Heine, Helge Niklas: Peptidmimetika an Zellulosemembranen - SPOT-Synthese und Screening kombinatorischer Peptoid-Bibliotheken

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Kapitel 5. Rückgratmodifizierte Peptoide

In der Peptoid-Synthese nach der Sub-Monomer-Methode macht man sich Bromessigsäure als bifunktionellen Baustein zunutze, der in der Lage ist, zwei Nukleophile (Amine) selektiv unter Aufbau des Peptoid-Rückgrats zu verbinden ( Schema 19 ). Dazu ist es notwendig, daß sich die beiden elektrophilen Zentren der Bromessigsäure in ihrer Reaktivität ausreichend unterscheiden, um die Bildung von Regioisomeren durch eine Vertauschung der Reaktionsreihenfolge zu verhindern. In Abschnitt 3.3.1 . konnte gezeigt werden, daß eine zu schwache Aktivierung der Carbonsäure (z. B. als 4-Nitrophenylester 12) tatsächlich eine Umkehr der
Regioselektivität bewirkt. Als zweite Voraussetzung, zusätzlich zum notwendigen Reaktivitätsunterschied, muß eine schnelle Reaktion auch am weniger reaktiven Zentrum gewährleistet sein.

Schema 19: Bromessigsäure als Biselektrophil zur sequenziellen Acylierung (1) und nachfolgenden Alkylierung (2) bei der Peptoid-Synthese nach der Sub-Monomer-Methode [X = Aktivierende Gruppe (z.B. -Dnp)].

Um weitere Rückgratstrukturen zugänglich zu machen, bot es sich an, andere Biselektrophile im Sinne einer Sub-Monomer-Synthese einzusetzen.[ 157 , 158 ]

Die in Abb. 29 gezeigten Bausteine erschienen potentiell geeignet und waren zudem kommerziell erhältlich. Es sollte im Rahmen eines „chemischen Screenings“ untersucht werden, ob diese Bausteine für einen Einschub in Peptoide geeignet sind. Im Vordergrund stand dabei zunächst nicht wie in Abschnitt 3 die N/O-selektive Reaktion sondern die generelle Untersuchung der Anwendbarkeit der Bausteine. Daher wurden die Reagenzien nicht als potentiell selektive Aktivester bzw. analoge Verbindung eingesetzt, sondern sie wurden in einer möglichst leicht zugänglichen, aktiven Form angewendet (als Anhydrid, Säurechlorid, Chloroformiat bzw. Isocyanat).


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Abb. 29: Bifunktionelle Bausteine, die auf ihre Eignung für eine Synthese nach dem Sub-Monomer-Konzept getestet wurden (Bromessigsäure zum Aufbau von Peptoiden ist zum Vergleich aufgeführt). Der Teil der Bausteine, der zum späteren Rückgrat beiträgt, ist farbig hervorgehoben.

In Anlehnung an die Versuche in Abschnitt 3.3 . sollte versucht werden, die Bausteine in einer Modellreaktion in der Mitte eines Dipeptoids zum Trimer 20 einzubauen ( Schema 20 ). Aus Art und Menge der Nebenprodukte sollte die Eignung der Bausteine abgeleitet werden: Ausgehend von einer Rink-Linker-derivatisierten Zellulosemembran 57, die bereits mit einem N-Butylglycin-Monomer versehen war, sollten die Bausteine 122 unter SPOT-Bedingungen angewendet (Doppelkopplung, 1 M Lösungen). Bei gelungener Acylierung zum Dimeren 123a und anschließender Verlängerung der Oligomerenkette im Sinne einer fortgesetzten Peptoid-Synthese beobachtet man die Bildung des Trimers 20. Falls die entscheidende erste Acylierung nicht stattfindet, wird aus dem Ausgangsmonomer 57 in der sich anschließenden Synthesesequenz das Dipeptoid 71 gebildet. Mißlingt hingegen nur die nachfolgende zweite Acylierung mit Bromessigsäure, erhält man das Dimer 123.


