122

Kapitel 9. Durchführung

9.1 Synthesen in Lösung

9.1.1 Allgemeine Arbeitsvorschriften

AAV 1:Synthese von Bromessigsäure-nitrophenylestern aus Bromessigsäurebromid und Nitrophenolen

AAV 2:Synthese von Bromessigsäureestern aus Bromessigsäure (53) unter Verwendung von DCC

AAV 3:Synthese von -Tritylthioalkylaminen modifiziert nach F.I. Carroll et al.^{[ 150 ]}

123

9.1.2 Spezielle Synthesen

Bromessigsäure-pentafluorphenylester

IR (Film): 2969 m (CH₂), 2672 m, 2464 m, 1810/1790 br (C=O), 1655 s, 1520 br (Ar-C=C), 1473 s, 1425 s, 1403 s, 1241 br, 1222 br, 1145 s, 1095 br, 1000 br, 599 s.

¹H-NMR (300 MHz, CDCl3): = 4.15 (s, 2H, CH₂).

¹³C-NMR (75.45 MHz, CDCl3): = 23.2 (CH2), 124.2-125.0 (m, Ar-C-O), 135.8-143.2 (m, Ar-C-F, Signale durch (¹³C,¹⁹F)-Kopplungen aufgespalten), 163.7 (C=O).

¹⁹F-NMR [284 MHz, CDCl3, verunreinigt mit < 3 Mol% Pentafluorphenol: = -168.86 (tt, ³J = 22, ⁴J = 6.0, 1F, p-F), -164.32 - -163.89 (m, 4F, o- und m-F)*]: = -162.16 (dd, 3J = 22, 3J = 18, 2F, m-F), -157.25 (t, 3J = 22, p-F), -152.93 (d, 3J = 18, o-F).

*: Die Signale von Pentafluorphenol entsprechen den in der Literatur genannten.^{[ 194 ]}

Elementaranalyse:	C8H2O2BrF5 (305.00).
	ber.: C: 31.50%, H: 0.66%, Br: 26.20%;
	gef: C: 31.36%, H: 0.77%, Br: 25.93%.

9.1.1.1.1.2 Bromessigsäure-2,4-dinitrophenylester

124

IR (KBr): 3112 m (Ar-C-H), 3071 m, 2957 m (-CH₂-), 1783 m (C=O), 1608 m (Ar-C=C), 1538 br, 1344 br (-NO2), 1219 s, 1097 br, 919 s, 836 s, 733 m.

¹H-NMR (300 MHz, CDCl3): = 4.19 (s, 2H, -CH₂-), 7.56 (d, ³J = 8.9, 1H, Ar-H6), 8.91 (dd, ³J = 8.9, ⁴J = 2.7, 1H, Ar-H5), 8.98 (d, ⁴J = 2.7, 1H, Ar-H3).

¹³C-NMR (75.45 MHz, CDCl3): = 24.3 (CH2), 121.8, 126.4, 129.3 (Ar-C-H), 141.2, 145.5, 147.8 (Ar-C-O), 164.2 (C=O).

Elementaranalyse:	C8H5N2O6Br (305.04).
	ber.: C: 31.50%, H: 1.65%, N: 9.18%, Br: 26.19%;
	gef.: C: 31.43%, H: 1.65%, N: 9.27%, Br: 26.32%.

Bromessigsäure-4-nitrophenylester

Schmp.: 81-84°C (Lit.: 86-87°C^{[ 134 ]}).

¹H-NMR (300 MHz, CDCl3): = 4.08 (s, 2H, CH₂), 7.34 (d, ³J = 9.0, 2H, Ar-H), 8.30 (d, ³J = 8.0, 2H, Ar-H).

¹³C-NMR (75.45 MHz, CDCl3): = 24.9 (CH2), 122.0, 125.3 (Ar-C-H), 149.0, 154.8 (Ar-C-O), 164.8 (C=O).

