-prozentiger Wahrscheinlichkeit um unterschiedliche Proben. Das Konfidenzintervall unserer Ergebnisse beträgt im Durchschnitt 110,8% des Mittelwertes, so dass Proben mit einer grösser als Faktor 2,2 betragenden Konzentrationsdifferenz unterschieden werden konnten. Diese Ergebnisse sind vergleichbar mit denen Rasmussens (87), die Proben mit einer Konzentrationdifferenz vom Faktor 2 unterscheiden konnte.

Werden niedrige DNA-Mengen eingesetzt, variieren die Quantifizierungsergebnisse auch aufgrund statistischer Schwankungen. Die Amplifikation eines Moleküls kann nur in zwei Extremsituationen mit Sicherheit vorausgesagt werden: Beträgt die PCR-Effizienz 1, kommt es zu keiner Amplifikation, beträgt sie 2, kommt es zu einer Verdoppelung der Ausgangsmenge. Liegt die Effizienz der PCR zwischen 1 und 2, ist die Vorhersage über die Amplifikation eines Moleküls nur mit statistischer Wahrscheinlichkeit möglich. Ist die DNA-Menge gross, kann dies vernachlässigt werden, da das Gesetz der grossen Zahlen gilt. Die Varianz aufgrund statistischer Überlegungen ist dagegen bei niedrigen DNA-Mengen ausgeprägter. Die Arbeitsgruppen um Rasmussen (87) und Peccoud (83) fanden bei 10 000 Kopien/Ansatz einen Variationskoeffizienten von 6,4, bei 100 dagegen von 18%. Je niedriger die eingesetzte DNA-Menge ist, umso grösser ist also das Konfidenzintervall. Da von uns ca. 2000 Kopien pro Ansatz eingesetzt wurden, beträgt der Variationskoeffizient ca. 10%, wodurch die Varianz zumindest teilweise erklärt werden kann. Eine weitere Ursache für die Varianz der Werte könnte in Pipettierungenauigkeiten liegen. Da die Menge der Ziel-DNA mit 1000 Kopien/µl klein ist, können geringe Abweichungen der Ausgangsmenge bereits grosse Schwankungen der Produktmenge bewirken.

4.1.3.3 Korrelation zwischen klonspezifischer PCR und Auftrennung mittels Agarosegels und PCR im LightCycler

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Vergleicht man die Ergebnisse der klonspezifischen PCR nach Auftrennung im Agarosegel und nach Amplifikation im LightCycler, konnte mit Hilfe des LightCyclers in 8/42 Fällen keine monoklonale DNA trotz eines positiven Ergebnisses durch PCR und Agarosegel nachgewiesen werden. In 6/42 Fällen war dies umgekehrt. Eine Erklärung für den ersten Fall könnte eine niedrigere Sensitivität der LightCycler-Methode sein (46). Die begrenzt einsetzbare DNA-Menge aufgrund eines Gesamtvolumens von 20µl pro PCR-Ansatz wird als möglicher Grund dafür angeführt (81). Dies könnte auch den fehlenden Nachweis des klonalen Rearrangements mittels LightCyclers trotz schwacher monoklonaler Banden im Agarosegel aus Blutproben des Patienten ZO begründen. Eine weitere Erklärung dafür könnten falsch-positive Ergebnisse im Agarosegel sein, die aufgrund der stringenteren Bedingungen im LightCycler vermieden werden konnten. Die 6/42 Fälle, die gegenüber einem positiven Ergebnis mittels PCR im LightCycler ein negatives Ergebnis mittels PCR und Agarosegel zeigten, könnten durch die Detektion durch unspezifische Produkte verursachte Fluoreszenzsignale im LightCycler erklärt werden.

