Heine, Helge Niklas: Peptidmimetika an Zellulosemembranen - SPOT-Synthese und Screening kombinatorischer Peptoid-Bibliotheken

Kapitel 1. Einleitung und Zielsetzung

1.1 Einleitung

Ein Netzwerk ineinandergreifender biochemischer Prozesse bildet die molekulare Grundlage lebender Organismen. Eine Schlüsselrolle in der Regulation dieser Prozesse spielt die molekulare Erkennung körpereigener Moleküle durch selektive Bindungen - beispielsweise zwischen einem Rezeptor-Protein und seinem Botenstoff. Störungen im biochemischen Gleichgewicht können eine Ursache für Krankheiten sein. Die Anwendung pharmazeutischer Wirkstoffe, die körpereigenen Verbindungen ähnlich sind, ermöglicht einen gezielten Eingriff in molekulare Erkennungsprozesse zur Wiederherstellung des Gleichgewichts.

Peptide 1 stellen eine wichtige Klasse körpereigener Botenstoffe dar. Ihre unterschiedlichen Wirkungen liegen in der jeweiligen Zahl und Abfolge der 20 alpha-Aminosäure-Bausteine begründet, aus denen sie oligomer aufgebaut sind. In der Vielfalt ihrer Wirkungen begründet sich die lange Tradition ihrer chemischen Synthese.[ 1 ] Vor diesem Hintergrund verwundert es nicht, daß Peptide auch als Pharmaka eingesetzt werden.[ 1 , 2 ] Verglichen mit nicht-peptidischen Wirkstoffen besitzen sie jedoch einige entscheidende Nachteile: oral verabreicht werden sie 1.) oft nur in geringem Maße aufgenommen und 2.) rasch zu unwirksamen Stoffen abgebaut. Eine Möglichkeit, diese Probleme zu umgehen, ist die Entwicklung peptidähnlicher Verbindungen mit verbesserten pharmakokinetischen Eigenschaften - den Peptidmimetika.

Zu den Peptidmimetika werden zahlreiche Verbindungen gezählt, die in den meisten Fällen ähnliche Seitenketten-Funktionalitäten wie Peptide enthalten, sich aber im Aufbau des Rückgrates von ihnen unterscheiden. Dabei reicht das Spektrum der möglichen Variationen von der Veränderung von Rückgrat-Atomen (z.B. Abb. 1 , A) über die Einführung bicyclischer Dipeptid-Analoga (B) bis zur Anordnung der funktionellen Gruppen an einer nicht-oligomeren Kernstruktur (C).[ 3 - 7 ]

Abb. 1: Peptide: Strukturformel und schematische Darstellung von Rückgrat und Seitenketten. Peptidmimetika: Beispiele für A) Rückgrat-Mimetika[ 8 ], B) Dipeptid-Analoga[ 9 ] und
C) Gerüst-Mimetika[ 10 ].


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Zu den am besten untersuchten Rückgrat-Mimetika gehören die Oligo-N-alkylglycine 2 (Peptoide). Sie unterscheiden sich von Peptiden 1 lediglich im Anknüpfungspunkt der Seitenkette, die formal vom alpha-Kohlenstoffatom an das Stickstoffatom des Rückgrates verschoben ist. Seitdem im Jahr 1992 zwei allgemeine Methoden zu ihrer Synthese beschrieben wurden[ 11 , 12 ], konnten zahlreiche Peptoide mit biologischer Aktivität identifiziert werden. Dabei wurden Enzyminhibition[ 11 , 13 ], antibiotische Wirkung[ 14 , 15 ], peptidhormonelle Aktivität[ 16 , 17 ] sowie Bindung an Rezeptoren[ 18 - 20 ] und lösliche Proteine[ 21 , 22 ] beschrieben. In Untersuchungen in vitro[ 16 , 23 ] und in vivo[ 24 ] konnte ferner gezeigt werden, daß Peptoide die gewünschte Stabilität gegenüber dem Abbau durch Proteasen besitzen - eine wichtige Voraussetzung für pharmazeutische Anwendungen.