Die NMR-spektroskopischen Daten stimmen mit den in der Literatur genannten überein.^{[ 134 ]}

Bromessigsäure-N-succinimidylester

Schmp.: 108-110°C (Lit.: 110°C^{[ 135 ]}).

125

¹³C-NMR (75.45 MHz, CDCl3): = 21.1 (Br-CH2), 25.5 (CH2-CH₂), 162.9 (Ester-C=O), 168.4 (Amid-C=O).

9.1.1.1.1.5 2-Tritylthioetylamin (vergl. Tab. 13 , Eintrag 3f)

R_f (CH₂Cl₂/Methanol 9:1) = 0.21.

Schmp.: 85-88°C (Lit.^{[ 150 ]}: 85-92°C).

¹H-NMR (300 MHz, [D₆]-DMSO): = 2.16 (br-t, ³J = 7.2, 2H, 2-CH₂), 2.42 (br-t, ³J = 7.2, 2H, 1-CH₂), 7.20-7.40 (m, 15H, Ar-H). Die Spektraldaten stimmen mit den in der Literatur genannten überein.^{[ 150 ]}

9.1.1.1.1.6 3-Tritylthiopropylamin (vergl. Tab. 13 , Eintrag 3g)

R_f (CH₂Cl₂/Methanol 9:1) = 0.27.

¹H-NMR [300 MHz, CDCl₃, verunreinigt mit 56 Mol% Methanol: = 3.35 (s, 8H, CH₂)]: = 1.38 (br-s, 2H, NH₂), 1.44 (br-pent., ³J = 7.2, 2H, 2-CH₂), 2.11 (br-t, ³J = 7.2, 2H, 3-CH₂), 2.54 (br-t, ³J = 7.2, 2H, 1-CH₂), 7.09-7.38 (m, 15H, Ar-H).

126

9.1.3 Untersuchungen zur N/O-Selektivität von Bromessigsäure-2,4-dinitrophenylester in Lösung mittels ¹H-NMR

Zur Untersuchung der N/O-Selektivität von Bromessigsäure-2,4-dinitrophenylester (11) gegenüber Diethylamin (66) und Methanol (68) wurden folgende Lösungen in Deuterochloroform angefertigt: (A) 30 mM Bromessigsäure-2,4-dinitrophenylester (11); (B) 60 mM Diethylamin; (C) 120 mM Methanol; (D) 400 mM Methanol und (E) 30 mM Triethylamin. Alle Reagenzien wurden dabei in 2.0 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße eingewogen, um eine genaue Einstellung der Konzentration zu ermöglichen. In einem 1.5 ml Reaktionsgefäß wurden die Substanzen jeweils gemäß Tab. 24 gemischt. Dabei wurde die Bromessigsäure-Lösung (A) als letztes zugegeben und sofort danach durchmischt. Die Lösungen wurden nach den in Tab. 8 (Seite 49) angegebenen Zeiten ¹H-NMR-spektroskopisch vermessen. Anhand der Integrale der Methylensignale der beteiligten Substanzen wurden die Produktverhältnisse bestimmt, sowie auf die genauen Verhältnisse der Edukte geschlossen (vergl. Tab. 8 ).

Tab. 24: Ansätze für die NMR-spektroskopische Bestimmung der N/O-Selektivität der Umsetzung von Bromessigsäure-2,4-dinitrophenylester (11) mit Diethylamin (66) und Methanol (68) in einem Konkurrenzexperiment [Die Buchstaben entsprechen den Lösungen wie oben im Text beschrieben. Die Nummer entspricht dem Versuchseintrag in Tab. 8 (Seite 49). Angegebene Werte in ml. Die Zugabe von (A) erfolgte als letztes; F = Deuterochloroform].