4.2  Diskussion der Ergebnisse

4.2.1  Diskussion der Sequenzierungsergebnisse

Von 47 Patienten, die klinisch und histologisch gesichert an einer Mycosis fungoides erkrankt waren, wurden 50 TCR-γ- und 6 TCR-β-Sequenzen analysiert. Die mittlere Länge der N-Sequenz der γ-Sequenzen betrug 6,8 bei MF-Patienten, die der β-Sequenzen 14 Basenpaare. Die Länge der γ-Sequenzen ist etwas grösser als die von Breit et al. (18) gefundene mittlere Länge von 4,6 Bp bei Gesunden, für die β-Sequenzen stimmen unsere mit den Ergebnissen Rowens et al. (94) überein. Überdurchschnittlich häufig wurden beim Rearrangement der TCR-γ-Ketten mit 48 bzw. 18% die Segmente Vγ2 und Vγ8 verwendet, bei der TCR-β-Kette Vβ13 mit 42,8%. Dies steht im Gegensatz zu den Beobachtungen von Breit et al. (16), der eine überdurchschnittlich häufige Verwendung von Vγ3- und Vγ8-Segmenten während des Rearrangements bei T-ALL fand, und zu denen Lukowskys et al. (69), der aus der VγI-Subfamilie ausschliesslich Rearrangements von Vγ2 und Vγ8 sah. Als Erklärung der von uns gesehenen Bevorzugung der Vγ2- und –8-Ketten beim Rearrangement wäre eine effizientere Bindung des Vγ-Konsensusprimers denkbar, was jedoch aufgrund der gleichen Spezifität für alle Gensegmente unwahrscheinlich ist.

In 84 % der untersuchten Hautbioptate wurde ein Rearrangement von VγI und Jγ1/2 gefunden, Zahlen, die im Einklang mit Werten von 80-90% in zuvor publizierten Arbeiten stehen (13). Die Verwendung der für VγI- und Jγ1/2 spezifischen Konsensusprimern als Screeningtests in der Diagnostik von Mycosis fungoides ist also ausreichend. Nur bei einem negativen Ergebnis der Konsensus-PCR suchten wir nach einem klonalen TCR-γ-Rearrangement in VγII-IV oder JγP1/2, die in 12 bzw. 8% gesehen wurden. Die tatsächliche Frequenz der Rearrangements von VγII-IV oder JγP1/2 ist vermutlich höher, da der TCR-γ-Locus auf beiden Allelen rearrangiert werden kann, ein Rearrangement auf dem zweiten Allel aber hier nicht untersucht wurde.

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Vγ1 und Vγ6 werden nicht rearrangiert, Vγ5 und Vγ7 gelten als Pseudogene, besitzen aber eine intakte Rekombinase-Erkennungssequenz (34). Mit den von uns verwendeten Primern wurde in 3 Hautbioptaten (6%) ein monoklonales Amplifikat der Vγ5-, in 2 (4%) der Vγ7-Sequenz eruiert (s. Abbildung 3). Ein Rearrangement der beiden Pseudogene wurde auch von anderen Autoren in Hautbioptaten sowohl von an anderen CTCL Erkrankten als auch MF-Patienten gesehen (14).

Wir ermittelten des Weiteren in 8% der Fälle ein Rearrangement der Pseudogene JγP1/2. Andere Autoren entdeckten mit 1-10,7% vergleichbare Frequenzen (13,69).

4.2.2 Diskussion der Diskrepanz der Ergebnisse zwischen Konsensus-PCR mit TGGE und klonspezifischer PCR

Mit Hilfe der PCR mit Konsensusprimern und der Auftrennung mittels TGGE konnte nur in 6/52 Blutproben ein monoklonales Amplifikat nachgewiesen werden, mit den klonspezifischen Primern dagegen war dies in 39 Fällen möglich. Eine Erklärung für die gefundene Diskrepanz liegt in der um 2 bis 3 Zehnerpotenzen niedrigere Sensitivität der Konsensusprimer (98). Dass der Nachweis klonaler Zellen im Blut mittels Konsensusprimern seltener als in vergleichbaren Untersuchungen (41,75) gelang, könnte an der Tatsache liegen, dass es sich dabei um mehrere Blutproben der gleichen Patienten handelte und die Zahl der Probanden mit 4 Patienten niedrig war.

