Aus der Klinik für Dermatologie
Der Medizinischen Fakultät der Charité-Universitätsmedizin Berlin

DISSERTATION

Qualitativer und quantitativer Nachweis monoklonaler Zellen in Blut und Haut von Patienten mit Mycosis fungoides und Small Plaque Parapsoriasis mittels klonspezifischer TCR-PCR

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

Vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité
Universitätmedizin Berlin

von
Jürgen Heim
aus Marktheidenfeld

Gutachter:
1. Prof. Dr. Dummer, Dermatologische Klinik, Zürich
2. Prof. Dr. Dietel, Institut für Pathologie, Charité, Berlin
3. PD Dr. Lukowsky, Dermatologische Klinik, Charité, Berlin

Datum der Promotion: 18.07.2005

Abstract

Mit klonspezifischer Polymerasekettenreaktion (PCR) ist ein spezifischer Nachweis kleiner DNA-Mengen möglich. Von 47 MF-Patienten wurden aus Hautproben 50 TCR-gamma- und 7 TCR-beta-Sequenzen sequenziert, von 15 bzw. 5 Patienten gelang die Entwicklung eines N-spezifischen Primers. Um einen Zusammenhang zwischen Frequenz der zirkulierenden klonalen Zellen und klinischem Verlauf zu untersuchen, wurden für 4 Patienten im LightCycler die im Blut zirkulierenden klonalen Rearrangements quantifiziert. Ein Vergleich dieser Daten mit dem klinischen Verlauf ergab bei zwei Patienten eine Tendenz zu einem reziproken Verhältnis, bei einem Patienten im Tumorstadium wurde eine gleichsinnige Entwicklung beider Parameter gesehen. Der Nachweis klonaler Rearrangements in Haut- und Blutproben von SPP-Patienten wäre ein Hinweis auf den Lymphomcharakter dieser Erkrankung. Bei 9 von 14 SPP-Patienten wurde in Blutproben mit Hilfe der für VgammaI-Jgamma1/2 spezifischen Konsensusprimer ein monoklonales Rearrangement gefunden. Für 6 Patienten konnte ein klonspezifischer Primer entwickelt werden. Ein Nachweis der klonalen Sequenz aus dem Blut in der Haut war trotz einer geschachtelten PCR nicht möglich.

Eigene Schlagworte: klonspezifische Polymerasekettenreaktion, Mycosis fungoides, Small Plaque Parapsoriasis, real time-PCR

Abstract

By clone specific polymerase chain reaction (pcr) small amounts of DNA can be detected. We discovered 50 tcr gamma and 7 tcr beta sequences from skin probes of 47 patients with mycosis fungoides. From 15 respectively 5 patients n-specific primers were designed. In order to examine if there is a relation between frequency of circulating clonal cells and clinical course, for 4 patients circulating clonal cells were quantified by real time pcr in LightCycler. In two patients we saw a reciproce proportion, in one patient with tumourstage disease rising numbers of circulating clonal cells were seen during worsening of clinical course.

Detection of clonal rearrangments in skin and blood probes of patients with small plaque parapsoriasis could be a hint for classifying SPP as a lymphoma. In 6/14 patients we designed a clone-specific primer for circulating clonal rearangments. Despite performing a nested pcr circulating clonal rearrangments could not be detected in skin lesions of these patients.

Keywords: clone-specific polymerase chain reaction, mycosis fungoides, real time pcr, small palque parapsoriasis