Nr.	A	B	C	D	E	F
1	0.5	0.25	-	-	-	0.25
2	0.5	-	0.25	-	-	0.25
3/4	0.5	-	0.25	-	0.25	-
5/6	0.5	0.25	0.125	-	-	0.125
7	0.5	0.25	-	0.25	-	-

Beobachtete Reaktions-Edukte:

Bromessigsäure-2,4-dinitrophenylester (11): vergl. 9.1.1.1.1.2 .

Methanol (68): 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): = 3.42 (s, 3H, CH₃).

Triethylamin: 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): = 1.23 (t, ³J = 7.3, 9H, CH₃), 3.11 (q, ³J = 7.3, 6H, CH₂).

Beobachtete Reaktionsprodukte:

2-Brom-N,N-diethylacetamid (67): 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): = 1.07 (t, ³J = 7.2, 3H, CH₃), 1.19 (t, ³J = 7.2, 3H, CH₃), 3.32 (q, ³J = 7.2, 4H, CH₂-CH₃), 3.78 (s, 2H, Br-CH₂).

Bromessigsäuremethylester (69): 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): = 3.74 (s, 2H, CH₃), 3.79 (s, 2H, CH₂).

127

Bromessigsäure: 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): = 3.88 (s, 2H, CH₂).

Die 1H-NMR-Spektren aller beteiligten Substanzen mit Ausnahme von 2-Brom-N,N-diethylacetamid (67) wurden durch getrennte Analyse authentischer Proben bestätigt.

128

9.2 Synthesen an Syntheseharzen

9.2.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift

AAV 4: Synthese von Peptoiden an Syntheseharzen nach G.M. Figliozzi et al. ^{[ 104 ]}

Acylierung: Man gibt 850 µl Bromessigsäure (0.6 M in DMF, 10 Äq., 1 x 30 min) und 200 µl DIC (3.2 M in DMF, 13 Äq.) zum Harz. Nach 30 Minuten wird die Lösung entfernt und der Acylierungsvorgang einmal wiederholt. Das Harz wird mit DMF (2 x 2 ml) und DMSO gewaschen (1 x 2 ml).

Bromsubstitution: Die Bromsubstitution erfolgt mit 1.0 ml einer Lösung eines primären Amins in DMSO (1-2 M; 1 x 2 h). Das Harz wird mit DMSO (2 x 2 ml) und DMF gewaschen (1 x 2 ml).

Die Acylierungs- und Bromsubstitutionsschritte werden wiederholt, bis die volle Sequenz aufgebaut ist. Es erfolgt dann ein zusätzlicher Waschschritt mit CH₂Cl₂ (2 x 2 ml). Anschließend wird das Harz getrocknet. Zu Abspaltung des Peptoids vom Harz und gleichzeitiger Entfernung von Seitenkettenschutzgruppen wird das Harz mit TFA (95% in H₂O, 5.0 ml) versetzt. Nach 20 Minuten wird die Lösung in einen Kolben überführt und das Harz mit TFA (95% in H₂O, 1.0 ml) gewaschen. Es wird H₂O (6 ml) zugesetzt und die Lösungsmittel durch Gefriertrocknung entfernt. Das Produkt wird zweimal in 10 ml Essigsäure oder Acetonitril/H₂O (1:1) aufgenommen und gefriergetrocknet. Man erhält das Produkt als Salz der Trifluoressigsäure (alle basischen Gruppen sind von je einem Molekül TFA protoniert) als weißes Pulver.

AAV 5: Synthese von Peptoiden an Syntheseharzen modifiziert nach G.M. Figliozzi et al. ^{[ 104 ]})

Acylierung: Je nach Baustein entscheidet sich, ob ein Cyclus aus Bromacetylierung und Bromsubstitution bzw. Acylierung und Fmoc-Abspaltung nach der Sub-Monomer- (a) oder der Monomer-Methode (b) durchgeführt wird.

