Heine, Helge Niklas: Peptidmimetika an Zellulosemembranen - SPOT-Synthese und Screening kombinatorischer Peptoid-Bibliotheken

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Kapitel 6. SPOT-Synthese von Heterocyclen: Hydantoine

6.1 Hydantoine - Neue Perspektiven in der SPOT-Synthese

Beim Versuch, Harnstoffe nach der Sub-Monomer-Methode aufzubauen, wurde unter den Bedingungen der Abspaltung vom Rink-Linker (95% TFA/H2O, 25°C, 20 min) die Bildung von Hydantoinen beobachtet (Vergl. Abschnitt 5 , Schema 21 ). Mit dieser interessanten Reaktion können heterocyclische Strukturen in Peptoide eingebracht werden, die für die Suche nach bioaktiven Verbindungen aus den folgenden Gründen von Interesse sind:

  1. Als Templat zur neuen Anordnung der umgebenden Reste können ggf. bindende Konformationen durch die Einführung der Hydantoin-Struktur in das Oligomeren-Rückgrat fixiert werden (Rückgrat-Fixierung).
  2. Der Heterocyclus selbst bietet durch seine Carbonyl-Sauerstoffatome die Möglichkeit zu bindenden Kontakten, die mit einer linearen Struktur nicht möglich gewesen wären (neue Rückgrat-Kontakte).

Nach der Synthese von Peptidmimetika (z.B. Peptoiden) würde mit der Einführung eines Heterocyclus ein weiterer Schritt in Richtung der Synthese pharmazeutisch relevanter Verbindungen[ 52 ] mit der SPOT-Methode unternommen (zur Übersicht über Synthesen von Heterocyclen an fester Phase vergl. Lit.[ 163 - 165 ]).

Die Synthese von Hydantoinen wurde im Jahr 1861 von A. Baeyer erstmals beschrieben (Übersichten[ 166 , 167 ]). Nicht zuletzt aufgrund der biologischen Aktivität einiger Hydantoine[ 166 - 168 ] hielt dieser Heterocyclus 1993 durch die Arbeiten von S.H. DeWitt et al. als einer der ersten nicht-oligomeren Strukturen Einzug in die kombinatorische Synthese an fester Phase.[ 169 ] Seitdem sind zahlreiche Festphasensynthesen beschrieben worden.[ 52 , 170 - 184 ] In den meisten Fällen wurde ein linearer Vorläufer während der Abspaltung zum Hydantoin cyclisiert (unter (Lewis-)Säurekatalyse[ 169 , 170 , 182 ], Basenkatalyse[ 171 - 177 ] oder neutralen Bedingungen[ 178 , 184 ]; Schema 22 , A/B). In anderen Fällen wurde intermediär ein Isocyanat erzeugt, welches an der festen Phase cyclisiert wurde ( Schema 22 , C).[ 52 , 179 - 181 , 183 ]


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Schema 22: Verschiedene Systeme und Bedingungen zur Synthese von Hydantoinen an fester Phase (BSTFA = Bis(trimethylsilyl)trifluoracetamid).

Während Hydantoin-Cyclisierungen meistens mit Alkoholen oder Phenolen als Abgangsgruppen durchgeführt wurden, fand in dieser Arbeit eine Cyclisierung unter Austritt von Ammoniak unter milden Bedingungen (95% TFA/H2O) statt ( Schema 23 ). In der Festphasenchemie wurde dieser Cyclisierungsweg bislang noch nicht genutzt.

Schema 23: Säurekatalysierte Cyclisierung von Peptoiden mit N-terminaler Harnstoff-Modifizierung 136 zu Hydantoinen 137 unter Austritt von Ammoniak.

In homogener Phase untersuchten J. Kaválek et al. den Einfluß der Substituenten auf die Kinetik einer derartigen Hydantoin-Cyclisierung ( Schema 24 ).[ 161 ] Dabei wurde deutlich, daß

Schema 24: Substitutenteneinfluß auf die Cyclisierungsgeschwindigkeit von Harnstoffen 138 zu Hydantoinen 139 nach J. Kaválek et al.[ 161 ] In der Tabelle ist angegeben, ob die Reaktion beschleunigt (+) bzw. verlangamt (-) wird, wenn ein Substituent Rn = H gegen Rn = Methyl bzw. Rn = Phenyl ausgetauscht wird (n.b. = nicht bestimmt).