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Schema 20: „Chemisches Screening“ auf die Möglichkeit zur Anwendung neuartiger Rückgrat-Strukturelemente nach der Sub-Monomer-Methode. Es ist der Reaktionsweg einschließlich der beobachteten möglichen Nebenprodukte beim Aufbau des Test-Trimeren 20 gezeigt. a) Benzylamin (5 M in NMP); b) Br-CH2COODnp (1 M in NMP);
c) Piperidin (5 M in NMP); d) 95% TFA/H2O.

Es wurden zunächst einige Vorversuche unternommen, in denen eine geeignete Möglichkeit gesucht wurde, die aus den Acylchloriden freigesetzte Chlorwasserstoffsäure abzufangen. Als ungünstig erwies sich eine Basenzugabe zur Reagenzienlösung, da in Abwesenheit des Nukleophils eine Hydrolyse und/oder Zersetzung der Reagenzien vor der Pipettierung und damit vor der Reaktion in teilweise erheblichem Ausmaß beobachtet wurde (z.B. durch CO2-Entwicklung im Fall des Chloroformiates 118 oder starker Verfärbung der Lösung von 116). Diese Reaktionen wurde auf den Kontakt der Reagenzien-Lösungen mit atmosphärischer Feuchtigkeit zurückgeführt.

Um dieses Problem zu umgehen, erwies es sich als günstig, die Membran vor der Acylierung in einem zusätzlichen Schritt mit einem unflüchtigen, nicht nukleophilen, tertiären Amin mittlerer Basizität zu behandeln. Die Reagenzien kommen dann erst in Anwesenheit des membrangebundenen Oligomers in Kontakt mit der Hilfsbase. In einer vergleichenden Synthese des Trimers 20 mit dem Säurechlorid 116 zeigte sich, daß bei Verwendung von


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N-Benzylimidazol (124) und Tris(3,6-dioxaheptyl)amin (125) die Acylierung des N-Butylglycins 57 nahezu vollständig verlief, was zu geringen Mengen des Nebenproduktes 71 führte (3% bzw. 2%). Die Verwendung von Diazabicyclo[2,2,2]octan (126) verlief weniger erfolgreich (9% 71) und führte zudem zu mehreren Nebenprodukten. Für die folgenden Experimenten wurde eine 3 M Lösung von N-Benzylimidazol (124) dem Tris(3,6-dioxaheptyl)amin (125) vorgezogen, da ersteres auf der Zellulosemembran auskristallisiert, so daß eine bessere Benetzung der Membran mit dem nachfolgenden Acylierungsmittel (hier: 116). Eine verzögerte Wiederauflösung des Amins kann zusätzlich eine Verdrängung der Base vom SPOT im Sinne einer Papier-Chromatographie unterdrücken.

Die Ergebnisse der Versuchsreihe zum Test der Acylierungsmittel 113-121 ist in Tab. 21 zusammengefaßt.

N-Alkylalanine:

Der Übergang von Bromessigsäure (53) auf die alpha-alkylierte 2-Brompropionsäure (113) und damit der Einschub eines sterisch anspruchsvollen N-Benzylalanin-Bausteins in ein Peptoid erwies sich mit einer Produktreinheit von 39% verglichen mit dem für das entsprechende Peptoid erreichbaren Wert (98%, Eintrag 1) als sehr unvollständig (Eintrag 2). Die zusätzliche alpha-Methylgruppe verringerte die Zugänglichkeit des sekundären Benzylamins in 123a offenbar so stark, daß eine vollständige Acylierung nicht mehr möglich war. Dabei ist der Effekt deulich ausgeprägter, als bei der Einführung einer alpha-Verzweigung in die Peptoid-Seitenkette (vergl. Einträge 4 bis 6 in Tab. 11 , Seite 60). Durch einen versuchsweisen Übergang zu einer Acylierung mit Bromessigsäureanhydrid (aus der Säure und DIC) im dritten Acylierungsschritt ließ sich das Ergebnis nicht wesentlich verbessern. Die Einführung einer Modifizierung des Peptoid-Rückgrates über alpha-alkylierte Bromessigsäure erschien daher unter den Bedingungen der SPOT-Synthese nicht in ausreichender Ausbeute möglich.