(a): Sub-Monomer-Methode: Man acyliert mit 1.5 ml einer Lösung von Bromessigsäure-2,4-dinitrophenylester (11) in DMF (0.3 M, 3.75 Äq., 1 x 30 min).

129

Das Harz wird mit DMF gewaschen (30 ml).

Bromsubstitution bzw. Fmoc-Abspaltung:

(a): Sub-Monomer-Methode: Die Bromsubstitution erfolgt mit 1.5 ml einer Lösung eines primären Amins in DMF (nach Möglichkeit 5 M, anderenfalls in möglichst hoher Konzentration; es sollten nicht unter 12 Äq. verwendet werden; 1 x 45 min). Sehr polare Amine können in wäßriger Lösung unter Zusatz von 0.05% Tween^® 20 eingesetzt werden, die mit 4.8 M wäßriger NaOH auf pH = 9 eingestellt wurde. In diesem Fall muß das Harz vor und nach Amin-Zugabe mit H₂O gewaschen weren (je 30 ml).

(b): Monomer-Methode: Zur Abspaltung der Fmoc-Gruppe wird das Harz mit 2.0 ml Piperidin (20% in DMF, 1 x 20 min) versetzt.

Das Harz wird mit DMF (20 ml), Piperidin (20% in DMF, 20 ml) und DMF (40 ml) gewaschen.

Die Acylierungsschritte werden wiederholt, bis die volle Sequenz aufgebaut ist. Es erfolgt dann zur Entfernung schwerlöslicher Rückstände eine umfangreiche, zusätzliche Waschprozedur: Piperidin (20% in DMF, 20 ml), DMF (30 ml), H₂O (30 ml), DMF (40 ml), Methanol (40 ml), CH₂Cl₂ (40 ml) und Et₂O (40 ml). Anschließend wird das Harz getrocknet. Zu Abspaltung des Peptoids vom Harz und gleichzeitiger Entfernung von Seitenkettenschutzgruppen wird das Harz mit TFA (95% in H₂O, 6.0 ml) versetzt. Nach 30 Minuten wird die Lösung in einen Kolben überführt und das Harz mit Acetonitril (3 x 5 ml) gewaschen. Das Lösungsmittel der vereinten organischen Phasen wird bei 0.1 mbar entfernt (ohne den Kolben zu bewegen, ca. 3 h). Der Rückstand wird in 5 ml Acetonitril gelöst bzw. suspendiert und mit 50 ml H₂O versetzt. Nach Gefriertrocknung erhält man das Produkt als Salz der Trifluoressigsäure (alle basischen Gruppen sind von je einem Molekül TFA protoniert) als weißes Pulver.

Das Rohprodukt wird mittels HPLC-MS analysiert und ggf. mittels präp. HPLC gereinigt.

130

9.2.2 Spezielle Synthesen

N-Benzyl-N-[(butyl-carbamoylmethyl-carbamoyl)-methyl]-2-piperidin-1-yl-acetamid

HPLC-MS: RT = 10.9; ber. (M+H⁺): 403.27; gef.: 403.2 (100), 273.2 (10), 98.1 (40); (vergl. Abb. 16 , Seite 40).

N-[(Butyl-carbamoylmethyl-carbamoyl)-methyl]-N-(2-hydroxyethyl)-2-piperidin-1-yl-acetamid

HPLC-MS: RT = 6.2; ber. (M+H⁺): 357.25; gef.: 357.1 (100), 227.2 (10), 98.1 (60); (vergl. Abb. 18 , Seite 48).

131

Piperidin-1-yl-essigsäure-2-{[(butyl-carbamoylmethyl-carbamoyl)-methyl]-(2-piperidin-1-yl-acetyl)-amino}-ethylester

HPLC-MS: RT = 7.7; ber. (M+H⁺): 482.34; gef.: 482.2 (100), 339.2 (50), 98.1 (20); (vergl. Abb. 18 , Seite 48).