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ein Alkyl-Substituent an Position R2 des Harnstoffs 138, wie er im Fall dieser Arbeit stets vorliegt, die Cyclisierungsgeschwindigkeit verglichen mit einem Wasserstoffsubstituenten erhöht. Verantwortlich für diese Beschleunigung ist der in diesem Fall vorliegende höherer Anteil an cis-konfigutierter Geometrie am Harnstoff, die für den Ringschluß notwendig ist. Ein Substituent in Position R1, der vom Isocyanat eingebracht wird, kann die Reaktion entweder beschleunigen (Alkyl-) oder verlangsamen (Aryl-Substitution). Die stärkste Hemmung wird für den Übergang eines unsubstituierten Amids zu einem Amid mit Alkyl-Substitution (R3) am Amid-Stickstoff beschrieben.

Letztere Eigenschaft eröffnet vielfältige Möglichkeiten der Hydantoinsynthese in Kombination mit der Peptoidsynthese: Sie ermöglicht neben der Synthese von Hydantoinen am C-Terminus, wie sie in Schema 23 beschrieben ist, auch eine selektive Bildung eines N-terminalen Hydantoins 143 aus einem Harnstoff 142 durch Cyclisierung mit einer geeigneten Seitenkette eines Peptoids 141 ( Schema 25 ). Die konkurrierende Cyclisierung zur N-Alkylamidbindung des Rückgrates, die einen unerwünschten Bruch des Oligomers bewirken würde, ist kinetisch benachteiligt. Die korrekte Anordnung wird erreicht, wenn der Harnstoffeinheit im Oligomer ein Peptoid-Baustein mit (substituierter) Glycinamid-Seitenkette als Hydantoin-Vorläufer vorausgehen.

Schema 25: Schema zur Synthese von Hydantoinen am N-Terminius von Peptoiden 140.

Die in der Literatur bislang beschriebenen Methoden zur N-terminalen Modifizierung von Harzgebundenen Peptiden durch Hydantoine[ 52 , 179 - 181 , 183 ] führen zu einer Bindung des Oligomers über das Imid-Stickstoffatom des Heterocyclus (vergl. Schema 22 , C). Mit der hier beschriebenen Methode wurde erstmals ein Zugang zu einer Hydantoin-Modifizierung über das Harnstoff-Stickstoffatom geschaffen.

Wenn, wie bereits in Abschnitt 5 durchgeführt, ein bifunktionelles Isocyanat (wie z.B. 144) zur Erzeugung des Harnstoffes 145 verwendet wird, ließe sich das Hydantoin sogar an beliebiger Stelle innerhalb des Oligomers 146 einsetzten und so eine Hydantoinstruktur universell mit der Peptoidchemie kombinieren ( Schema 26 ).


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Schema 26: Verwendung bifunktioneller Isocyanate zur Synthese von Oligomeren 146, in die eine Hydantoin-Einheit eingeschoben ist (hier gezeigt am Beispiel von Chlormethyphenylisocyanaten 144 und Peptoiden).

6.2 Optimierung der Cycliserungsbedingungen

Im Gegensatz zu den Hydantoin-Synthesen mittels cyclisierender Abspaltung von Harz findet die Hydantoin-Bildung hier nach der Abspaltung statt. Es sollte eine Möglichkeit gefunden werden, die in Abschnitt 5 beobachtete unvollständige Cyclisierung zur Vollständigkeit zu bringen. Dazu wurden verschiedene Cyclisierungsbedingungen an den Modellverbindungen 147 getestet ( Tab. 22 ).

