Heine, Helge Niklas: Peptidmimetika an Zellulosemembranen - SPOT-Synthese und Screening kombinatorischer Peptoid-Bibliotheken

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Kapitel 8. Allgemeine Experimentelle Bedingungen

Reagenzien

Die verwendeten Reagenzien wurden von den Firmen Advanced ChemTech (Bamberg, Deutschland), Aldrich (Steinheim, Deutschland), Bachem (Heidelberg, Deutschland), J.T. Baker (Phillipsburg, USA), Fluka (Deisenhofen, Deutschland), Lancaster (Mühlheim/Main, Deutschland), Merck Eurolab (Darmstadt, Deutschland), Neosystem (Straßburg, Frankreich), Novabiochem (Bad Soden, Deutschland) oder Sigma (Taufkirchen, Deutschland) bezogen und ohne weitere Aufreinigung verwendet. Das TentaGel-S-RAM-Harz wurde bei der Firma RAPP Polymere (Tübingen, Deutschland) und das Rink-Amid MBHA-Harz bei der Firma Novabiochem (Bad Soden, Deutschland) bezogen.

Zur SPOT-Synthese wurden Whatman 50 Membranen (Whatman Maidstone, UK) verwendet, die auf die benötigte Größe zurechtgeschnitten wurden.

Folgende Substanzen wurden nach literaturbeschriebenen Verfahren hergestellt:

4-Hydroxyphenylmethylamin: Synthese aus 4-Hydroxybenzonitril nach A.G. Johnston et al.[ 193 ]

Mono-Boc-geschützte alpha,omega-Diamine: Synthese aus den entsprechenden Diaminen nach A.P. Krapcho et al.[ 147 ] oder von Fluka.

Lösungsmittel

Alle verwendeten Lösungsmittel wurden in der angegebenen Qualität ohne weitere Reinigung eingesetzt:

Acetonitril (Gradient grade, J.T. Baker); Dichlormethan (zur Synthese, Merck Eurolab); Diethylether (zur Synthese, Merck Eurolab); N,N-Dimethylformamid (LAB, Merck Eurolab); Dioxan (zur Synthese, Aldrich); Methanol (zur Synthese, Merck Eurolab).

Wasser wurde unter Verwendung einer Vollentsalzungsanlage (Milli-Q Plus, Millipore) entmineralisiert.

Die Lösungsmittel für Reagenzien, die zur SPOT-Synthese verwendet wurden, wurden über Molsieb gelagert: N-Methylpyrrolidon und Dimethylsulfoxid (beide: Fluka).

Chromatographie und Physikalische Daten

Dünnschichtchromatographische Kontrolle (DC-Kontrolle) und Rf-Wert-Bestimmung erfolgten auf mit Kieselgel beschichteten Aluminiumfolien (Kieselgel 60 F254, Schichtdicke 0.2 mm, Merck Eurolab). Die Detektion erfolgte durch Beobachtung der Fluoreszenzlöschung bei 254 nm sowie der Färbungen nach Eintauchen in Ninhydrinlösung (0.3% in


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n-Butanol mit 3% Essigsäure) oder Molybdatophosphorsäurelösung (5% in Ethanol) und Heißluftbehandlung.

Säulenchromatographie (SC) wurde an Kieselgel (Kieselgel 60, 0.063 - 0.200 mm Merck Eurolab) durchgeführt.

(RP-)HPLC (präparativ) erfolgte mit einem System der Firma Merck/Hitachi (Quaternäre Pumpe L-6250, Variabler UV-Detektor L-7400, Interface D-7000, Software: HPLC Systemmanager D-7000 für NT 4.0) unter Verwendung einer Säule der Firma Merck Eurolab (LiChrospher 100, RP18, 10 x 250 mm) bei einem Lösungsmittelfluß von 6.0 ml/min; Die Laufmittel-Gradienten wurden aus einem analytischen Probe-Chromatogramm abgeleitet. Das verwendete Lösungsmittelsystem setzte sich aus den Komponenten A (H2O/0.1 Vol-% TFA) und B (CH3CN/0.1 Vol-% TFA) zusammen.

