Heine, Helge Niklas: Peptidmimetika an Zellulosemembranen - SPOT-Synthese und Screening kombinatorischer Peptoid-Bibliotheken

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Kapitel 3. Peptoid-Synthese an Zellulosemembranen

3.1 Derivatisierung der Zellulose für die Peptoid-Synthese

Zellulosemembranen sind stabil gegenüber den meisten Lösungsmitteln (z.B. DMF, DMSO, NMP, MeOH, H2O, CH2Cl2, Et2O), auch wenn diese bei erhöhter Temperatur angewendet werden (z.B. 80°C oder Mikrowellen-Bestrahlung). Gegenüber basischen Bedingungen ist Zellulose ebenfalls weitgehend stabil: eine mehrstündige Behandlung mit methanolischer Natriummethylat-Lösung oder mit erwärmten konzentrierten Aminen ist problemlos möglich. Lediglich Hydrazin-Lösungen vermögen sie langsam zu zersetzen. Behandlung mit Säuren zersetzt Zellulose in Abhängigkeit von Konzentration, Wassergehalt, Temperatur und Zeit. Die Membranstruktur bleibt jedoch bei Bedingungen der Seitenkettenschutzgruppen-Abspaltung in der Peptid-Synthese (z.B. 90% Trifluoressigsäure) ausreichend stabil, wenn auf mechanische Belastungen wie Schütteln des Reaktionsgefäßes und zu lange Reaktionszeiten (> 2 Stunden) verzichtet wird.[ 59 ]

Um Zellulose in eine für die SPOT-Synthese geeignete Form zu bringen, müssen einige der Hydroxyfunktionen in reaktivere Gruppen überführt werden. Die dazu am häufigsten verwendete Methode ist die Veresterung mit einer Aminosäure zur Einführung von Aminogruppen.[ 39 , 62 , 120 ] Esterbindungen mit Zellulose sind gegenüber den Bedingungen der Peptidsynthese nach der Fmoc/tBu-Strategie, insbesondere der Fmoc-Schutzgruppenabspaltung mit Piperidin, stabil. Ammoniak vermag sie jedoch, vermutlich aufgrund seines geringen sterischen Anspruchs, zu spalten, was man sich in der Abspaltung zellulosegebundener Peptide mit gasförmigem Ammoniak zu Nutze macht.[ 59 , 66 ] Beim Aufbau von Peptoiden nach der Sub-Monomer-Methode kommen primäre Amine in hoher Konzentration (1-2 M) zum Einsatz.[ 104 ] Zusätzlich führt die Verdampfung des Lösungsmittels bei unflüchtigen Aminen dazu, daß die lokalen Aminkonzentrationen nach dem Pipettieren noch weiter ansteigen. Gerade einfache primäre Amine bringen daher, verglichen mit der Peptid-Synthese, eine zusätzliche Aminolyse-Gefahr für die Esterbindung zur Zellulosemembran mit sich. Um mögliche Aminolysen und damit eine vorzeitige Abspaltung von der Membran auszuschließen, sollte für die Peptoid-Synthese eine esterfrei derivatisierte Zellulosemembran verwendet werden.

Eine geeignete Derivatisierungsmethode stellt die Zinkchlorid-katalysierte Alkylierung von Zellulose (7) mit Epoxiden 8 dar, bei der der Anker über eine Etherbindung an die Membran gebunden ist ( Schema 7 ).[ 48 ]

Mit dieser Methode erreicht man Deriviatisierungsgrade zwischen 50 und 100 nmol/cm2. Das ist zwar für Festphasen-Bindungsstudien ausreichend, für Bindungsstudien in Lösung oder für analytische Zwecke wäre jedoch eine Derivatisierung im Bereich von 0.50-1.0 µmol/cm2 ( 0.053-0.11 mmol/g) günstiger. (Zum Vergleich: Typische Syntheseharze weisen Derivatisierungsgrade von 0.20-1.00 mmol/g auf.) Die in Schema 7 beschreibene Methode sollte im Hinblick auf die angestrebte Beladung optimiert und ggf. abgewandelt werden.


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Schema 7: Esterfreie Aminoderivatisierung von Zellulose nach R. Volkmer-Engert et al.[ 48 ]

Zellulose weist eine primäre und zwei sekundäre Hydroxyfunktionen pro Monomereinheit auf. Das Membrangewicht einer typischen Membran (Whatman 50) beträgt 95 g/m2 was einer Funktionalitätendichte von 177 µmol/cm2 (Gesamt-OH-Funktionalitätendichte) bzw. 59 µmol/cm2 (nur reaktive primäre Hydroxyfunktionen) entspricht. Die angestrebten Beladungsdichten erreicht man daher bei Annahme einer gleichmäßigen Verteilung durch Derivatisierung jeder fünfzigsten bis hundertsten Monomereinheit, was einen ausreichenden Abstand zwischen den einzelnen Zielmolekülen gewährleisten sollte.

Ein Ansatzpunkt für die Optimierung der Methode lag in der Verbesserung der Alkylierungsbedingungen. Durch die Behandlung der Membran in Instrumentenschalen läßt sich Wasser nur schlecht ausschließen, so daß die katalytische Wirksamkeit der beschriebenen Lewis-Säure (ZnCl2) herabgesetzt und schließlich unterbunden wird. Daher sollte versucht werden, einen wasserunempfindlichen Katalysator zur Aktivierung des Epoxids einzusetzen. Perchlorsäure als eine starke Brönsted-Säure mit einem wenig nukleophilen Gegenion erschien geeignet zu sein.

Ferner erwies sich die Behandlung der Zellulosemembranen mit Hydrazin-Lösungen, wie sie zur Abspaltung der Phthaloyl-Schutzgruppe benötigt werden, als nachteilig, da längere Behandlungen die Membran angreifen. Das alternativ verwendete Fmoc-geschützte Epoxid 8 (SG = Fmoc) ist nicht kommerziell erhältlich und muß in zwei Stufen aus Allylamin gewonnen werden. Für eine einfache und schnelle Membrangenerierung erschien daher das kommerziell erhältliche Epibromhydrin (35) geeigneter zu sein. Zudem sollte es in Dioxan statt in THF eingesetzt werden, um die Verflüchtigung des Lösungsmittels während der Reaktion zu verringern. Die durch Alkylierung von Zellulose (7) gewonnene Brompropyl-derivatisierte Membran 36 wurde anschließend mit einer gesättigten Lösung von Ammoniak in Methanol (ca. 4 M) zur Membran 9 umgesetzt (Derivatisierung A in Schema 8 ).


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Schema 8: Neue Methoden zur Synthese esterfrei aminoderivatisierter Zellulosemembranen.

Zur Bestimmung des Derivatisierungsgrades wurden freie primäre Aminofunktionen mit dem Pentafluorphenylester von Fmoc-geschütztem beta-Alanin (Fmoc-betaAla-OPfp; 0.6 M in DMF, 30 min) zum Amid umgesetzt. Eine Quantifizierung erfolgte durch Messung der UV-Absorption des Adduktes aus Dibenzofulven und Piperidin nach Abspaltung der Fmoc-Gruppe gemäß J. Eichler et al.[ 121 ] (epsilon301 = 8100). Die von Pentafluorphenylestern unter basenfreien Bedingungen bekannte selektive Acylierung primärer Aminogruppen neben freien Hydroxyfunktionen und sekundären Aminogruppen[ 122 , 123 ] ermöglicht dabei die präzise Messung. Es zeigte sich in mehreren Experimenten, daß mit den neuen Derivatisierungsbedingungen Beladungen zwischen 50 und 500 nmol/cm2 erreicht werden können. Um festzustellen, ob die Alkylierung oder die Substitution des Halogens die erreichbare Derivatisierung begrenzten, wurden die Massenänderungen einer Membran im Verlauf der Modifikation verfolgt. Der für diese Membran aus den gravimetrischen Daten berechnete Derivatisierungsgrad übertraf mit 1.39 µmol/cm2 den chemisch zugänglichen Wert (0.12 µmol/cm2) etwa um das 12-fache. Folgende Nebenreaktionen würden diese Beobachtung erklären (vergl. Schema 9 ):

  1. Das zunächst gebildete primäre Amin 9 ist deutlich nukleophiler als Ammoniak und reagiert mit einer benachbarten Brompropylfunktionalität 36 zum quervernetzten Amin 39. Dieses läßt sich als sekundäres Amin nicht mehr mit dem zur Quantifizierung verwendeten Fmoc-Aminosäurepentafluorphenylester nachweisen, wie Vergleichsexperimente zeigten.[ 122 , 123 ]
  2. Methanol tritt als Nukleophil auf und reagiert zum Methylether 40.
  3. Dem Halogen benachbarte Hydroxygruppen der Zellulose reagieren basenkatalysiert zu einem quervernetzten Produkt 41.
  4. Das Halogenid 36 cyclisiert als beta-Halogenalkohol unter Basenkatalyse zum Epoxid 42, das seinerseits zu den möglichen Produkten (9, 39, 40, 41) weiter reagieren kann.

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Schema 9: Mögliche Nebenreaktionen bei der Substitution des Zellulose-Brompropylethers 36 mit ges. Ammoniak in Methanol.

Eine Quervernetzung durch Reaktion primärer Amine [Reaktion (1)] wurden für die wahrscheinlichste Nebenreaktion gehalten. Auf der Basis dieser Überlegungen sollte ein nukleophileres Reagenz als Ammoniak zur Generierung der Aminogruppen eingesetzt werden. Es bot sich die Verwendung eines Alkyldiamins an. Aus einer Vielzahl kommerziell erhältlicher Reagenzien erschien das 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin (37) besonders geeignet (Derivatisierung B in Schema 8 ). Wie fast alle Diamine und im Gegensatz zu Ammoniak, der nur in Methanol oder Wasser in hoher Konzentration gelöst werden kann, läßt es sich auch in aprotischen Lösungsmitteln anwenden, so daß möglicherweise konkurrierende Reaktionen von O-Nukleophilen [Reaktion (2)] vermieden werden können. Durch die Oligoetherkette von 37 sind die zu synthetisierenden Zielmoleküle von der Membran 38 verglichen mit 9 durch 14 zusätzliche Atome getrennt. Dieser Abstand sollte sich positiv auf die Produktqualität und möglicherweise auch auf die Zugänglichkeit der Verbindungen in Festphasen-Bindungsstudien auswirken, da die immobilisierten Moleküle in großem Abstand von der Membran „quasi homogen“ solvatisiert werden können.

Prinzipiell nachteilig könnte sich die zusätzliche (membrannahe) sekundäre Aminogruppe auswirken. Acylierungen mit der ersten Fmoc-Aminosäure bei der SPOT-Definition sollten jedoch selektiv an der primären Aminogruppe stattfinden, sofern Pentafluorphenylester eingesetzt werden. Bei der im Anschluß durchgeführten Acetylierung mit Essigsäureanhydrid werden alle verbliebenen freien (primären und sekundären) Aminofunktionen blockiert.


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Um geeignete Bedingungen für die Membrangenerierung zu finden, wurden die Reaktionsbedingungen systematisch untersucht.

A) Optimierung der Alkylierungsbedingungen.

Zur Bestimmung des Einflusses der Epoxidkonzentration und der Reaktionszeit auf den Derivatisierungsgrad wurden die Alkylierungsbedingungen variiert. Man alkylierte dazu Zellulosemembranen mit Lösungen von Epibromhydrin in Dioxan bei verschiedenen Konzentrationen (1.2 M und 6.0 M). Eine Quantifizierung der Reaktion konnte erst nach Generierung von Aminogruppen durchgeführt werden, die durch Reaktion mit dem Diamin 37 erzeugt wurden (2.3 M in DMF, 17 h, 25°C, Abb. 10 ).

Abb. 10: Einfluß der Epoxidkonzentration und der Reaktionszeit auf den Derivatisierungsgrad bei der Generierung von aminofunktionalisierten Membranen 38. *) Zur Katalyse wurden 8 Mol% Perchlorsäure zugesetzt.

Aus den gemessenen Werten läßt sich zunächst ersehen, daß sich mit dem Diamin 37 deutlich höhere Derivatiserungsgrade als bei der Verwendung von Ammoniak in Methanol erzielen ließen (Steigerung der maximal erreichbaren Derivatisierung auf das etwa Vierfache von 500 auf 2200 nmol/cm2). Dabei wurden die angestrebten Werte von 500-1000 nmol/cm2 bereits mit einer 10%igen Epibromhydrin-Lösung (1.2 M) bei kurzer Reaktionszeit (1-3 Stunden) erreicht.

B) Optimierung der Substitutionsbedingungen.

An die Untersuchung der Alkylierungsbedingungen schloß sich eine Optimierung der Brom-Substitutionsbedingungen an. Dazu wurde bei Membranen, die unter optimierten Bedingungen mit Epibromhydrin umgesetzt wurden (1.2 M in Dioxan, 3 h), die Aminkonzentration sowie die Reaktionszeit variiert ( Abb. 11 ).

Aus den gemessenen Werten wird deutlich, daß der Derivatisierungsgrad über einen weiten Reaktionszeitraum hinweg stetig ansteigt. Die Substitutionsreaktion findet bei 25°C offenbar


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langsam statt und konnte auch bei Anwendung von hochkonzentierten Lösungen (2.30 M 50 %) nicht in praktikabler Zeit zur Vollständigkeit gebracht werden.

Abb. 11: Einfluß der Diaminkonzentration und der Reaktionszeit auf den Derivatisierungsgrad bei der Synthese von aminofunktionalisierten Membranen 38 (25°C).

Daher wurde das Diamin in einer weiteren Versuchsreihe bei erhöhten Temperaturen angewendet ( Tab. 5 ).

Tab. 5: Einfluß der Reaktionszeit auf den Derivatisierungsgrad bei der Generierung von aminofunktionalisierten Membranen 38 bei erhöhter Temperatur. Das zur Bromsubstitution eingesetzte Diamin wurde bei verschiedenen Temperaturen eingesetzt (0.90 M in DMF).

Reaktionszeit

Erwärmung

Derivatisierung [nmol/cm2]

60

min

80°C

219

180

min

80°C

249

300

min

80°C

242

2

min

Mikrowellen-bestrahlung (810 W)

254

4

min

Mikrowellen-bestrahlung (810 W)

281

44

h

25°C

1074

Die Meßreihen machen deutlich, daß der jeweils erste Meßwert kaum weiter gesteigert werden kann (60 min, 80°C bzw. 2 min, Mikrowellenbestrahlung), wenngleich ein weit höherer Derivatisierungsgrad durch die (langsame) Reaktion bei 25°C nach 44 h erreicht wird. Die Reaktion konnte also schnell zur Vollständigkeit gebracht werden, die temperatur


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bedingt erhöhte Reaktionsgeschwindigkeit bewirkte jedoch möglicherweise eine Quervernetzung durch Beteiligung beider Aminogruppen an der Reaktion, so daß Teile der Funktionalitäten blockiert wurden. Um der möglichen Quervernetzung zu begegnen und so größere Derivatisierungsgrade in kurzer Zeit zu erreichen, wurden höhere Aminkonzentrationen angewendet ( Abb. 12 ).

