Heine, Helge Niklas: Peptidmimetika an Zellulosemembranen - SPOT-Synthese und Screening kombinatorischer Peptoid-Bibliotheken

72

Kapitel 4. Identifizierung bioaktiver Peptoide de novo

Für die Suche nach Liganden für Proteine und anderen bioaktiven Verbindungen existieren zwei grundlegend unterschiedliche Ansätze:

  1. Identifizierung und Optimierung eines bindenden Moleküls auf der Basis einer bekannten aktiven Verbindung, z.B. eines Rezeptors oder eines natürlich vorkommenden Peptids.
  2. Suche nach einer aktiven Verbindung de novo, d. h. ohne strukturelle Vorinformationen zu nutzen.

Die erste Methode ist naturgemäß direkter als die zweite Methode, da sie sich an einer bereits aktiven Struktur, der sogenannten Leitstruktur, orientiert. Die zweite Methode birgt ein hohes Potential, da bioaktive Verbindungen ohne Vorinformationen gefunden und zudem völlig neuartige aktive Strukturen identifiziert werden können. Ziel des de novo Ansatzes ist nicht die direkte Auffindung hochaffiner Liganden, sondern die Identifizierung einer neuen aktiven Substanz im Sinne einer Leitstruktur. Diese soll dann ihrerseits als Ausgangspunkt zu weiteren Optimierungen dienen.

Bei der de novo Methode müssen deutlich mehr Verbindungen getestet werden, um eine aktive Verbindung zu finden als bei der zielgerichteten Synthese, da die Trefferwahrscheinlichkeit aufgrund der fehlenden Vorinformationen deutlich geringer ist. Die Entwicklung von Bindungsstudien mit hohem Durchsatz (High Throughput Screening, HTS) lieferten eine erste Voraussetzung zur Durchführung von de novo Ansätzen.[ 151 ] Eine zweite Voraussetzung war die Einführung der kombinatorischen Chemie, die eine ausreichende Zahl an Verbindungen innerhalb kurzer Zeit zur Verfügung stellen kann.[ 152 ] Die SPOT-Synthese an Zellulose besitzt in diesem Zusammenhang ein hohes Potential, da in einer Synthese bis zu 8000 verschiedene Verbindungen innerhalb einer Woche parallel synthetisiert werden können.

Auf der Ebene von Peptiden war es bereits gelungen, die Erkennungsmotive von Antikörpern (Epitope) de novo mittels SPOT-Synthese zu identifizieren (Übersichten in Lit.[ 44 , 45 ]). Im Rahmen dieser Arbeit sollte am Beispiel von Peptoiden untersucht werden, ob sich auch nichtpeptidische Liganden für den auf peptidischer Ebene gut untersuchten monoklonalen Antikörper Tab-2[ 41 , 42 , 49 , 50 ] identifizieren lassen.

4.1 Chemische Voraussetzungen

Bei den Untersuchungen des vorangegangenen Abschnitts wurden die Peptoide stets auf einer Fläche synthetisiert, die eine zur Analyse ausreichende Substanzmenge trägt („große“ SPOTs). Typischerweise wurden die Substanzen an SPOTs im Abstand von etwa 1 cm synthetisiert und nach Ausstanzen einer 0.23 cm2 großen Fläche aus der SPOT-Mitte analysiert.

Um Bindungsstudien mit membrangebundenen Substanzen durchzuführen, reichen weitaus geringere Substanzmengen und damit verbunden kleinere SPOTs aus. In mehreren


73

Untersuchungen wurden Bindungsstudien mit zellulosegebundenen Peptiden durchgeführt, die mit einem SPOT-Abstand von ca. 2.2 mm und einer Dichte von ca. 21 SPOTs / cm2 synthetisiert wurden, so daß auf einer typischen Membran (19 x 28 cm) etwa 8000 SPOTs sowie Kontrollen Platz fanden.[ 41 , 45 , 96 ] Der Vorteil dieser Methode lag auf der Hand: eine große Zahl an Verbindungen ließ sich simultan an einem Träger synthetisieren und ohne großen apparativen Aufwand auf Bindung testen.

Abb. 21: Zellulosemembran (9.4 x 2.1 cm) mit „großen“ und „kleinen“ SPOTs im Vergleich. Die Aminogruppen des Rink-Linkers wurden durch Inkubation mit Bromphenolblau angefärbt. Die Markierungen wurden mit Bleistift gemacht.

Bevor auch Peptoid-Bibliotheken mit 8000 Verbindungen pro Membran synthetisiert werden konnten, sollte die Synthesequalität an „kleinen“ SPOTs anhand von drei Modelltrimeren untersucht werden. Die Verbindungen wurden dazu unter den entsprechenden Bedingungen synthetisiert (automatische Pipettierung, geringe SPOT-Größe und kleiner SPOT-Abstand; vergl. Abb. 21 ). Die Synthesequalität sollte mit der an „großen“ SPOTs erreichbaren verglichen werden. Da der verwendete Syntheseroboter die Pipettierung unterschiedlicher Volumina innerhalb eines Synthesecyclus, wie sie zur Erzeugung unterschiedlich großer SPOTs benötigt werden, nicht unterstützte, wurden größere SPOTs durch mehrfaches Pipettieren an die gleiche Stelle erzeugt. Zur Analyse wurden zehn „kleine“ SPOTs mit identischer Sequenz synthetisiert und zusammen analysiert, um eine ausreichende Substanzmenge zu erhalten.

In Tab. 15 sind die Produktreinheiten bei der Synthese an unterschiedlich großen SPOTs gegenübergestellt. Es läßt sich erkennen, daß die Reinheiten der Tripeptoide, die von „kleinen“ SPOTs (Durchmesser: ca. 1.2 mm) erhalten wurden, etwa 2/3 der Werte von „großen“ SPOTs erreichen. Eine etwas geringere Synthesequalität wurde jedoch erwartet, da der Randbereich, der durch kleine Unterschiede im Pipettiervolumen Fehlsequenzen trägt, bei der Analyse „kleiner“ SPOTs mit untersucht wurde, während er bei den „großen“ SPOTs ausgespart werden konnte. Bei der quantitativen Auswertung der Ergebnisse von Bindungsstudien werden auch bei „kleinen“ SPOTs nur die SPOT-Zentren berücksichtigt, wo mit großer Wahrscheinlichkeit höhere Reinheiten als am Rand vorliegen. Durch die erfolgreiche Miniaturisierung der SPOT-Größe konnte die Peptoid-Synthese auf „kleine“ SPOTs übertragen werden.


