Heine, Helge Niklas: Peptidmimetika an Zellulosemembranen - SPOT-Synthese und Screening kombinatorischer Peptoid-Bibliotheken

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Kapitel 7. Zusammenfassung und Ausblick

Die SPOT-Synthese an Zellulosemembranen ist eine hocheffiziente Methode zur parallelen Synthese von Peptiden. Die wichtigste Anwendung der so synthetisierten Verbindungen ist das direkte Festphasen-Screening. Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, das Anwendungsgebiet der SPOT-Methode von Peptiden auf verschiedene Peptidmimetika auszudehnen und auf diese Weise bioaktive Substanzen zu identifizieren. Die Ergebnisse der schrittweisen Vorgehensweise sind im folgenden zusammengefaßt:

(1) Peptoid-Synthese an Zellulosemembranen

Die Ähnlichkeit der Oligo-N-alkylglycine 2 (Peptoide) zu Peptiden sowie die Vereinbarkeit ihrer Synthese mit den Bedingungen der SPOT-Technik ließen sie als besonders geeignete Kandidaten für eine Erweiterung der SPOT-Synthese von Peptiden auf Peptidmimetika erscheinen. Ihre Synthese konnte systematisch von Syntheseharzen auf Zellulose übertragen werden. Die Peptoide wurden dabei nach der Sub-Monomer-Methode synthetisiert, bei der die N-Alkylglycin-Monomere zweistufig durch Bromacetylierung und nachfolgende Bromsubstitution durch ein primäres Amin aufgebaut wurden ( Schema 28 ).

Schema 28: Peptoidsynthese nach der Sub-Monomer-Methode nach R.N. Zuckermann et al.[ 12 ]

Als Grundlage wurde zunächst die neue, esterfrei aminoderivatisierte Zellulosemembran 38 mit Derivatisierungsgraden zwischen 0.6 und 1.4 µmol/cm2 durch Alkylierung von Zellulose (7) mit dem Epoxid 35 und anschließender Einführung einer Spacer-Einheit zugänglich gemacht ( Schema 29 ).

Schema 29: Synthese der esterfrei aminoderivatisierten Zellulosemembran 38.

Es schloß sich die Optimierung der Peptoid-Synthesebedingungen an. Die Kernaufgabe war dabei die Entwicklung einer N/O-selektiven Bromacetylierungsmethode. Die SPOT-Synthese an Zellulose verlangt durch die Anwesenheit freier Hydroxyfunktionalitäten der Membran sowie durch den Kontakt der Reagenzien mit Luftfeuchtigkeit ein Reagenz, welches eine effiziente und selektive N-Acylierung in Anwesenheit von O-Nukleophilen zuläßt. Durch Untersuchung von sechs Aktivestern der Bromessigsäure konnte gezeigt werden, daß der kristalline Bromessigsäure-2,4-dinitrophenylester (11) im Hinblick auf


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Ausbeute und N/O-Selektivität optimale Eigenschaften besitzt. Das Hydroxy-Tripeptoid 17 wurde so in einer sechsstufigen Synthese mit einer Gesamt-Ausbeute von 81% und einer HPLC-Reinheit von 90% erhalten. Eine Veresterung der Seitenketten-Hydroxyfunktion konnte mit einer N/O-Selektivität von 93:7 weitgehend unterdrückt werden. Unter den Bedingungen der SPOT-Synthese ist der 2,4-Dinitrophenylester 11 sogar dem üblicherweise zur Peptoidsynthese verwendeten, in situ erzeugten Bromessigsäureanhydrid überlegen.

Im Rahmen der Optimierung der Bromsubstitutionsbedingungen konnte gezeigt werden, daß neben NMP und DMSO interessanterweise auch das bei der Synthese an fester Phase wenig gebräuchliche Wasser als Lösungsmittel geeignet ist. Wie bei der Synthese am Harz ist es dabei unvermeidlich, die Amine in hohem Überschuß sowie in hohen Konzentrationen anzuwenden. In vier Meßreihen wurden 46 Amine (R-NH2) auf ihre Anwendbarkeit bei der Synthese der Tripeptoide 19 untersucht. Aus den Ergebnissen konnten Gesetzmäßigkeiten abgeleitet werden, die eine Abschätzung der Verwendbarkeit von Aminen für die Peptoidsynthese im Hinblick auf Flüchtigkeit, sterischen Anspruch, Nukleophilie des Stickstoffatoms sowie vorhandene funktionelle Seitengruppen ermöglichen.

