Heine, Helge Niklas: Peptidmimetika an Zellulosemembranen - SPOT-Synthese und Screening kombinatorischer Peptoid-Bibliotheken

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Kapitel 2. Von Peptiden zu Peptidmimetika

Der Weg zur SPOT-Synthese von Peptoiden

2.1 Peptid-Synthese an fester Phase

Die Synthese an fester Phase wurde 1963 von R.B. Merrifield in die Peptidchemie eingeführt.[ 25 ] Die Peptide werden beim Festphasen-Verfahren gewöhnlich vom C- zum N-Terminus schrittweise aufgebaut ( Schema 3 ). Ein Synthesecyclus beginnt mit der Aktivierung eines N-terminal geschützten Aminosäure-Bausteins. Funktionelle Gruppen in den Seitenketten müssen mit orthogonalen Schutzgruppen versehen sein, die bis zum Ende der Synthese stabil sind. Die aktivierte Aminosäure wird mit dem N-Terminus des festphasengebundenen Peptids zur Reaktion gebracht. Als feste Phasen werden gekörnte unlösliche Syntheseharze auf Polystyrol-Basis verwendet, an die die wachsende Peptidkette über ein Linkermolekül kovalent gebunden ist. Nach erfolgreicher Kopplung wird überschüssiges Reagenz durch Waschen entfernt und die N-terminale Schutzgruppe abgespalten, so daß ein neuer Kopplungscyclus beginnen kann. Ist der letzte Baustein eingeführt, werden die Schutzgruppen von den Seitenketten entfernt und das Peptid meistens gleichzeitig durch Spaltung des Linkers vom Harz abgelöst. Aus der Abspaltlösung wird das Peptid isoliert und gereinigt.

Schema 3: Syntheseschema zur Peptid-Synthese an fester Phase.


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Verglichen mit der Peptid-Synthese in homogener Lösung sind mit dem Festphasenverfahren deutlich längere Oligomere in kürzerer Zeit synthetisierbar. Die sonst nach jedem Syntheseschritt erforderliche - meist chromatographische - Aufreinigung wird bei der Festphasensynthese durch einfaches Waschen der Harzkügelchen ersetzt. Die Zeit für einen Kopplungscyclus wird so erheblich verkürzt. Zwar können Nebenprodukte, wie sie etwa durch unvollständige Reaktionen entstehen, nicht abgetrennt werden, dieser Nachteil kann jedoch durch die Anwendung hoher Reagenzienüberschüsse sowie Mehrfachkopplungen minimiert werden. Reaktionen lassen sich auf diese Weise zur Vollständigkeit bringen. Die so für jeden Reaktionsschritt erreichbaren hohen Ausbeuten sind eine notwendige Voraussetzung zur Synthese längerer Oligomere, da anderenfalls keine zufriedenstellenden Produktausbeuten erwartet werden können ( Tab. 1 ).

Tab. 1: Abhängigkeit der Gesamtausbeute aufeinanderfolgender Reaktionen von der Ausbeute der Einzelreaktionen.

Ausbeute pro Kopplungsschritt [%]

Anzahl der Kopplungsschritte

Gesamtausbeute [%]

90

1

90

90

10

35

90

15

21

99

1

99

99

10

90

99

15

86

Seit der Einführung der 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-Schutzgruppe (Fmoc-Gruppe)[ 53 ] hat die Fmoc/tBu-Schutzgruppenstrategie in der Peptid-Synthese eine sehr große Bedeutung erlangt[ 1 , 26 ] ( Abb. 5 ). Die basenlabile Fmoc-Gruppe schützt dabei den N-Terminus und wird am Ende jedes Cyclus mit einem sekundären Amin (z.B. Piperidin) abgespalten. Funktionelle Gruppen in den Seitenketten werden mit säurelabilen Schutzgruppen wie z.B. der tert-Butyloxycarbonyl- (Boc-), der tert-Butyl- oder der Trityl-Gruppe (Trt-) geschützt. Als säurelabile Linker werden neben anderen der Rink-Linker 21 zur Erzeugung von C-terminalen Amiden sowie der Wang-Linker 22 für freie Carbonsäuren häufig verwendet.[ 26 ]


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Abb. 5: Schutzgruppenstrategie für die Synthese von Peptid-Amiden nach der Fmoc / tBu-Schutzgruppenstrategie [R = Seitenkette einer Aminosäure mit Hydroxy- oder Carboxy-Funktionalität (z.B.: R = CH2 für Ser); das Peptid ist farbig hervorgehoben].