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Die Tatsache, dass im zeitlichen Verlauf mittels PCR und TGGE immer wieder monoklonale mit polyklonalen Ergebnisse abwechseln, legt ausserdem den Schluss nahe, dass sich die Konzentration der klonalen Zellen bei MF-Patienten in der Nähe des TGGE-Detektionslimits von 1% befindet und im zeitlichen Verlauf variiert.

Die Arbeitsgruppen um Merlio (12), Wechsler (29) und Muche (74) haben den Zusammenhang zwischen Krankheitsprogredienz und Monoklonalität untersucht. Die Arbeitsgruppe um Muche (74) fand eine schlechtere Prognose nur bei Patienten mit höherem Alter und bei gleichzeitigem Nachweis eines monoklonalen Amplifikats in Blut- und Hautprobe. Der Nachweis des monoklonalen Rearrangements aus der Haut in 39/52 Blutproben von MF-Patienten zeigt, dass der fehlende Nachweis von monoklonalen Zellen mittels Konsensus-PCR und TGGE bzw. DGGE auf die mangelnde Sensitivität der Methode zurückzuführen ist und nicht bedeutet, dass sich keine klonalen Zellen im Blut befinden.

Mittels Immunophänotypisierung wurden die bei der MF klonal proliferierenden Zellen als skin homing -Zellen identifiziert (92). Diese zirkulieren von der Haut über die Lymphknoten ins Blut und wieder in die Haut, eine Annahme, die durch den Nachweis klonaler Rearrangements in einem hohen Anteil der Blutproben untermauert wird. Ein negatives Ergebnis mittels Konsensusprimer-PCR und DGGE oder TGGE bedeutet also nicht, dass keine klonalen Zellen vorhanden sind, sondern nur, dass der Anteil der klonalen Zellen niedriger als das Detektionslimit der Methode ist.

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Eine Hilfe bei der Interpretation des Nachweises klonaler Zellen aus der Haut im Blut von MF-Patienten liefert das Konzept der Minimal-residual-disease bei Patienten mit ALL. Man nimmt an, dass während der ALL-Therapie die zirkulierenden, malignen Zellen nicht eradiziert werden können. Bei ALL-Patienten wurde ein Zusammenhang zwischen der Prognose und der Menge zirkulierender, klonaler Zellen gefunden (34).

Der fehlende Nachweis des monoklonalen Rearrangements aus der Haut durch die klonspezifische PCR in 13/52 Blutproben wäre durch eine Konzentration der klonalen Zellen unterhalb des Detektionslimits der Methode zu erklären. Auch das Nichtvorhandensein klonaler Zellen im Blut wäre möglich, stünde aber im Widerspruch zum vorher postulierten biologischen Verhalten der klonalen Zellen.

Desweiteren weist der Nachweis des monoklonalen Zellen aus der Haut in den Blutproben auf eine Persistenz des klonalen Rearrangements im Verlauf der MF-Erkrankung hin. Kaltoft et al. (55) beschreiben die Entwicklung monoklonaler, maligner Zellen, die über oligoklonale aus gentraumatisierten, polyklonalen Zellen entstehen. Im Krankheitsverlauf wäre die Entwicklung eines Subklons denkbar, numerische und strukturelle Chromosomenveränderungen gehen mit dem Übergang in malignere Entitäten mit einer schnelleren Progredienz und Therapieresistenz einher. Kaltoft et al. (55) wiesen chromosomale Veränderungen bei in vitro gewachsenen CTCL-Zellen nach, Karenko et al. (57) konnten bei 6 von 7 Patienten mit Sezáry-Syndrom mittels komparativer Genomhybridisierung (CGH) zeigen, dass das T-Zellrearrangement von den Veränderungen nicht betroffen war. Vega et al. (104) dagegen fanden mittels PCR bei 8/39 MF-Patienten neue TCR-Rearrangements. Mit Hilfe der klonspezifischen PCR wäre der Nachweis oligoklonaler Subklone oder von Mutationen im Verlauf nicht möglich.