(2) Synthese und Screening von Peptoid-Bibliotheken

Unter den optimierten Synthesebedingungen wurden zwei Bibliotheken mit jeweils 8000 Tri- bzw. Hexapeptoiden synthetisiert. Die Trimeren-Bibliothek beinhaltete dabei den gesamten Sequenzraum basierend auf 20 Bausteinen (20 x 20 x 20), während die Verbindungen der Hexameren-Bibliothek aus einem wesentlich größeren, auf 40 Bausteinen basierenden Sequenzraum statistisch ausgewählt wurden. Um zu überprüfen, ob sich die Bibliotheken zur Auffindung von Protein-Liganden eignen, wurden sie auf Bindung zum monoklonalen Antikörper Tab-2 untersucht. Es konnten in beiden Fällen bindende Oligomere identifiziert werden. Die höchsten Affinitäten wurden für das Trimer 98 (KD = 87 µM) sowie das Hexamer 109 (KD = 2.7 µM) bestimmt ( Abb. 32 ), wobei die Messung der Dissoziationskonstanten nach Resynthese der Verbindungen am Harz und anschließender Quantifizierung der Affinität mittels Oberflächen-Plasmonenresonanz erfolgte. Mit der hier angewendeten de novo-Methode konnten somit Peptoide identifiziert werden, die sich vom Peptid-Epitop des Antikörpers [VVSHFND-NH2] deutlich unterscheiden.


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Abb. 32: Strukturen und Dissoziationskonstanten der aktivsten Verbindungen aus dem Screening einer Tripeptoid- sowie einer Hexapeptoid Bibliothek auf Bindung zum Antikörper Tab-2.

(3) Rückgratmodifizierte Peptoide

Mit dem Ziel, Rückgratmodifikationen in Peptoide einzufügen, wurden neun Biselektrophile im Rahmen eines „chemischen Screenings“ zur Synthese des Trimers 20 verwendet. Es unterscheidet sich vom entsprechenden Tripeptoid durch Verwendung eines neuen Rückgrat-Bausteins anstelle von Bromessigsäure in der mittleren Position. Die Untersuchung ergab, daß vier der Bausteine zur Synthese geeignet sind. Es wurde damit die Einführung von beta-Peptoid-, m- und p-Aminomethylbenzoesäure- sowie Carbamat-Einheiten in Peptoide in Reinheiten zwischen 69 und 84% (HPLC) möglich ( Schema 30 ). Ein Schlüsselschritt war die Vorbehandlung der SPOTs mit der unflüchtigen Base N-Benzylimidazol, um die bei der Acylierung freiwerdende Säure abzufangen. Die verglichen mit einer Vorabmischung verringerte Kontaktzeit der aktivierten Säuren mit der tertiären Base verhinderte Nebenreaktionen wie z.B. eine vorzeitige Hydrolyse.

Schema 30: Mögliche Rückgratmodifikationen bei der Synthese des Trimers 20.


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Beim Versuch, in analoger Weise auch Harnstoffe wie 20-7a oder 20-7b zugänglich zu machen, wurden zwar gute Acylierungsausbeuten erzielt, es wurde jedoch unter den Bedingungen der Abspaltung vom Rink-Linker (95% TFA/H2O) in erheblichem Ausmaß eine Cyclisierung zu den Hydantoinen 131 bzw. 132 beobachtet.

Diese interessante Reaktion wurde näher untersucht, um die SPOT-Methode auf die Synthese von Hydantoinen als heterocyclische Struktur zu erweitern.