Die Aminosäurebausteine können auf verschiedene Arten aktiviert werden, um den festphasengebundenen N-Terminus zu acylieren.[ 54 ] Dabei muß die Aktivierung eine schnelle Amidbildung ohne Nebenreaktionen gewährleisten. Zusätzlich muß die alpha-chirale Aminosäure vor Racemisierung geschützt werden, die besonders im aktivierten Zustand und unter Einwirkung von Basen auftreten kann. Geeignet aktivierte Derivate der Aminosäuren sind die sogenannten Aktivester. Sie basieren auf Hydroxyverbindungen, die gute Abgangsgruppen darstellen, wie beispielsweise das 1-Hydroxybenzotriazol 23, 7-Aza-1-hydroxybenzotriazol 24, Pentafluorphenol 25 oder N-Hydroxysuccinimid 26.

In der Peptid-Synthese hat sich die Aktivierung unter Zuhilfenahme von Reagenzien bewährt, die die entsprechenden Aktivester in situ generieren ( Abb. 6 , oben).[ 54 ] In einem zweistufigen Prozeß reagiert zunächst das von einer in stöchiometrischen Mengen zugesetzten Hilfsbase [z.B. Diisopropylethylamin (DIEA)] deprotonierte Aminosäurecarboxylat 27 mit dem elektrophilen Zentrum des Aktivierungsreagenzes. Im Anschluß wird der Aktivester 28 durch einen nukleophilen Angriff der freigesetzten N-Hydroxyverbindung an der Carbonylgruppe der Aminosäure unter Freisetzung einer stabilen Abgangsgruppe [Tetramethylharnstoff (29) bei TBTU / HATU oder Tris(N,N-tetramethylen)phosphorsäuretriamid bei PyBOP] gebildet ( Abb. 6 , unten).


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Abb. 6: Oben: Auswahl von Kopplungsreagenzien in der Peptid-Synthese. Unten: Mechanismus der in situ-Aktivierung am Beispiel der Aktivierung einer Fmoc-Aminosäure mit TBTU.

2.2 SPOT-Synthese von Peptiden

Die Peptid-Synthese an Zellulose wurde 1988 praktisch gleichzeitig von R. Frank et al.[ 55 ] und J. Eichler et al.[ 56 ] beschrieben. In der Gruppe von R. Frank wurde die Methode 1992 dahingehend erweitert, daß auf einer Membran nebeneinander lokal begrenzte, runde Reaktionsbereiche, sogenannte SPOTs, erzeugt wurden, indem kleine Mengen der Reagenzienlösungen tropfenweise aufgetragen wurden ( Abb. 7 ).[ 39 , 44 ] Auf diese Weise ist die parallele Synthese verschiedener Substanzen an einer zusammenhängenden Membran möglich.[ 57 - 60 ] Die Größe der SPOTs und damit die mögliche Anzahl parallel synthetisierbarer Verbindungen ist vom pipettierten Volumen, der Benetzbarkeit der Membran, sowie von Flüchtigkeit und Viskosität des Lösungsmittels abhängig.

Abb. 7: Schematische Darstellung der SPOT-Synthese.


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Zellulose besitzt als lineares Polysaccharid freie Hydroxyfunktionen, die zur kovalenten Immobilisierung der zu synthetisierten Verbindungen genutzt werden (vergl. M. Lebl in Lit.[ 61 ]). Sie können beispielsweise mit einer Aminosäure wie Fmoc-beta-Alanin verestert werden ( Abb. 8 ).[ 39 , 62 ] Am N-Terminus läßt sich nach Abspaltung der Fmoc-Gruppe ein Peptid synthetisieren. Dazu haben sich die kommerziell erhältlichen Fmoc-Aminosäurepentafluorphenylester in einem schwerflüchtigen Lösungsmittel wie N-Methylpyrrolidon (NMP) bewährt.[ 42 , 58 ] Sie reagieren schnell zu den gewünschten Amiden, ohne Ester mit den freien Hydroxyfunktionen der Zellulose zu bilden, insbesondere wenn sie, wie bei der SPOT-Synthese üblich, in Abwesenheit von Basen eingesetzt werden. Diese Chemoselektivität (N/O-Selektivität) ist eine wichtige Voraussetzung für eine Oligomeren-Synthese an Zelluloseträgern.