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Tab. 21:Produktreinheiten bei der Synthese der Trimere 20 an Rink-Linker modifizierter Zellulose unter Verwendung verschiedener Rückgrat-Bausteine 122. Zum Vergleich ist die Synthese mit Bromessigsäure gezeigt (Eintrag 1; vergl. Abschnitt 3.3 .).

Nr.

 

 

Base
1)

Dimer 71
[%]

Dimer 123
[%]

Trimer 20
[%]

n2)

1

11

 

-

-

-

98

1

2

113


+ 0.5 Äq. DIC3)

 

-

-

59

39

1

3

114


+ 0.5 Äq. DIC4)

 

-

23

3

615)

2

4

115


+ 0.5 Äq. DIC3)

 

-

-

7

695)

1

5a

116

 

+

3

-

846) (meta)

2

5b

117

 

+

3

-

836) (para)

2

6

118

 

+

8

-

82

2

7a

119

 

+

-

7

757)(ortho)

1

7b

120

 

+

-

1

598)(para)

1

8

121

 

-

-

-

149)

1

1) Vorinkubation der SPOTs mit N-Benzylimidazol (1 x 3 M in DMF); 2) Zahl der durchgeführten Synthesen; 3) 2 M Carbonsäure-Lösung + 0.5 Äq. DIC; 4) Aktivierung in CH2Cl2, Pipettierung nach Entfernen des Lösungsmittels und Resuspendieren in NMP; 5) Nebenprodukt: Dimer 129 (12% bei 114, 19% bei 115); 6) Nebenprodukt: 130 [8% (meta) bzw. 10% (para)]; 7) Betrag beinhaltet Hydantoin 131 (32%); 8) Betrag beinhaltet Hydantoin 132 (57%); 9) Als Hydantoin 133. Das Trimer 20 wurde nur massenspektrometrisch detektiert (Reinheit nach UV: < 1%). Nebenprodukt: 4,5-Dihydro-oxazol 135 (28%).


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beta-Peptoide:

Um einen von beta-Peptiden abgeleiteten „beta-Peptoid“-Baustein einzuführen, standen zwei Möglichkeiten zur Verfügung: (1) Die Verwendung von 3-Brompropionsäure (114) mit nachfolgender Halogensubstitution analog zur Peptoidsynthese und (2) die Acylierung mit Acrylsäure (115) und anschließender Michael-Addition, wie es von B.C. Hamper et al. beschrieben wurde.[ 159 ] Erstere Methode lieferte das gewünschte Trimer 20 bei einer Aktivierung von 3-Brompropionsäure mit DIC in NMP (45 Minuten Voraktivierung) in nur 47% Reinheit. Ein hoher Anteil an Dimer 71 (39%) deutete auf eine unvollständige Acylierung hin, für die möglicherweise eine zu langsame Aktivierung der 3-Brompropionsäure aufgrund des Fehlens eines elektronenziehenden alpha-Substituenten verantwortlich war. Daher wurde die Säure in einem weiteren Versuch im unpolareren Lösungsmittel CH2Cl2 aktiviert (10 Minuten) und nach einem Wechsel des Lösungsmittels durch Evaporieren und Resuspendieren in NMP zur Reaktion gebracht (Eintrag 3). Die Reinheit des Produktes konnte tatsächlich auf 61% gesteigert werden, eine vollständige Acylierung wurde jedoch auch so nicht erreicht. Bei der Verwendung von Acrylsäure (115) erhielt man das Trimer 20 in nur wenig höherer Reinheit (69%, Eintrag 4). Zwar war die Acylierung hier vollständig, dafür bereitete die Michael-Addition Probleme. Das Auftreten eines Produktes 129 mit M = 269 g/mol (19%) läßt sich durch die Addition von Piperidin (128) im letzten Schritt der Synthese an zuvor in der Reaktion mit Benzylamin unumgesetztes Acrylamid 127 erklären.