74

Tab. 15: Produktreinheiten bei einer vergleichenden Synthese der Tripeptoide 16, 90 und 91 auf „großen“ und „kleinen“ SPOTs an Rink-Linker derivatisierter Zellulosemembran.

Tripeptoid

Reinheit an „großem“ SPOT [%]1)

Reinheit an „kleinem“ SPOT [%]2)

16

98

69

90

63

42

91

90

57

1) Analyse der SPOT-Mitte (0.23 cm2) ohne Randbereich. Substanzmenge pro „großem“ SPOT: 170 nmol [nach Quantifizierung der Fmoc-Schutzgruppe des Rink-Linkers]; 2) Gemeinsame Analyse von jeweils zehn „kleinen“ SPOTs (je 0.01 cm2), ohne den SPOT-Rand zu entfernen. Substanzmenge pro „kleinem“ SPOT: 8.3 nmol [nach Fmoc wie in 1)].

4.2 Biochemische Voraussetzungen: Bindung eines Antikörpers als Modellsystem

Der monoklonale Antikörper Tab-2 erkennt die lineare Sequenz VVSHFND aus dem N-Terminus des transforming groth factor-alpha (TGF-alpha).[ 42 , 49 ] Dessen Bindungsspezifität gegenüber dem Peptid wurde durch eine Substitutionsanalyse bestimmt (vergl. Abb. 4 , Seite 4). Dabei zeigt sich, daß die Bindung im C-terminalen Bereich des Peptids (SHFND) durch Kontakte zu den Seitenketten charakterisiert ist, während an den Positionen der beiden N-termialen Valin-Bausteine Kontakte zum Rückgrat bestehen.[ 41 ] Durch kombinatorische Peptid-Bibliotheken an Zellulose und unter Verwendung der phage-display-Technik konnte das Bindungsmotiv auch de novo identifiziert werden.[ 42 , 50 ] Dieser allgemeine Ansatz ermöglicht dabei prinzipiell auch die Identifizierung von zuvor unbekannten, bindenden Peptiden mit Sequenzen, die sich von derjenigen des Antikörper- Epitops unterscheiden. Während im Falle von mAk Tab-2 hauptsächlich ähnliche Sequenzen gefunden wurden, gelang es, für den Antikörper mAk CB4-1 völlig verschiedene Sequenzen auf kombinatorischem Weg zu identifizieren.[ 94 ]

Bei de novo Strategien in der Peptidchemie an Zellulose wurde im allgemeinen mit Peptiden aus 6-14 Aminosäuren gearbeitet, die in 2-3 Positionen eine definierte Aminosäure besitzen, während die anderen Positionen randomisiert vorliegen. Ein SPOT einer solchen Bibliothek


75

kann beispielsweise eine Sequenz der Art XXB1B2XX besitzen, in der die mittleren Positionen zwei bestimmte Aminosäuren B1 und B2 tragen, während an den übrigen Positionen Mixturen aus allen 20 Aminosäuren zur Synthese eingesetzt werden, so daß letzlich eine sehr große Zahl an Sequenzen/SPOT vorliegt.

Da durch die, verglichen mit der Peptidsynthese, geringere Synthesequalität der Peptoide die Synthese längerer Sequenzen erschwert war, sollte zunächst versucht werden, ein bindendes trimeres Peptoid für mAk Tab-2 zu identifizieren. Der monoklonale Antikörper sollte dabei als Modellsystem für die Identifikation von Proteinbindung im Hinblick auf Affinität und Spezifität dienen. Dabei war die Verfügbarkeit und Stabilität des Proteins sowie die Verfügbarkeit von Bindungsdaten auf Peptidebene für die Auswahl ausschlaggebend. Es wurde aufgrund der geringen Molekülgröße eine relativ schwache Bindung erwartet, so daß keine Mischungen sondern einzelne, definierte Verbindungen auf jedem SPOT synthetisiert werden sollten. Bei Verwendung von 20 Bausteinen läßt sich an einer Zellulosemembran (19 x 28 cm) der vollständige Sequenzraum von 8000 (= 20 x 20 x 20) Tripeptoiden synthetisieren.

4.3 Identifizierung Antikörper-bindender Tripeptoide

Basierend auf 20 Bausteinen sollte eine Bibliothek aller 8000 möglichen Tripeptoide 92 synthetisiert werden. Dabei sollten sich die Bausteine nach Möglichkeit stark unterscheiden, um möglichst verschiedene Tripeptoide zu erhalten. Der Auswahl wurden die folgenden Kriterien zugrunde gelegt:

  1. Es sollten möglichst viele verschiedene funktionelle Gruppen vertreten sein, die die Strukturelemente Wasserstoff-Donor (HD) und -Akzeptor (HA), aromatischer Ring (Ar), hydrophobe Kontaktmöglichkeit (Lip) sowie bei neutralem pH-Wert in wäßrigen Lösungen positiv (+) sowie negativ (-) geladene Gruppen beinhalten.
  2. Die Auswahl der Reste sollte funktionelle Gruppen der proteinogenen Aminosäuren beinhalten.
  3. Der Satz an Bausteinen sollte auf der Grundlage einer Berechnung des Verteilungskoeffizienten zwischen Wasser und n-Octanol (logP) das Polaritätsspektrum möglichst gleichmäßig abdecken.
  4. Für die Bausteine sollte auf der Basis der in Abschnitt 3.3.3 gemachten Untersuchungen und der daraus abgeleiteten allgemeinen Prinzipien (vergl. 3.3.4 ) eine hohe Synthesequalität zu erwarten sein.


76

Abb. 22: 20 Bausteine zur Synthese einer Bibliothek aus Tripeptoiden 92 (n-Oct = n-Octyl).