Inhaltsverzeichnis

• 1  EINLEITUNG
  • 1.1  Kutanes T-Zell-Lymphom / Mycosis fungoides
    • 1.1.1  Definition
    • 1.1.2 Vorkommen
    • 1.1.3 Ätiologie
    • 1.1.4 Pathophysiologie
    • 1.1.5 Klinische Präsentation der MF
    • 1.1.6 Diagnostik und Staging
      • 1.1.6.1 Histopathologie
      • 1.1.6.2 Immunphänotypisierung
      • 1.1.6.3 Genotypisierung
      • 1.1.6.4 Staging
      • 1.1.6.5 Therapie
  • 1.2 Parapsoriasis en plaques
    • 1.2.1  Definition
    • 1.2.2 Small Plaque Parapsoriasis (SPP)
      • 1.2.2.1 Klinischer Verlauf
      • 1.2.2.2 Histologie
      • 1.2.2.3 Therapie
    • 1.2.3 Beziehung zu Mycosis Fungoides
  • 1.3 Molekularbiologie des kutanen T-Zell-Lymphoms
    • 1.3.1  Techniken der Genotypisierung
      • 1.3.1.1 T-Zell-Rezeptoren
      • 1.3.1.2 Southern-Blot
      • 1.3.1.3 PCR
      • 1.3.1.4 Klonspezifische PCR
        • 1.3.1.4.1 Design eines klonspezifischen Primers
        • 1.3.1.4.2 Gelelektrophoreseverfahren
        • 1.3.1.4.3 Quantitative PCR im LightCycler®
    • 1.3.2 Genotypisierung und Sequenzierung
      • 1.3.2.1 Ergebnisse molekularbiologischer Untersuchungen in der Haut
      • 1.3.2.2 Ergebnisse molekularbiologischer Untersuchungen im Blut
      • 1.3.2.3 Prognostische Relevanz des Nachweises monoklonaler Zellen im Blut vom MF-Patienten
  • 1.4 Fragestellung
• 2 Material und Methoden
  • 2.1  Patienten MF / SPP
  • 2.2  Material
    • 2.2.1  Chemikalien
    • 2.2.2 Software
  • 2.3 Genotypisierung
    • 2.3.1  DNA-Isolation
    • 2.3.2 TCR-β-PCR
    • 2.3.3 TCR-y-PCR
    • 2.3.4 Agarosegelektrophorese
    • 2.3.5 TGGE
    • 2.3.6 Sequenzierung
  • 2.4 Klonspezifische PCR
    • 2.4.1  Entwicklung eines N-spezifischen Primers
    • 2.4.2 Optimierung der Bedingungen der klonspezifischen PCR
  • 2.5 Quantifizierung mittels SYBR-Green
  • 2.6 Spezifitätsprüfung
  • 2.7 Korrelation zur Klinik
• 3 Ergebnisse
  • 3.1  Quantifizierung klonaler Zellen in peripherem Blut von MF-Patienten
  • 3.2 Sequenzierungsergebnisse
    • 3.2.1  Klonspezifische Primer
    • 3.2.2 Spezifität und Sensitivität der klonspezifischen PCR
    • 3.2.3 Detektion zirkulierender, klonaler Zellen im Verlauf
    • 3.2.4 Quantifizierung
  • 3.3 TCR-Klonalität bei Patienten mit SPP
    • 3.3.1  Nachweis klonaler Zellen in Blut- bzw. Hautproben
    • 3.3.2 Sequenzierung und Entwicklung klonspezifischer Primer
    • 3.3.3 Ergebnisse der klonspezifischen PCR in Haut- und Blutproben
• 4 Diskussion
  • 4.1  Methodendiskussion
    • 4.1.1  Validität der Ergebnisse der PCR mit Konsensusprimern und Auftrennung mittels TGGE
    • 4.1.2  Validität der quantitativen PCR
      • 4.1.2.1 Sensitivität und Spezifität der klonspezifischen PCR
    • 4.1.3 Validität der quantitativen PCR
      • 4.1.3.1 Wahl der Quanitifizierungsmethode
      • 4.1.3.2 Validität der Quantifizierung
      • 4.1.3.3 Korrelation zwischen klonspezifischer PCR und Auftrennung mittels Agarosegels und PCR im LightCycler
  • 4.2  Diskussion der Ergebnisse
    • 4.2.1  Diskussion der Sequenzierungsergebnisse
    • 4.2.2 Diskussion der Diskrepanz der Ergebnisse zwischen Konsensus-PCR mit TGGE und klonspezifischer PCR
    • 4.2.3 Diskussion der Ergebnisse der Quantifizierung
    • 4.2.4 Diskussion der Ergebnisse bei SPP-Patienten
      • 4.2.4.1 Blutklonalität bei Nicht-Lymphom-Patienten
      • 4.2.4.2 Zusammenhang zwischen Blutklonalität und SPP-Erkrankung
• 5 Zusammenfassung
• Abkürzungsverzeichnis
• LITERATURVERZEICHNIS
• Erklärung an Eides Statt
• Danksagung