Auch bei der Verwendung von 3-Brompropionsäure wurde das Dimer 129 beobachtet, wenn auch in etwas geringerem Ausmaß (12%). Möglicherweise ist die Halogensubstitution verglichen mit Bromessigsäure verlangsamt, wahrscheinlicher erscheint jedoch, daß Benzylamin als Base zu HBr-Eliminierung zum Acrylamid 127 führte, welches wie oben beschrieben nur eine unvollständige Aminaddition zuläßt.

Die Tatsache, daß bereits das reaktive Benzylamin zu Problemen bei der Brom-Substitution bzw. Michael-Addition führt, läßt eine weitaus geringere Anwendbarkeit von Amin-Bausteinen vermuten, als dies für Peptoide der Fall ist. Ein Einschub von beta-Peptoid-Bausteinen in Peptoide kann daher nur bei sterisch wenig anspruchsvollen, schwerflüchtigen Aminen (wie z.B. Benzylamin) empfohlen werden, wobei nur mäßige Reinheiten zu erwarten sind (< 70%). Aufgrund der größeren Acylierungsausbeute st dazu die Acrylsäure der 3-Brompropionsäure vorzuziehen.


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N-Alkylaminomethylbenzoesäuren:

Gute Ergebnisse lieferte die Einführung von meta- und para-Aminomethylbenzoesäure in das Peptoid-Rückgrat. Mit bis zu 84% Reinheit wurden beide verwendeten Bausteine gut gekoppelt und die Kette anschließend erfolgreich fortgesetzt (Einträge 5a und 5b). Offenbar glich der Übergang vom Aktivester bei der Bromessigsäureaktivierung zum Säurechlorid zur Benzoesäureaktivierung die geringere Reaktivität der Benzoesäuren aus. Parallel durchgeführte Versuche ohne Hilfsbase zeigten, daß eine Vorbehandlung mit N-Benzylimidazol notwendig ist, um entstehende Säure zu neutralisieren. Das mit einem Anteil von 8-10% gebildete Nebenprodukt 130 weist auf eine nicht ganz vollständige Chlor-Substitution durch Benzylamin am membrangebundenen Benzylchlorid hin, welche in weiteren Verlauf der Synthesesequenz durch Piperidin erreicht wurde. Durch Verwendung der entsprechenden Brommethylbenzoylhalogenide könnte dieses Problem umgangen werden.

Y. Feng et al. beobachteten die Induktion von beta-Schleifenstrukturen beim Einbau eines den Benzoesäurederivaten 116 und 117 analogen, ortho-substituierten Bausteins in cyclische Tripeptide.[ 160 ] Dies läßt die Bausteine 116 und 117 auch vor dem Hintergrund einer möglichen Ausbildung stabilisierter Rückgrat-Strukturen als interessant erscheinen.

Carbamate:

Mit dem 2-Bromethylchloroformiat (118) steht ein Reagenz zur eleganten Einführung einer Carbamat-Gruppe in ein Peptoid zur Verfügung. Mit einer Reinheit von 82% wird das gewünschte Trimer 20 in guter Ausbeute gebildet (Eintrag 6). Der Schlüssel zur Synthese war hier wie schon bei den Benzoesäurechloriden die Vorbehandlung der Membran mit N-Benzylimidazol.