(4) Synthese von Hydantoinen an Zellulosemembranen

Die Bildung von Hydantoinen in einer Cyclisierungsreaktion, bei der Ammoniak aus einem Amid freigesetzt wird, wurde an fester Phase noch nicht genutzt, während dieser Reaktionstyp in Lösung bereits intensiv untersucht wurde.[ 161 , 185 ] Es war bekannt, daß die Cyclisierung deutlich schneller mit unsubstituierten Amiden (-CONH2) als mit substituierten (-CONR2) verläuft. Um das Oligomerenkonzept mit der Hydantoinchemie zu verbinden wurden daher Harnstoffe 147 als Cyclisierungsvorläufer gewählt, die die Amidgruppe (-CONH2) in Form einer Peptoid-Seitenkette tragen ( Schema 31 ). Die Optimierung der Cyclisierungsbedingungen ergab eine vollständige Reaktion zum Hydantoin 149 bei einer Behandlung des Vorläufers mit TFA (95% in H2O) bei 60°C nach 10 bis 20 Minuten je nach Substituent R´ am Harnstoff.

Schema 31: Hydantoinsynthese durch Cyclisierung N-terminal carbamoylierter Dipeptoide 147 (R´ = Ph, n-Butyl).


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Zu Bestätigung der Hydantoin-Struktur wurde die Verbindung 151 an einer Zellulosemembran von ausreichender Größe synthetisiert (25 cm2), um genügend Substanz für eine NMR-spektroskopische Untersuchung zu erhalten. Mit der erfolgreichen Analyse der Verbindung konnte erstmals das NMR-Spektrum einer Substanz aufgenommen werden, die mittels SPOT-Synthese hergestellt wurde (vergl. Abb. 31 , Seite 108).

Die Untersuchungen von Hydantoinen wurden durch die Synthese C-substituierter Hydantoine 154 abgerundet. Es zeigte sich, daß Substitutionen mit einer Reihe von Resten (R) möglich sind, die durch Verwendung von alpha-Aminosäureamiden bzw. -tert-butylestern enantiomerenrein eingebracht werden können. Daß die Verbindungen unter den Cyclisierungsbedingungen nicht racemisieren, konnte abschließend durch Anwendung von deuterierten Cyclisierungsreagenzien auf das Hydantoin D2-155 gezeigt werden: das bei Racemisierung auftretende ringdeuterierte Hydantoin D3-155 wurde nicht beobachtet.

Ausblick

Durch das Festphasen-Screening zellulosegebundener Peptoide auf Bindung zum Antikörper mAk Tab-2 konnte gezeigt werden, daß sich die SPOT-Synthese eignet, neben Peptiden[ 50 ] auch biologisch aktive Nicht-Peptide de novo zu identifizieren. Basierend auf diesen Ergebnissen können die gefundenen (Leit-)Strukturen einer Optimierung durch weitere, nunmehr wissensbasierte, Peptoid-Bibliotheken unterworfen werden, was zu wesentlich höheren Affinitäten führen sollte. Interessant wäre auch eine vergleichende Analyse der Aktivkonformationen der als bindend identifizierten Oligomere mit dem Peptidepitop des Antikörpers. Zwar ist der direkte strukturelle Vergleich aufgrund der konformationellen Flexibilität von Peptiden und Peptoiden erschwert, mit Verfahren wie der Kristallstrukturanalyse von Kristallen des Antikörpers mit gebundenem Liganden oder Molecular Modelling-Methoden könnten die Aktivkonformationen jedoch zugänglich gemacht werden. In einer Erweiterung der durchgeführen Bindungsstudien können die vorhandenen Bibliotheken ferner zum Screening mit weiteren Proteinen eingesetzt werden, um andere Leitstrukturen aus der gleichen Bibliothek zu identifizieren.


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Durch die Untersuchungen, die auf der erfolgreichen SPOT-Synthese von Peptoiden aufbauen, konnten zusätzlich zu Seitenkettenvariationen auch Rückgratmodifikationen bis hin zu Peptoid-Hydantoin-Hybridverbindungen zugänglich gemacht werden. Mit entsprechenden Bibliotheken sind interessante Ergebnisse in Bindungsstudien zu erwarten. Die modulare Chemie ermöglicht darüberhinaus eine Vermischung der verschiedenen SPOT-Synthesemethoden, einschließlich der Peptidchemie. Im Sinne eines Transformationsprozesses ist damit eine sukzessive Veränderung eines bioaktiven Peptids über ein Peptoid hin zu einer heterocyclischen Struktur denkbar, was von großem Interesse für pharmazeutische Fragestellungen wäre.[ 52 , 192 ]
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