Zur Synthese der Peptoide, wie auch anderer Oligomere, lassen sich hervorragend die für Peptide entwickelten Synthesemethoden anwenden. Sie basieren auf der im Jahr 1963 durch R.B. Merrifield eingeführten Synthese an fester Phase.[ 1 , 25 - 27 ] Dabei wird die Oligomerenkette kovalent an ein festes Trägermaterial gebunden, so daß die Reaktionsprodukte durch Filtration isoliert werden können. Darüberhinaus können Reagenzien im Überschuß eingesetzt werden, um die Reaktionen zur Vollständigkeit zu bringen. Die Vereinfachung der Reaktionsdurchführung, verglichen mit der klassischen Synthese in homogener Lösung, ermöglicht deren Automatisierung. Am Ende der Synthese steht im allgemeinen eine Untersuchung der biologischen Wirksamkeit. Dazu kann das Produkt entweder durch selektive Spaltung eines speziellen Linkermoleküls vom festen Trägermaterial freigesetzt und in Lösung untersucht werden (homogenes Screening), oder direkt an der festen Phase auf Aktivität getestet werden (Festphasen-Screening).[ 28 ]

Zur praktischen Umsetzung der Festphasensynthese stehen vielfältige Verfahren zur Verfügung.[ 29 - 36 ] Man unterscheidet die parallele Synthese definierter Verbindungen und die Synthese von Substanzgemischen. Zwar ist die Zahl der erreichbaren Verbindungen bei der Anwendung von Mischtechniken („Split-Synthesis“) wesentlich größer als bei der Parallelsynthese, die Identifizierung der aktiven Substanzen ist jedoch mit hohem Aufwand verbunden.[ 32 ] Im Gegensatz dazu ist die Identität der Verbindungen bei der parallelen Synthese festgelegt, für die sich die folgenden Methoden durchgesetzt haben ( Abb. 2 ):[ 33 ]

  1. Zur Synthese in Reaktoren sind Kügelchen auf Polystyrol-Basis (Syntheseharze) am weitesten verbreitet. Die besondere Konstruktion der Reaktoren ermöglicht dabei das Abfiltrieren der Reagenzien und Waschlösungen. Zwischen 40 und 100 Reaktoren können unter Verwendung von Syntheseautomaten[ 34 ], die in den unterschiedlichsten Ausführungen erhältlich sind, parallel angesteuert werden.

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Abb. 2: Methoden zur parallelen Synthese an fester Phase (P: Feste Phase; R: Reagenzien;
G: Reaktionsgefäß).

  1. Bei der Synthese an Pins sind die Substanzen an den Enden von 96 Stäbchen (Pins) gebunden, die im Format einer Mikrotiterplatte fixiert sind. Zur Synthese werden sie in die Vertiefungen der mit Reagenzien gefüllten Platte gesenkt.[ 37 ]
  2. Die Synthese an planaren Oberflächen kann mit zwei unterschiedlichen Methoden erfolgen[ 38 ]:

Abb. 3: Roboter zur automatischen Pipettierung von Reagenzien auf eine Zellulosemembran (SPOT-Synthese). Links befinden sich die Reagenzienvorräte, rechts ist eine 19 x 28 cm große Membran mit 8000 (blau eingefärbten) SPOTs fixiert.


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Mit steigender Zahl synthetisierbarer Verbindungen (Harz < Pins < Zellulose < Glas) verringert sich die synthetisierte Substanzmenge, was wiederum die Detektion in Bindungsstudien und chemischer Analytik erschwert. Unter diesem Aspekt verbindet die 1992 von R. Frank eingeführte SPOT-Synthese[ 39 ] die parallele Synthese von bis zu 8000 Verbindungen[ 41 , 42 ] mit der Möglichkeit, die Substanzen ohne besonderen technischen Aufwand mit herkömmlichen Laborgeräten biochemisch und chemisch zu analysieren. Die Synthese kann unter Verwendung eines Pipettierroboters zur ortsgenauen Reagenzienverteilung durchgeführt werden ( Abb. 3 ).