Abb. 8: Derivatisierung von Zellulose für die SPOT-Synthese von Peptiden (1) und Definition der SPOTs durch die erste Pipettierung einer Aminosäure (2). Durch Acetylierung (e) werden freie Aminogruppen zwischen den SPOTs blockiert und können nicht mehr durch Bromphenolblau (BPB) angefärbt werden. a) Fmoc-betaAla-OH / DIC / NMI, 12 h; b) 20% Piperidin / DMF; c) BPB / MeOH; d) Fmoc-beta-Ala-OPfp (SPOT-weise); e) Ac2O / DIEA / DMF.

Die Peptid-Synthese erfolgt an Zellulose analog zur Synthese an Harzen (vergl. Abschnitt 2.1 ). Die beiden Synthesestrategien sind in Tab. 2 gegenübergestellt. Hauptunterschied besteht in einer anderen Linkerstrategie, da zellulosegebundene Peptide oft an der Membran immobilisiert bleiben. Ein willkommener Nebeneffekt der miniaturisierten Synthese ist der geringe Reagenzienbedarf pro SPOT und damit pro Peptid, was die Kosten der Methode begrenzt. Das Pipettieren der Reagenzien kann dabei mit einem Pipettierroboter automatisch erfolgen ( Abb. 3 , Seite 3). Mit der dadurch erreichbaren Präzision lassen sich bis zu 8.000 SPOTs auf einer Membran der Größe 19 x 28 cm parallel synthetisieren.[ 58 ]

Ein großes Potential der SPOT-Synthese liegt in der Möglichkeit, Substanzen hochparallel zu synthetisieren und anschließend direkt auf Bindung zu testen. Dabei bleiben die Substanzen membrangebunden, so daß die Identität von aktiven Verbindungen sofort anhand der Position auf der Membran abgelesen werden kann (örtliche Adressierung).


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Tab. 2: Vergleich gängiger Synthesebedingungen für die Peptid-Synthese an Syntheseharzen und der SPOT-Synthese an Zellulose.

 

Peptid-Synthese an

 

Syntheseharzen

Zellulose (SPOT-Synthese)

Feste Phase

Polystyrol- oder Polystyrol-Polyethylenglycol-Harz

Zellulosemembran

Linker

Rink-, Wang- oder HMB-Linker (zahlreiche weitere Möglichkeiten[ 63 ])

beta-Alanin (Esterbindung zum Träger), Rink- oder Photo-Linker sowie HMB-[ 48 ] und Safety-Catch-Linker[ 64 , 65 ]

Schutzgruppenstrategie

Fmoc / tBu oder Boc / Bzl

Fmoc / tBu

Aminosäure-Aktivierung

Aktivierung in situ (z.B. TBTU, PyBOP)

Aminosäurepentafluorphenylester oder basenfreie Aktivierung in situ (z.B. DIC/HOBt)

Automatisierung

Vollautomatisch

Halbautomatisch (manuelle Wasch-Schritte)

Abspaltung vom Träger

Meistens zusammen mit den Seitenketten-Schutzgruppen

Nach der Abspaltung der Seitenketten-Schutzgruppen (Wahrung der Ortsadressierung)

Maßstab

< mg bis mehrere g / Peptid

25 - 100 µg / SPOT

Reagenzienbedarf

100 mg bis mehrere g / Peptid

mg / SPOT

Bei Verwendung eines geeigneten Linkers läßt sich die kovalente Bindung zum Träger lösen, ohne die räumliche Zuordnung zu verlieren: Die Anwendung der abspaltenden Reagenzien in der Gasphase (z.B. Ammoniak bei Ester-Linkern[ 59 , 66 ]) führt zu Produkten, die nach der Abspaltung noch adhäsiv am Träger gebunden bleiben. Solche SPOTs können ausgestanzt und die anhaftende Substanz mit einem Lösungsmittel abgelöst werden. Diese Vorgehensweise ist vor allem für Bindungsstudien in homogener Lösung oder für analytische Untersuchungen (z.B. HPLC/MS) interessant.