Abb. 12: Einfluß der Diaminkonzentration auf den Derivatisierungsgrad bei der Generierung von aminofunktionalisierten Membranen 38 bei erhöhter Temperatur. Das Diamin 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin (37) wurde in DMF oder pur eingesetzt (80°C für 1 h oder 810 W Mikrowellenbestrahlung (MW) für 3 min).

Tatsächlich ließ sich auf diese Weise der Derivatisierungsgrad steigern. Bei 80°C läßt sich die Derivatisierung durch Verfünffachung der Diaminkonzentration annähernd verdoppeln. Eine weniger ausgeprägte Steigerung der Werte wurde bei einer Erwärmung mit Mikrowellen erreicht. Das Vergleichsexperiment bei 25°C mit einer unter identischen Alkylierungsbedingungen vorbereiteten Membran zeigte allerdings auch hier, daß noch weitaus höhere Derivatisierungen möglich sind [2.3 µmol/cm2 bei Verwendung einer 2.30 M Diaminlösung ( 50% in DMF), 44 h].

Durch Optimierung der Alkylierungsbedingungen und eine Anwendung des Diamins 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin (37) bei erhöhter Temperatur ließ sich das Ziel einer Aminoderivatisierung von Zellulose mit Derivatsierungsgraden von 0.50 bis 1.00 µmol/cm2 erreichen. Es zeigte sich, daß auch noch wesentlich höhere Werte erreichbar sind, wenn das Diamin deutlich länger, dafür bei 25°C angewendet wird. Im Hinblick auf eine Vermeidung von Abbruchsequenzen durch zu geringe Reagenzienüberschüsse war dies jedoch nicht erwünscht. Die für hohe Derivatisierungen (> 2.0 µmol/cm2) notwendigen langen Reaktionszeiten behindern zudem den zeitlich praktikablen Derivatisierungsprozeß.

Da - abgesehen vom Zeitgewinn - die Anwendung von Mikrowellenenergie keinen entscheidenden Vorteil gegenüber der Erwärmung auf einer Heizmatte bewirken konnte, letztere aber insbesondere im Falle von großen Membranen (19 x 28 cm) gleichmäßiger erfolgen kann, wurde im folgenden zur Membrangenerierung das Diamin 4,7,10-Trioxa-


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1,13-tridecandiamin (37) unverdünnt bei 80°C angewendet.

Auf der Basis der Ergebnisse dieser Versuchsreihe wurde davon ausgegangen, daß auf Membranen, die mit Epibromhydrin alkyliert wurden, auch nach der Aminbehandlung noch Reste substituierbarer Funktionalitäten vorhanden sein können. Um diese abzusättigen, erfolgt nach der Reaktion mit dem Diamin eine zweistündige Behandlung mit Natriummethoxid in Methanol.

Zusammenfassend ergab die Optimierung folgende Reaktionsbedingungen:

  1. Alkylierung der Zellulose mit einer Lösung von Epibromhydrin in Dioxan (1.2 M; 3 h) unter Perchlorsäure-Katalyse (8 Mol%). (vergl. Abb. 10 )
  2. Substitution des Halogens mit purem 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin (37) bei 80°C (1 h). (vergl. Abb. 12 )
  3. Blockieren von restlichen reaktiven Gruppen mit Natriummethoxid (5 M in MeOH, 2 h).

Die erreichten Derivatisierungsgrade lagen mit dieser Methode im Bereich von 600-1400 nmol/cm2.

Um für bestimmte Anwendungen auch niedrigere Derivatisierungen erhalten zu können, kann das Protokoll auf der Basis der Versuchsreihe folgendermaßen abgewandelt werden:

  1. Verkürzung der Alkylierungszeit auf 1 Stunde.
  2. Anwendung einer Lösung des Diamins 37 in DMF (0.9 M) bei 25°C.

Mit dieser Methode lagen die erreichten Derivatisierungsgrade im Bereich von 100-400 nmol/cm2.

An dieser Stelle sei erwähnt, daß zwar die Derivatisierungsgrade verschiedener Membranen in den angegebenen Bereichen durchaus erheblich voneinander abweichen können. Mehrfachbestimmungen der Derivatisierung innerhalb einer Membran ergaben jedoch stets eine sehr geringe Streuung der Werte (< 10%), was eine homogene Membranderivatisierung widerspiegelt.

3.2 Geeignete Linker-Systeme

Nachdem mit der esterfrei aminoderivatisierten Membran 38 ein für die Peptoid-Synthese geeigneter Träger vorlag, galt es, geeignete Linker zu wählen.

3.2.1 Synthese ohne Linker

Die wichtigsten Anwendungen von Substanzen, die an Zellulose synthetisiert wurden, sind


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heterogene Bindungsstudien, bei denen im allgemeinen die Bindung von Proteinen untersucht wird (vergl. Tab. 3 , Seite 15). In diesem Fall ist eine Abspaltung von der Membran und damit die Verwendung eines Linkers nicht notwendig. Die Membran 38 kann direkt mit der ersten Aminosäure zur Definition der SPOTs umgesetzt werden, so daß die Substanzen nur mittels Amid- und Etherbindungen an die Zellulose gebunden sind, was eine zerstörungsfreie Abspaltung verhindert (zur Veranschaulichung der SPOT-Definition vergl. Abb. 8 -(2), Seite 13).

3.2.2 Sauer spaltbare Linker in der SPOT-Synthese

Sowohl für Bindungsstudien in homogener Lösung als auch für analytische Zwecke (Qualitätskontrolle und Optimierung der Synthesebedingungen) muß ein geeigneter Linker gewählt werden, welcher die Abspaltung der Produkte zuläßt. Für Substanz-Bibliotheken aus der SPOT-Synthese sind dabei Bedingungen zu wählen, die eine Vermischung der Substanzen verhindern, indem sie deren räumliche Trennung aufrechterhalten ( Schema 10 ). In der Peptid-Synthese erfüllt beispielsweise eine einfache Esterbindung zur Membran diese Aufgabe. Nach erfolgter Synthese und Abspaltung der Seitenkettenschutzgruppen wird die trockene Membran gasförmigem Ammoniak ausgesetzt, welcher die Ester zu Amiden aminolysiert. Die Substanzen bleiben adhäsiv auf der Membran gebunden und können nach Ausstanzen der SPOTs beispielsweise in Mikrotiterplatten überführt und dort mit einem geeigneten Lösungsmittel (z.B. einem wäßrigen Puffer) abgelöst werden.

Schema 10: Verschiedene Möglichkeiten zur räumlich getrennten Behandlung von Syntheseprodukten der SPOT-Synthese.

Für die Peptoid-Synthese sind Linker auf Ester-Basis ungeeignet, da im Verlauf der Synthese Amine in hohen Konzentrationen angewendet werden, die Ester vorzeitig spalten können (vergl. Abschnitt 3.1 ). Aus diesem Grund konnte nicht auf die für Zellulose beschriebenen Linkersysteme zurückgegriffen werden.[ 44 , 48 , 59 ] Es mußte ein geeigneter Linker neu in die SPOT-Synthese eingeführt werden.

Vor dem Hintergrund der Synthese von Peptoiden und der Anwendbarkeit an Zellulosemembranen erschienen vor allem säure- oder photolytisch spaltbare Linker geeignet. Die


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Erhaltung der örtlichen Adressierung kann dabei durch verschiedene Maßnahmen gewährleistet werden (vergl. Schema 10 ):

  1. Zur säurekatalysierten Abspaltung muß die Membran entweder Säuredämpfen (z.B. TFA-Dampf) ausgesetzt werden oder die SPOTs müssen vor der Abspaltung in getrennte Gefäße (z.B. in eine Mikrotiterplatte) überführt werden. In beiden Fällen bleiben allerdings Verunreinigungen zurück, wenn Schutzgruppen angewendet werden, die unflüchtige Spaltungsprodukte ergeben (z.B. Trityl).
  2. Die Spaltung eines lichtempfindlichen Linkers kann mit einer trockenen Membran lösungsmittelfrei erfolgen, so daß die Substanzen adhäsiv gebunden bleiben. In diesem Fall können alle Schutzgruppen vor der Linkerabspaltung entfernt werden.

Die säurespaltbaren Linker 43 - 46 sind zur Immobilisierung von Carbonsäureamiden in der Festphasensynthese am Harz weit verbreitet ( Abb. 13 ). Sie sind mit TFA spaltbar, wobei die benötigte Konzentration von der jeweiligen Struktur des Linkers abhängt.

Abb. 13: Säurespaltbare Linker zur Immobilisierung von Carbonsäureamiden (R-CONH2) an Harzen. In Klammern: TFA-Volumenanteile in CH2Cl2, die zur Spaltung benötigt werden.

Der in der Peptid- und Peptoid-Synthese weitverbreitete Rink-Linker 44 erschien unter bestimmten Voraussetzungen auch für die SPOT-Synthese geeignet zu sein. Das Haupt-Anwendungsgebiet sollte aufgrund der schnellen und vollständigen Abspaltung in der Substanz-Analytik liegen. Zur Synthese umfangreicher Substanz-Bibliotheken ist der Rink-Linker nur geeignet, wenn auf Seitenkettenschutzgruppen, die unflüchtige Spaltungs-Fragmente bewirken (z.B. Trityl, 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl), vollständig verzichtet werden kann.[ 124 ]


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Eine Reihe von Aktivierungsbedingungen wurden getestet, um den Linker in Form seines Fmoc-geschützten Derivats 47 möglichst effizient an die aminoderivatisierte Membran zu koppeln. Der Derivatisierungsgrad wurde über die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe spektroskopisch bestimmt ( Abb. 14 ). Interessanterweise zeigt der Vergleich der Kopplungsausbeuten, daß die in situ Aktivierung zum Pentafluorphenylester mit Diisopropylcarbodiimid (DIC) die höchsten Derivatisierungsgrade liefert (Eintrag 4). Möglicherweise führt eine basenvermittelte Hydrolyse im Anschluß an die Aktivierung im Falle des Esters des 1-Hydroxybenzotriazols (HOBt), für den aus der Peptidchemie eine hohe Kopplungseffizienz bekannt ist, zu den beobachteten geringen Werten (Einträge 1 und 2). Diese Annahme würde die Verschlechterung der Kopplungs-Effizienz bei Basenüberschuß (Eintrag 1) erklären. Auch das in situ erzeugte Anhydrid lieferte unbefriedigende Ausbeuten, wahrscheinlich ebenfalls aufgrund von Hydrolyse (Eintrag 3).

Abb. 14: Untersuchung der Kopplungseffizienz bei Anwendung verschiedener Aktivierungsbedingungen zur Immobilisierung des Rink-Linkers an aminoderivatisierter Zellulose 38. Lösungen des Fmoc-geschützten Rink-Linkers 47 (0.5 M in NMP) wurden mit den angegebenen Aktivierungsmitteln versetzt, 30 min voraktiviert und mit 38 zur Reaktion gebracht (2 µl; 3 x 15 min).

Der Rink-Linker erwies sich in zahlreichen Experimenten als sehr zuverlässig und ermöglichte eine nebenproduktfreie und vollständige Abspaltung. In dieser Arbeit wurde die die Abspaltung auf zwei Wegen durchgeführt:

  1. Ein SPOT wurde ausgestanzt und in einem Gefäß [z.B. Eppendorf-Reaktionsgefäß (2.0 ml) oder Mikrotiterplatte] mit TFA versetzt (95% in H2O, 70µl, 15 min). Das Lösungsmittel wurde im Anschluß in einer Vakuumzentrifuge bei 40°C entfernt. Das Syntheseprodukt konnte nun abgelöst und analysiert werden (z.B. in H2O/CH3CN-Gemischen).

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  2. Zur Abspaltung mit gasförmigen Reagenzien wurde die Membran für 30 Minuten in einen Exsiccator über TFA gebracht.[ 125 ] Nach Entfernung der TFA-Dämpfe konnten die SPOTs ausgestanzt und die Substanzen einzeln abgelöst werden.[ 124 , 126 ]

In zahlreichen Experimenten erwies sich der Rink-Linkers sowohl für die Qualitätskontrolle von Substanz-Bibliotheken als auch bei der Syntheseevaluierung und -optimierung als hervorragend geeignet.

3.2.3 Photolytisch spaltbare Linker in der SPOT-Synthese

Um die Abspaltung säurelabiler Schutzgruppen von der Linkerspaltung zu trennen, darf letzterer erst unter orthogonalen Bedingungen abgespalten werden. Im Bereich der kombinatorischen Synthesen am Harz haben sich für Anforderungen dieser Art photolytisch spaltbare Linkersysteme vom Typ der ortho-Nitrobenzylalkohole und -amine bewährt. Mit der Fmoc-geschützten Aminosäure 48 (im folgenden als Photolinker (PL) bezeichnet) steht ein Linker kommerziell zur Verfügung, der bei Bestahlung mit langwelligem ultraviolettem Licht (365 nm) eine schnelle Spaltung ermöglicht ( Schema 11 ).[ 127 , 128 ] Nach photolytischer Anregung eines PL-gebundenen Amids 49 oxidiert die Nitrogruppe in einer Radikalreaktions-Kaskade dabei die benachbarte Benzyl-Position durch Übertragung eines Sauerstoffatoms. Das gebildete N-Acylhemiaminal 52 reagiert zum Nitrosoaromaten 51 unter Freisetzung des Amids 50.[ 129 ]

Schema 11: Fmoc-Photolinker 48 und Spaltungsmechanismus.

In einer vergleichenden Untersuchung mehrerer Aktivierungsmethoden konnte gezeigt werden, daß der Photolinker-Baustein 48 bei einer Aktivierung mit HATU die besten Kopplungsausbeuten zeigt.[ 123 ] In Versuchen zur lösungsmittelfreien (trockenen) Spaltung


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des Linkers unter Wahrung der Ortsadressierung der Substanzen zeigte sich die hervorragende Eignung des Linkers für die SPOT-Synthese. Bei Bestrahlung der gesamten Membran auf einen UV-Leuchttisch bei einer Lichtenergie von 7 mW/cm2 ist die Abspaltung nach 90-100 Minuten abgeschlossen.[ 110 , 123 ] Bei Derivatisierungsgraden über 150 nmol/cm2 bleibt die Abspaltung leider auch bei längeren Belichtungen unvollständig, was auf die starke UV-Absorption des Nitrosoaromaten 51 und die daraus resultierende Abschirmung von in der Membran verborgener Substanz zurückzuführen ist. Um diesem Problem zu begegnen, wurde eine Test-Verbindung vergleichend unter Verwendung einer wesentlich stärkeren UV-Lichtquelle (340 mW/cm2 ca. 50-fache Energiedichte) abgespalten. Dabei wurde die maximale Abspaltungsausbeute deutlich schneller erreicht (nach 2-10 Minuten) - die theoretisch mögliche Ausbeute konnte jedoch insbesondere bei hohem Derivatisierungsgrad auch hier nicht erreicht werden. Eine Erhöhung der Lichtintensität bewirkt demnach im wesentlichen eine Steigerung der Spaltungsgeschwindigkeit und nur in deutlich geringerem Ausmaß der Spaltungsausbeute. In dieser Arbeit wurde der Photolinker unter Verwendung des UV-Leuchttisches abgespalten.