Tabellen

• Tab. 1: Stadieneinteilung bei MF
• Tab. 2: TNM-Stadieneinteilung nach EORTC (75), KO: Körperoberfläche
• Tab. 3: In Hautbioptaten von MF-Patienten mittels TCR-γ-PCR und TGGE (75) bzw. DGGE (28) gefundene Monoklonalität in Abhängigkeit vom Krankheitsstadium
• Tab. 4: In Blutproben von MF-Patienten mittels TCR-γ-PCR und TGGE (75) bzw. SSCP-PAGE (41) gefundene monoklonale Ergebnisse in Abhängigkeit vom Krankheitsstadium
• Tab. 5: Primer, Spezifität und Sequenzen (Quelle der Primersequenzen in Klammern)
• Tab. 6: TCR-β-Sequenzen, N-Sequenzen sind unterstrichen
• Tab. 7: TCR-γ-Sequenzen in Haut der MF-Patienten; N-Region ; + Primerdesign bzw. Verlauf möglich
• Tab. 8: Sequenzen der klonspezifischen Primer mit PCR-Bedingungen, Mg-Konz.: MgCl2-Konzentration
• Tab. 9: Spezifitäts-Nachweis: Klonspez. Primer Zl 1, Einzelzell-PCR- F.Z.Zellen 1,2,3,16,18, 20, 22-30 Zellen ohne Einzelzell-PCR-Produkt, Klon-spez.PCR negativ, *0,6 dNTP/2mM MgCl₂
• Tab. 10: Patient FI: Ergebnisse der Routine-PCR, klonspezifischen PCR und Quantifizierung im LightCycler im Vergleich. PCR-TGGE: Ergebnisse der Routine-PCR mit TGGE, poly: polyklonal, mono: monoklonal, bi: biklonal; sq TuZ: semiquantitative Abschätzung im Agarosegel nach klonspez. PCR, Grad 0 bis +++; % TuZ: im LightCycler bestimmter Anteil an Tumorzellen im Blut, Therapie: bis zur Blutabnahme erhaltene Therapie
• Tab. 11: Patient GL: Ergebnisse Routine-PCR, klonspezifische PCR und Quantifizierung im LightCycler im Vergleich. Erläuterungen siehe Tab. 10
• Tab. 12: Patient LO: Vergleich der Ergebnisse der Routine-PCR mit denen der klonspezifischen PCR und Quantifizierung im LightCycler. Erläuterungen s. Tabelle 10
• Tab. 13: Patient ZO, Vergleich Ergebnisse der Routine-PCR mit klonspezifischer PCR und LightCycler-Quantifizierung. (Erläuterungen siehe Tabelle 10)
• Tab. 14: Sequenzen und Ergebnisse der klonspezifischen PCR der SPP-Patienten

Bilder

• Abb. 1: Haarnadelstrukturbildung
• Abb. 2: Unspezifische Primerdoppelstrangbildung und deren Progression
• Abb. 3: Häufigkeit der Vg-Rearrangments
• Abb. 4: Klonale Jurkat-Zellen vor polyklonalem Hintergrund in oben angegebener Verdünnung, H2O: Negativprobe; Marker: Hinc III Lambda; klonspezifischer Primer: Ju
• Abb. 5: Klonspezifische Real time–PCR Patient LO; Schwarz: Standard in zunehmender Verdünnung 1:10, mittelgrau: Blutproben LO; hellgrau: Negativproben
• Abb. 6: Schmelzkurvenanalyse nach klonspezifischer PCR mit Blutprobe des Pat. FI im LightCycler
• Abb. 7: PCR mit klonspez. Primer BE; Marker: Hinc III Lambda; H₂O: Negativprobe; Blut 1: diagnostische Blutprobe; Blut 2: zweite Blutprobe BE; Haut 1: Hautprobe BE; Haut 2: Hautprobe 1 nach nested PCR
• Abb. 8: Schmelzkurvenanalyse real time-PCR Patient GL; Schwarz: Standard; Rot: Blutproben; Grün: Negativprobe; Die Blutproben haben einen zweiten Peak bei ca. 81°C.
• Abb. 9: Schmelzkurvenanalyse Real time-PCR Blutprobe GL: Der zweite Schmelzkurvenpeak ist bei einer niedrigeren Temperatur als 83°C
• Abb. 10: Patient GL: Anteil klonaler Zellen im Blut im Verlauf, Werte 11/99 29,5%, 11/00 91,0%, 01/01 21,0% nicht eingezeichnet.(C)CR: (klinisch) komplette Remission, PR: partielle Remission, Rez.: Rezidiv, PD: Progressive Disease, St. Steroid, MTX Methotrexat, Ta Targretin, ECP Extrakoporale Photophorese.
• Abb. 11: Patient LO: Anteil zirkulierender, klonaler Zellen im Verlauf.Erläuterungen s. Abbildung 10
• Abb. 12: Patient FI: Anteil der zirkulierenden Tumorzellen im zeitlichen Verlauf in Bezug auf Klinik und Therapie. P/I/S : PUVA/IFN/Steroid, Ster. : Steroid, sonstige Erläuterungen siehe Abbildung 10