Die gewählten Bausteine ( Abb. 22 ) erfüllen diese Kriterien in folgender Weise:

  1. Funktionelle Gruppen (Einzelne Bausteine können mehreren Strukturelementen zugeordnet sein):
    HD: B-05, B-06, B-07, B-08, B-10, B-14, B-15, B-17, B-18, B-20
    HA: B-02, B-05, B-07, B-10, B-11, B-14, B-15, B-19, B-20
    Ar: B-01, B-02, B-08, B-09, B-10, B-11, B-12, B-15
    Lip: B-03, B-04, B-13
    + : B-15, B-17, B-18
    - : B-19
  2. Seitenketten, die den proteinogenen Aminosäuren gleichen, haben (ohne Berücksichtigung des korrekten Abstandes zum Rückgrat):
  3. B-01: Phe; B-05: Ser; B-06: Gly; B-08: Trp; B-10: Tyr; B-13: Leu; B-15: His; B-16: Ala; B-18: Lys; B-19: Glu; B-20: Gln
  4. Die Verteilung der LogP-Werte der den Aminbausteinen entsprechenden N-Methylacetamide 93 ist in Abb. 23 wiedergegeben.
  5. Alle Bausteine entsprechen den in Abschnitt 3.3.4 zusammengefaßten Kriterien, so daß eine ausreichend hohe Synthesequalität erwartet wurde. Mit Ausnahme der Bausteine B-14 und B-18 (Boc) sowie B-19 (tBu) wurden alle Bausteine ohne Seitenkettenschutzgruppe eingesetzt. Die Bausteine B-06 und B-16 wurden nicht nach der Sub-Monomer-Methode synthetisiert, sondern mittels ihrer entsprechend Fmoc-geschützten Monomerbausteine eingebracht

    77

    (Fmoc-Gly-OH für B-06, Fmoc-Sar-OH für B-16). Es zeigte sich zu einem späteren Zeitpunkt der Arbeit, daß die Verwendung der Bausteine B-02 und B-17 aufgrund ihrer tertiären Stickstoffatome zu Nebenreaktionen führt (vergl. Betrachtungen zu den Peptoiden 88 auf Seite 69). Trimere, die diese Bausteine in den beiden C-terminalen Positionen enthielten, wiesen daher vermutlich nicht die gewünschte Struktur auf.

Abb. 23: LogP-Werte der N-Methylacetamide 93 der 20 Bausteine (R-• = B-1 - B-20), die zur Synthese einer Tripeptoid-Bibliothek verwendet wurden (Berechnet mit ChemDraw Ultra, Cambridge Soft; zur Identität der Bausteine vergl. Abb. 22 ).

Die Bibliothek wurde zu einem relativ frühen Zeitpunkt der vorliegenden Arbeit synthetisiert. Daher wurde die Synthese an einer Zellulosemembran 9 durchgeführt, die mit Epibromhydrin und anschließend Ammoniak anstelle des später verwendeten 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamins (37) derivatisiert wurde (Derivatisierungsgrad: 500 nmol/cm2). Um ein flexibles Abstandselement einzuführen, ging der Synthese des Tripeptoids die Einführung einer Tetraglycin-Einheit voraus, bei der die drei ersten Bausteine durch Inkubation der gesamten Membran eingeführt wurden. Die so erhaltenen Triglycin-derivatisierte Zellulosemembran 94 (Derivatisierungsgrad: 401 nmol/cm2) diente als Grundlage für die SPOT-Synthese mit Hilfe des Pipettierroboters, wobei die SPOT-Definition mit dem vierten Glycinbaustein (Fmoc-Gly-OPfp) zur Membran 95 durchgeführt wurde ( Schema 17 ).


78

Schema 17: Synthese der membrangebundener Tripeptoide 96.

Um die Synthese zu kontrollieren wurde am Rand der Membran das Tripeptoid 16 (aus den Aminen n-Butylamin, Benzylamin und Piperidin) synthetisiert. Der Synthese ging dazu die Kopplung des N-terminal Fmoc-geschützten Rink-Linkers anstelle des vierten Glycinbausteins voraus, um eine Abspaltung und Analyse zu ermöglichen. Die Reagenzien wurden für jeden Kopplungscyclus manuell pipettiert, um SPOTs der notwendigen Größe zu erhalten. Die Analyse nach der Abspaltung ergab das gewünschte Tripeptoid in einer Reinheit von 45% als Hauptprodukt (HPLC). Die Synthesequalität war zwar niedriger als erwartet, die Tatsache, daß das Produkt als Hauptkomponente vorhanden war, ließ die Qualität als ausreichend für eine Festphasen-Bindungsstudie erscheinen.

Abb. 24: Festphasen-Bindungsstudie einer zellulosegebundenen Tripeptoid-Bibliothek (POD = Meerrettich-Peroxidase, Substrat: Chemolumineszenz-Substrat auf Luminol-Basis).

Die Membran wurde in einer Festphasen-Bindungsstudie mit dem Antikörper mAk Tab-2 inkubiert. Gebundene Antikörper wurden mit einem zweiten, Meerrettichperoxidase-markierten Antikörper durch eine Chemolumineszenzreaktion nachgewiesen ( Abb. 24 ). Die


79

digitale Detektion (LumiImager™) ermöglichte darüberhinaus eine quantitative Bestimmung der Signalintensitäten. Als Kontrolle ging der Inkubation mit mAk Tab-2 eine Behandlung der Membran mit dem zweiten Antikörper voraus, die keine Signale zeigte.

Das Ergebnis der Bindungsstudie ist in Abb. 25 dargestellt. Anstelle von einzelnen bindenden Tripeptoiden, die eine sequenz- und seitenkettenspezifische Erkennung signalisieren würden, werden Bindungsmuster beobachtet. Diese werden durch eine positionsabhängige Bindung einzelner Reste verursacht: In der C-terminalen Position erfolgt eine Bindung des Antikörpers bevorzugt an die Reste B-01 (Benzyl), B-03 (Cyclohexylmethyl) und B-04 (n-Octyl), erkennbar an Signalen in den entprechenden Spalten der Membran. Da sich in den Zeilen keine ausgeprägten durchgehenden Muster erkennen lassen, scheint der Antikörper dort keine Seitenketten zu bevorzugen. Am auffälligsten sind jedoch die starken Signale für diejenigen Tripeptoide, die den Baustein B-03 (Cyclohexylmethyl-) in der N-terminalen Position tragen.