3.3 Peptoid-Synthese an Zellulose nach der Sub-Monomer-Methode

Die Peptoid-Synthese nach der Sub-Monomer-Methode wurde für Syntheseharze optimiert[ 12 , 104 ]:

  1. Bromacetylierung des N-Terminus der wachsenden Oligo-N-alkylglycin-Kette 3 mit in situ aktivierter Bromessigsäure [10-12 Äq. Bromessigsäure (53) ( ca. 0.6 M Lösung), 13 Äq. DIC in DMF, 2 x 30 min, 25°C].
  2. Nukleophile Substitution des Halogens im Bromacetamid 4 mit einem primären Amin 5 in hohem Überschuß (20-40 Äq. in DMSO (ca. 1-2 M), 1 x 2 h, 25°C) führt zum N-Alkylglycin Baustein 6.

Die Verwendung von Chloressigsäure führte bei anschließender Reaktion mit einfachen Alkylaminen ebenfalls zu guten Ergebnissen, während Aniline nur einen unvollständigen Halogenaustausch bewirken. Iodessigsäure lieferte vergleichbare Ergebnisse wie Bromessigsäure.[ 12 ] Interessanterweise behindert die Zugabe des für die Kopplung von Aminosäuren äußerst günstigen 1-Hydroxybenzotriazols die Bromacetylierung erheblich.[ 12 ] Der hohe Aminüberschuß in den Substitutionsreaktionen wurde als notwendig beschrieben. Dabei sollte das Amin in wenigstens molarer Konzentration eingesetzt werden.[ 104 ]


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Für die Synthese müssen einige Seitenkettenfunktionalitäten mit geeigneten Schutzgruppen versehen werden. Für aliphatische Alkohole wurde beispielsweise die Triisopropylsilyl-Gruppe vorgeschlagen.[ 18 ] Derart geschützte Bausteine lassen sich in einer Stufe aus kommerziell erhältlichen Aminoalkoholen gewinnen. Amino-, Carboxyl- und Thiolfunktionalitäten in der Seitenkette werden zweckmäßigerweise analog zur Peptid-Synthese mit der Boc-, tert-Butyl- bzw. Tritylgruppe geschützt. Auch für die Guanidin-Gruppe bietet sich die Verwendung von Boc-Gruppen an. T. Uno et al. beschrieben jedoch Schwierigkeiten bei der Synthese des dem Arginin analogen Sub-Monomer-Bausteins, so daß sie die Synthese eines 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl geschützten Bausteins vorschlugen.[ 130 ] Ohne Schutzgruppe wurden Indol-, Imidazol- und Phenol-Strukturelemente eingesetzt.[ 12 ]

3.3.1 Aktivierung von Bromessigsäure

3.3.1.1 Bromacetylierung von N-Alkylglycinen unter Bedingungen der SPOT-Synthese

A) Überlegungen zu geeigneten Modellverbindungen

Bei der Auswahl von Modell-Verbindungen zur Untersuchung der Peptoid-Synthese an Zellulose wurden folgende Kriterien zugrunde gelegt:

  1. Die Modellverbindungen sollten einfach aufgebaut sein. Erwartete Probleme bei der Synthese sollten vermieden werden.
  2. Die verwendeten Amine sollten sich für die SPOT-Synthese eignen, d.h. in hoher Konzentration in NMP oder DMSO löslich sowie nicht zu flüchtig sein, um eine ausreichende Reaktionszeit zu gewährleisten.
  3. Die Verbindungen sollten sich gut und schnell analysieren lassen.
  4. Die Verbindungen sollten in einer kurzen Synthese zugänglich sein.

Nach diesen Kriterien wurden die Tripeptoide 16 und 17 als Modellverbindungen ausgewählt. Sie erfüllen die obengenannten Bedingungen in folgender Weise:

  1. Der weitgehende Verzicht auf reaktive funktionelle Gruppen in den Seitenketten, sowie die Verwendung von alpha-unverzweigten Aminbausteinen ließen eine unproblematische Synthese erwarten. Die Verwendung von Piperidin als

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    letztem Baustein bewirkt ein „Endcapping“, das das Risiko von Nebenreaktionen nach der Synthese bzw. bei der Abspaltung verringert. Zusätzlich erhöht die tertiäre Aminofunktion die Löslichkeit in polaren Lösungsmitteln, was die Analyse erleichtert. Die Hydroxyfunktion in 17 wurde als Sonde vorgesehen, um die Produktausbeuten mit dem potentiell gebildeten seitenkettenacylierten Produkt 18 vergleichen zu können und so ein Maß für die N/O-Selektivität des Acylierungsreagenzes zu bekommen.
  2. Die zugrunde liegenden Amine (n-Butylamin, Benzylamin, Ethanolamin und Piperidin) besitzen ausreichend hohe Siedepunkte (77°C, 184°C, 170°C, 105°C) und sind in jedem Verhältnis mit NMP und DMSO mischbar.
  3. Die Analyse sollte im wesentlichen mittels HPLC und daran gekoppelter ESI-Massenspektrometrie (HPLC-MS) erfolgen, um eine schnelle und äußerst aussagekräftige Analyse der Produkte durchführen zu können. Die Trimere 16 und 17 besitzen eine mittlere Polarität, was bereits im Rahmen eines Routinechromatogramms eine hohe Trennschärfe an einem C18-Umkehrphasen-Trennmedium gewährleistet. Die Molekülmassen der Verbindungen (16: M = 402.5 g/mol; 17: M = 356.5 g/mol) liegen in einem mit dem verwendeten Massenspektrometer problemlos detektierbaren Bereich (Nachweisgrenze m/z < 50).
  4. Aufgrund ihrer kurzen Synthese (sechs Syntheseschritte) und der geringeren Zahl potentiell unvollständiger Reaktionsschritte wurden hier Trimere ausgewählt, wenngleich G.M. Figliozzi et al. für den Test von Aminen auf ihre Eignung in der Peptoidsynthese Pentamere vorschlugen.[ 104 ]

B) Synthese der Modellverbindung 16 am Harz

Zu Beginn wurde das Tripeptoid 16 nach R.N. Zuckermann et al.[ 12 ] am Syntheseharz hergestellt (56% Ausbeute nach Reinigung mittels präparativer HPLC), um die Synthese an Zellulose verfolgen und quantifizieren zu können. Aus genau eingewogenen Proben wurde eine Eichkurve erstellt, anhand der sich aus der Peakfläche des Signals von 16 im UV-Detektor des HPLC-Systems die injizierte Menge bestimmen läßt ( Abb. 15 ). Die Eichkurve ließ sich gut durch eine quadratische Funktion annähern (durchgehende Linie). Im häufig verwendeten Bereich le 25 nmol/Injektion wird die Ausbeutebestimmung durch den annähernd linearen Zusammenhang zwischen Injektionsmenge und Peakfläche erleichtert (unterbrochene Linie; 5.99·105 Flächeneinheiten/nmol injizierte Substanz).

37

Abb. 15: Auftragung der Peakfläche des UV-Signals von 16 in einer Serie von HPLC-Läufen in Abhängigkeit von der injizierten Menge. Die Ausgleichskurven wurden quadratisch (durchgehende Linie) sowie für Injektionsmengen le 25 nmol linear (unterbrochene Linie) angenähert (Meßwerte für HP-1100 HPLC an Finnigan LCQ, Software Ver. 1.1).

C) Synthese geeigneter Bromacetylierungsmittel

Die Bedingungen der Peptoid-Synthese am Harz sollten nun auf die SPOT-Synthese übertragen werden. Im Unterschied zur Harz-Synthese, bei der eine in situ Aktivierung von Bromessigsäure in Anwesenheit der festphasengebundenen Substanz möglich ist, ist hier eine Bereitstellung der Carbonsäure in voraktivierter Form notwendig. Bei Vorversuchen wurde deutlich, daß sich die am Harz übliche Methode der Säureaktivierung nur mit Einschränkungen für die SPOT-Synthese eignet: Wie bei jeder Carbonsäure bildet sich nach Zugabe eines Äquivalents DIC zu einer 0.6 M Lösung von Bromessigsäure in NMP nach etwa 10 Minuten ein kristalliner Niederschlag von Diisopropylharnstoff. Dieser behindert zwar die manuelle SPOT-Synthese nur wenig, bei der automatischen Pipettierung ist allerdings sicher mit Problemen zu rechnen (Verschluß der Pipettiernadel).

Es mußte daher eine alternative Aktivierung für Bromessigsäure gefunden werden. Dabei sollte berücksichtigt werden, daß eine schützende Derivatisierung aller freien Hydroxyfunktionen des Zelluloseträgers (Capping) nicht möglich ist, ohne günstige Membraneigenschaften wie z.B. Benetzbarkeit oder Flexibilität zu verändern. Es galt daher ein gegenüber Aminen ausreichend reaktives Reagenz zu finden, das nicht mit freien Membran-Hydroxyfunktionen reagiert, d.h. ausreichend N/O-selektiv ist. So ließe sich nicht nur die Bildung störender Nebensequenzen vermeiden, es könnte auch auf den Schutz von Hydroxyfunktionen in den Peptoid-Seitenketten verzichtet werden.

Die Carbonsäure-Aktivierung mit Carbodiimiden führt in Abwesenheit von Nukleophilen schnell zu Bildung des entsprechenden Anhydrids.[ 1 ] Eine höhere N/O-Selektivität sollten die weniger reaktiven Aktivester besitzen. Dabei ist die Reaktivität der verschiedenen Aktivester in weiten Grenzen duch die Wahl der zugrunde liegenden Hydroxy-Verbindung


38

(Alkohol/Phenol) bestimmbar. Der Pentafluorphenylester der Essigsäure wurde beispielsweise von L. Kisfaludy et al. als Acetylierungsmittel mit hoher N/O-Selektivität selbst bei einer Verwendung des Aktivesters in dreifachem Überschuß beschrieben.[ 131 ] Erst die Zugabe einer tertiären Base ermöglicht die O-Acylierung.

Aktivester können isoliert eingesetzt oder in situ (z.B. mit TBTU, HATU) erzeugt werden. In dieser Arbeit sollten eine Reihe von Aktivestern synthetisiert, isoliert und anschließend getestet werden.

Die folgenden Derivate wurden dazu ausgewählt:

Synthese von Bromessigsäurepentafluorphenylester (10):

Mit Pentafluorphenol (25) ließ sich Bromessigsäure ausgehend vom Säurebromid 54 zum flüssigen Bromessigsäurepentafluorphenylester (10) umsetzen. Der Ester wurde in 92% Ausbeute analysenrein erhalten [NMR (1H, 13C, 19F); IR; Elementaranalyse]. Anhand von 19F-NMR konnte ein Restgehalt von Pentafluorphenol von < 3 Mol% bestimmt werden. Der Pentafluorphenylester 10 wurde bislang nicht in isolierter Form beschrieben, allerdings wurde bereits von einer in situ Aktivierung der Bromessigsäure mit DCC unter Zusatz von Pentafluorphenol berichtet.[ 132 ]

Synthese von Bromessigsäure-2,4-dinitrophenylester (11):

2,4-Dinitrophenol (55) ließ sich in 78% Ausbeute zum gut kristallisierenden Bromessigsäure-2,4-dinitrophenylester (11) bromacetylieren. Die schwächere Base Pyridin führte dabei verglichen mit dem zur Synthese von 10 verwendeten DIEA zu höheren Ausbeuten. Die erhaltene Substanz wurde vollständig charakterisiert [Schmp.; NMR (1H, 13C); IR; Elementaranalyse]. In der Literatur wurde zwar von einer Verwendung von 11 berichtet, Angaben zu Synthese und Analyse der Verbindung wurden dort jedoch nicht gemacht.[ 133 ]


39

Synthese von Bromessigsäure-4-nitrophenylester (12):

Der Bromessigsäure-4-nitrophenylester (12) wurde analog zum 2,4-Dinitrophenylester 11 durch Bromacetylierung von 4-Nitrophenol (56) in 61% Ausbeute als kristalline Substanz erhalten. Die analytischen Daten (Schmp.; 1H- und 13C-NMR) stimmten mit der Literatur überein.[ 134 ]

Synthese von Bromessigsäure-N-succinimidylester (13):

Die Synthese des Esters 13 erfolgte aus Bromessigsäure (53) und N-Hydroxysuccinimid (26) mit Dicyclohexylcarbodiimid in quantitativer Ausbeute nach Lit.[ 135 , 136 ].

D) SPOT-Synthese der Modellverbindung 16

Im Unterschied zur Synthese am Harz kann die Reaktionszeit bei der SPOT-Synthese nicht frei gewählt werden. Sie wird durch die Physikochemie der Oberfläche sowie die Verdampfung des Lösungsmittels und der Reagenzien bestimmt. Unter der Annahme, daß die Reaktion mit dem Verdampfen der Lösungmittel zum Stillstand kommt, beträgt die Reaktionszeit bei Lösungen in DMSO oder NMP typischerweise 10-15 Minuten pro Kopplung. Eine längere Reaktionszeit kann durch Mehrfachkopplungen erreicht werden. In Anlehnung an die Bedingungen der SPOT-Synthese von Peptiden sollten die Acylierungen als Doppelkopplungen erfolgen (2 x 15 min; Lösungsmittel: NMP). Im Halogen-Substitutionsschritt sollte eine Dreifachkopplung durchgeführt werden.


40

Die SPOT-Synthese des Tripeptoids 16 an Rink-Linker-derivatisierter Zellulose lieferte unter initialer Verwendung einer 1 M Lösung von Bromessigsäure-2,4-dinitrophenylester (11) in NMP das gewünschte Produkt in überraschend hoher Reinheit (95% nach HPLC) und Ausbeute (73%; Abb. 16 ). Die Halogensubstitutionen wurden zunächst durch Inkubation der gesamten Membran mit Amin-Lösungen (n-Butylamin, Benzylamin, Piperidin; 5 M in NMP) erreicht.

Abb. 16: HPLC-UV-Spur (220 nm, links) und ESI-Massenspektrum (rechts) des Rohproduktes einer Synthese von 16 an Zellulose. Es wurden 10% der Substanz, die von einem SPOT (0.23 cm2) abgespalten wurde, zur HPLC injiziert (ca. 30 nmol).

Die zuvor synthetisierten Bromacetylierungsmittel wurden nun vergleichend zur Synthese des Tripeptoids 16 eingesetzt. Dabei wurden die Acylierungsmittel beim Aufbau des zentralen Bausteins variiert, während bei den anderen Acylierungen der bereits erfolgreich eingesetzte 2,4-Dinitrophenylester 11 verwendet wurde, um hier Nebenprodukte zu vermeiden. In einer parallelen Synthese (10 SPOTs) wurde das N-Butylglycin 57 zunächst an Rink-Linker-derivatisierter Zellulose synthesetisiert. In der anschließenden Bromacetylierung wurden die Acylierungsmittel variiert und jeweils mit und ohne Zusatz von 2,6-Dimethylpyridin als Hilfsbase eingesetzt. Zur Bromsubstitution wurde anstelle der Reagenzienpipettierung die gesamte Membran mit den entsprechenden Amin-Lösungen inkubiert (5 M in NMP, 30 min). Die SPOTs wurden ausgestanzt und einzeln mit Trifluoressigsäure behandelt (95% in H2O, 20 min). Nach Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum wurden die Produkte mittels HPLC-MS untersucht ( Tab. 6 ).