Harnstoffe:

Mit den beiden verwendeten Chlormethylphenylisocyanaten 119 und 120 ließen sich mittlere bis gute Umsetzungen erzielen (Einträge 7a und 7b). Vergleiche mit einer Reaktion ohne Beteiligung von N-Benzylimidazol (11% Dimer 71) zeigten einen günstigen Einfluß der Base auf die Vollständigkeit der Umsetzung, obwohl sie hier nicht zum Abfangen von Säure benötigt wird. In beiden Fällen traten Produkte mit einer um 17 Einheiten verringerten Masse auf. Diese Beobachtung ließ sich gut mit einer säurekatalysierten Cyclisierung der erwarteten Trimere 20 zu den Hydantoinen 131 bzw. 132 im Verlauf der Abspaltung vom Rink-Linker erklären ( Schema 21 ).[ 161 ]


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Schema 21:Säurekatalysierte Bildung der Hydantoine 131/132 aus den Harnstoffen 20-7a/20-7b bei der Abspaltung vom Rink-Linker (vergleiche Einträge 7a und 7b in Tab. 21 ).

Die Beobachtung gab zur genaueren Untersuchung des Cyclisierungsmechanismus Anlaß, die im folgenden Abschnitt ausführlich beschrieben wird. Die Cyclisierung verhindert jedoch, daß die gewünschten Harnstoffe in ausreichend guter Synthesequalität erhalten werden. Eine Nutzung der Bausteine ist daher nur unter speziellen Bedingungen sinnvoll, bei denen die Cyclisierung entweder vorgesehen (Abschnitt 6 ) oder verhindert wird.

Auch der Harnstoff 20-8 wurde in der zum Hydantoin cyclisierten Form 133 nachgewiesen (Eintrag 8), so daß sich die erfolgreiche Synthese des Carbamats 20-6 (Eintrag 6) nicht auf Harnstoffe übertragen ließ. Eine hohe Produktreinheit wurde im wesentlichen durch Bildung einer polaren Verbindung M = 199 g/mol verhindert, bei der es sich vermutlich um das 4.5-Dihydrooxazol 135 handelt[ 162 ], welches durch HBr-Eliminierung aus dem primär gebildeten 2-Bromethylharnstoff 134 hervorgeht.


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Zusammenfassung

Die Untersuchungen der bifunktionellen Bausteine 113-121 machten die Einführung von Aminomethylbenzoesäure- sowie Carbamat-Bausteinen in das Peptoid-Synthese-Protokoll in effizienter und modularer Weise möglich. Die erreichten Produkt-Reinheiten sind etwas geringer als bei der Verwendung von Bromessigsäure (ca. 85% gegenüber 98%), so daß die Bausteine in erster Linie zum punktuellen Einschub in Peptoide geeignet sind. Zum Aufbau der entsprechenden Homopolymere müßten die Acylierungsbedingungen weiter optimiert werden.

Bei den Synthesen mit N-Alkylalanin- und beta-Peptoid-Bausteinen zeigte sich, daß kleine Veränderungen der Rückgratbausteine (jeweils ein Einschub einer CH2-Einheit) zu deutlich niedrigeren Produktreinheiten führen. Erstere sind mit der SPOT-Synthese nicht in ausreichender Reinheit, letztere nur in Kombination mit reaktiven Aminen zugänglich.

Die neuen Bausteine können neben den Aminen als Diversitätselemente von Peptoiden verstanden werden. Bei der Optimierung eines bioaktiven Peptoids könnten sie beispielsweise durch eine Fixierung des Rückgrates oder durch die Induktion einer Schleifenstruktur zu einer Bindungsverbesserung führen. Auch die Veränderung der Seitenkettenabstände durch eine CH2-Homologisierung des Rückgrates kann zu einer Verbesserung eines biologischen Effektes führen.

Als Nebenreaktion wurde die Cyclisierung von Harnstoff-Derivaten zu Hydantoinen beobachtet, die Anlaß zu weiteren Untersuchungen gab, die im folgenden Abschnitt beschrieben werden.


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