Abb. 25: Bindung von mAk Tab-2 an eine Bibliothek aus 8000 trimeren Peptoiden, die auf 20 Bausteinen basieren. Peptoide in den 20 markierten Blöcken besitzen den gleichen N-terminalen Baustein, Substanzen in einer Zeile gleichen sich im mittleren Baustein, in den Spalten ist jeweils der C-terminale Baustein identisch. Die markierten Verbindungen wurden später am Syntheseharz resynthetisiert.

Zur besseren Übersicht ist in Abb. 26 eine Ausschnittsvergrößerung des dritten Quadranten mit veränderter Gradationskurve gezeigt. In dieser Einstellung läßt sich erkennen, daß von den Tripeptoiden mit N-terminalem Cyclohexylmetylrest (B-03) diejenigen ein besonders


80

intensives Signal zeigen, die in der mittleren Position einen der aromatischen Reste B-08, B-09, B-10, B-11 oder B-12 tragen (Zeilen), wenn gleichzeitig C-terminal ein Thiophenmethyl- (B-09) bzw. p-Hydroxyphenethyl-Rest (B-10) vorliegt (Spalten).

Abb. 26: Ausschnittsvergrößerung von Block 3 in Abb. 25 (Baustein 03 in der N-terminalen Position), dargestellt mit veränderter Gradationskurve verglichen mit Abb. 25 .

Um zu überprüfen, ob eine spezifische Bindung an das Paratop des Antikörpers vorlag und wenn ja, wie stark diese Bindung ist, wurden vier Substanzen ausgewählt und am

Schema 18: Vereinfachte Darstellung der Messung von Bindungsaffinitäten durch Oberflächen-Plasmonenresonanz: Monochromatisches, polarisiertes Licht (hny) wird unter Totalreflektionsbedingungen durch ein Prisma auf eine Grenzfläche Glas/Wasser eingestrahlt. Ein Anteil des Lichtes (evaneszierende Welle) dringt dennoch, begünstigt durch eine Goldbeschichtung, in das wäßrige Medium in der direkten Nähe der Oberfläche ein (bis ca. 300 nm). Die resultierende Abschwächung des reflektierten Lichts ist bei einem bestimmten Winkel phi-gr maximal (Resonanz). Die Resonanzbedingung hängt vom Brechungsindex des wäßrigen Mediums und damit von der Masse der an der Oberfläche gebundenen Substanzen ab (hier: Antikörper und Tripeptoide).


81

Syntheseharz synthetisiert (vergl. Markierungen in Abb. 25 und Abb. 26 , die Bezeichung der Substanzen bezieht sich auf die Nummer der Bausteine vom N- zum C-Terminus, die Strukturen finden sich in Tab. 16 ). Dabei wurden zwei Peptoide mit sehr intensiven Signalen (03-09-08 und 03-11-09), eine Substanz mit einem schwachen Signal aus dem auffällig aktiven Block 3 [N-terminaler Cyclohexylmethyl-Rest (B-03) 03-20-11] sowie eine inaktive Substanz als Negativkontrolle (05-16-12) gewählt. Die Substanzen wurden in mäßigen bis sehr guten Ausbeuten (24% - 93%) und guten Reinheiten (76% - 89%) als Salze der Trifluoressigsäure erhalten. Sie wurden ohne weitere Reinigung für die Bindungstests eingesetzt.

Die Bindung wurde durch Messung der Resonanzbedingung eines in die goldbeschichtete Oberfläche eines Glas-Chips eingekoppelten Lichtanteils (evaneszente Welle) bestimmt (Oberflächen-Plasmonenresonanz, Schema 18 , vergl. Lit.[ 153 , 154 ]). Sie hängt u.a. vom Brechungsindex des Mediums in direkter Nähe der Oberfläche (ca. 300 nm) und damit von der Masse der dort gebundenen Moleküle ab. Aus der Änderung des Wertes bei einer Behandlung der Oberfläche mit Lösungen der Tripeptoide lassen sich so Rückschlüsse auf die Menge der vom immobilisierten Antikörper gebundenen Substanzmenge ziehen. Die Messung wurde nach einem Standardprotokoll[ 154 ] durchgeführt (Gerät: Biacore X). Unspezifische Wechselwirkungen wurden durch Subtraktion des Signals einer Vergleichs-Meßzelle, die den Antikörper mAk TE-33 der gleichen Antikörper-Klasse (Maus-IgG) trug, herausgemittelt. Zur Berechnung der Dissoziationskonstanten wurden die in einer Konzentrationsreihe bestimmten Primärdaten nach der Steady-State-Methode berechnet (Programm: Bia-Evaluation[ 154 ]). Die Daten ließen sich dabei sehr gut anpassen, was sich in einer deutlichen Unterschreitung des empfohlenen Bereichs für den engsten Kurvenfit zeigte. Der Fehler der gesamten Meßmethode ist weniger leicht zu quantifizieren. Für das Antikörper-Epitop VVSHFND-NH2 wurde in dieser Messreihe eine Dissoziationskonstante von KD = 20 nM bestimmt. In einer anderen Messreihe an einem Gold-Chip, der den Vergleichs-Antikörper mAk CB4-1 trug, wurde eine Dissoziationskonstante von KD = 31 nM bestimmt[ 155 ], so daß in diesem Fall ein Fehler von ± 30% abgeschätzt werden kann.

Wie in Tab. 16 gezeigt ist, konnten für die Tripeptoide Dissoziationskonstanten im µM-Bereich gemessen werden: für das Tripeptoid 97 (03-09-08) wurde eine Dissoziationskonstante von KD = 282 µM und für 98 (03-11-09) sogar KD = 87 µM bestimmt. Die Verbindung 100 (05-16-12), welche als Negativkontrolle synthetisiert wurde, zeigte wie erwartet bis zur höchsten gemessenen Konzentration (2 mM) keine Bindung. Allerdings konnte auch eine Bindung für das Trimer 99 (03-20-11) gemessen werden (KD = 225 µM), das als eine zweite Negativkontrolle dienen sollte, welche den N-terminalen Cyclohexylmethyl-Rest zusammen mit einer ungünstigen Kombination der übrigen Reste trägt. Eine Erklärung könnte sein, daß das C-terminale, freie Amid in 99 an der Bindung in Lösung beteiligt ist, während die Verankerung an der Membran die Wechselwirkung bei der Bindungsstudie an Zellulose verhinderte.