Der Vergleich zeigt, daß sowohl die höchsten Reinheiten, als auch die höchsten Ausbeuten bei der Verwendung von Bromessigsäure-2,4-dinitrophenylester (11) erhalten wurden (Einträge 1 und 6). Bei den übrigen Aktivierungen wurde eine geringere Produktqualität erreicht, wobei die Reinheiten, die mit dem in situ erzeugten Anhydrid sowie dem Pentafluorphenylester 10 erreicht wurden, nur geringfügig hinter denen des 2,4-Dinitrophenylesters zurücktreten (Einträge 2, 3, 7 und 8). Für die unerwartet niedrigen Ausbeuten des reaktiven Bromessigsäureanhydrids verglichen mit dem Aktivester 11 werden


41

Nebenreaktionen wie Hydrolyse oder Reaktionen mit der Zellulosemembran als besondere Bedingungen der SPOT-Synthese verantwortlich gemacht.

Tab. 6: Synthese von 16 unter Anwendung verschiedener Bromacetylierungsbedingungen. Bei der Bromacetylierung des Monomers 57 wurden die tabellierten Bedingungen angewendet, alle übrigen Acylierungen wurden mit 11 durchgeführt (jeweils 1 M in NMP).

 

X =

2,6-Dimethyl-pyridin
[M in NMP]

Reinheit1)
[%]

Ausbeute2)
[%]

13,4)

-ODnp (11)

-

95

73

2

-OH / DIC5)

-

88

67

3

-OPfp (10)

-

87

65

4

-ONSu (13)

-

36

13

5

-ONp (12)

-

14

4

63)

-ODnp (11)

1

94

75

7

-OH / DIC5)

2

80

65

8

-OPfp (10)

1

84

65

9

-ONSu (13)

1

55

19

10

-ONp (12)

1

13

3

1) Nach HPLC, 220 nm; 2) Basierend auf einem Vergleich der erhaltenen Menge 16 (bestimmt durch quantitative Auswertung der UV-Absorption) mit dem Derivatisierungsgrad; 3) Mittelwert aus zwei Synthesen; 4) HPLC-MS dazu: Abb. 16 ; 5) 2 M Br-CH2COOH, 1 M DIC.


42

Interessante Resultate brachte die Auswertung der Reaktionsprodukte bei der Acylierung mit Bromessigsäure-4-nitrophenylester (12) (Einträge 5 und 10, sowie Abb. 17 ): Neben der nur in geringem Maße beobachteten gewünschten Acylierungsreaktion (Pfad A) wurden zwei Produkte mit M = 277 g/mol (46% bzw. 50%; ohne bzw. mit Basenzusatz) und M = 255 g/mol (40% bzw. 37%; ohne bzw. mit Basenzusatz) beobachtet. Die Massen können dem Diamid 60 sowie dem Dipeptoid 61 zugeordnet werden. Deren Bildung läßt sich durch die geringere Reaktivität von 12 verglichen mit den anderen verwendeten Acylierungsmitteln erklären. Anstelle der N-Acylierung tritt hier offenbar N-Alkylierung ein

Abb. 17: Oben: Nebenreaktionen und -produkte beim Versuch der Bromacetylierung des membrangebundenen Monomers 57 mit Bromessigsäure-4-nitrophenylester (12). a) Benzylamin (5 M in NMP, 30 min), b) Br-CH2-COODnp (1 M in NMP, 2 x 15 min), c) Piperidin (5 M in NMP, 30 min), d) TFA (95% in H2O, 20 min). Unten: HPLC-UV-Spur (220 nm, links) und ESI-Massenspektren (rechts) der Reaktionsprodukte. Es wurden 20% der Substanz, die von einem SPOT (0.23 cm2) abgespalten wurde, analysiert (ca. 60 nmol).


43

(Pfad B). Der intermediär gebildete membrangebundene Aktivester 59 reagiert mit Benzylamin zum Diamid 60, welches aus der anschließenden Acylierung unverändert hervorgeht. Dieser Reaktionsweg wird durch die Beobachtung gestützt, daß sich die Membran bei der Inkubation mit Benzylamin durch das aus 59 freigesetzte, gelbe 4-Nitrophenol eingefärbte, während benachbarte SPOTs, die zuvor mit Bromessigsäure-2,4-dinitrophenylester (11) behandelt wurden, farblos blieben, da hier kein entsprechender Reaktionsweg beschritten wurde. Das dritte Reaktionsprodukt 61 entsteht, wenn das membrangebundene Monomer 57 überhaupt nicht mit 12 reagiert (Pfad 3). In diesem Fall wird in den anschließenden Reaktionen das Dipeptoid 61 aufgebaut.

Diese umgekehrte Reaktivität des Bromessigsäure-4-nitrophenylesters (12) wurde nicht bei Reaktionen mit primären Aminen beschrieben.[ 134 , 137 ] Allerdings beobachteten R.D. Elliott et al. bei der Verwendung von 12 einen Selektivitätsverlust beim Übergang von der Bromacetylierung eines primären Amins (5´-Amino-5´-deoxythymidin) zum N-Methyl-analogen sekundären Amin (5´-Deoxy-5´-methylaminothymidin), was sich mit den hier gemachten Beobachtungen deckt.[ 138 ]

Bromessigsäure-N-succinimidylester (13) ist in seiner Reaktivität zwischen dem 4-Nitrophenylester und den aktiveren Estern 10 und 11 einzuorden (Einträge 4 und 9). Wie beim 4-Nitrophenylester reichte die Aktivierung nicht aus, um eine vollständige Acylierung zu bewirken. Neben dem Dimer 61 (52% bzw. 26% mit bzw. ohne Base) wurden hier allerdings nur geringe Mengen N-Alkylierungs-Produkt 60 beobachtet (5% mit und ohne Base).

Die Verwendung der Base 2,6-Dimethylpyridin bewirkt lediglich im Fall der unvollständigen Acylierung mit dem N-Succinimidylester 13 eine leichte Verbesserung des Ergebnisses, in den übrigen Fällen hat sie keinen vorteiligen Effekt.

E) Versuch der Synthese zusätzlicher Aktivderivate der Bromessigsäure

Inspiriert durch die positiven Ergebnisse mit Aktivestern der Bromessigsäure sollten in die folgenden Untersuchungen zusätzlich die Aktivester 14 und 15 einbezogen werden:

Die Ester des 1-Hydroxybenzotriazols (HOBt, 23) und 7-Aza-1-hydroxybenzotriazols (HOAt, 24) finden in der Peptidchemie eine breite Anwendung.[ 1 ] Ihre Ester mit Bromessigsäure wurden bislang nicht in isolierter Form beschrieben. Zudem berichteten R.N. Zuckermann et al. einen nachteiligen Effekt bei der Verwendung von HOBt als Additiv in der Sub-Monomer Peptoid-Synthese.[ 12 ] Auch bei einer Carbodiimid-vermittelten Bromacetylierung eines Anilins wurde unter HOBt-Zusatz das Auftreten unerwünschter Nebenprodukte beschrieben[ 139 ], daher waren Schwierigkeiten bei der Synthese oder eine


44

unzureichende Reaktivität der Aktivspezies zu erwarten. Um das Potential der beiden Aktivester abzuschätzen, sollte zunächst versucht werden, das Test-Tripeptoid 16, wie in Abschnitt 3.3.1.1 beschrieben, mit den in situ-generierten Aktivestern zu synthetisieren:

HOBt (23): Analog der in der Literatur beschriebenen Probleme lieferten die Umsetzungen jeweils äquimolarer Mengen von Bromessigsäure und (1) HOBt/DIC sowie (2) TBTU/DIEA in NMP das Tripeptoid 16 nur in geringen Produktausbeuten (3% bzw. 6% Reinheit). Das Hauptprodukt der Reaktion war in beiden Fällen das Dimer 61, was auf eine unvollständige Acylierung schließen ließ. Da für Ester des HOBt eine höhere Reaktivität verglichen mit den Phenylestern 10 und 11 und damit eine vollständige Umsetzung erwartet wurde, wurde das Vorliegen von Nebenprodukten vermutet, die jedoch nicht identifiziert wurden.

HOAt (24): Wie schon im Falle des HOBt-Esters 14 sollte die Reaktivität des Aza-analogen Aktivesters 15, für den in Analogie zur Peptidchemie eine höherer Reaktivität erwartet wurde[ 140 ], zunächst mittels in situ Aktivierung von Bromessigsäure in der Synthese der Modellverbindung 16 untersucht werden. Die Verwendung von jeweils äquimolaren Mischungen aus Bromessigsäure und (1) HOAt/DIC sowie (2) HATU/DIEA führte zur Synthese von 16 in Ausbeuten von 65% bzw. 42%. Nebenprodukt war in beiden Fällen das Dipeptoid 61, was auch hier auf eine unvollständige Reaktion hindeutete. Wie erwartet wurden bessere Ergebnisse mit dem 7-Aza-Analogon des HOBt erreicht, die Ergebnisse blieben allerdings deutlich hinter den der bereits erfolgreich eingesetzten Ester 10 und 11 zurück. Es wurden daher auch hier keine weiteren Versuche unternommen.

Zusammen mit den in der Literatur beschriebenen Problemen bei Bromacetylierungen unter Zusatz von HOBt[ 12 , 139 ] bzw. HOAt zeigten die hier durchgeführten Untersuchungen, daß die herrausragende Rolle der beiden Verbindungen in der Peptidchemie nicht auf die Peptoidchemie übertragen werden kann. Zu bedenken ist, daß Bromessigsäure, wie die höhere Acidität verglichen mit alpha-Aminosäuren zeigt, eine elektronenärmere Carboxylfunktion besitzt und somit eine reaktivere Carbonsäure darstellt. Sie muß folglich weniger stark aktiviert werden, um vergleichbare Reaktivitäten zu erreichen. Ihre Ester mit HOBt und HOAt sind daher möglicherweise zu reaktiv und reagieren vorzeitig in Nebenreaktionen wie der Acylierung des aus DIC gebildeten Harnstoffs, der DIEA-vermittelten Hydrolyse oder durch Alkylierung von HOBt/HOAt zu unreaktiven Spezies ab.


45

3.3.1.2 Untersuchungen zur N/O-Selektivität verschiedener Bromacetylierungsmittel

A) Überlegungen zum Modellsystem

Nachdem nun mit dem Bromessigsäure-2,4-dinitrophenylester (11) ein für die SPOT-Synthese geeignetes Bromacetylierungsmittel zur Verfügung stand, schloß sich eine Untersuchung zur N/O-Selektivität an. Um die O-Acylierung sowohl von Zellulose- als auch von Seitenketten-Hydroxyfunktionen zu bestimmen, sollte exemplarisch während der Synthese des Tripeptoids 17 der Anteil an Veresterung zu 18 im Verhältnis zum Zielmolekül 17 ermittelt werden ( Schema 12 ).

Schema 12: Bestimmung der N/O-Selektivität verschiedener Bromacetylierungsmittel durch Bestimmung des Verhältnisses von 17 zu 18. Bei unvollständiger Acylierung wird 63 als Nebenprodukt beobachtet. a) Br-CH2-COODnp (1.0 M in NMP, 2 x 15 min);
b) n-Butylamin (5 M in NMP, 30 min); c) Ethanolamin (5 M in NMP, 30 min);
d) Piperidin (5 M in NMP, 30 min); e) TFA (95% in H2O, 20 min).

3.3.1.2.1 Synthese der Modellverbindungen 17 und 18 am Harz

Da die Reaktionsprodukte nach der Abspaltung von Zellulose quantifiziert werden sollten, wurden zunächst, wie schon bei der Untersuchung des Modell-Trimeren 16, die Vergleichssubstanzen 17 und 18 am Harz hergestellt ( Schema 13 ). Um bei der Synthese des Hydroxy-Tripeptoids 17 eine Veresterung der Seitenkette zu verhindern, wurde in der dritten Acylierung zum Dipeptoid 64 der Bromessigssäure-2,4-dinitrophenylester (11) in nur 1.5 Äq. verwendet (Einfachkopplung, 20 min). Im Gegensatz dazu mußte die Veresterung der Seitenketten-Hydroxyfunktion bei der Synthese von 18 möglichst vollständig erfolgen. Dazu wurde die dritte Acylierung zum doppelt bromacetylierten Dipeptoid 65 mit Bromessigsäureanhydrid in einem unpolaren Lösungsmittel (CH2Cl2 statt DMF) sowie unter Zusatz eines großen Überschusses an Base (40 Äq. 2,6-Dimethylpyridin) durchgeführt (Veresterungseffizienz: 96% verestertes Produkt). Man erhielt die Trimeren in 36% (17) und


46

37% (18) Ausbeute nach Reinigung mittels präparativer HPLC. Da bei der Synthese des Hydroxy-Peptoids 17 unter Verwendung von nur 1.5 Äq. Bromessigssäure-2,4-dinitrophenylester (11) weder Abbruchsequenzen noch das veresterte Produkt 18 als Nebenprodukte gebildet wurden (beide < 1%) ergab sich nicht nur ein Hinweis auf die gute N/O-Selektivität dieses Aktivesters sondern es zeigte sich auch seine hohe Reaktivität.

Schema 13: Harz-Synthese von 17 und 18. a) 20 Äq. Br-CH2-COOH, 10 Äq. DIC, 10 Äq. 2,6-Dimethylpyridin (DMF, 1 x 15 min); b) 150 Äq. n-Butylamin (DMF, 1 x 30 min);
c) 150 Äq. Ethanolamin (DMF, 1 x 30 min); d) 1.5 Äq. Br-CH2-COODnp (DMF, 1 x 20 min); e) 20 Äq. Br-CH2-COOH, 10 Äq. DIC, 40 Äq. 2,6-Dimethylpyridin (CH2Cl2, 1 x 20 min); f) 150 Äq. Piperidin (DMF, 1 x 30 min); g) TFA (95% in H2O, 30 min).

Im Anschluß wurden die UV-Absorptionen mittels HPLC/UV-Detektion bestimmt. Es zeigte sich, daß die Absorptionen bei Messungen von Substanzmengen unter 25 nmol/Injektion annähernd linear von der injizierten Menge abhängen. Sie betragen 3.09·105 (16) bzw. 3.13·105 (17) Flächeneinheiten/nmol injizierte Substanz (Software: Finnigan Navigator Ver 1.1 an Hewlett Packard 1100 HPLC). Es zeigte sich, daß sich die Absorption des Esters 18 von derjenigen des Alkohols 17 kaum unterscheidet. Dies ist auf die verglichen mit Amidbindungen geringere UV-Absorption von Esterbindungen bei 220 nm zurückzuführen.