(RP-)HPLC-MS-Analysen wurden durch Chromatographie unter Verwendung eines Hewlett Packard Serie 1100-Systems (Entgaser G1322A, Quaternäre Pumpe G1311A, Automatischer Probengeber G1313A, Thermostatiertes Säulenfach G 1316A, Variabler UV-Detektor G1314A) und gekoppelter ESI-MS (Finnigan LCQ Ion-Trap-Massenspektrometer) durchgeführt. Dazu wurde einer Steuersoftware der Firma Finnigan verwendet (Navigator Ver 1.1 sp1). Als Stoßgas in der Ionenfalle diente Helium. Die Trennung erfolgte an RP-18-Säulenmaterial (Vydac 218 TP5215, 2.1 x 150 mm, 5 µm, C18, 300 A mit Vorsäule) bei 30°C und einem Fluß von 0.3 ml/min unter Anwendung eines linearen Gradienten für alle Chromatogramme (5-95% B innerhalb von 25 min, wobei A: 0.05% TFA in Wasser und B: 0.05% TFA in CH3CN). Die UV-Detektion erfolgte bei lambda = 220 nm. Retentionszeiten (RT) sind im Dezimalsystem angegeben (z.B. 1.9 min = 1 min 54 sec) und beziehen sich auf die Detektion im Massenspektrometer. Die Totzeit zwischen Injektion und UV-Detektion (HPLC) betrug 1.65 min, zwischen UV-Detektion und Massen-Detektion 0.21 min. Innerhalb eines Laufes erfolgte die Massenanalyse mittels einer Abfolge verschiedener Spektren-Typen: (a) Standard-Spektren in den Massen-Bereichen 50-600 und 150-2000, (b) MS2-Spektren der beiden intensivsten Ionen im Bereich 50-600 mit einer Kollisons-Energie von 24% und (c) Collision-Induced Dissociation- (CID-)Spektren im Bereich 50-600 bei 35% Kollisions-Energie. Für Produkte mit einer Masse 600 < M < 1000 wurde im Bereich 50-1000 anstelle von 150-600 gearbeitet. Die Zuordnung der Reaktionsprodukte zu den Signalen des UV-Detektors der HPLC wurde durch Anwendung von Massenfiltern für die gesuchte(n) Masse(n) durchgeführt. Die theoretischen Massen sind mit den exakten Massen der Hauptisotope berechnet. Die angegebenen Werte beschreiben die beobachtete Masse m/z, wobei im Massen-Bereich m/z < 1000 gewöhlich das M+H+ bzw. (selten) M+Na+-Ion die intensivsten Signale ergeben (keine Hochladungen wie z.B. M+2 H+). Die Beschreibung der Massenspektren wurde auf Signale mit einer Intensität > 15% sowie auf charakteristische Signale > 5% beschränkt (die Signalintensität in % ist in Klammern angegeben). Die Werte wurden auf 10%-Schritte gerundet. Die Genauigkeit des Massenspektrometers beträgt ca. m/z ± 0.2.

Schmelzpunkte wurden mit dem Gerät 9200 der Firma Elektrothermal gemessen.


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FT-IR-Spektren wurden mit einem Gerät der Firma Bruker (IFS 66) aufgenommen. Die Peakmaxima sind in Wellenzahlen ( ) in cm-1 angegeben.

UV-Absorbtionen wurden mit dem Gerät Ultrospec 3000 der Firma Pharmacia Biotech gemessen.

Kernspinresonanz- (NMR-)Spektren wurden an den Geräten Varian Unity-plus 300 und Unity-plus 500 aufgenommen. Als interner Standard diente in 1H-NMR-Spektren Tetramethylsilan (deltaH = 0.00 ppm) oder Signale der Restprotonen aus CDCl3 (deltaH = 7.24 ppm) oder [D6]-DMSO (deltaH = 2.50 ppm). Die 13C-NMR-Spektren wurden breitbandentkoppelt und, wenn nicht anders angegeben, mit APT aufgenommen und mittels internem Standard referenziert (CDCl3: deltaC = 77.0 ppm, [D6]-DMSO: deltaC = 39.4 ppm). Zugeordnete Signale sind im Einklang mit dem gemessenen Signal-Vorzeichen (prim/tert-C oder sek/quart-C). In 19F-NMR-Spektren diente CFCl3 (deltaF = 0 ppm) als interner Standard. Alle Verschiebungen (delta) sind in ppm, alle Kopplungskonstanten (J) in Hz angegeben. Bei den Kopplungen handelt es sich, wenn nicht anders angegeben, um H,H-Kopplungen. Alle Spektren wurden bei 25°C aufgenommen.