Die Cyclisierung von membrangebundenen Harnstoffen 147a zu Hydantoinen 149a wurde unter allen angewendeten Abspaltbedingungen beobachtet. Sogar die Vermeidung von sowohl sauren als auch basischen Bedingungen durch die Synthese des Cyclisierungsvorläufers 147a an Photo-Linker führte zu 21% cyclisiertem Produkt neben 79% linearem Harnstoff ( Tab. 22 , Eintrag 1). Es zeigte sich allerdings, wie schon bei den Versuchen im vorangegangenen Abschnitt, daß die Cyclisierung unvollständig war. Unterschiedlich lange Behandlungen mit TFA bei 25°C zeigten nur eine geringe Abhängigkeit des Hydantoin-Anteils von der Reaktionszeit (Einträge 2-4). Auch die basische Cyclisierung mit methanolischer Natriummethanolat-Lösung bewirkte ein nur geringfügig günstigeres Ergebnis als die unkatalysierte Reaktion, obwohl gerade der Aryl-Substituent als günstig in basenkatalysierten Cyclisierungen beschrieben wurde (Vergleich der Einträge 5 und 1).[ 185 ] Erst die säurekatalysierte Abspaltung bei erhöhter Temperatur (60°C) brachte die Reaktion zu Vollständigkeit (Eintrag 6). Durch Variation der Reaktionszeit wurde deutlich, daß die Cyclisierung bei dieser Temperatur bereits nach 10 Minuten abgeschlossen war (Einträge 7 und 8).


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Tab. 22: Optimierung der Cyclisierungsbedingungen zur Synthese von Hydantoinen. Bestimmt wurde das Verhältnis der Produktreinheiten der linearen Harnstoffe 148 zu den entsprechenden Hydantoinen 149. Die Synthese wurde an Photo-Linker (PL) bzw. Rink-Linker (R) durchgeführt.

 

Nr.

R
in
149

Linker

Cyclisierungs-
bedingungen

t
[min]

Gesamt-Reinheit
148 + 149

Verhältnis
148 : 149

 

 

1

Ph

PL

-

-

91%

79 : 21

 

 

2

Ph

R

95% TFA/H2O, 25°C

20

72%

50 : 50

 

 

3

Ph

R

"

40

74%

46 : 54

 

 

4

Ph

R

"

60

82%

41 : 59

 

 

5

Ph

PL

30% NaOMe/MeOH, 25°C

60

83%

65 : 35

 

 

6

Ph

PL

95% TFA/H2O, 60°C

40

81%

0 : 100

 

 

7

Ph

PL

"

10

66%1)

0 : 100

 

 

8

Ph

PL

"

5

67%1)

14 : 86

 

 

9

But

PL

-

-

64%

100 : 0

 

 

10

But

PL

95% TFA/H2O, 60°C

40

82%

0 : 100

 

 

11

But

PL

"

20

53%1)

0 : 100

 

 

12

But

PL

"

15

52%1)

7 : 93

 

1) Ein Nebenprodukt ist eine nicht identifizierte Verunreinigung (22-29%), die nur bei den gekennzeichneten Substanzen beobachtet wurde. Es handelte sich vermutlich um ein Photolyse-Nebenprodukt, welches unabhängig von den gewünschten Reaktionsprodukten auftrat und daher das Verhältnis 148 : 149 nicht beeinflußt.

Auch der n-Butyl-Harnstoff 148b, der ohne Säurebehandlung nicht cyclisierte (Eintrag 9), bildete unter den optimierten Bedingungen das entsprechende Hydantoin 149b (Eintrag 10). Es war hier allerdings eine etwas längere Reaktionszeit von etwa 20 Minuten erforderlich, um die Reaktion zur Vollständigkeit zu bringen (Einträge 11 und 12).


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Schema 27: Synthese des Hydantoins 151 zur NMR-spektroskopischen Untersuchung. a) Br-CH2-COODnp (1 M in NMP); b) Glycinamid (5 M in H2O); c) Ph-NCO (1 M in NMP; Zusatz von 1.1 Äq. NMI); d) TFA (95% in H2O, 60°C, 20 min).

Zur Bestätigung der Struktur[ 186 ] sollte ein Hydantoin an Zellulose in einer für die NMR-Spektroskopie ausreichenden Menge synthetisiert werden. Damit sollte erstmals das NMR-Spektrum einer Substanz gemessen werden, die durch SPOT-Synthese an Zellulose hergestellt wurde. Der Harnstoff 150 wurde zu diesem Zweck an einem 25 cm2 großen Zellulosestück synthetisiert, welches mit dem Rink-Linker derivatisiert war (Derivatisierungsgrad: 0.58 µmol/cm2, vergl. Schema 27 ). Das nach Abspaltung unter cyclisierenden Bedingungen (95% TFA/H2O, 60°C, 20 min) und Entfernen der Lösungsmittel im Vakuum isolierte Rohprodukt (7.1 mg) enthielt neben dem Hydantoin 151 noch Zellulosefasern. Zur Analyse wurde die Substanz in [D6]-DMSO gelöst und ungelöste Fasern durch Zentrifugation abgetrennt. Der Überstand enthielt das Hydantoin in ausgezeichneter Reinheit [> 99% (HPLC); Abb. 30 ]. Im ESI-Massenspektrum wurden neben dem Molekülion zwei charakteristische Fragmente beobachtet, die die Hydantoin-Struktur bestätigten ( Abb. 30 , rechts). Die Protonen-Resonanzen bei delta = 3.95 und 4.14 im 1H-NMR-Spektrum ließen sich gut mit den beiden Methylengruppen der Zielverbindung vereinbaren (vergl. Abb. 31 ), wobei das Signal der Ring-Methylengruppe durch Vergleich mit dem Wert des literaturbeschriebenen[ 187 ], ähnlichen Hydantoins 152 zugeordnet wurde.