Tab. 16: Signalintensitäten von vier Tripeptoiden bei der Festphasen-Bindungsstudie (BLU) mit dem Antikörper mAk Tab-2 sowie Dissoziationskonstanten (KD) der freien Tripeptoide, bestimmt durch Oberflächen-Plasmonenresonanz.


82

 

Sequenz

Struktur

BLU

KD [µM]

97

03-09-08

738.708

282

98

03-11-09

624.489

87

99

03-20-11

88.364

225

100

05-16-12

13.976

> 2000

4.4 Identifizierung Antikörper-bindender Hexapeptoide

Die Ergebnisse der Untersuchung der Tripeptoide legten den Schluß nahe, daß die beobachtete Bindung zu einem hohen Anteil auf den Wechselwirkungen eines einzelnen (N-terminalen Cyclohexylmethyl-)Restes beruhte. Um ein Peptoid zu finden, das mehrere bindende Kontakte ausbildet, und das somit durch additive Effekte zu einer stärkeren Bindung befähigt ist, sollte daher eine Bibliothek von Hexapeptoiden synthetisiert werden, die dem Antikörper eine größere molekulare Kontaktfläche präsentieren können. Zusätzlich sollte ein größerer Satz an Bausteinen gewählt werden.

Beide Bedingungen erhöhen jedoch die Zahl der möglichen Verbindungen enorm ( Tab. 17 ). Kann auf einer Membran noch der gesamte Sequenzraum der auf 20 Bausteinen basierenden Tripeptoide synthetisiert werden, so lassen sich mit 8000 Hexapeptoiden nur 0.013% der möglichen Sequenzen synthetisieren. Erhöht man die Zahl der Bausteine und damit die eingebrachte Diversität auf das doppelte, so sind mit 8000 Verbindungen nur noch 0.00020% des Sequenzraumes repräsentiert. Trotz dieses geringen Ausschnitts aus dem Sequenzraum wurden mit solchen Bibliotheken auf der Basis von Peptiden erfolgreich bindende


83

Substanzen gefunden, wenn die Sequenzen statistisch ausgewählt wurden.[ 156 ] Der Hintergrund dieser Erfolge ist vermutlich die Tatsache, daß Antikörper oft relativ kleine Bereiche erkennen (4-12 Aminosäuren[ 70 ]), die darüberhinaus eine gewisse Bandbreite an ähnlichen Resten tragen dürfen (Supertope[ 94 ]). Zusätzlich ermöglicht die Bindungsstudie an Zellulose auch, relativ schwache Bindungsaffinitäten zu detektieren.[ 45 ] Auf der Basis dieser Ergebnisse sollte eine entsprechende Bibliothek aus 8000 Hexapeptoiden synthetisiert und auf Bindung zum Antikörper mAk Tab-2 untersucht werden.

Tab. 17: Größe des Sequenzraumes in Abhängigkeit von der Oligomerenlänge und der Anzahl der Bausteine. Zusätzlich ist der Anteil des Sequenzraumes tabelliert, der von 8000 Verbindungen abgedeckt wird.

Oligomerenlänge

Zahl der Bausteine

Größe des
Sequenzraumes

Anteil des Sequenzraumes, der von 8000 Verbindungen abgedeckt wird

3

20

203 = 8000

100%

6

20

206 = 6.4 · 107

0.013%

6

40

406 = 4.1 · 109

0.00020%

Es wurden 40 Bausteine gewählt, was der maximalen Zahl der am Pipettierroboter verfügbaren Reagenzienplätze entspricht. Die Kriterien zur Auswahl stimmten dabei mit denjenigen bei der Synthese der Tripeptoid-Bibliothek überein. Bis auf fünf Ausnahmen wurden daher die Bausteine der Trimeren-Bibliothek übernommen [(1,2): Für die Bausteine B-02 und B-17 wurden in Vergleichsexperimenten Nebenreaktionen beobachtet, so daß sie nicht mehr eingesetzt wurden; (3,4,5): Die Bausteine B-04, B-11 und B-12 wurden durch die Bausteine B-40, B-39 und B-45 ersetzt.]. Das Spektrum der Seitenkettenfunktionalitäten wurde anschließend durch Hinzufügen weiterer Peptoidbausteine auf 40 ergänzt ( Abb. 27 ). Prolin und Pipecolinsäure wurden als „Peptoide“ hinzugenommen, die eine Verbrückung zum Rückgrat aufweisen. Um auch mögliche Proteinkontakte zu gestatten, die in einer Position auf eine alpha-Alkylierung neben einer unsubstituierten Amidbindung unbedingt angewiesen sind, wurde das Peptoidkonzept dahingehend modifiziert, daß auch L-Alanin zu den Bausteinen hinzugenommen wurde. Die drei letztgenannten Aminosäuren wurden, wie schon Glycin und Sarcosin, unter Verwendung der entsprechenden Fmoc-geschützten Bausteine nach der Monomer-Methode eingebracht.


84

Abb. 27: 40 Bausteine zur Synthese einer Bibliothek aus Hexapeptoiden 101. Für die Bausteine, bei denen die alpha-Position des Rückgrates beteiligt ist (B-31, B-33 und B-36) wurde aus Gründen der Übersichtlichkeit ein Teil des Rückgrates mitdargestellt (Pip = Pipecolinsäure).

Mit Hilfe des Programmes LISA wurden 8000 Hexamerensequenzen basierend auf 40 Monomerbausteinen erzeugt. Jede einzelne Position in jedem Hexapaptoid wurde dabei zufällig gewählt.

Die Synthese wurde, wie der überwiegende Teil der Synthesen in dieser Arbeit, an einer Zellulosemembran 38 durchgeführt, die unter Verwendung von 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin (37) derivatisiert wurde. Im Gegensatz zur Synthese der Tripeptoid-Bibliothek wurde daher auf Tetraglycin als abstandhaltendes Element verzichtet. Nach der Definition der SPOTs mit Fmoc-beta-Ala-OPfp (Derivatisierungsgrad: 387 nmol/cm2) wurden die Hexapeptoide direkt mit Hilfe des Pipettierroboters synthetisiert. Da ein Synthesecyclus zwischen 6 und 9 Stunden dauerte (Doppel- bzw. Dreifachkopplung), wurden die


85

Reagenziengefäße zusätzlich mit Aluminiumfolie verschlossen, um eine Verflüchtigung von Lösungsmitteln und Reagenzien zu minimieren. Eine Öffnung minimaler Größe wurde direkt vor Beginn der Synthese eingeführt.