Aufgrund der guten Benetzbarkeit der Zellulosemembran mit wäßrigen Lösungen lassen sich Peptid-Bibliotheken direkt mit Proteinen inkubieren, um deren Bindung an die immobilisierten Substanzen zu untersuchen. Am Beispiel einer vergleichsweise kleinen Bibliothek aus 140 Peptiden kann dieser Vorzug der SPOT-Synthese verdeutlicht werden ( Abb. 4 ). Nachdem das Heptapeptid VVSHFND (jeder Buchstabe steht für eine Aminosäure im 1-Buchstaben-Code) als Bindungsmotiv für den monoklonalen Antikörper Tab-2 identifiziert wurde, galt es in diesem Experiment, die Bindung genauer zu charakterisieren. Dazu wurden alle Peptide synthetisiert, die sich in einer Aminosäure von der Ausgangssequenz („Wildtyp“) unterscheiden. Nach der Synthese wurde die Membran mit dem Antikörper inkubiert und Bindung als dunkle Färbung visualisiert. An Zeilen, die viele bindende SPOTs aufweisen, erkennt man Positionen des Ausgangspeptids, die verschiedene Aminosäuren tragen können, ohne daß die Bindung zum Antikörpers verloren geht (in Abb. 4 die oberen beiden Zeilen, die eine Austauschbarkeit der N-terminalen Valin-Bausteine signalisieren). Im Gegensatz dazu zeigen Zeilen, die nur wenige bindende SPOTs aufweisen, nicht oder nur eingeschränkt substituierbare Schlüsselpositionen an (im gezeigten Beispiel die fünf C-terminalen Positionen SHFND). Synthese und Screening der gezeigten Peptid-Bibliothek erforderte dabei den vergleichsweise geringen Zeitaufwand von ca. zwei Tagen.

Abb. 4: Substitutionsanalyse des Hepta-Peptids VVSHFND: 140 (7 x 20) Hepta-Peptide zzgl. 7 Kopien des Wildtyps (wt) wurden an einer Zellulosemembran (6 x 13 cm) synthetisiert und mit dem Antikörper mAk Tab-2 inkubiert. Dunkel gefärbt sind diejenigen SPOTs erkennbar, an denen Peptide durch den Antikörper gebunden wurden. Sie unterscheiden sich in genau einer Aminosäure (hervorgehoben in den exemplarisch angegeben Sequenzen).[ 41 ]


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Das Potential der SPOT-Synthese liegt in der schnellen, parallelen Synthese einer großen Zahl von Substanzen in Verbindung mit der Anwendbarkeit der Bibliotheken in direkten und wenig aufwendigen Bindungsstudien. Durch die Kombination von Synthese und Screening an einem Träger läßt sich die Isolierung und Charakterisierung einzelner Substanzen auf aktive Verbindungen beschränken.[ 43 ] Durch die frei wählbare Größe und Anordnung der SPOTs auf der Membran lassen sich die Bibliotheken zudem an die Anforderungen von Synthese und Screening anpassen. Mit der Methode konnten bindende Peptide in einer großen Vielzahl von Experimenten gefunden werden.[ 41 , 44 - 47 ] Dennoch wurde die SPOT-Methode an Zellulose bislang noch nicht auf die Synthese von nicht-peptidischen Verbindungen angewendet.

1.2 Zielsetzung

Ziel dieser Arbeit war es, die Methoden des SPOT-Verfahrens auf Synthese und Screening von Peptidmimetika zu erweitern. Das Potential der Methode - hochparallele Synthese in Verbindung mit guten Eigenschaften in Protein-Bindungs-Studien - sollte damit neuen, nicht-peptidischen Stoffklassen zugänglich gemacht werden.

(1) Peptoid-Synthese an Zellulosemembranen

Zunächst sollten Peptidmimetika untersucht werden, die bereits zuvor an fester Phase synthetisiert wurden und die in kombinatorisch-chemischen Projekten zu bioaktiven Verbindungen geführt haben. Dabei mußte berücksichtigt werden, daß nicht alle Synthesebedingungen, die bei Festphasensynthesen möglich sind, auf die Bedingungen der SPOT-Synthese übertragbar sind. Die Reaktionen erfolgen hierbei in einem offenen System, so daß Reagenzien zusammen mit dem Lösungsmittel verdampfen können und zudem der umgebenden Atmosphäre (Feuchtigkeit und Sauerstoff) ausgesetzt sind. Die Reaktionen an Zellulose müssen darüberhinaus mit freien Hydroxygruppen vereinbar sein, die in großer Zahl an der Membran vorhanden sind.