ESI-Massenspektroskopie: siehe unter (RP-)HPLC-MS .

Elementaranalysen wurden am Institut für Chemie der Humboldt-Universität Berlin am Analyseautomat CHNS-933 der Firma LECO bestimmt. Die Brom-Bestimmung erfolgte durch Aufschluß der Verbindung nach Schöniger und Titration der freigesetzten Halogenidionen mit 0.01 N Hg(ClO4)2 unter Verwendung von Diphenylcarbazon als Indikator nach Dirscherl und Erne.

SPOT-Synthese

Die automatische SPOT-Synthese erfolgte mit dem Gerät Autospot Robot AMS 222 (Abimed, Langenfeld, Deutschland) unter Anwendung der Steuersoftware Autospot XL Ver. 2.02. Die benötigten Steuerdateien, in denen Ort und Sequenzen der SPOTs festgelegt wurden, wurden mit den Programmen LISA und DIGEN (beide: Jerini Bio Tools GmbH, Berlin, Deutschland) angefertigt. Die Waschschritte erfolgten in Edelstahlschalen (Merck Eurolab), die auf einem Wipptisch (Labortechnik Fröbel, Lindau/Bodensee, Deutschland) bewegt wurden. Für Reaktionen bei erhöhter Temperatur wurde die Membran in einer Edelstahlschale auf einer regelbaren Heizmatte (Merck Eurolab) erwärmt oder in einer mit einem Glasdeckel verschlossenen Glasschale in einem Haushaltsmikrowellenofen bei 810 W Mikrowellenleistung behandelt. Einzelne SPOTs wurden mit einem Büro-Locher ausgestanzt und zur Weiterbehandlung in eine Mikrotiterplatte oder 2.0 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt. Thermomixer 5437, Zentrifuge 5475C und Vakuumzentrifuge 5301 der Firma Eppendorf wurden zur Behandlung von Zellulosespots in Eppendorf-Reaktoren verwendet. Zur Beschleunigung des Lösungsvorganges von Reagenzien für die SPOT-Synthese wurde ein Ultraschallbad verwendet (Sonomatic 300 PC). Zur Spaltung des Photo-Linkers 48 wurde UV-Licht verwendet, welches mit dem Gerät Vilber Lourmat TFX 20 LC (7 mW/cm2 bei 320-390 nm, Bestrahlungsfläche: 20 x 20 cm) oder Beltron UV-


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Trockner 50/II [340 mW/cm2 bei lambda > 310 nm (Borsilikat-Filter)] erzeugt wurde. Bei den angegebenen UV-Energiedichten handelt es sich um Herstellerangaben.

Bindungsstudien

Die monoklonalen Antikörper Tab-2 und TE-33 wurden von W. Höhne (Institut für Biochemie, Charité, Humboldt-Universität, Berlin) bzw. T. Scherf (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel) zur Verfügung gestellt.

Die Bestimmung von Bindung an zellulosegebundene Peptoid-Bibliotheken erfolgte mit dem LumiImager™ der Firma Boehringer Mannheim (Mannheim, Deutschland), bei der auch die Reagenzien Blocking Reagent und Luminescence Substrate Solution A und B erworben wurden. Die verwendete TRIS-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) war 10 mM und auf pH = 8.0 eingestellt. Der anti-Maus IgG Nachweis-Antikörper wurde von Sigma (Taufkirchen, Deutschland) bezogen.

Die Bestimmung von Dissoziationskonstanten mittels Oberflächen-Plasmonenresonanz wurde mit einem System der Firma Biacore AB (Uppsala, Schweden) durchgeführt [Gerät: Biacore X, Software: Biacore X Control Software 2.1, BIAevaluation 3.0.1, Sensor Chip: CM5, Puffer: HBS-EP [Zusammensetzung: HEPES (0.01 M, pH = 7.4); NaCl (0.15 M), EDTA (3 mM), Polysorbat 20 (0.005%, v/v)], Immobilisierung: Kit zur Aminkopplung, Regenerierung: Glycin/HCl-Puffer (10 mM, pH = 2.0)].


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