Synthesen von Tripeptoiden für Bindungsstudien in Lösung (97 - 100)

B-03: Cyclohexylmethylamin (5 M); B-05: Ethanolamin (5 M); B-08: Tryptamin (1.5 M); B-09: 2-Aminometylthiophen (5 M); B-11: Homoveratrylamin (5 M); B-12: Napht-1-ylmethylamin (3.5 M); B-16: Fmoc-Sar-OH (Monomer-Methode); B-20: -Alaninamid (2.5 M in H₂O aus dem Hydrochlorid mit 0.9 Äq. NaOH + 0.05% Tween^® 20).

Analytische Daten der Rohprodukte und der durch präparative HPLC gereinigten Substanzen:

97: 16.8 mg (= 24%, M (TFA-Salz) = 637.71).

HPLC-MS: Reinheit: 89%; RT = 14.0; ber. (M+H⁺): 524.27; gef.: 524.2 (100), 371.1 (10), 307.1 (10).

132

98: 66.4 mg (= 92%, M (TFA-Salz) = 658.73). HPLC-MS: Reinheit: 87%; RT = 13.2; ber. (M+H+): 545.28; gef.: 545.2 (100), 392.1 (10), 375.2 (10), 250.1 (30), 222.3 (10). 1H-NMR* [500 MHz, [D6]-DMSO] = 0.81-0.98 und 1.07-1.27 und 1.56-1.76 (jeweils m, zusammen 11H, 23-H, 24-H2, 25-H2, 26-H2), 2.51-2.58 und

2.63-2.73 und 2.74-2.80 (jeweils m, zusammen 4H, 11-H₂, 22-H₂), 3.71, 3.72, 3.74, 3.75 (jeweils s, zusammen 6H, 18-H₃, 19-H₃), [3.75-3.87 (m) und 3.97, 3.99, 4.20, 4.28, 4.31, 4.46, 4.48, 4.60, 4.62, 4.69, 4.77, 4.79, 4.80 (jeweils s, zusammen 10H, 2-H₂, 3-H₂, 9-H₂, 10-H₂, 21-H₂)], 6.67-7.98 (m, 8H, 5-H, 6-H, 7-H, 13-H, 16-H, 17-H, CONH₂), 8.66, 8.74 (jeweils br-s, 2H, NH₂⁺); (vergl. Abb. 33 , Seite 179).

¹³C-NMR* [126 MHz, [D₆]-DMSO, Standard-Messung (kein APT)]: = 24.87, 24.94, 25.50, 29.82, 29.87, 32.46, 32.73, 34.13 (C-11, C-23, C-24, C-25, C-26), 44.66, 45.01, 46.19, 47.00, 47.15, 48.15, 48.38, 48.89, 49.09, 49.20, 52.95 (C-2, C-3, C-9, C-10, C-21, C-22), 55.44, 55.48, 55.50 (C-18, C-19), 111.90, 112.47, 112.91 (C-13, C-16), 120.47, 120.93, 125.84, 126.00, 126.10, 126.25, 126.35, 126.58, 126.60, 127.09, 127.15, 127.22, 127.30, 127.41, 127.68, 128.17, 130.79, 131.09, 131.16, 134.24, 139.36, 139.56, 139.74, 147.30, 147.52, 148.64, 148.75, 157.71, 157.96 (C-4, C-5, C-6, C-7, C-12, C-14, C-15, C-17), 165.27, 166.19, 167.32, 167.82, 167.98, 168.60, 169.32, 169.54 (C-1, C-8, C-20); (vergl. Abb. 34 , Seite 179).

* Die Auswertung der NMR-Spektren wurde durch das Vorliegen von bis zu vier Isomeren (theoretischer Wert) erschwert, die auf die cis/trans-Isomerie der N-Alkylamid-Bindung an C-8 und C-20 zurückzuführen sind.

99: 38.8 mg (= 56%, M (TFA-Salz) = 633.66).