Mit den Mitteln der SPOT-Synthese und anschließendem Screening konnten zahlreiche bioaktive Peptide unter Anwendung verschiedener Bindungsexperimente[ 67 ] identifiziert werden - im allgemeinen vor dem Hintergrund der Analyse von Protein-Protein Wechselwirkungen ( Tab. 3 )[ 47 ]:


    15

  1. Als sehr erfolgreich erwies sich die Identifizierung und Charakterisierung des bindenen Bereiches (Epitops) eines Proteins A mit bekannter Aminosäuresequenz durch Analyse der Bindung des Partners B an zellulosegebundene Teilsequenzen von A ( Abb. 9 ). Ein dazu häufig angewendetes Vorgehen ist die Lokalisation des bindenden Bereiches mittels Analyse kurzer Peptide (6-15 Aminosäuren), deren Sequenzen die Primärsequenz des zu untersuchenden Proteins durch überlappende Sequenzen überspannen (Epitop-Kartierung mittels überlappender Peptide).[ 68 ] Aus der Analyse der bindenden Peptide erhält man einen oder mehrere Bereiche, die das kontinuierliche bzw. diskontiuierliche Epitop anzeigen. Insbesonders letzterer Bindungstyp ist auf der Basis herkömmlicher Methoden (z.B. ELISA) nur schwer nachzuweisen, da die

    Tab. 3: Methoden zur Identifizierung bioaktiver Substanzen durch Bindungsstudien mit Peptiden, die mittels SPOT-Synthese hergestellt wurden (F = Heterogene (Festphasen-) Bindungsstudie; H = Bindungsstudie in homogener Phase).

    Nr.

    Methode

    Typ

    Analysierte Wechselwirkungen/Effekte

    1

    Identifizierung von Protein/Protein-Wechselwirkungen

    F

    Kontinuierliche Epitope:
    Antikörper-Antigen Wechselwirkung[ 39 , 42 , 69 - 71 ]
    Substrat-Spezifität von Chaperones[ 72 , 73 ]
    Bindungs-Spezifität von Protein-Domänen[ 74 , 75 ]

    Diskontinuierliche Epitope:
    Antikörper-Antigen Wechselwirkung[ 71 , 76 - 78 ]
    Cytokin-Rezeptor Wechselwirkung[ 79 - 81 ]

    Sonstiges[ 82 , 83 ]; Übersichten[ 41 , 45 , 46 ]

    2

    Wissensbasiertes Liganden-Design: Protein-mimetische Peptide

    F

    Affinitätserhöhung durch Kombination getrennter Bereiche eines diskontinuierlichen Epitops[ 77 , 78 ]

    3

    Transformation von Peptiden

    F

    L- in D-Peptid[ 84 , 85 ]
    L-Peptid in unverwandtes L-Peptid[ 86 , 87 ]

    4

    Identifizierung von Enzym-Aktivitäten

    F

    Kinase-Aktivität[ 88 - 90 ]
    Protease-Aktivität[ 91 - 93 ]

    5

    De novo-Identifizierung bindender Peptide

    F

    Protein-Bindung[ 50 , 90 , 94 ] (Übersichten[ 42 , 44 , 45 , 95 ])

    Metall-Bindung[ 42 , 96 ] (Übersicht[ 41 ])

    DNA- Bindung[ 97 ]

    6

    Bindungsstudien mit intakten Zellen

    H

    T-Zell-Epitope[ 98 - 100 ]
    Inhibierung des HIV-Eintritts[ 101 ]
    Antibiotische Wirkung von Peptiden[ 102 ]


    16

    Bindungsaffinitäten der Teil-Epitope vergleichsweise gering sind. Erst die Eigenschaft zellulosegebundener Peptide, auch sehr schwache Bindungen (bis in den mM Bereich[Auskommentiertes Element 59 ]) zu signalisieren, macht diese Daten zugänglich.[Auskommentiertes Element 45 ] An die Identifizierung schließt sich meistens die Analyse der Schlüsselaminosäuren im Rahmen einer Substitutionsanalyse an (ein Beispiel ist in Abb. 4 , Seite 4 gezeigt).