47

3.3.1.2.2 SPOT-Synthese der Modellverbindung 17

Die Bromessigsäure-Aktivester 10 und 11 wurden vergleichend mit Carbodiimid-aktivierter Bromessigsäure zur Synthese des Hydroxy-Tripeptoids 17 eingesetzt. Als Grundlage wurde auf einer mit dem Rink-Linker derivatisierten Zellulosemembran das bifunktionelle Dipeptoid 62 unter Verwendung von Bromessigsäure-2,4-dinitrophenylester (11) synthetisiert. Die Synthese zum Trimer wurde daraufhin unter Verwendung der verschiedenen Acylierungsbedingungen vollendet ( Schema 12 ). Zur Bestimmung der N/O-Selektivität wurde nun das Verhältnis des Hydroxy-Tripeptoids 17 zum Ester 18 bestimmt ( Tab. 7 ).

Tab. 7: SPOT-Synthese von 17 unter Anwendung verschiedener Bromacetylierungsbedingungen.

Nr.

X =

Konz. Base1)
[M]

Reinheit 172)
[%]

Ausbeute 173)
[%]

Ausbeute 183)
[%]

N/O-Selektivität (17/18)

n4)

1

-ODnp (11)5)

-

90 ± 4

81 ± 10

6 ± 3

93 : 7

7

2

-OH / DIC6)

-

79 ± 9

73 ± 10

10 ± 4

88 : 12

5

3

-OPfp (10)

-

75 ± 6

67 ± 4

9 ± 4

88 : 12

6

4

-ODnp (11)

1

85

73

11

87 : 13

1

5

-OH / DIC6)

2

64 ± 2

57 ± 13

32 ± 4

64 : 36

2

6

-OPfp (10)

1

69

65

9

88 : 12

1

1) 2,6-Dimethylpyridin in NMP; 2) Nach HPLC, 220 nm; 3) Basierend auf einem Vergleich der erhaltenen Menge 17 bzw. 18 (bestimmt durch quantitative Auswertung der UV-Absorption) mit dem Derivatisierungsgrad; 4) Zahl der durchgeführten unabhängigen Synthesen; 5) HPLC-MS: vergl. Abb. 18 ; 6) 2 M Br-CH2COOH, 1 M DIC.

Alle getesteten Acylierungsmittel zeigten unter den angewendeten Bedingungen neben der gewünschten N-Acylierung auch in unterschiedlichem Ausmaß O-Acylierung der Seitenkette. Am erfolgreichsten war erneut die Verwendung von Bromessigsäure-2,4-dinitrophenylester (11). Er ermöglichte die Synthese des Hydroxy-Tripeptoids 17 in einer Ausbeute von 81% und einer HPLC-Reinheit von 90%, während der Ester 18 in 6% Ausbeute nachgewiesen wurde (Eintrag 1, Tab. 7 und Abb. 18 ). Zusammen mit der besten Ausbeute der Versuchsreihe wurde hier auch die größte N/O-Selektivität beobachtet (93 : 7).


48

Die Verwendung von 2,6-Dimethylpyridin als Base führte in den meisten Fällen wie erwartet zu einer Verringerung der Selektivität der einzelnen Acylierungsmittel. Dabei erwies sich das aus Bromessigsäure mit DIC gewonnene Anhydrid deutlich empfindlicher gegenüber Basenzusatz als die Aktivester: die Ausbeute des Ester-Nebenproduktes stieg von 10% auf 32% (Einträge 2 und 5) im Fall des Anhydrids während bei den Aktivestern eine Steigerung von 6% auf 11% (11, Einträge 1 und 4) bzw. keine Steigerung (10, Einträge 3 und 6) beobachtet wurde.

Abb. 18: HPLC-UV-Spur (220 nm, links) und ESI-Massenspektren (rechts) der Produkte der SPOT-Synthese von 17 an Zellulose (vergl. Eintrag 1, Tabelle 7 ).

3.3.1.2.3 Untersuchung der N/O-Selektivität von 11 in CDCl3

Um die N/O-Selektivität von Bromessigsäure-2,4-dinitrophenylester (11) auch in Lösung zu untersuchen, wurde in einem Konkurrenzexperiment eine Lösung des Esters 11 in Deuterochloroform zu Diethylamin-Lösungen (66) gegeben, die mit Methanol (68) in unterschiedlichen Anteilen versetzt waren. Anhand des NMR-spektroskopisch bestimmten Verhältnisses aus gebildetem Diethylamid 67 und Methylester 69 konnte die N/O-Selektivität bestimmt werden ( Tab. 8 ).

Zunächst wurden die Reaktionsprodukte in getrennten Experimenten dargestellt. In Abwesenheit von Methanol fand eine glatte Umsetzung zu Bromessigsäure-N,N-diethylacetamid (67) statt ( Tab. 8 , Eintrag 1). Da die Reaktion vollständig verlief, fand offenbar keine Behinderung durch eine Bildung von Diethylammonium-2,4-dinitrophenolat statt. Interessanterweise wies 67 nur ein 1H-NMR-Signal (Quartett) für die an den Amidstickstoff gebundenen Methylengruppen auf, obwohl aufgrund der eingeschränkten Rotation der Amidbindung zwei verschiedene Signale erwartet wurden. Die beiden Methylgruppen zeigten allerdings getrennte Signale. Offenbar ist die chemische Verschiebung der beiden Methylengruppen zufällig gleich. Die Identität der anderen beiden Produkte 69 und 55 wurde durch authentische Vergleichsproben sichergestellt.


49

Tab. 8: Konkurrenzexperiment zur Untersuchung der N/O-Selektivität bei der Umsetzung von Bromessigsäure-2,4-dinitrophenylester (11) mit Diethylamin (66) und Methanol (68).

Nr.

Amin-Komponente (Äq.)1)

Hydroxy-Komponente (Äq.)1)

Reaktionszeit

Nicht umgesetztes Edukt 11 [%]2)

N/O-Selektivität (67/69)

1

Et2NH (0.95)

-

2 h

5

-

2

-

MeOH (1.9)

2 d

98

-

3

Et3N (0.4)

MeOH (1.4)

2 h

67

-

4

Et3N (0.4)

MeOH (2.0)

5 d

11

-

5

Et2NH (0.78)

MeOH (0.62)

2 h

15

95 : 5

6

Et2NH (0.78)

MeOH (0.62)

2 d

9

94 : 6

7

Et2NH (0.71)

MeOH (6.6)

2 h

13

82 : 18

1) Bestimmt nach 1H-NMR; 2) Außer den angegebenen Produkten wurde in einigen Fällen Bromessigsäure in Mengen < 1% beobachtet.

In alleiniger Anwesenheit von Methanol ist der 2,4-Dinitrophenylester beachtlich stabil (Eintrag 2). Selbst nach zwei Tagen lag er praktisch unverändert vor. Durch Zusatz von katalytischen Mengen einer tertiären Base (Triethylamin) bildet sich jedoch im Verlauf mehrerer Tage langsam der Methylester (Einträge 3 und 4).

Im Konkurrenzexperimert mit etwa gleichen Mengen Diethylamin und Methanol findet die Reaktion mit einer N/O-Selektivität von 95:5 haupsächlich zum Diethylamid statt (Eintrag 5). Dieser Wert entspricht recht gut dem an Zellulose gemessenen Wert (97:3; vergl. Tab. 7 , Eintrag 1). Die Reaktion scheint beendet zu sein, denn auch nach zwei Tagen findet sich noch überschüssiger 2,4-Dinitrophenylester neben Methanol (Eintrag 6). Um eine Veresterung zu provozieren wurde der Aktivester zu einem leichten Unterschuß an Diethylamin und 6.6 Äquivalenten Alkohol gegeben. Diese Verzehnfachung der Alkoholmenge bewirkte lediglich eine Verschlechterung der Selektivität auf 82:18 (Eintrag 7). Die Experimente machen deutlich, daß Bromessigsäure-2,4-dinitrophenylester im basenfreien Milieu in Deuterochloroform praktisch nicht mit Alkoholen reagiert. Zum


50

geringen Anteil des Esterproduktes kommt es nach einem basenkatalysierten Mechanismus, bei dem auch das Nukleophil (in diesem Fall Diethylamin) als Base wirken kann.

3.3.1.3 Ergebnisse der Bromacetylierung sekundärer Amine

Auf der Grundlage der beschriebenen Experimente erweist sich Bromessigsäure-2,4-dinitrophenylester (11) als optimales Bromacetylierungs-Reagenz in der SPOT-Synthese von Peptoiden (erste Ergebnisse wurden bereits in Lit.[ 110 ] beschrieben). Er übertrifft in Ausbeute und N/O-Selektivität die anderen untersuchten Biselektrophile.

Den bei den verschiedenen Acylierungsbedingungen beobachteten Produktverteilungen und -ausbeuten liegen mehrere Ursachen zugrunde:

  1. Je stärker die Bromessigsäureaktivierung ist, desto höher ist die Ausbeute an bromacetyliertem Produkt. Eine mangelnde Reaktivität ist am Auftreten der nicht acylierten Dimeren 61 und 63 abzulesen. Sie wurde beim Pentafluorphenylester 10 in wenigen Prozenten Ausbeute, beim 4-Nitrophenylester 12 und N-Succinimidylester 13 in deutlichem Ausmaß beobachtet.
  2. Unterschreitet die Reaktivität des Aktivesters ein Minimum, so treten neben den unter 1.) diskutierten Dipeptoiden auch N-Alkylierungsprodukte auf. (Für den Pentafluorphenylester: < 1%, für den N-Succinimidylester: 5%). Bei Verwendung des 4-Nitrophenylesters der Bromessigsäure wird diese Reaktion zur Hauptreaktion. Die Reaktivität der beiden elektrophilen Zentren der Bromessigsäure (Carbonyl-Kohlenstoff- und Bromsubstituiertes-Kohlenstoffatom) kehrt sich hier um.
  3. Ist die Reaktivität zu hoch, so tritt in zunehmendem Maße auch O-Acylierung ein - die N/O-Selektivität wird geringer. Basenzugabe (2,6-Dimethylpyridin) bewirkt ebenfalls eine Erhöhung der O-Acylierung, ohne die N-Acylierung nennenswert zu fördern.
  4. Zusätzlich zu den Reaktivitäten spielen die Reaktionsbedingungen der SPOT-Synthese eine Rolle:

Die verwendeten Bromacetylierungsmittel lassen sich auf der Basis der Ergebnisse in eine Reaktivitätsreihe gegenüber der Acylierung des sekundären Amins eines N-Alkylglycin-Bausteins einordnen ( Abb. 19 ). Die Reihenfolge ist dabei im Einklang mit Literaturangaben zu Aktivestern von Fmoc-Aminosäuren.[ 26 ] Das aus Aktivierung mit DIC hervorgegangene Bromessigsäureanhydrid läßt sich aus den obengenannten Gründen nicht ohne weiteres in die Reihe eingliedern. In jedem Fall ergeben sich jedoch geringfügig schlechtere Ergebnisse als unter Verwendung des 2,4-Dinitrophenylesters.

Abb. 19: Reaktivitätsreihe von Bromessigsäureestern gegenüber sekundären Aminen unter den Bedingungen der SPOT-Synthese.

3.3.2 Bromsubstitution durch primäre Amine

Im Zusammenhang mit der Optimierung des Bromacetylierungsmittels wurden im vorangegangenen Abschnitt erfolgreich Modell-Peptoide an Zellulosemembranen synthetisiert. Zur Bromsubstitution wurden dabei jeweils die gesamten Membranen mit 5 M Amin-Lösungen behandelt, um eine sichere Bromsubstitution zu erreichen. Nach der Bromacetylierung galt es nun auch die nukleophile Substitution und damit die Einführung der Seitenkettenfunktionalitäten für die Bedingungen der SPOT-Synthese zu optimieren. Dazu sollte der Einfluß des Lösungsmittels und der Aminkonzentration auf die Produktqualität untersucht werden.

3.3.2.1 Lösungsmittel

Zusätzlich zu allgemeinen Funktionen wie der Solvatation der Reagenzien übernimmt das Lösungsmittel bei der SPOT-Synthese die Kontrolle der Reaktionszeit, die durch seine Flüchtigkeit begrenzt ist. Bei Verwendung von N-Methylpyrrolidon (NMP) oder Dimethylsulfoxid (DMSO) bleibt die Membran pro Kopplung etwa 10-15 Minuten benetzt. Längere Reaktionszeiten können durch Mehrfachkopplungen erreicht werden. Die Synthese von Peptoiden am Syntheseharz wird mit einer zweistündigen Reaktionszeit für jeden Substitutionsschritt durchgeführt.[ 104 ] Entsprechende 8- bis 12-fach-Kopplungen an Zellulose würden zu Problemen mit unflüchtigen Reagenzien führen, da diese auf der Membran


52

zurückbleiben. Die erfolgreichen Synthesen aus Abschnitt 3.3.1 lassen eine Kopplungzeit von 45 Minuten als ausreichend erscheinen, so daß für die hier durchgeführten Experimente Bromsubstitutionen als Dreifachkopplung durchgeführt wurden.

Für die SPOT-Synthese geeignete Lösungsmittel sollten folgende Eigenschaften aufweisen:

  1. Hoher Siedepunkt und damit geringe Flüchtigkeit, um eine lange Reaktionszeit zu ermöglichen.
  2. Gute Benetzungseigenschaften für Zellulose.
  3. Gute Lösungseigenschaften für Reagenzien verschiedenster Art, um Konzentration > 1 M zu erlauben.
  4. Nicht zu große Viskosität, um eine Pipettierung kleiner Lösungsmittelmengen im 10 nl-Bereich zu ermöglichen.

Die Lösungsmittel NMP und DMSO erfüllen diese Kriterien weitgehend. Insbesondere NMP (Siedepunkt: 203°C) hat sich in der SPOT-Synthese bewährt, da es unflüchtiger als DMSO (Siedepunkt: 189°C) ist und keine Oxidation von Sulfiden (wie z.B. in Methionin) bewirkt.[ 39 ] Da einige Amine in der SPOT-Synthese eingesetzt werden sollten, die aufgrund ihrer Polarität nur schwer in organischen Lösungsmitteln löslich sind (z.B. Glycinamid), sollte auch Wasser als drittes Lösungsmittel mit in die Untersuchung einbezogen werden. Um den Einfluß des Lösungsmittels auf die Bromsubstitution zu bestimmen, wurde die trimere Testverbindung 16 unter Verwendung der genannten Lösungsmittel (NMP, DMSO, H2O) an Rink-Linker-derivatisierter Zellulose synthetisiert ( Tab. 9 ). Durch Iodid-Zusatz (0.05 M) sollte zusätzlich untersucht werden, ob sich die Reaktion durch in situ-Erzeugung des Iodacetamides beschleunigen läßt.[ 12 ]

Tab. 9: Reinheiten der Rohprodukte einer Synthese des Tripeptoids 16 an einer Rink-Linker-derivatsierten Zellulosemembran.

 

Lösungmittel

NMP

DMSO

H2O1)

 

 

Zusatz 2)

-

Me4N+I-

-

Me4N+I-

-

Cs+I-

 

 

Reinheit [%] 3)

93

93

95

95

93

93

 

1) Zusatz von 0.05% Tween® 20; 2) 0.05 M; 3) HPLC, 220 nm; gemittelt aus zwei Synthesen; die Ausbeute betrug 55-100% (bestimmt durch quantitative Auswertung der UV-Absorption und Vergleich mit dem Derivatisierungsgrad).