4.2.3 Diskussion der Ergebnisse der Quantifizierung

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Wir haben bei 3 MF-Patienten mit Hilfe des LightCyclers die Frequenz der zirkulierenden, klonalen Zellen eruiert. Dabei fällt auf, dass sich die Frequenz der im Blut zirkulierenden klonalen Zellen im Lauf der Erkrankung verändert, bei den Patienten LO und FI schwankte sie zwischen nicht-nachweisbar und 8,8% bei einem niedrigsten Wert von 0,9 Prozent, also um eine Zehnerpotenz.

Bei Patient GL variierte sie um den Faktor 100 zwischen 0,8 und 91,1%. Die Krankheit dieses Patienten befand sich im Tumorstadium und die bei ihm gefundene hohe Frequenz klonaler Rearrangements im Blut steht im Einklang mit einem von anderen Autoren mittels PCR und Southern-Blot gefundenen hohen Anteil bei der Untersuchung von Blutproben von Patienten mit fortgeschrittener MF (29, 69).

Setzt man die quantitativen Daten unter Berücksichtigung der Varianz in Beziehung zu Klinik und Therapie, so gibt es weder eine Korrelation zwischen den quantitativen Daten mit der Klinik noch mit der Therapie.

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Es gab Messpunkte, zu denen die Frequenz der klonalen Zellen im Blut trotz sich modifizierter Klinik nur wenig änderte. Ein Beispiel waren die nur leicht angestiegenen Werte zwischen der Remission 06/98 und einem Rezidiv 3/99 bei Patient GL (s. Abb. 10). Eine ähnliche Situation war bei Patient FI (s. Abb. 12) zwischen der Remission 04/01 und einem Rezidiv 07/01 zu beobachten.

Umgekehrt war zu beobachten, dass sich eine Veränderung des Anteils klonaler Zellen im Blut nicht unbedingt auf die Klinik auswirkte. Ein beeindruckendes Beispiel war bei Patient GL die Abnahme der klonalen T-Zellen im Blut von 91,1% 11/00 auf 21% 01/01 während der andauernden, kompletten, klinischen Remission.

Besonders bei den Patienten GL und FI fällt jedoch die Tendenz eines reziproken Zusammenhangs zwischen dem Anteil der klonalen T-Zellen im Blut und der Klinik auf. Bei GL war im Blut 10/98 kein klonales Rearrangement mehr nachweisbar zu einem Zeitpunkt, zu dem klinisch ein vergrösserter Lymphknoten tastbar war. Die gleiche Situation stellte sich bei FI dar, wo während der Rezidive 02/97 und 7/98 kein klonales Amplifikat im Blut detektiert werden konnte. Umgekehrt stieg beim gleichen Patienten der Anteil klonaler Rearrangements 11/98 während der unter Steroidtherapie erreichten Remission auf den für ihn maximalen Wert von 9% an, eine Entwicklung, die auch bei GL zu beobachten war. Während der kompletten, klinischen Remission im November 2000 stieg der Anteil des monoklonalen Rearrangements auf den Höchstwert von 91,1%.

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Auch bei Patient LO (s. Abb. 11) bestätigt sich ein reziproker Zusammenhang zwischen Frequenz der im Blut nachweisbaren, klonalen Rearrangements und Klinik nicht. Hier stieg zwischen 03/00 und 03/01 während klinischer Progredienz der Anteil klonaler Rearrangements an, auch während einer darauffolgenden Remission und eines Rezidivs sanken bzw. stieg die Frequenz der im Blut nachweisbaren, klonalen Zellen.

Eine Erklärung für die zur Klinik reziproke Entwicklung der klonalen Rearrangements im Blut könnte ein Shift der Tumorzellen zwischen Haut und Blut sein. Eine Besserung der Hauterscheinungen bedeutete lediglich, dass die klonalen T-Zellen ins Blut verdrängt wurden und viceversa.