    Abb. 9: Veranschaulichung kontinuierlicher und diskontinuierlicher Protein-Protein Kontakte bei der Wechselwirkung zwischen zwei Proteinen A und B.

  2. Zur Affinitätserhöhung bekannter Peptide lassen sich mit Hilfe der SPOT-Synthese in wissensbasierten Ansätzen proteinmimetische Peptide identifizieren, beispielsweise indem zwei Peptide eines diskontinuierlichen Epitops mit einer Linkereinheit verbunden werden.
  3. Ebenfalls zur Optimierung von bindenden Peptiden eignet sich die schrittweise Transformation eines L-Peptids in ein D-Peptid unter Erhalt der Aktivität, die insbesondere im Hinblick auf die Entwicklung von pharmakologisch interessanten, proteasestabilen Peptid-Wirkstoffen von Interesse ist.
  4. Auch Enzymaktivitäten, wie die Substratspezifität von Proteasen und Kinasen, konnten mit Peptiden aus der SPOT-Synthese gezeigt werden.
  5. Die Anwendung kombinatorischer Bibliotheken ermöglichte die Identifizierung von bindenden Peptiden, ohne Vorinformationen in die Untersuchung einzubringen, was besonders in Hinblick auf die Identifizierung neue Leitstrukturen von Interesse ist. Auf diese Weise konnten bindende Peptide für Proteine, Metalle und DNA gefunden werden.
  6. Schließlich konnte das Potential der hochparallelen Synthese auch für die Bereitstellung von freien Peptiden genutzt werden, die in Bindungsstudien in homogener Phase eingesetzt wurden. Auf diese Weise konnten Wechselwirkungen an intakten Zellen des Immunsystems untersucht sowie antibiotische Peptide identifiziert werden.


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2.3 Peptoid-Synthese an Syntheseharzen

Ziel dieser Arbeit war es, die Methoden der SPOT-Synthese auf Synthese und Screening von Peptidmimetika anzuwenden um neue Stoffklassen dem umfangreichen Potential der Methode zugänglich zu machen. Besonders geeignet für diesen Ansatz erschienen Oligo-N-alkylglycine (Peptoide 2), die 1992 von R.J. Simon et al. als neue, in modularer Weise zugängliche, Peptidmimetika beschrieben wurden[ 11 ]. Ihre Festphasensynthese ist nach zwei verschiedenen Methoden möglich ( Schema 4 ):

  1. Die Monomer-Methode ist der Peptid-Synthese[ 26 ] nach der Fmoc/tBu-Strategie analog.[ 11 , 103 ]
  2. Bei der Sub-Monomer-Methode wird jeder Baustein in einer Sequenz aus Bromacetylierung und nukleophiler Substitution des Halogens durch ein primäres Amin eingeführt.[ 12 , 104 ]

Schema 4: Synthese von Peptoiden an fester Phase A) nach der Monomer-Methode oder B) nach der Sub-Monomer-Methode.

Die Synthesebedingungen der Monomer-Methode sind denen der Peptidchemie sehr ähnlich, wenngleich die Kopplung des Monomers mit der sekundären Aminofunktion einer N-terminalen N-Alkylglycin-Einheit drastischere Bedingungen erfordert[ 105 ] (Mehrfachkopplungen mit PyBOP[ 11 ] oder die Verwendung des reaktiveren PyBroP[ 11 , 16 , 17 , 103 , 106 ]). Die benötigten Fmoc-N-alkylglycin-Bausteine 34 sind aus primären Aminen 23 (1.) durch reduktive Aminierung von Glyoxalsäure 30 oder (2.) nukleophile Substitution an Halogenessigsäureester 31 sowie (3.) aus Aldeyden 32 durch reduktive Aminierung von Glycinestern 33 zugänglich[ 11 , 16 , 103 , 107 ] ( Schema 5 ).