Es traten zwei Resonanzen bei delta = 7.27 und 7.65 auf, die den Amid-Protonen zuzuordnen sind. Zunächst ungewöhnlich war ein Triplett aus drei Signalen gleicher Intensität bei delta = 7.13 mit einer Kopplungskonstante von J = 51 Hz. Es handelte sich dabei um die Resonanzen des bei der Cyclisierung gebildeten Ammoniumtrifluoracetats, wie durch die Messung einer authentischen Probe bestätigt werden konnte. Die ungewöhnliche Kopplung wurde durch das 14N-Atom (I = 3/2) des Ammoniumions hervorgerufen, dessen 1J-Kopplung nur durch die hohe Symmetrie der tetraedrischen Anordnung der vier Wasserstoffatome beobachtet werden konnte.[ 188 ] Auch das 13C-NMR-Spektrum ließ sich mit der Struktur vereinbaren. Das Vorhandensein eines uncyclisierten Harnstoffes konnte (1) durch eine quantitative Auswertung der Signalintensitäten im 1H-NMR-Spektrum, (2) durch den Nachweis des bei der Cyclisierung gebildeten Ammoniumions sowie (3) durch die


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massenspektroskopischen Daten ausgeschlossen werden.

Abb. 30: HPLC-UV-Spur (220 nm, links) und ESI-Massenspektrum (rechts) des Rohproduktes einer Synthese des Hydantoins 151 an Rink-Linker-modifizierter Zellulose. Abspaltung und Cyclisierung erfolgten mit TFA (95% in H2O) bei 60°C (20 min).

Abb. 31: 1H-NMR-Spektrum (500 MHz, [D6]-DMSO) des Hydantoins 151 (Rohprodukt) nach Synthese an 25 cm2 Rink-Linker-derivatisierter Zellulose. (Die Amid-Protonen-Zuordnung (Ha/Hb) ist nicht eindeutig.)


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6.3 Synthese C-substituierter Hydantoine

Im vorangegangenen Abschnitt konnte gezeigt werden, daß sich Hydantoine an Zellulosemembranen in guten Ausbeuten synthetisieren lassen. Es war nun von Interesse, ob auch an der Methylengruppe substituierte Hydantoine durch SPOT-Synthese zugänglich sind. Die Einführung von Substituenten beschleunigt dabei die Cyclisierung aufgrund des Thorpe-Ingold Effekts, wie A.H. Koedjikov et al. zeigen konnten.[ 187 ] Als Modellsystem wurden die Hydantoine 154 gewählt, bei denen das zur Einführung einer cyclisierbaren Seitenkette eingesetzte Glycinamid durch andere alpha-Aminosäurederivate ersetzt wurde. In diesem Zusammenhang sollte zusätzlich untersucht werden, ob neben Amiden auch Carbonsäuren, die in Form ihrer tert-Butylester eingebracht werden, zur Cyclisierung geeignet sind. Das an Rink-Linker-modifizierter Zellulose synthetisierte, bromacetylierte N-Butylglycin 58 wurde mit verschiedenen Aminosäurebausteinen 153 zum entsprechenden Dipeptoid umgesetzt. Durch Behandlung mit Phenylisocyanat und anschließender Abspaltung vom Träger unter cyclisierenden Bedingungen wurden die Hydantoine 154 erhalten ( Tab. 23 ).

Tab. 23: Untersuchung zur Synthese von substituierten Hydantoinen 154.