Abb. 10: Patient GL: Anteil klonaler Zellen im Blut im Verlauf, Werte 11/99 29,5%, 11/00 91,0%, 01/01 21,0% nicht eingezeichnet.(C)CR: (klinisch) komplette Remission, PR: partielle Remission, Rez.: Rezidiv, PD: Progressive Disease, St. Steroid, MTX Methotrexat, Ta Targretin, ECP Extrakoporale Photophorese.

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Es wäre möglich, dass topische Therapieformen die klonalen Zellen nicht eradizieren, sondern es den klonalen Zellen ermöglichen, abzuwandern. Der Anstieg von 0 auf 9% 11/98 bei FI zum Zeitpunkt einer unter Steroiden erreichten Remission und eine leichte Zunahme der klonalen Rearrangements während der PUVA-Therapie bei Patient LO 03/99 untermauern diese Annahme.

Als Konsequenz daraus ergäbe sich die Notwendigkeit einer systemischen Therapie. Ein Indiz für die Wirksamkeit einer systemischen Therapie wäre die Verringerung der klonalen T-Zellen auch im Blut. Ein Beispiel dafür war die prozentuale Abnahme der klonalen Rearrangements von 29,5% 11/99 auf 5,2% 01/00 bei Patient GL unter Methotrexat-Therapie trotz Verschlechterung der Klinik. Ein nur geteiltes Ansprechen war auch während der Hybridzellvakzinierung bei Patient LO zu beobachten, die klinisch zwar keine Besserung brachte, während derer im Blut jedoch der Anteil klonaler Rearrangements unter das Detektionslimit sank.

Abb. 11: Patient LO: Anteil zirkulierender, klonaler Zellen im Verlauf.Erläuterungen s. Abbildung 10

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Abb. 12: Patient FI: Anteil der zirkulierenden Tumorzellen im zeitlichen Verlauf in Bezug auf Klinik und Therapie. P/I/S : PUVA/IFN/Steroid, Ster. : Steroid, sonstige Erläuterungen siehe Abbildung 10

Es sind jedoch auch Situationen zu beobachten, in denen eine systemische Therapie keine Abnahme klonaler Rearrangements im Blut mit sich brachte, z.B. während der Hybridzellvakzinierung 02/99 und der MTX-Therapie 11/99 bei dem Patienten GL.

Das bedeutet, dass die Klinik und die Zahl der klonalen Zellen im Blut nicht miteinander korrelieren. Mutmassungen über Tendenzen in der Variation der im Blut zirkulierenden, klonalen Zellen bleiben aufgrund der geringen Patientenzahl und des hohen Variationskoeffizienten Spekulation.

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Vergleichbare quantitative Untersuchungen klonaler Rearrangements im Blut bei MF-Patienten gibt es bisher in der Literatur nicht. Zur Erforschung des Krankheitsverlaufs der MF und der Therapiewirksamkeit mittels molekularbiologischer Daten wäre die Untersuchung einer grossen Patientenzahl in einer prospektiven Multicenterstudie notwendig, was aus den oben genannten Gründen schwierig ist.

4.2.4 Diskussion der Ergebnisse bei SPP-Patienten

Die Einordnung der SPP ist umstritten. Von einigen Autoren wird sie als abortives Lymphom oder benigne Erkrankung, von anderen als Vorstufe eines CTCL bewertet. Der Nachweis eines klonalen Rearrangements in der Haut könnte auf eine CTCL-Erkrankung hindeuten. Mittels PCR mit TCRγ-Konsensusprimern und Auftrennung mittels TGGE fanden wir bei 9 von 14 SPP-Patienten ein monoklonales Rearrangement im Blut. Da die durchschnittliche N-Sequenz mit 10,2 Basenpaaren länger war als bei den MF-Patienten, konnte mit Hilfe der klonspezifischen PCR bei 6 SPP-Patienten (66%) das klonale Rearrangement in allen übrigen Blutproben nachgewiesen werden. Die Länge der N-Sequenz war in anderen Untersuchungen (47,60) zur Monoklonalität bei SPP Patienten nicht angegeben.