Am Rand der Membran wurde zur Kontrolle der Synthesebedingungen das Tripeptoid 16 sowie acht Hexapeptoide synthetisiert (drei Modellverbindungen mit Seitenketten, die in hoher Ausbeute koppeln sowie fünf Verbindungen, die examplarisch aus der Bibliothek gewählt wurden). Um die Abspaltung und nachfolgende Analytik zu ermöglichen, wurde statt beta-Alanin der Rink-Linker zur SPOT-Definition gekoppelt. Ausreichend große SPOTs wurden erhalten, indem man die Reagenzien an der betreffenden Stelle 45 mal pipettieren ließ. Die Analyse mittels HPLC-MS nach der Abspaltung vom Linker ergab die gewünschten Peptoide in durchschnittlich 48% Reinheit (HPLC) und in sieben Fällen als Hauptprodukte ( Tab. 18 ). Die Synthesequalität wurde als zufriedenstellend für eine Bindungsstudie bewertet.

Tab. 18: Reinheiten der Kontrollpeptoide bei der Synthese der Hexapeptoid-Bibliothek. Gekennzeichnet ist darüberhinaus, ob das gewünschte Produkt das Hauptprodukt darstellt.

Peptoid1)

Reinheit
[%]2)

Hauptprodukt

 

Peptoid1)

Reinheit
[%]2)

Hauptprodukt

46-01-403)

84

+

 

29-44-05-16-26-315)

55

+

46-01-40-20-01-404)

63

+

 

14-36-36-16-33-035)

47

+

46-01-40-20-01-344)

76

+

 

15-45-27-30-08-445)

11

-

33-29-27-13-19-104)

42

+

 

23-25-22-03-28-135)

< 107)

-

33-38-24-21-20-295)

446)

+

 

Mittelwert:

48

+(7) -(2)

1) B-46: Piperidin (50% in NMP); 2) HPLC, 220 nm; 3) entspricht 16; 4) Modellverbindungen; 5) Hexamere zufällig aus der Bibliothek ausgewählt; 6) die Reinheit ließ sich nur schwer bestimmen, da das Produkt sehr polar und das Signal bei HPLC daher breit ist; 7) Substanz vermutlich zusätzlich verunreinigt von Verbindungen gleicher RT.


86

Abb. 28: Bindung von mAk Tab-2 an eine Bibliothek aus 8000 hexameren Peptoiden, deren Sequenzen aus 40 Bausteinen nach dem Zufallsprinzip generiert wurden. Auf einem SPOT wurde stets nur eine Sequenz synthetisiert. Die markierten Verbindungen wurden später am Syntheseharz resynthetisiert (eingekreiste Verbindungen: Negativ-Kontrollen).

Das Ergebnis der Bindungsstudien der membrangebundenen Hexapeptoide auf Bindung des Antikörpers mAk Tab-2 ist in Abb. 28 dargestellt (auch hier wurde in einer Kontrollinkubation mit dem zweiten Antikörper kein Signal beobachtet). Im Gegensatz zur Trimeren-Bibliothek sind hier wesentlich weniger, dafür aber deutlicher vom Hintergrund abgegrenzte Signale zu beobachten. Aus den 15 stärksten Signalen wurden vier Sequenzen gewählt, die am Syntheseharz resynthetisiert wurden (SPOT-Nummern 2456, 3292, 6247 und 636, vergl. Tab. 19 ). Bei der Auswahl wurde darauf geachtet, daß nicht zu viele unpolare Gruppen im Molekül vorhanden waren, damit die Verbindung zum Zwecke der Bindungsstudie in ausreichend hoher Konzentration in Wasser löslich ist. Zusätzlich wurden zwei nicht-bindende Sequenzen gewählt (2078 und 7862).

Bei der Resynthese der gewählten Verbindungen wurden in drei Fällen sequenzspezifische Nebenreaktionen beobachtet. Da sie vermutlich in der gleichen Weise auch an der Zellulose aufgetreten sind, sind die erhaltenen Verbindungen dennoch zur Reproduktion der Ergebnisse des Festphasen-Screenings geeignet.


87

Tab. 19: Sequenzen und Signalintensitäten (BLU) der SPOTs mit höchster Signalintensität in Abb. 28 . Die kursiv hervorgehobenen Verbindungen wurden am Syntheseharz resynthetisiert und auf Bindung getestet. Die Nummerierungen der Verbindungen beziehen sich auf die Reste in Abb. 27 .

SPOT-Nummer

BLU

Sequenz
(Bausteine B-XX)

 

SPOT-Nummer

BLU

Sequenz
(Bausteine B-XX)

2456 (1)

78923

03-03-06-22-06-03

 

636 (10)

33200

39-26-03-31-39-03

7325 (2)

49361

03-25-43-13-01-43

 

2311 (11)

32372

32-03-06-28-16-39

3292 (3)

43956

29-44-03-06-30-43

 

2049 (12)

30231

03-26-39-10-34-10

7946 (4)

43673

33-03-36-09-16-45

 

2219 (13)

30148

42-39-19-09-08-03

313 (5)

41557

13-01-41-38-39-03

 

831 (14)

29113

28-03-08-09-33-41

4819 (6)

40215

44-29-41-03-03-43

 

5409 (15)

27669

08-45-01-20-44-03

5305 (7)

37365

43-03-06-10-10-45

 

 

 

 

1855 (8)

34586

03-06-13-42-34-45

 

7862

15379

15-37-29-22-40-39

6247 (9)

33598

32-22-39-03-13-43

 

2078

14569

33-31-26-38-18-39

Die Synthese von 104, dem Hexapeptoid von SPOT 2456, lieferte hauptsächlich ein Produkt der Masse M = 381, wobei es sich um das Diketopiperazin 103 handelte. Es bildete sich aus dem Vorläufer 102 durch Angriff der N-terminalen Aminogruppe auf die Esterbindung des vorangegangenen Bausteins. Eine analoge Bildung von Diketopiperazinen ist beispielsweise aus der Peptidchemie bekannt, wenn Prolinester (= Ester einer N-Alkylaminosäure) mit alpha-Aminosäuren acyliert werden. Da die Cyclisierung nicht mit sekundären Aminen stattfindet, war im vorliegenden Fall die ungünstige Abfolge von Glycinesterseitenkette und Glycinbaustein (mit primärer Aminofunktion) für die Nebenreaktion entscheidend. Beide


88

Produkte konnten in ausreichenden Mengen isoliert und somit beide auf Bindung untersucht werden.