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Schema 5: Synthese von Peptoid-Monomerbausteinen. a) H2/Pd in H2O, pH = 6 oder NaBH3CN;
b) NaOH in H2O/CH3CN (R = organischer Rest mit geeignet geschützten funktionellen Gruppen. X = Br, Cl).

Mit der Sub-Monomer-Methode stellten R.N. Zuckermann et al. 1992 einen alternativen Zugang zu Peptoiden vor.[ 12 , 104 ] Hierbei tritt an die Stelle der Monomerkopplung eine zweistufige Synthesesequenz aus Bromacetylierung und nukleophiler Substitution des Halogens mit einem primären Amin (Vergl. B in Schema 4 ). Da eine sehr große Zahl primärer Amine kommerziell erhältlich ist (> 13.000, davon > 1.000 unter 10 DM/g[ 108 ]), lassen sich Peptoide auf diese Weise ohne vorangehende Synthese der Bausteine gewinnen. Das Arbeiten mit großen Überschüssen ermöglicht zudem den Einsatz von weniger reaktiven Aminen (wie z.B. Anilinen). Durch die Immobilisierung der Bromacetamide ist die in homogener Lösung häufig auftretende Mehrfachalkylierung der Amine weitgehend unterdrückt.

Die Methoden der Peptoidchemie eignen sich nicht nur zur Synthese reiner Oligo-N-alkylglycine, sondern auch zur Darstellung von Hybrid-Verbindungen aus Peptiden und Peptoiden (sogenannten Peptomeren).[ 17 , 106 , 109 , 110 ] Als peptidmimetischer Ansatz in der SPOT-Synthese sind Peptoide daher von besonderem Interesse.

2.4 Stukturelle Eigenschaften von Peptoiden

Peptoide sind Isomere der Peptide und gehen formal aus ihnen durch eine Verlagerung der Seitenkette vom alpha-C-Atom an den Amid-Stickstoff unter Aufgabe der Chiralität hervor. Neben der strukturellen Ähnlichkeit weisen sie aber auch einige Unterschiede zu Peptiden auf (vergl. Tab. 4 ). Möchte man beispielsweise die relative Anordnung der Seitenketten zu den Carbonylfunktionen erhalten, so entspricht einem vorgegebenen Peptid die Retro-Sequenz des Peptoids[ 11 ]:


19

Darüberhinaus resultieren aus der Dialkylierung der Amidbindung Unterschiede zu Peptiden: Zum einen stehen Peptoiden keine Amid-Protonen im Rückgrat mehr zur Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen zur Verfügung, was die Bildung einiger aus der Peptidchemie bekannter, charakteristischer Strukturelemente wie z.B. beta-Schleifenstrukturen verhindert. Zum anderen besitzen die beiden Amidbindungskonformere bei Peptoiden im Gegensatz zu den überwiegend s-trans konfigurierten Peptiden vergleichbare Energien (DeltaG° < 8.4 kJ/mol für Prolin[ 111 ]), so daß eine größere Flexibilität möglich ist ( Schema 6 ; die Isomere, die durch die gehinderte Rotation um die Amid C-N-Bindung entstehen, werden im folgenden als einfache cis/trans-Isomere bezeichnet).

Schema 6: Amidbindungskonformere bei Peptiden und Peptoiden.

Erwartungsgemäß verhalten sich N-Alkylglycine aufgrund der fehlenden Amidprotonen in Oligomeren prolinähnlich.[ 112 , 113 ] Bei Peptoiden mit chiralen Seitenketten konnten bereits ab einer Oligomerenlänge von fünf Bausteinen alpha-helikale Strukturen NMR-spektroskopisch nachgewiesen werden.[ 114 ] Gestützt wurden die Ergebnisse durch Untersuchungen zum Circulardichroismus[ 115 ] sowie durch Berechnungen[ 116 ]. Erschwert durch das Auftreten von cis/trans-Amid-Isomeren wurden die Strukturen von Peptoiden in mehreren Untersuchungen auf der Basis von NMR-Spektroskopie[ 115 ] und Berechnungen analysiert[ 11 , 108 , 117 , 118 ] und mit Peptiden verglichen. Dabei wurde deutlich, daß Peptoide sowohl peptidähnliche als auch peptoidspezifische Sekundärstrukturen ausbilden können.