Besonders geeignet für diesen Ansatz war die Synthese von Oligo-N-alkylglycinen 2 (Peptoiden). Dabei sollte die 1992 von R.N. Zuckermann et al. beschriebene Sub-Monomer-Methode angewendet werden, bei der die N-Alkylglycine 6 in einem zweistufigen Prozeß durch Bromacetylierung eines festphasengebundenen Amins 3 zum Bromacetamid 4 und anschließende Bromsubstitution mit einem primären Amin 5 aufgebaut werden ( Schema 1 ).[ 12 ]

Schema 1: Sub-Monomer-Synthese von Peptoiden nach R.N. Zuckermann et al.[ 12 ]


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Die Peptoid-Synthese erfordert hohe Aminkonzentrationen, die bei der Verwendung von Linkern auf Ester-Basis, wie sie in der SPOT-Synthese von Peptiden üblich sind, zu einer unerwünschten, vorzeitigen Abspaltung der Peptoide führen würden. Mit esterfrei aminoderivatisierten Membranen 9, die durch Alkylierung von Zellulose (7) mit Epoxiden 8 ( Schema 2 ) zugänglich sind, lassen sich Ester vermeiden.[ 48 ] Um eine für die Peptoid-Synthese geeignete Membran zu erhalten, sollte auf dieser Basis eine Derivatisierungsmethode entwickelt werden, die höhere Derivatisierungsgrade zwischen 0.5 und 1.0 µmol/cm2 ermöglicht. Im Anschluß galt es, ein geeignetes Linkersystem zu etablieren.

Schema 2: Esterfreie Aminoderivatisierung von Zellulose nach R. Volkmer-Engert et al.[ 48 ]
(SG = Schutzgruppe).

Die Bedingungen der Peptoidsynthese sollten durch Variation beteiligter Parameter, wie der Bromessigsäureaktivierung, der Aminkonzentration und der Art des Lösungsmittels, anhand der Synthese des Tripeptoids 16 optimiert werden. Ein Schwerpunkt sollte dabei die Untersuchung von Aktivierungsmethoden für Bromessigsäure sein. Dazu waren die Reaktivitäten einiger Aktivester der Bromessigsäure [Bromessigsäurepentafluorphenylester (10), -2,4-dinitrophenylester (11), -4-nitrophenylester (12), -N-succinimidylester (13), -benzotriazol-1-ylester (14) und -7-azabenzotriazol-1-ylester (15)] mit den Synthesebedingungen der Peptoidsynthese am Harz (Bromessigsäure/DIC) zu vergleichen.

Um die unerwünschte Acylierung freier Hydroxyfunktionen der Zellulosemembran im Verlauf der Synthese abschätzen zu können, sollte die N/O-Selektivität der Bromacetylierung untersucht werden. Dazu sollte das Hydroxytripeptoid 17 synthetisiert und der dabei durch O-Acylierung gebildete Anteil des seitenkettenacylierten Nebenproduktes 18 ermittelt werden.


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Die Synthese von Peptoid-Bibliotheken sollte schließlich durch die ausführliche Untersuchung der Anwendbarkeit primärer Amine (R-NH2) in der SPOT-Synthese von Modelltripeptoiden 19 vorbereitet werden.

(2) Identifizierung bioaktiver Peptoide de novo

Nach der Evaluierung der SPOT-Synthesebedingungen galt es, Peptoid-Bibliotheken zu synthetisieren und auf Protein-Bindung zu untersuchen. Als Modellsystem sollte der auf Peptidebene gut untersuchte monoklonale Antikörper Tab-2 angewendet werden.[ 41 , 42 , 49 , 50 ] Eine Tri- und eine Hexapeptoid-Bibliothek mit jeweils 8000 Verbindungen sollten synthetisiert werden, um bindende Peptoide de novo zu finden. Aktive Substanzen sollten am Syntheseharz resynthetisiert und die Affinitäten zum Antikörper mittels Oberflächen-Plasmonenresonanz quantitativ bestimmt werden.

(3) Rückgratmodifizierte Peptoide

Das Sub-Monomer-Synthesekonzept sollte erweitert werden, indem Bromessigsäure in Modelltrimeren 20 durch eine Reihe von Biselektrophilen im Sinne eines „chemischen Screenings“ ersetzt wird. Auf diese Weise sollte versucht werden, andere pseudo-biopolymere Strukturelemente[ 51 ] wie N-Alkylalanine, N-Alkyl-beta-alanine, Carbamate, Benzoesäuren und Harnstoffe in das Peptoidkonzept einzufügen.


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(4) Synthese von Heterocyclen an Zellulosemembranen

Im Verlauf der Arbeit sollten Wege gefunden werden, heterocyclische Strukturen, die im Hinblick auf pharmakologische Anwendungen von besonderem Interesse sind[ 52 ], mittels SPOT-Synthese aufzubauen. Dabei wäre es günstig, die Synthese in das Sub-Monomer-Synthesekonzept einzufügen.


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