Bei der versuchten Synthese von 105 wurde eine Mischung aus mindestens sechs Substanzen erhalten, die die gewünschte Verbindung nur in 17% Reinheit enthielt. Verantwortlich sind hier die beiden Bausteine, die auf aromatischen Aminen basieren (2-Aminothiazol und 4-Phenoxyanilin). Durch besonders unvollständige Acylierungen, insbesondere bei der Umsetzung des 2-Aminothiazol-Bausteines mit Fmoc-Glycinanhydrid, wurden neben der gewünschten Sequenz auch mehrere Abbruchsequenzen gebildet. Die einzelnen Verbindungen wurden nicht isoliert. Um zu überprüfen, ob sich ein Bindungssignal in Lösung reproduzieren läßt, wurde jedoch die gesamte Mischung untersucht.

Bei der Synthese von 108 schließlich deutete die um 17 Einheiten verringerte Masse des Produktes wiederum auf eine Diketopiperazinbildung zu 107 hin. Wie schon beim Hexapeptoid 104 lag hier eine besonders ungünstige Sequenz vor: in diesem Fall ermöglichte der besonders nukleophile N-hydroxylierte N-Terminus des seitenkettengeschützten Hexapeptoids 106 die Cyclisierung zur vorangegangenen tert-Butylester-Seitenkette - eine Art der Cyclisierung, die bei N-alkylierten, „gewöhnlichen“ Peptoiden nicht beobachtet wird.


89

Die Synthesen der Hexameren 109, 110 und 111 verliefen problemlos und in guten Ausbeuten (54%, 35% und 33%).

Mit Ausnahme der bei der Synthese von 105 erhaltenen Mischung wurden alle Substanzen mittels präparativer HPLC gereinigt und in Reinheiten zwischen 89 und 98% als TFA-Salze erhalten. Wie schon bei den Tripeptoiden schloß sich eine Messung der Bindungsaffinitäten an immobilisiertem Antikörper mAk Tab-2 mittels Oberflächen-Plasmonenresonanz an. Die Ergebnisse sind in Tab. 20 zusammengestellt.


90

Tab. 20: Dissoziationskonstanten [KD] von sechs Hexapeptoiden gemessen durch Bestimmung der spezifischen Bindung an den immobilisierten Antikörper mAk Tab-2 mittels Oberflächen-Plasmonenresonanz. Gekennzeichnet sind Substanzen, die Diketipiperazine (DKP) bei der Harzsynthese bildeten. Die Signalintensitäten (BLU) der Festphasen-Bindungsstudie sind zum Vergleich angegeben (vergl. Tab. 19 ).

Peptoid (SPOT-Nr.)

Sequenz

 

BLU

KD [µM]

104 (2456)

03-03-06-22-06-03

78.923

408

103 (DKP, 2456)

06-22-06-03

> 2000

105 (3292)1)

29-44-03-06-30-43

 

43.956

(1632))

107 (DKP, 6247)

32-22-39-03-13-43

 

33.598

> 500

109 (636)

39-26-03-31-39-03

 

33.200

2.7

110 (7862)

15-37-29-22-40-39

 

15.379

> 2000

111 (2078)

33-31-26-38-18-39

 

14.569

> 2000

1) Es wurde das Rohprodukt der Synthese eingesetzt (Mischung aus mindestens 6 Substanzen); 2) Um eine Bindungskonstante abschätzen zu können wurde zur Bestimmung das Molgewicht von 105 verwendet, obwohl eine Mischung vorlag.

Die Werte zeigen, daß sich die in der Festphasen-Bindungsstudie gefundenen Bindungen, abgesehen vom Hexameren 107, auch an den freien Hexapeptoiden bestätigen und quantifizieren lassen. Interessant ist, daß die volle Sequenz von 104, die bei der Harzsynthese in deutlich geringerer Menge als das Diketopiperazin 103 entstand, offenbar dennoch für die Bindung (KD = 408 µM) verantwortlich ist. Für das Diketopiperazin wurde bis zur höchsten betrachteten Konzentration kein Signal beobachtet. Die Rohmischung, die das Hexamere 105 beinhaltete, zeigte ebenfalls Bindung. Eine Dissoziationskonstante kann jedoch nicht angegeben werden, da es sich um eine Mischung handelt und die bindende Komponente nicht bekannt ist. Unter der Annahme der Molmasse des Hexameren kann der Bereich jedoch auf den µM-Bereich eingegrenzt werden. Da es vermutlich zu ähnlichen Nebenprodukten bei der Synthese an Zelluose kam, spiegelt das Experiment auch hier die Bindungsdaten an Zellulose wider. Für das Hexapeptoid 107, das N-terminal ein Diketopiperazin trägt, konnte bis zur betrachteten Konzentration (500 µM) keine Bindung beobachtet werden. Höhere Konzentrationen konnten nicht untersucht werden, da die sehr unpolare Substanz in Wasser nicht in höheren Konzentrationen löslich ist. Die stärkste Bindung zeigte das Hexapeptoid 109 mit einer Dissoziationskonstante von KD = 2.1 µM. Durch diese hohe Affinität ließ sich die Bindung hier nicht nur, wie bei allen anderen Peptoiden, über die im Gleichgewicht an den Chip gebundene Menge (Steady-State-Bedingung), sondern auch über den Verlauf der Bindungs-Kinetik auswerten: Die Assoziations- und Dissoziations-Konstanten wurden mit ka = 1.13 · 104 M-1s-1 und kd = 1.55 · 10-2 s-1 bestimmt, was einer Dissoziationskonstante von KD = 1.37 µM und damit im Rahmen der Meßgenauigkeit dem Wert aus der Auswertung der Gleichgewichts-


91

Sättigung entspricht. Die im gleichen Experiment gemessene Dissoziationskonstante des Peptids VVSHFND-NH2 (112), welches dem Tab-2-Epitop von TGF-alpha entspricht, wurde mit KD = 20 nM aus den kinetischen Konstanten ka = 1.10 · 105 M-1s-1 und kd = 2.18 · 10-3 s-1 bestimmt. Damit entspricht der gemessene Wert in den Fehlergrenzen dem in der Literatur beschriebenen Wert für die Verdrängung des Antikörpers von festphasengebundenem TGF-alpha mittels ELISA (IC50 = 9.0 nM).[ 41 ] Mit einem de novo gefundenen Hexapeptoid (109) konnte also innerhalb eines einzelnen Bindungsexperiments eine Verbindung erhalten werden, die bis auf zwei Größenordnungen an das hochaffine Wildtyp-Peptid heranreicht.