20

Auf den strukturellen Eigenschaften basiert ein entscheidender biochemischer Unterschied: die Stabilität der Peptoide gegenüber Proteasen.[ 11 , 16 , 23 ] Daraus resuliert eine im Vergleich zu Peptiden deutlich höhere in vivo Stabilität, wie am Beispiel eines Tripeptoids in Ratten nach Injektion gezeigt werden konnte.[ 24 ]

In Tab. 4 sind Eigenschaften von Peptiden und Peptoiden zusammengefaßt:

Tab. 4: Vergleichende Gegenüberstellung einiger Eigenschaften von Peptiden und Peptoiden.

Peptide

Peptoide

Chirales Oligomeren-Rückgrat
(außer Gly)

Achirales Oligomeren-Rückgrat

Möglichkeit zur Bildung inter- und intramolekularer Wasserstoffbrücken mit Amid-Protonen

Keine Möglichkeit zur Bildung von Rückgrat-Wasserstoffbrückenbindungen

Trans-Amidgeometrie (außer Pro)

Cis- und trans-Amid-Isomere im Gleichgewicht[ 119 ]

Tendenz zur Sekundärstrukturbildung

Sekundärstrukturen an Beispielen nachgewiesen

Leicht spaltbar durch Proteasen (geringe metabolische Stabilität)

Proteasestabil (in vitro und in vivo)

2.5 Vorgehensweise auf dem Weg zur Peptoid-Synthese an Zellulose

Verglichen mit der Synthese an Harzen müssen bei der SPOT-Synthese an Zellulose spezielle Umstände berücksichtigt werden:

  1. Die Reaktionszeit ist durch die Verdampfung des Lösungsmittels begrenzt.
  2. Die Reaktionen erfolgen in einem offenen System, d.h. Luftfeuchtigkeit und Sauerstoff können auf die Reagenzien einwirken.
  3. Die Reaktionstemperatur entspricht stets der Umgebungstemperatur.
  4. Freie Hydroxy-Gruppen der Zellulosemembran können die Reaktionen negativ beeinflussen.

Mögliche Schwierigkeiten, die auf den speziellen Bedingungen der SPOT-Synthese basieren, sollten mit geeigneten Maßnahmen umgangen werden.

Im Vergleich der Monomer- mit der Sub-Monomer-Methode zum Aufbau von Peptoiden erschien die Sub-Monomer-Methode für die SPOT-Synthese geeigneter zu sein:

  1. Die Acylierungsbedingungen, wie sie für die Monomer-Methode zur Kopplung an den N-terminalen N-Alkylglycin-Baustein benötigt werden, können zu einer unerwünschten Esterbildung mit der Zellulose führen. Im Falle der Sub-Monomer-Methode tritt Bromacetylierung an die Stelle der

    21

    aktivierten Aminosäure. Es bestand die Aussicht, aufgrund ihres geringeren sterischen Anspruchs und der höheren Acidität der freien Säure ein ausreichend N/O-selektives Aktivderivat der Bromessigsäure finden zu können.
  2. Basierend auf der Vielzahl kommerziell erhältlicher Amine werden Peptoid-Bibliotheken zugänglich, die aus Verbindungen bestehen, die nur eine geringe Ähnlichkeit aufweisen. Diese hohe Diversität kann dabei ohne eine zeitaufwändige Synthese von Bausteinen errreicht werden.

Die Unterschiede zur Peptid-Synthese machten eine detaillierte Untersuchung der einzelnen Schritte auf dem Weg zur SPOT-Synthese von Peptoiden erforderlich:

  1. Prüfung der standardmäßig verwendeten Zelluloseträger auf ihre Eignung in der Peptoid-Synthese.
  2. Etablierung geeigneter Linker-Strategien.
  3. Optimierung der Aktivierung von Bromessigsäure im Hinblick auf die Bedingungen der SPOT-Synthese (N/O-Selektivität).
  4. Auswahl und Test von primären Aminen, die zu möglichst diversen Oligomeren-Bibliotheken führen.
  5. Untersuchungen zur Synthetisierbarkeit umfangreicher Peptoid-Bibliotheken.

Die einzelnen Punkte werden im folgenden dargelegt.


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