 

Nr.

Reinheit
154 [%]

 

 

1

R = H;

X = OtBu

(= H-Gly-OtBu)

79

 

 

2

R = Methyl;

X = NH2

(= H-Ala-NH2)

84

 

 

3

R = Isobutyl;

X = NH2

(= H-Leu-NH2)

76

 

 

4

R = sec-Butyl;

X = OtBu

(= H-Ile-OtBu)

54

 

Die Untersuchungen zeigten, daß zur Cyclisierung Alkyl-Seitenketten mit unterschiedlichem sterischem Anspruch toleriert wurden (R = Methyl, Isobutyl, sec-Butyl; Einträge 2-4; Tab. 23 ), wenn auch der alpha-verzweigte sec-Butylrest des Isoleucins nur zu einer mäßigen Produktreinheit führte (54%; Eintrag 4). Ferner waren die Cyclisierungsbedingungen auch geeignet, um eine Hydantoinbildung von tert-Butylestern zu bewirken - vermutlich nach Abspaltung der säurelabilen tert-Butylgruppe und Cyclisierung der resultierenden Carbonsäure unter Wasserabspaltung (Einträge 1 und 4).[ 189 ] Die Synthese der Hydantoine erfolgte mit Carbonsäure-tert-butylestern und den entsprechenden Amiden mit vergleichbarer Reinheit [Eintrag 1 (79%) und Eintrag 6 in Tab. 22 (81%)]. In keinem Fall konnte ein offenkettiger Harnstoff nachgewiesen werden.


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Da die Hydantoine 154 (R ne H) ein Chiralitätszentrum aufweisen, galt es zu klären, ob unter den Bedingungen der Cyclisierung Racemisierung auftritt. Für die Schwefel-analogen Thiohydantoine ist bekannt, daß sie im basischen leicht, in Trifluoressigsäure bei 25°C jedoch nicht racemisieren.[ 190 ] Um die hier angewandten, drastischeren Bedingungen zu untersuchen, wurde das Hydantoin H2-155 synthetisiert, isoliert und anschließend den Cyclisierungsbedingungen mit deuterierten Abspaltreagenzien ausgesetzt. Falls Racemisierung über ein möglicherweise gebildetes Enol 156 auftritt, sollte das Produkt durch Deuterierung am Hydantoinring sowie den unvermeidlichen H/D-Austausch der Amid-Gruppe eine um drei Einheiten erhöhte Masse aufweisen (D3-155). Nach Analyse einer Lösung in D2O/CD3CN (7/3) mittels ESI-MS wurde jedoch nur das deuterierte Amid D2-155 beobachtet, wodurch Racemisierung am Hydantoin unter den angewandten Bedingungen im Rahmen der Meßgenauigkeit ausgeschlossen werden kann.

In Erweiterung der Versuche zur Hydantoinbildung sollte versucht werden, das Dihydropyrimidin-2,4-dion 158 durch Verwendung von beta-Alaninamid anstelle von Glycinamid zu synthetisieren. Dazu wurde der Vorläufer 157 mittels SPOT-Synthese hergestellt. Überraschenderweise wurde das gewünschte Produkt 158 nach Anwendung der üblichen Cyclisierungsbedingungen nur in Spuren nachgewiesen (4% Reinheit). Stattdessen wurde als Hauptprodukt eine Verbindung mit der Masse M = 247 g/mol in 72% Reinheit detektiert, bei der es sich um das Hydantoin 159 handelt. Die 1.5-Cyclisierung des N,N-Dialkylamids, die bei den obengenannten Versuchen nicht beobachtet wurde, erfolgt offenbar schneller, als der 1,6-Ringschluß.


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Dihydropyrimidin-2,4-dione sind also auf einem der Hydantoinsynthese analogen Weg nicht zugänglich. Es zeigte sich jedoch, daß unter den Cyclisierungsbedingungen auch gewöhnliche Isocyanate in der Lage, ein Peptoid-Rückgrat zu spalten. A. Boeijen et al. beschrieben 1998 den Abbau von Peptoiden in einer dem Edman-Abbau von Peptiden analogen Reaktion zu Thiohydantoinen.[ 191 ] Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit lassen für die Peptoide (im Gegensatz zu Peptiden) auch die Sequenzierung mit gewöhnlichen Isocyanaten für möglich erscheinen.


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