53

Alle drei verwendeten Lösungsmittel lieferten das gewünschte Produkt in ausgezeichneten Reinheiten (> 93%) und guter bis sehr guter Ausbeute (55-100%). Ein Zusatz von Iodid führte zu keiner Verbesserung der Ergebnisse. Den wäßrigen Lösungen wurde Tween® 20 (0.05%) als Detergenz zugesetzt, um die Oberflächenspannung herabzusetzen und eine gleichmäßige Benetzung der Membran zu ermöglichen.

Die Verwendung von Wasser als Lösungsmittel wurde bisher noch nicht in der Peptoid-Synthese beschrieben und ist generell unüblich bei Reaktionen an Syntheseharzen. Die hier gezeigten Ergebnisse belegen, daß wäßrige Lösungen für die SPOT-Synthese an Zellulose geeignet sind. Es ist auf diese Weise möglich, das Spektrum anwendbarer Bausteine auf sehr polare Amine zu erweitern. Nachteilig ist allerdings die verglichen mit NMP und DMSO höhere Flüchtigkeit von Wasser.

3.3.2.2 Konzentrationen

In einer Reihe von Synthesen sollte die minimal benötigte Aminkonzentration ermittelt werden. Dazu wurde wie bei der Variation der Lösungsmittel das Tripeptoid 16 - in diesem Fall unter Anwendung verschiedener Aminkonzentrationen - aufgebaut ( Abb. 20 ).

Abb. 20: Reinheiten und Ausbeuten der Rohprodukte einer Synthese des Tripeptoids 16 an einer Rink-Linker-derivatisierten Zellulosemembran (Lösungen in NMP). 1) 9 M (77 Äq.) für Benzylamin; 2) Bei der verwendeten Membran (1.26 µmol/cm2), einer Reagenzienmenge von ca. 3.6 µl/cm2 und Dreifach-Pipettierung des Amins.

Die Meßwerte zeigen eine deutliche Abhängigkeit sowohl der Reinheit als auch der Ausbeute von der Aminkonzentration. Reinheiten über 90% werden erst bei Anwendung 2 M Amin-Lösungen, eine maximale Ausbeute sogar erst bei Anwendung 5 M Lösungen erreicht. Letztere Aminkonzentration entspricht bei der hier verwendeten Membran (1.26 µmol/cm2) einer Anwendung von rund 43 Äquivalenten. Mit einem Derivatisierungsgrad über 1 µmol/cm2 liegt die für die Optimierung verwendete Membran allerdings an der


54

oberen Grenze der für die SPOT-Synthese geeigneten Träger, so daß 2-5 M Aminkonzentrationen bei Membranen mit niedrigerer Derivatisierung in jedem Fall ausreichen sollten. Die unerwartet niedrige Reinheit und Ausbeute für die 10 M Lösungen ist vermutlich auf das schnellere Verdampfen der puren Amine verglichen mit ihren Lösungen in NMP und die damit verbundene verkürzte Reaktionszeit zurückzuführen. Da die puren Amine als Lösungsmittel auch eine von NMP verschiedene Polarität haben, könnten auch Lösungsmitteleffekte eine Rolle spielen.

Um die Amine stets in ausreichendem Überschuß einzusetzen, sollte die Synthese von Peptoiden im folgenden mit 50%igen Lösungen (bei flüssigen Aminen ca. 4-5 M Lösungen bei Aminen mit M < 150 g/mol) bzw. mit 2-5 M Lösungen (bei Feststoffen) in NMP erfolgen. Der Substanz-Verbrauch bleibt trotz der hohen Konzentrationen begrenzt, da die SPOT-Synthese mit Lösungsmengen im µl-Bereich auskommt.

3.3.3 Einführung von Diversität: Test von Aminen auf ihre Eignung in der SPOT-Synthese

In der Peptoid-Synthese nach der Sub-Monomer-Methode werden die Bausteine in einem 2-stufigen Prozeß eingeführt. Die Bromacetylierung dient dem Aufbau des Peptoid-Rückgrates (Carbonyl- und alpha-CH2-Gruppe), während mit den Aminen die Seitenketten eingebracht werden. Die Eigenschaften der synthetisierten Verbindungen werden, wie auch bei den Peptiden, weitgehend von den Seitenketten bestimmt, denen daher eine entscheidende Bedeutung zukommt. Während man sich bei der Peptidsynthese häufig auf die 20 proteinogenen Aminosäuren sowie deren Enantiomere beschränkt, steht zur Synthese der Peptoide das gewaltige Repertoire der (vielfach kommerziell erhältlichen) primären Amine zur Verfügung. Da die Auswahl der Bausteine die „Unterschiedlichkeit“ der einzelnen Peptoide einer Peptoid-Bibliothek - ihre Diversität - bestimmt, kommt den Aminen eine entscheidende Bedeutung für den Erfolg der Bindungsstudien zu.

3.3.3.1 Untersuchung der zur Synthese notwendigen Amineigenschaften

Kommerziell sind primäre Amine in großer Anzahl erhältlich (> 13.000 in „Available Chemicals Database“, davon 1.000 zu einem Preis unter 10 DM/g[ 108 ]). Zusätzlich existieren zahlreiche Methoden zu deren Synthese (z.B.: Reduktive Aminierung, Reduktion von Nitrilen, Gabriel-Synthese, Decarboxylierung von Aminosäuren[ 141 ]). Um die Bausteine für die Synthese einer Peptoid-Bibliothek auswählen zu können, muß man die Kriterien kennen, nach denen sich die Eignung der Amine für die Peptoid-Synthese entscheiden läßt.


55

Generell muß der ausgewählte Baustein drei Kriterien genügen:

  1. Er muß zur nukleophilen Substitution des Bromatoms befähigt sein.
  2. Das gebildete sekundäre Amin muß durch Bromessigsäure acylierbar sein.
  3. Er muß eine ausreichende Löslichkeit in einem zur SPOT-Synthese geeigneten Lösungsmittel (vergl. 3.3.1.4 ) besitzen.

Eine Ausnahme bilden Bausteine, die in der N-terminalen Position eingesetzt werden sollen. Sie brauchen Kriterium 2.) nicht zu erfüllen.

Mehrere Faktoren spielen bei der Erfüllung dieser Kriterien eine Rolle:

  1. Reaktivität (Nukleophilie) des Stickstoffatoms.
  2. Sterischer Anspruch, insbesondere in der Nähe der reaktiven Aminogruppe (alpha- und beta-Position).
  3. Löslichkeit in den geeigneten Lösungsmitteln.
  4. Flüchtigkeit.
  5. Anwesenheit von funktionellen Gruppen (zusätzlich zur Aminofunktion).

G.M. Figliozzi et al. schlugen die Synthese des Pentapeptoids 70 vor, um eine experimentelle Aussage über die Eignung eines Amin-Bausteins 5 in der Peptoidsynthese zu erhalten[ 104 ]. Geeignete Amine sollten das Pentamer dabei in einer Reinheit von > 70% (HPLC) sowie einer Ausbeute > 50% ergeben. Die Identität sollte mittels ESI-MS überprüft werden.

Um die Amine auf eine Eignung zur SPOT-Synthese zu überprüfen, wurde die Synthese des kürzeren Tripeptoids 19 gewählt. Vorteile dieses Verfahrens sind eine schnellere Synthese und eine leichtere Interpretierbarkeit der Nebenprodukte. Aus Art und Menge der Nebenprodukte lassen sich wichtige Rückschlüsse auf die zugrunde liegenden Probleme ziehen und diese gegebenenfalls umgehen.

Ausgehend von einer Zellulosemembran, die bereits mit dem ersten bromacetylierten Monomer versehen war (58), wurde das zu testende Amin 5 unter SPOT-Bedingungen angewendet (Dreifachkopplung, 2-5 M, Schema 14 ). Gelang sowohl die Bromsubstitution zum Dimeren 73 als auch die anschließende Acylierung, so erhielt man das Tripeptoid 19. War das Amin nicht in der Lage, das Halogen zu substitutieren, dann blieb die Ausgangsverbindung 58 erhalten. Nach der anschließenden (in diesem Fall wirkungslosen) Acylierung bewirkte dann Piperidin den Bromaustausch zu 71. Das Auftreten des Dimeren 72 schließlich zeigte eine unvollständige Bromacetylierung des Dimers 73 an. Anhand der


56

jeweiligen Mengen der drei Produkte konnte ein Reaktionsprofil des zu testenden Amins erstellt werden.

Schema 14: Mögliche Nebenprodukte bei der Synthese des Tripeptoids 19 mit dem Amin 5.
a) Br-CH2COODnp (1 M in NMP); b) Piperidin (5 M in NMP); c) In Abhängigkeit vom verwendeten Linker: 95% TFA/H2O (Rink-Linker) bzw. hny (365 nm) (Photolinker).

Auswahl der Amine

Es sollten repräsentative Amine ausgewählt und anhand der Synthese der entsprechenden Modell-Trimeren 19 auf ihre Eignung zur Peptoid-Synthese unter SPOT-Bedingungen untersucht werden. Die Kriterien der Auswahl gründeten sich in erster Linie auf der jeweiligenen Fragestellung (z.B. der Untersuchung sterischer Faktoren). In zweiter Linie galt es Bausteine zu wählen, die aufgrund ihrer interessanten Struktur (wie beispielsweise den Seitenketten der proteinogenen Aminosäuren) einen Beitrag zu einer bioaktiven Struktur liefern könnten. Dazu war auch zu berücksichtigen, daß sich die gewählten Amine ausreichend in Struktur und Art der funktionellen Seitenketten-Gruppe unterscheiden, um das Erreichen einer hohen Diversität der später synthetisierten Peptoid-Bibliotheken zu gewährleisten.

Auf die Wahl des Amins folgte die Suche eines geeigneten Lösungsmittels (NMP oder DMSO, bei Schwerlöslichkeit H2O). Amine, die nur als Hydrochloride erhältlich sind, mußten durch Basenzugabe freigesetzt werden. Dazu wurden bei relativ unpolaren Aminen 0.9 Äquivalente DIEA zur Lösung in NMP bzw. bei polaren Aminen 0.9 Äquivalente NaOH zur wäßrigen Lösung zugegeben (die unterstöchimetrische Basenzugabe sollte sicherstellen, daß Hydroxidionen nicht mit dem Amin um die Bromsubstitution konkurrieren).


57

Analytik mittels HPLC-MS

Nach der SPOT-Synthese wurde das membrangebundene Trimer 19 mit dem entsprechenden Membranstück ausgestanzt und vom Linker abgespalten. Man erhielt je nach Derivatisierungsgrad zwischen 50 und 300 nmol Substanz, die in einer Standardmessung mittels HPLC und gekoppelter ESI-MS analysiert wurden. Die Bedingungen der HPLC-Trennung waren wie folgt: C18 Reverse-Phase Säule (2.1 x 150 mm), linearer Gradient 5-95% B, wobei A: 0.05% TFA in Wasser und B: 0.05% TFA in Acetonitril, Fluß 0.3 ml/min, Gradienten-Länge: 25 Minuten. Die Produktreinheiten wurden durch quantitative Auswertung der Integralflächen des UV-Chromatogramms (220 nm) erhalten. Die Massenanalyse erfolgte mittels einer Abfolge verschiedener Massenspektren-Typen: Standard-Spektren in den Massen-Bereichen 50-600 und 150-2000 sowie MS2-Spektren der beiden intensivsten Ionen im Bereich 50-600 mit einer Kollisons-Energie von 24% und Collision-Induced Dissociation- (CID-)Spektren im gleichen Bereich bei 35% Kollisions-Energie. Die Zuordnung der Reaktionsprodukte zu den Signalen des UV-Detektors der HPLC wurde durch Anwendung von Massenfiltern für die gesuchte Masse durchgeführt. Die Identität der Verbindungen wurde durch Analyse charakteristischer Signale im Spektrum (im allgemeinen M+H+) sowie der Betrachtung von Fragmenten im Haupt- sowie in den MS2-Spektren überprüft. Einige immer wiederkehrende Fragmentierungen resultieren aus Bindungsbrüchen der Amidbindungen insbesondere der Verlust von Ammoniak bei der Spaltung des C-terminalen Amides (-17). Carbonsäure- und Hydroxyethyl-Seitenketten zeigten eine Neigung zur Eliminierung von Wasser (-18). Bei Verwendung eines N-terminalen Piperidin-Bausteins wird stets ein Fragment 75 mit der Masse m/z = 98.1 beobachtet, welches aus protonierten Peptoiden 74 nach einem Bruch der N-terminalen Amidbindung und anschließender Eliminierung von Kohlenmonoxid gebildet wird. (Zur Analytik mittels ESI-MS vergleiche Lit.[ 142 - 144 ] sowie zur speziellen MS-Analytik von Peptoiden Lit.[ 145 , 146 ])

Die folgenden Parameter wurden untersucht, um die Anwendbarkeit von Aminen einschätzen zu können:

  1. Einfluß der Flüchtigkeit des Amins.
  2. Einfluß sterischer Faktoren (Verzweigungen).
  3. Einfluß der Nukleophilie der NH2-Gruppe.
  4. Anwendbarkeit funktioneller Gruppen in der Seitenkette.


58

3.3.3.1.1 Einfluß der Flüchtigkeit des Amins

Zunächst sollte der Einfluß der Flüchtigkeit der Amine auf die Produktreinheiten untersucht werden ( Tab. 10 ).

Tab. 10: Einfluß der Flüchtigkeit von Aminen R-NH2 auf die Produktreinheiten bei der Synthese der Tripeptoide 19 an Rink-Linker modifizierter Zellulose.

Nr.

 

Lösungs-mittel

Sdp. des Amins1)

Trimer 19
[%]2)

1

 

H2O
[12 M]

-33°C

11

2

 

H2O
[12 M]

-6°C

263)

3

 

H2O
[12 M]

17°C

323)

4

 

NMP
[50%]4)

53°C

85

5

 

NMP
[50%]4)

78°C

90

1) Literaturwerte; 2) Die Daten sind das Ergebnis von Einzelsynthesen; 3) Synthetisiert am Photo-Linker 48; 4) Vol-%.

Es wird deutlich, daß die flüchtigen Amine Ammoniak, Methyl- und Ethylamin ( Tab. 10 , Einträge 1-3), selbst wenn sie in hoher Konzentration angewendet werden, keine zufriedenstellenden Ergebnisse liefern. Die Reaktionszeit ist durch ihr rasches Verdampfen zu kurz. Mit einem Siedepunkt von 53°C liefert Allylamin bereits gute Ergebnisse (Eintrag 4), die von n-Butylamin (Sdp. 78°C, Eintrag 5) noch übertroffen werden. Die Flüchtigkeit ist in diesem Fall allerdings nicht die einzige Variable: auch Nukleophilie und sterischer Anspruch unterscheiden sich bei den hier verwendeten Aminen. Der Flüchtigkeit wird jedoch in dieser Reihe die entscheidende Rolle zugeschrieben.