4.2.4.1 Blutklonalität bei Nicht-Lymphom-Patienten

Der Nachweis eines klonalen T-Zell-Rearrangements im Blut deutet auf eine Lymphom-Erkrankung hin. Bei ca. 40 % der Patienten mit früher und 73% mit fortgeschrittener MF-Erkrankung (31), jedoch nicht bei gesunden Probanden konnten einige Autoren (41,79) im Blut ein monoklonales Amplifikat mittels PCR nachweisen. Andere fanden jedoch auch bei Nicht-Lymphom-Patienten klonale T-Zellen im Blut. Delfau-Larue et al. (29) konnten bei 30% der Patienten einen Blutklon allein nachweisen, egal ob die Patienten an einer MF erkrankt waren oder nicht. Niedrigere Zahlen ermittelten Muche et al. (74) und Beylot-Barry et al. (12). Ein häufigerer Nachweis von Blutklonalität wurde bei Patienten mit Autoimmunerkrankungen, anderen Hautkrebsarten (74), benignen Dermatosen (31) und mit erworbenen oder angeborenen CD4-Lymphozytopenien (11,101) gesehen, Krankheitsbilder, die bei den von uns untersuchten Patienten ausgeschlossen wurden.

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Schon seit längerem ist die Expansion von monoklonalen Vβ-Rearrangements unter CD8+-Zellen, im späteren Lebensalter auch unter CD4+-Zellen bekannt (84,100,108). Bei gesunden, meist über 60 Jahre alten Probanden konnte von Schwab et al. (100) in 8/11 Fällen in der CD4-positiven und in 7 von 11 Probanden in der CD8-positiven Fraktion ein Blutklon gefunden werden. Die Probanden entwickelten auch im weiteren Verlauf kein Lymphom. Eine mögliche Erklärung ist die Bildung und Persistenz von Klonen reaktiver Zellen nach Infektionskrankheiten. Die von uns untersuchten Patienten zeigten bei Diagnosestellung einen Altersdurchschnitt von 68,1 Jahren mit 7 Patienten über 65 Jahren. Mittels Zellsortierung der PBMC von zwei zufällig ausgewählten Patienten wurde der nachgewiesene Klon dem CD4-positiven Zellspektrum zugeordnet.

4.2.4.2 Zusammenhang zwischen Blutklonalität und SPP-Erkrankung

In den Hautproben war der Nachweis der im Blut gefundenen klonalen Rearrangements mit Hilfe der klonspezifischen Primer nicht möglich, und zwar trotz nochmaligen Einsatzes von PCR-Produkt in einer geschachtelten PCR zur Erhöhung der Sensitivität. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit Klemke et al. (60), die zwar mittels Genescan-Analyse bei 2/6 SPP-Patienten im Blut und 2/5 Patienten in der Haut, jedoch nur bei 1/8 Patienten in beiden Kompartimenten ein monoklonales Rearrangement zeigen konnten. Haeffner et al. (47) dagegen gelangen bei 2/3 Patienten der Klonalitätsnachweis in der Haut bei gleichzeitiger Dominanz von CD4-positiven Zellen, Blutproben wurden von ihm nicht untersucht.

Stünden die im Blut gefundenen, klonalen Zellen im Zusammenhang mit der SPP-Erkrankung, gäbe es dafür folgende Erklärungsmöglichkeiten:

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Bei den klonalen Zellen handelt es sich um Tumorzellen, die, wie ihre Vorläuferzellen, aufgrund ihrer skin homing-Natur von der Haut über die Lymphknoten ins Blut zirkulieren. Die Zellen wären dann zwar auch in der Haut vorhanden, jedoch aufgrund einer zu geringen Sensitivität der Methode nicht nachweisbar. Die Konzentration der Tumorzellen in der Haut müsste damit aufgrund eines hohen Anteils polyklonaler, reaktiver Zellen niedriger als eine klonale in 105 polyklonalen Zellen sein. Gerade in Frühstadien von CTCL ist eine stark ausgeprägte Immunantwort durch CD8+-Zellen belegt (8), jedoch ist es unwahrscheinlich, dass so wenige Zellen eine Hautläsion hervorrufen.