Betrachtet man die Zahl der identifizierten bindenden Peptoide (je nach Setzung der Grenzen 10-25), so ergibt sich eine Trefferquote von 0.1-0.3%. Das entspricht einem bindenden Peptoid auf 300-1000 Verbindungen. Bibliotheken mit mehreren tausend Verbindungen wurden folglich in diesem System tatsächlich benötigt, um Liganden mit einer ausreichenden Wahrscheinlichkeit zu finden.

Zur näheren Untersuchung der Strukturen des Tripeptoids 98 sowie des Hexapeptoids 109 wurden 1H- und 13C-NMR-Spektren der Verbindungen aufgenommen (vergl. Anhang, Seite 179, Abb. 33 - Abb. 35 ). Die Spektren zeigten überlagerte Signale mehrerer Amidbindungs-Isomere. Bei cyclischen und nichtcyclischen dialkylierten Amiden ist die Rotationsbarriere um die Amid-C-N-Bindung hoch genug, um die einzelnen Isomere mittels NMR beobachten zu können.[ 119 ] Für Prolin sowie einige Prolin-Derivate wurden beispielsweise Barrieren von DeltaG = 70-85 kJ/mol bestimmt.[ 111 ] Für das Tripeptoid 98 sind maximal vier sowie für das Hexapeptoid 109 sechzehn Isomere möglich (basierend auf zwei bzw. vier dialkylierten Amidbindungen in diesen Molekülen). Die genaue Zahl der wirklich vorliegenden Isomere ließ sich aus den Spektren im Rahmen der durchgeführten Untersuchungen nicht eindeutig ablesen, da charakteristische Signale verschiedener Isomere nicht unbedingt unterschiedliche chemische Verschiebungen aufweisen müssen. Für die beiden Methoxygruppen in 98 beispielsweise wurden im 1H-Spektrum vier getrennte Signale


92

beobachtet, was für mindestens zwei Isomere spricht. Im Bereich 110-158 ppm des 13C-Spektrums wurden jedoch 30 Signale beobachtet, die auf 10 Kohlenstoffatome zurückzuführen sind, was auf das Vorhandensein von mindestens drei der vier möglichen Isomere hindeutet. Schwieriger war die Bestimmung der Zahl der Isomere im Fall des Hexapeptoids 109. Im Bereich der zwei Methoxygruppen (3.68-3.77 ppm) zeigte das 1H-Spektrum 12 Signale, was auf mindestens sechs Isomere (von maximal 16) hindeutet. Das 13C-Spektrum ließ sich aufgrund der Vielzahl von Isomeren nicht vollständig auswerten, da die einzelnen Signalintensitäten zu gering waren (zur Diskussion der Peptoid-Struktur vergl. auch Abschnitt 2.4 : Stukturelle Eigenschaften von Peptoiden, Seite 18).

Zur Bindung an ein Protein wie den Antikörper Tab-2 ist ein Molekül im allgemeinen in nur einer Konformation (Aktivkonformation) und damit in nur einer Amidgeometrie befähigt. Die hohe Zahl der Isomere bedeutet allerdings nicht, daß nur ein geringer Anteil der gelösten Substanz zur Bindung zur Verfügung steht. Die Isomerisierungsgeschwindigkeit ist hoch genug (kcisrarrtrans = 0.06-6.0 s-1 bei 300 K für Prolin sowie einige Prolin-Derivate[ 111 ]), um eine Umwandlung der freien Peptoide in die für die Bindung bevorzugte Konformation im Rahmen eines Bindungsexperiments zu gestatten (Die Inkubationszeit mit dem Protein beträgt zwei Stunden). Ferner sind Induced-Fit-Mechanismen denkbar, die die Isomerisierung beschleunigen können.

Zusammendfassend konnte gezeigt werden, daß sich mit jeweils nur einer Bibliothek Tri- bzw. Hexapeptoide de novo identifizieren lassen, die den Antikörper mAk Tab-2 mit Dissoziationskonstanten im mittleren bis unteren µM-Bereich binden. Die Strukturen der gefundenen Verbindungen unterscheiden sich dabei deutlich von denjenigen des Peptid-Epitops VVSHFND-NH2 (vergl. 98, 109 und 112). Beim Vergleich der Strukturen, auch unter Einbeziehung der weniger affinen Liganden, fällt auf, daß der Antikörper bevorzugt an den Cyclohexylmethyl-Rest (nicht aber an den Benzylrest) sowie an elektronenreiche Aromaten bindet. Da die Bibliothek der Hexapeptoide nur einen kleinen Teil des Sequenzraumes abgedeckt hat, sind die gefundenen Substanzen mit hoher Wahrscheinlichkeit nicht die optimalen Hexameren, die sich auf der Basis der Bausteine identifizieren lassen. Es ist folglich zu erwarten, daß eine Optimierung der Strukturen (z.B. durch eine Reihe von Substitutionsanalysen) zu einer deutlichen Steigerung der Bindungsaffinitäten führen kann.

Von einer Überprüfung der Bindungskonstanten mit einer weiteren biochemischen Methode mußte im Rahmen dieser Arbeit aus Zeitgründen abgesehen werden. Die gemessenen Daten für das Kontrollpeptid stimmten jedoch gut mit den Literaturwerten, die aus ELISA-Bindungsstudien erhalten wurden, überein.


[Titelseite] [Widmung] [Abkürzungsverzeichnis] [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [Bibliographie] [Anhang] [Danksagung] [Lebenslauf] [Selbständigkeitserklärung]

© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.

DiML DTD Version 2.0
Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML - Version erstellt am:
Mon Dec 4 12:40:49 2000