Es sei angemerkt, daß Glycin sowie die Peptoide mit Methyl- und Ethylrest alternativ gut über die Anwendung der entsprechenden Fmoc-geschützten Monomer-Bausteine (Fmoc-Glycin, Fmoc-Sarcosin und Fmoc-N-Ethylglycin) eingeführt werden können. Die Kopplung


59

der Aminosäuren mit N-Alkylglycinen erfolgt in der SPOT-Synthese am besten nach einer Aktivierung zum Anhydrid durch DIC.[ 110 , 123 ] Bei Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe mit einer unflüchtigen Base (DBU) anstelle von Piperidin kann die Monomer-Synthese mit der Sub-Monomer-Methode auf einer Membran kombiniert werden ( Schema 15 ).

Schema 15: Parallele Durchführung der Peptoid-Synthese nach der Sub-Monomer- und der Monomer-Methode auf einer zusammenhängenden Membran.[ 110 , 123 ] Die beiden Synthesewege können dabei an benachbarten SPOTs durchgeführt werden. Zur Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe innerhalb eines SPOT-Schrittes hat sich hier das im Vergleich zu Piperidin unflüchtigere DBU (4% in NMP) bewährt.

3.3.3.1.2 Einfluß sterischer Faktoren (Verzweigungen)

Es war zu erwarten, daß ein hoher sterischer Anspruch der Peptoid-Seitenkette die Synthese behindern kann - insbesondere bei der auf die Aminkopplung folgenden Acylierung des sekundären Amins 76 mit der aktivierten Bromessigsäure 11. Der Raumbedarf des Peptoid-Rückgrates (alpha´- und beta´-Positionen) ist dabei vom Amin unabhängig und konstant. Verzweigungen in alpha-, beta- oder gamma-Position des Amins lassen, verglichen mit den unsubstituierten Aminen, eine Behinderung der Acylierung erwarten. Eine Auswahl an Bausteinen wurde getestet, um die Abhängigkeit der Reaktion von sterischen Faktoren abschätzen zu können ( Tab. 11 ).


60

Tab. 11: Einfluß sterischer Faktoren auf die Produktreinheiten bei der Synthese der Tripeptoide 19 an Rink-Linker modifizierter Zellulose. Die zugrunde liegenden Amine R-NH2 wurden als Lösungen in NMP eingesetzt (50%).

Nr.

 

Verzweigung

Dimer 72
[%]

Trimer 19
[%]

n1)

1

 

gamma

-

80

1

2a

 

beta

-

95 (Bn)

5

2b

 

beta

-

87 (Napht)

1

3

2)

beta

21

62

1

4

 

alpha

-

97

1

5

 

alpha

9

81

2

6

3)

alpha

20

72

1

7

4)

alpha

30

475)

1

8

6)

alpha

95

0

1

1) Zahl der durchgeführten Synthesen; 2) (+)-Dehydroabietylamin: tech. (60% GC); 3) Die Synthese erfolgte mit dem entsprechenden Dimethylacetal; 4) 4 M in NMP; 5) Summe aus 27% der Tripeptoids 19 (R = •-C(CH2OH)3) und 20% des entsprechenden im 3. Acylierungsschritt einfach O-acylierten Produktes; 6) 0.8 M in NMP.


61

Bei keinem der hier getesteten Amine wurde ein Auftreten des Dimers 71 beobachtet (vergl. Schema 14 , Seite 56), welches nach unvollständiger Brom-Substitution beobachtet wird. Selbst das sterisch sehr anspruchsvolle 1-Adamantylamin ermöglichte eine vollständige Reaktion. Die Dimere 72 traten jedoch in unterschiedlichem Maß auf und signalisierten unvollständige Bromacetylierung des membrangebundenen sekundären Amins in Abhängigkeit vom Verzweigungsgrad.

In gamma-Positon behinderte selbst eine Substitution mit zwei Phenylresten die Reaktion nicht ( Tab. 11 , Eintrag 1). Auch eine beta-Substitution liefert bei Resten mittleren sterischen Anspruchs (z.B. Naphtyl, Eintrag 2b) vollständige Acylierung. Der sehr voluminöse (+)-Dehydroabietylrest, der ein quartäres C-Atom in beta-Stellung aufweist, ließ sich nicht mehr vollständig umsetzten, lieferte das gewünschte Trimer jedoch immer noch in einer Reinheit von 62% (Eintrag 3).

In alpha-Position werden einfache Verzweigungen problemlos toleriert, wenn sie Teil eines Fünfringes sind (Eintrag 4). Der Cyclohexyl-Rest (Eintrag 5) sowie eine einfache offenkettige alpha-Verzeigung (Eintrag 6) ergeben noch gute Trimer-Reinheiten (81% bzw. 72%), wenngleich die Acylierung unvollständig ist. Nur sehr unvollständig oder gar nicht lassen sich Seitenketten mit drei alpha-Substitutenten umsetzen (Einträge 7 und 8).

3.3.3.1.3 Einfluß der Nukleophilie der NH2-Gruppe

Genau wie der sterische Anspruch kann sich die Nukleophilie des primären Amins sowohl auf die Brom-Substitutuion als auch auf die nachfolgende Bromacetylierung auswirken. Das Spektrum der N-Nukleophile reicht von einer hohen Reaktivität bei Hydrazinen und Hydroxylaminen auf der einen Seite über aliphatische Amine zu Arylaminen (Anilinen und heterocyclisch substituierten Aminen) auf der anderen Seite. Die Elektronendichte am Stickstoff wird bei letzteren entscheidend von Art und Position der Substituenten am aromatischen System sowie bei heterocyclischen Systemen von der Art des Heterocyclus bestimmt. Als Ergänzung zu den bereits getesteten aliphatischen Aminen ( Tab. 10 und Tab. 11 ) wurde eine Auswahl an elektronenreichen und -armen Aminen getestet, um den Einfluß der Nukleophilie beurteilen zu können ( Tab. 12 ). Dabei ist zu berücksichtigen, daß insbesondere bei den Anilinen durch die alpha-Verzweigung auch sterische Faktoren eine Rolle spielen.


62

Tab. 12: Einfluß der Nukleophilie der Amino-Gruppe von Aminen R-NH2 auf die Produktreinheiten bei der Synthese der Tripeptoide 19 an Rink-Linker modifizierter Zellulose.

Nr.

 

Lösungs-mittel

Dimer 71
[%]

Dimer 72
[%]

Trimer 19
[%]

n1)

1

 

H2O
[50%]

-

-

78

2

2a

X = H2)

NMP
[2 M]

-

-

64

3

2b

X =

H2O
[5 M]

-

-

80

1

3

 

H2O
[5 M]

-

90

7

5

4a

X = p-OH

NMP
[1 M]4)

12

0

80

1

4b

X = m-OH

NMP
[2 M]

-

285)

48

1

4c

X = o-OH

NMP
[2 M]

-

11 + 225)

166)

2

4d

X = p-OMe

NMP
[4 M]

-

-

687)

1

4e

X = H

NMP
[50%]3)

-

585)

35

2

4f

X = m-F

NMP
[50%]3)

-

805)

< 1

1

5a

X = CH

NMP
[1.5 M]

2

-

69

2

5b

X = N

NMP
[2 M]

20

13

22

2

6

 

NMP
[5 M]

-

36

4

1

1) Zahl der durchgeführten Synthesen; 2) Hydrazin wurde mono-Boc-geschützt eingesetzt; 3) Vol-%; 4) gesättigte Lösung; 5) Als Diketopiperazin 80; 6) Nebenprodukt: 47% 4H-Benzo[1,4]oxazin-3-one 79; 7) Bei der Bestimmung der Reinheiten wurde das Signal von adhäsiv am Träger gebundenem und durch TFA abgelöstem Amin nicht berücksichtigt.


63

Elektronenreiche Amine:

Hydroxylamin und einfach acylierte Hydrazine ( Tab. 12 , Einträge 1, 2a und 2b) ergeben das Tripeptoid 19 in mittleren bis guten Reinheiten (64-80%). Als Nebenprodukte treten zahlreiche Verbindungen in jeweils geringer Menge auf. Sie bilden sich vermutlich während der Abspaltung mit TFA aus den entsprechenden heteroatomsubstituierten und daher elektronenreichen Amiden. Interessanterweise läßt sich aus dem N,N-Dialkylhydrazin N-Aminopyrrolidin (Eintrag 3) nur das nicht-acylierte Dimer N-Pyrrolidinyl-72 gewinnen. Selbst bei Versuchen zur säurefreien Abspaltung nach Synthese am Photo-Linker wurde nur das Dimer nachgewiesen. Eine säurekatalysierte Amidspaltung konnte die Beobachtung also nicht erklären. Möglicherweise liegt N-Pyrrolidinyl-72 als basisches Trialkylhydrazin in hohem Maße protoniert vor und eine Acylierung wird so verhindert. Die Bromsubstitution könnte auch mit dem nukleophilen, dialkylierten Stickstoffatom zum isomeren Hydrazinium-Ion 77 erfolgt sein, dessen Ladung eine Acylierung verhindern würde. Im Rahmen dieser Untersuchung konnte die Beobachtung nicht geklärt werden.

Elektronenarme (aromatische) Amine:

Die untersuchten Aniline lassen sich in ihrer Reaktivität analog ihrer elektrophilen aromatischen Substituierbarkeit einorden (Einträge 4a-4f). Elektronenreiche Aniline sind für die Peptoid-Synthese an Zellulose geeignet (Einträge 4a,b,d). Die phenolischen Hydroxygruppen müssen dabei nicht gegenüber Seitenkettenacylierung geschützt werden. Aus sterischen Gründen muß jedoch wie bei Cyclohexylamin mit einem Anteil an nicht-acyliertem Produkt gerechnet werden. Eine Besonderheit wurde bei ortho-Hydroxy-Anilin (Eintrag 4c) beobachtet: Es wurde hauptsächlich ein Produkt mit M = 319 g/mol beobachtet, bei dem es sich auf der Basis des Massen-Spektrums um das 4H-Benzo[1,4]oxazin-3-one 79 handelt, welches durch intramolekularen Ringschluß nach der Bromacetylierung aus 78 gebildet wurde.

Anilin selbst wird in der Literatur als geeignet für die Peptoid-Synthese beschrieben.[ 12 ] Mit nur 35% Reinheit bei der Trimeren-Synthese ist es für die Synthese an Zellulose jedoch


64

ungeeignet (Eintrag 4e). Die Reaktion kann bei den Synthesebedingungen am Harz zur Vollständigkeit gebracht werden, während sie an Zellulose vorzeitig endet - sie stellt ein Beispiel für die Grenzen der Peptoidchemie an Zellulose dar. Im Falle einer Fluorsubstitution am Anilin ist der anilinische Stickstoff derart deaktiviert, daß eine Acylierung nicht mehr möglich ist (Eintrag 4f).

Eine bemerkenswerte Beobachtung in der Reihe der Aniline war das Auftreten von Produkten, die verglichen mit den Dimeren 72 eine um 17 Einheiten verminderte Masse aufwiesen. Sie trat hauptsächlich nach einer Behandlung mit TFA bei der Abspaltung vom Rink-Linker auf - nach einer vergleichenden Synthese am Photo-Linker und säurefreier Photolyse erhält man hauptsächlich das Dimer 72. In einer Lösung von Acetonitril (30%) und TFA (0.1%) in Wasser verschwand letzteres allerdings nach 1-2 Tagen zugunsten des obengenannten Produktes. Eine säurekatalysierte Cyclisierung der Dimeren 72 zu den entsprechenden Diketopiperazinen 80 erklärt die Nebenreaktion.[ 104 ] Sie ist jedoch nur im speziellen Fall von Peptoiden möglich, die einen Anilin-Rest N-terminal tragen.

Eine weitere Beobachtung machte die Grenzen der Reaktion am Beispiel der Aniline deutlich: Der Versuch, 4-Hydroxyphenyl-73 mit Fmoc-Prolin an Stelle von Bromessigsäure zu acylieren, um ein Hybrid-Oligomer 81 aus Peptoid- und Peptid-Bausteinen (Peptomer[ 17 ]) zu erhalten, war nicht erfolgreich ( Schema 16 ). Aus der Beobachtung läßt sich ableiten, daß Bromessigsäure-2,4-dinitrophenylester (11) unter den hier angewendeten Bedingungen sogar etwas reaktiver als Aminosäureanhydride ist, welche sich für die Acylierung aliphatisch substituierter Peptoide unter SPOT-Bedingungen als optimal erwiesen hatten.[ 110 ]

Schema 16: Versuch der Synthese von Peptoid/Peptid Hybriden (Peptomeren) mit Anilinen. Das membrangebundene Anilin 4-Hydroxyphenyl-73 läßt sich unter den für die SPOT-Synthese mit aliphatischen Aminen optimierten Bedingungen (mit Fmoc-Prolinanhydrid[ 110 ]) nicht mehr zum Peptomer 81 acylieren, während die Reaktion mit Bromessigsäure-2,4-dinitrophenylester glatt zu 4-Hydroxyphenyl-19 verläuft (vergl. Tab. 12 , Eintrag 4a). a) Piperidin (50% in DMF); b) TFA (95% in H2O); c) DBU (4% in DMF).


65

(Zur Peptomer-Synthese vergl. Schema 15 , wobei statt des Fmoc-N-alkylglycins eine Fmoc-Aminosäure eingesetzt wird.) Für die Peptomer-Synthese ist die Reaktivität des 4-Hydroxyanilins nicht mehr ausreichend. Aniline sollten daher nur zur Synthese von „reinen“ Peptoiden eingesetzt werden.

Von den verwendeten heterocyclischen Aminen 2-Aminothiazol (Eintrag 5a), 2-Amino-1,3,4-thiadiazol (Eintrag 5b) und 2-Aminopyridin (Eintrag 6) wurde nur erstgenanntes in einer brauchbaren Reinheit von 69% zum gewünschten Trimer umgesetzt. Die elektronegativen Ring-Stickstoffatome bewirken eine Verminderung der Reaktivität, so daß eine Acylierung mit Bromessigsäure nicht oder nur unvollständig möglich ist.

3.3.3.1.4 Anwendbarkeit funktioneller Gruppen in der Seitenkette

Als letzter Parameter sollte die Vereinbarkeit der Peptoid-Synthese mit funktionellen Gruppen in Seitenketten untersucht werden. Entscheidend war dabei, ob die gewünschte Gruppe ungeschützt eingebracht werden kann, oder ob eine Schutzgruppe notwendig ist. Für die Synthese am Harz wurde vorgeschlagen, Alkohole, Amine, Carbonsäuren, Thiole und Guanidine zu schützen, während weniger reaktive Gruppen wie Indole, Phenole und Imidazole ungeschützt bleiben können.[ 12 , 104 ] Entsprechende Synthesen von geschützten Aminen für die Sub-Monomer-Methode wurden beschrieben.[ 18 , 130 ]

Die Untersuchung der N/O-Selektivität bei der Bromessigsäureaktivierung (Abschnitt 3.3.1.2 ) ergab bereits, daß Aminoalkohole, anders als bei der Peptoid-Synthese am Harz, bei Verwendung von Bromessigsäure-2,4-dinitrophenylester (11) auch ohne Schutzgruppe eingesetzt werden können. Der Verzicht auf Schutzgruppen ist dabei vor allem in Hinblick auf die schnelle Zugänglichkeit der Bausteine von erheblichem Vorteil.