Bei den klonalen Zellen im Blut könnte es sich ausserdem um reaktive Zellen handeln, die sich als Immunantwort auf die SPP gebildet haben. Dafür spräche die Expression von CD8, der von den für die Immunantwort wichtigen zytotoxischen T-Zellen exprimiert wird. Durch Zellsortierung mittels Midi-Macs und anschliessendem Einsatz der DNA zweier Patienten in der klonspezifischen PCR wurde die Zugehörigkeit der klonalen Zellen zu den CD4-Zellen gezeigt, ein Ergebnis, das die genannte Erklärung zumindest bei diesen Patienten unwahrscheinlich erscheinen lässt. Ausserdem müssten die reaktiven Zellen dann auch in der Haut in einer ähnlichen Konzentration wie im Blut vorliegen, ein weiteres Argument, das gegen die Entwicklung der klonalen Zellen als Reaktion auf die SPP-Erkrankung spricht.

Als letztes bleibt die Möglichkeit, dass der Nachweis klonaler Rearrangements im Blut nicht direkt mit einer SPP-Erkrankung in Zusammenhang steht.

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Wie oben beschrieben, konnten klonale Rearrangements im Blut bei gesunden Probanden sowohl von CD8- als auch CD4-positiven Zellen nachgewiesen werden (84,108). Schwab et al. (100) gelangen dieser Nachweis bei 8/11 meist über 60 Jahre alten Gesunden im CD4-positiven Spektrum. Zwar konnten auch wir bei 9 von 14 SPP-Patienten im Blut ein monoklonales Rearrangement nachweisen. Der Altersdurchschnitt unserer Patienten war zur Zeit der Probenentnahme bei 68,1 Jahren, 7 waren älter als 60, und durch Zellsortierung von 2 zufällig ausgewählten Patienten konnten die klonalen Rearrangements dem CD4-positiven Spektrum zugeordnet werden. Im Unterschied zu den von uns durchgeführten Untersuchungen benutzten Schwab et al. (100) jedoch die TCR-β-PCR, eine aufgrund geringer Sequenzhomologie zwischen den TCR-β-Ketten weniger spezifische Methode. Obwohl die Vergleichbarkeit unserer mit den Ergebnissen Schwabs et al. (100) fraglich ist, wäre es denkbar, dass der Nachweis klonaler Rearrangements nichts mit der Erkrankung an SPP zu tun hat. Bei den von uns untersuchten MF-Patienten wurde ein Rearrangement von VγII- IV nur in 12%, bei den SPP-Patienten dagegen in 55% der Fälle gefunden. Breit et al. (17) beschreiben eine Prädominanz von VγI bei Thymozyten und akuter T-Zell-Leukämie, jedoch ein Rearrangement von VγII bei der Mehrheit gesunder Probanden. Dies legt die häufigere Verwendung der VγII-IV-Rearrangements bei reaktiven Zellen nahe und spricht für den reaktiven Charakter des im Blut nachgewiesenen Klons.

Der Anteil der von uns gesehenen SPP-Patienten mit klonalem Rearrangement im Blut ist nur unwesentlich höher als der von gesunden Probanden gleichen Alters. Da CTCL schon in den Frühstadien eine systemische Erkrankung darstellen, hätte der Nachweis im Blut detektierter, klonaler T-Zellen auch in den Hautläsionen von SPP-Patienten einen direkten Hinweis auf die Einordnung der SPP als CTCL gegeben. Unsere Ergebnisse sprechen jedoch dagegen: Es gab keinen Hinweis für die Einordnung der Small Plaque Parapsoriasis als kutanes T-Zell-Lymphom


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08.11.2006