Die Schutzgruppen-Strategien bei den hier untersuchten Seitenkettenfunktionalitäten werden im folgenden erläutert (die Daten sind in Tab. 13 zusammengefaßt):

-COOH: Carbonsäuren

Vorversuche mit freien, ungeschützten Carbonsäurefunktionalitäten in der Seitenkette führten zu Nebenprodukten, in denen die Säure mit dem in der Synthese folgenden Amin zum Amid reagiert hatte. Vermutlich setzte sich das Carboxylat zum Teil mit der aktivierten Bromessigsäure zum gemischten Anhydrid um. Der Einsatz von säurespaltbaren tert-Butylestern sollte einen ausreichenden Schutz bewirken, ohne Aminolysen des sterisch anspruchsvollen Esters befürchten zu müssen. Zudem sind einige Bausteine für die Peptoid-Synthese (Glycin, beta-Alanin) als tert-Butylester kommerziell erhältlich ( Tab. 13 , Einträge 1a und 1b).

-CONH2: Carbonsäureamide

Carbonsäureamide wurden ungeschützt eingesetzt (Einträge 1c, 1d, 2 und 3b).


66

Tab. 13: Produktreinheiten bei Anwendung von bifunktionellen Aminbausteinen R-NH2 in der Synthese der Tripeptoide 19 an Rink-Linker modifizierter Zellulose

Nr.

 

Lösungsmittel

Trimer 19
[%]

n1)

1a

X = OH, n = 12)

H2O [2.5 M]

68

1

1b

X = OH, n = 22)

H2O [3 M]

85

1

1c

X = NH2, n = 1

H2O [5 M]

78

1

1d

X = NH2, n = 2

H2O [5 M]

69

1

2

 

NMP [50%]3)

96

1

3a

X = NH2, n = 14)

NMP [50%]3)

93

1

3b

X = NHAc, n = 1

NMP [50%]3)

99

1

3c

X = , n = 3

H2O [3 M]

435)

2

3d

X = OSO3H, n = 1

H2O [2 M]

59

2

3e

X = OPO3H2, n = 1

H2O [3 M]

17

3

3f

X = SH, n = 16)

NMP [3 M]

827)

1

3g

X = SH, n = 26)

NMP [3 M]

847)

1

1) Zahl der durchgeführten Synthesen; 2) Die zugrunde liegende Carbonsäure war als tert-Butylester geschützt; 3) Vol-%; 4) Das zugrunde liegende Diamin war mono-Boc-geschützt; 5) Seitenkettenacyliertes Produkt: 10%; 6) Die zugrunde liegenden Mercaptane waren S-Trityl geschützt; 7) Bei der Abspaltung wurde Triisopropylsilan (5%) zugesetzt, Disulfid-Dimer: 3% bzw. 4%, Tritylfragment bei der Berechnung der Reinheit nicht berücksichtigt.

Fortsetzung Tab. 13 :


67

Nr.

 

Lösungsmittel

Trimer 19
[%]

n1)

4a

X = H

NMP [50%]3)

908)

7

4b

X = Me

NMP [50%]3)

97

1

5

 

NMP [2 M]

95

1

6

<sup>9)</sup>

 

NMP [50%]3)

8010)

1

7

 

NMP [50%]3)

96

1

8

 

NMP [1.5 M]

6411)

3

9

 

NMP [1.5 M]

73

1

8) Seitenkettenacyliertes Produkt: 6%; 9) Die Synthese erfolgte aus dem entsprechenden Dimethylacetal; 10) Nebenprodukt: 20% Aldol-Dimerisierungsprodukt; 11) Nebenprodukt: 8% bicyclisches Produkt 87.

-NH2: Primäre Amine

Primäre Amine in der Seitenkette werden zur Peptoidsynthese zweckmäßigerweise mit einer Boc-Gruppe geschützt. Einige einfach geschützte Diamine sind kommerziell erhältlich. Aus den entsprechenden Diaminen lassen sie sich auch im hohen Ausbeuten nach A.P. Krapcho et al. herstellen.[ 147 ] (Eintrag 3a)

-NH-C(NH)NH2: Guanidine

Im Verlauf dieser Arbeit wurde von T. Uno et al. von Schwierigkeiten bei der Synthese doppelt-Boc-geschützter Guanidin-Seitenkettenfunktionen für Sub-Monomer-Bausteine berichtet und ein neuer Zugang zu 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl-geschützten Produkten vorgeschlagen.[ 130 ] Im Rahmen dieser Arbeit wurde versucht, die Guanidin-Funktionalität gänzlich ohne Schutzgruppe einzubringen, vor dem Hintergrund, daß auch Protonierung der sehr basischen Gruppe einen ausreichenden Schutz bewirken kann (Eintrag 3c).[ 137 , 148 ]


68

-OPO3H2: Phosphate und -OSO3H: Sulfate

Phosphorylierte Hydroxyfunktionen spielen im Organismus eine entscheidende Rolle bei der Regulation von Proteinaktivitäten.[ 149 ] Die kommerziell verfügbaren, einfachen Aminoethylester der Phosphorsäure und der Schwefelsäure sollten daher auf ihre Anwendbarkeit in der SPOT-Synthese hin getestet werden, um einen Zugang zu Phospho- und Sulfato-Peptoiden zu erhalten. Wie schon bei den ungeschützen Amino-Guanidinen macht auch hier die Verwendung von Wasser als Lösungsmittel den Einsatz erst möglich (Einträge 3d und 3e).

-SH: Thiole

Thiole in der Seitenkette sind insbesondere im Hinblick auf Cyclisierungen interessant. Das S-Trityl-geschützte Mercaptoethylamin (85) läßt sich leicht nach F.I. Carroll et al. aus Triphenylmethanthiol (82) und 2-Aminoethylbromidhydrobromid (83) herstellen.[ 150 ] Auf dem gleichen Weg wurde das CH2-homologe Mercaptopropylamin (86) aus 3-Aminopropylbromidhydrobromid (84) synthetisiert (Einträge 3f und 3g).

-OH: Alkohole/Phenole

Auf der Basis der positiven Ergebnisse in Abschnitt 3.3.1.2 wurden Hydroxyfunktionalitäten ungeschützt eingesetzt (Einträge 4a, 4b und 5).

-CHO: Aldehyde

Um die Bildung Schiff´scher Basen zu vermeiden, sollten Aldehyde acetalgeschützt eingesetzt werden. Die Dimethylacetale des Aminoacetaldehyds und 2-Aminopropionaldehyds sind kommerziell erhältlich (Eintrag 6 und Tab. 11 , Seite 60, Eintrag 6).

-CN: Nitrile

Nitrile wurden ungeschützt eingesetzt (Eintrag 7).

Imidazole

Der Imidazolring des Histamins wurde ungeschützt eingesetzt (Eintrag 8).

Indole

Indol Seitenketten wurden ungeschützt eingesetzt (Eintrag 9).

Die Ergebnisse zeigen, daß neben einfachen Alkyl- und Aryl-Resten auch eine große Anzahl von Seitenkettenfunktionalitäten in Reinheiten zwischen 64% und 99% zugänglich sind


69

(Carbonsäuren, Carbonsäureamide, primäre Amine, Thiole, Alkohole, Phenole, Aldehyde, Nitrile, Imidazole, Indole).

Die Seitenkettenveresterung, die beim primären Alkohol noch zu 6% beobachtet wurde, trat beim sekundären Alkohol aus sterischen Gründen nicht mehr auf (Einträge 4a und 4b). Für Histamin mit einer Imidazol-Trityl-Schutzgruppe wurden Nebenreaktionen beschrieben[ 104 ] - dennoch konnte das Test-Tripeptoid Imidazolylethyl-19 hier bei Verwendung von ungeschütztem Histamin in einer Reinheit von 64% neben nur 8% des beschriebenen bicyclischen Nebenproduktes 87 erhalten werden (Eintrag 8). Der Verzicht auf eine Schutzgruppe scheint die Cyclisierung in diesem Fall (evtl. durch Protonierung des Imidazols) zu unterdrücken.

Mit niedrigen Ausbeuten von 43% bzw. 59% eignen sich die hier getesteten Bausteine zur Einführung von Guanidin- oder Sulfat-Seitenkette allenfalls zur Synthese kurzer Oligopeptoide. Trotz einiger Versuche, den pH-Wert der Aminlösung zu variieren, ließ sich eine Phosphat-Seitenkette nur in 17% Reinheit erhalten. Der Baustein ist offenbar nicht zur Synthese geeignet. (Einträge 3d und 3e)

Eine interessante Gruppe von Diaminen wurde bereits als ungeeignet für die Peptoid-Synthese beschrieben[ 104 ]: Amine, die eine tertiäre Aminofunktion im Abstand von 3-4 Atomen vom Rückgrat tragen. Entsprechende Peptoide 88 quaternisieren bei der Bromacetylierung spontan zu cyclischen Produkten 89.

3.3.3.2 Seitenkettenfunktionalitäten der proteinogenen Aminosäuren

Im Hinblick auf die Ähnlichkeit der Peptoide mit den Peptiden sowie deren potentielle peptidmimetische Eigenschaften sind unter den verwendbaren Aminen diejenigen von besonderem Interesse, die zu Seitenketten der 20 proteinogenen Aminosäuren führen. Mit den im vorangegangenen Abschnitt gemachten Untersuchungen lassen sich alle entsprechenden funktionellen Gruppen in Peptoide einbringen. Dabei ist es allerdings oftmals nicht möglich, einen gleichen Abstand der Funktionalität vom Oligomeren-Rückgrat


70

zu wahren, da die entsprechenden Strukturen nicht stabil wären (z.B. N-Acylhemiaminal-Strukturen im Falle der Ser/Thr-Seitenketten). In Tab. 14 sind die zugänglichen Bausteine zusammengestellt.

Tab. 14: Zugänglichkeit der Sub-Monomer-Bausteine zur SPOT-Synthese von Peptoiden mit Seitenketten, die denen der proteinogenen Aminosäuren entsprechen. In der Zeile „0“ ist der Abstand zum Oligomeren-Rückgrat identisch mit den entsprechenden Peptiden. Bei
„-1“ bzw. „+1“ ist der Abstand um eine Methylengruppe kürzer bzw. länger.

 

Ala

Cys

Asp

Glu

Phe

Gly

His

Ile

Lys

Leu

-1

+ 1)

-

-

68%

-

-

-

-

+

-

0

+ 1)

-

68%

85%

96%

+ 1)

+ 2)

+

+

+

+1

+ 1,2)

82%

85%

+ 2)

+

+ 1)

64%

+ 2)

+

+

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Met

Asn

Pro

Gln

Arg

Ser

Thr

Val

Trp

Tyr

-1

-

-

+ 1,2)

78%

+ 2)

78%

-

-

-

80%

0

+

78%

+ 1)

69%

+ 2)

-

-

-

+ 2)

95%

+1

+ 2)

69%

+ 1)

+ 2)

43%

90%

97%

+

73%

+

Legende: Prozentangaben: Reinheiten, die mit den entsprechenden Bausteinen im Modell-Tripeptoid 19 erreicht wurden (vergl. Tab. 11 - Tab. 13 im vorangegangenen Abschnitt); „+“: Baustein, wenn nicht anders vermerkt, im Rahmen dieser Dissertation getestet (Daten innerhalb dieser Arbeit nicht gezeigt); „-“: Synthese nicht möglich.
1) Verwendung des entsprechenden Fmoc-geschützten N-Alkylglycinbausteins (Monomer-Methode); 2) Entsprechender Baustein nicht getestet, Synthese prinzipiell möglich.

3.3.4 Zusammenfassung: Möglichkeiten und Grenzen der Peptoid-Synthese

Aufgrund der speziellen Bedingungen der SPOT-Synthese wie einer besonderen Reaktionskinetik durch Verdampfung der Lösungsmittel oder der Anwesenheit von Hydroxyfunktionen des Zelluloseträgers ergeben sich Unterschiede zur Synthese an Harzen.

Es konnte gezeigt werden, daß Bromessigsäure-2,4-dinitrophenylester (11) optimal für die SPOT-Synthese an Zellulose geeignet ist.

Amine sollten in hoher Konzentration (2-5 M) in NMP oder DMSO gelöst eingesetzt werden. Bei sehr polaren Aminen ist die Anwendung von Wasser als Lösungsmittel möglich. Nach der Synthese einer Reihe von Tripeptoiden konnten Kriterien bestimmt werden, nach denen die Eignung von Aminen für die SPOT-Synthese eingeschätzt werden kann:


71

Ein primäres Amin ist für die Peptoid-Synthese an Zellulose geeignet, wenn es

  • einen Siedepunkt über ca. 50°C besitzt;
  • keine alpha-Verzweigung (R-CH2-NH2) oder eine alpha-Verzweigung als Teil eines 5-Ringes (Cyclopentylamine) aufweist;
  • eine alpha-Verzweigung aufweist und ein Anteil von 10-20% Abbruchsequenz im Produkt toleriert wird;
  • zu einer der folgenden Verbindungsklassen gehört: Alkylamin, Arylamin (wenn es elektronenreicher als Anilin selbst ist), Hydroxylamin, Acylhydrazin, Aminoalkohol, -phenol, -carbonsäureamid, -nitril, -indol oder -imidazol;
  • eine der folgenden Funktionalitäten in der Seitenkette trägt, die mit einer geeigneten Schutzgruppe versehen ist: Hydrazin (Boc), primäres/sekundäres Amin (Boc), Thiol (Trityl), Carbonsäure (tert-Butyl) oder Aldehyd (Acetal).

Es werden dabei Tripeptoide in einer Reinheit von 62% bis 99% erhalten.

Mit Nebenprodukten ist die Verwendung von Aminen mit freien Alkylsulfat- und Guanidin-Funktionen in der Seitenkette verbunden. In Rahmen von Synthesen kurzer Oligomere (z.B. Trimere) kann eine Verwendung jedoch erwogen werden.

Ungeeignet sind u.a. Amine, die an ein tertiäres Zentrum gebunden sind, Alkylhydrazine, und 2-Hydroxyaniline. Elektronenreiche Aniline sind zwar für die Synthese von Peptoiden, nicht aber für die Acylierung mit Fmoc-Aminosäureanhydriden nach der Monomer-Methode (Peptomer-Synthese[ 110 ]) geeignet.

Trotz der abgeleiteten Gesetzmäßigkeiten ist bei Aminen, die in der SPOT-Synthese von Peptoiden noch nicht eingesetzten wurden, ein chemischer Test durch die Synthese des Tripeptoids 19 zu empfehlen. Auch die genaue Einhaltung aller Syntheseparameter ist von großer Bedeutung für die Synthesequalität. Insbesondere sollte der Derivatisierungsgrad nach der Membranalkylierung und Kopplung des Linkers im Bereich von 200-1400 nmol/cm2 liegen, um eine zur Analyse ausreichende Produktmenge zu erhalten.


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