HPLC-MS: Reinheit: 76%; RT = 10.4; ber. (M+H⁺): 520.32; gef.: 520.3 (100), 367.2 (20).

100: 51.2 mg (= 93%, M (TFA-Salz) = 500.47).

HPLC-MS: Reinheit: 89%; RT = 9.6; ber. (M+H⁺): 387.21; gef.: 387.1 (100), 286.1 (30), 215.1 (10), 173.1 (10), 141.2 (50), 100.1 (10).

Die Verbindungen 97-100 wurden ohne weiter Reinigung in den Bindungsstudien eingesetzt.

133

Synthesen von Hexapeptoiden (104, 105, 108, 109, 110 und 111) sowie den Diketopiperazinen 103 und 107 für Bindungsstudien in Lösung.

104 (SPOT Nr.: 2456)	03-03-06-22-06-03
105 (SPOT Nr.: 3292)	29-44-03-06-30-43
108 (SPOT Nr.: 6247)	32-22-39-03-13-43
109 (SPOT Nr.: 636)	39-26-03-31-39-03
110 (SPOT Nr.: 7862)	15-37-29-22-40-39
111 (SPOT Nr.: 2078)	33-31-26-38-18-39

Es wurden die folgenden Aminlösungen verwendet:

B-03: Cyclohexylmethylamin (5 M); B-06: Fmoc-Gly-OH (Monomer-Methode); B-07: rac-3-Amino-1,2-propandiol (3 M); B-13: Isobutylamin (5 M); B-15: Histamin (1.5 M); B-18: N-Boc-1,4-diaminobutan (3 M); B-22: Glycin-tert-butylester (3.0 M in H₂O aus dem Acetat mit 0.9 Äq. NaOH + 0.05% Tween^® 20); B-26: N-Boc-1,3-diaminopropan (3 M); B-27: rac-2-Amino-1-propanol (3 M); B-29: 2-Methoxyethylamin (5 M); B-30: 2-Aminothiazol (1.5 M); B-31: Fmoc-L-Ala-OH (Monomer-Methode); B-32: Hydroxylamin (50% in H₂O + 0.05% Tween^® 20); B-33: Fmoc-L-Pro-OH (Monomer-Methode); B-37: rac-Fmoc-Pip-OH (Monomer-Methode); B-38: rac-s-Butylamin (5 M); B-39: 4-Methoxybenzylamin (5 M); B-40: n-Butylamin (5 M); B-43: 2-Chlorbenzylamin (5 M); B-44: 4-Phenoxyanilin (2 M in NMP).

Analytische Daten der Rohprodukte und der durch präparative HPLC gereinigten Substanzen:

104 + 103: 50 mg (66% (bez. auf 104); M (104, TFA-Salz) = 819.91; M (103) = 381.43).

HPLC-MS: 104: Reinheit: 22%; RT = 15.0; ber. (M+H⁺): 706.45; gef.: 706.3 (100), 553.3 (10); 103: Reinheit: 73%; RT = 8.8; ber. (M+H⁺): 382.21; gef.: 381.9 (80%), 365.0 (100), 211.9 (10), 171.1 (10), 154.9 (30).

Beide Substanzen wurden mittels präp. HPLC getrennt und gereinigt: 104: 7.4 mg (Gesamtausbeute 10%; Reinheit: 98%); 103: 15.0 mg (Gesamtausbeute 43%; Reinheit: 91%).

105: 60 mg (65%; M (TFA-Salz) = 1003.48).

134

Da das Hexapeptoid neben mindestens fünf anderen Substanzen bei RT = 8.9, 10.9, 13.4, 14.2 und 18.4 vorlag, wurde keine weiter Reinigung vorgenommen.

108 + 107: 85 mg (= 98% (bez. auf 108); M (108, TFA-Salz) = 944.39; M (107) = 812.35).

HPLC-MS: 108: Nicht gefunden. Offenbar hatte vollständige Cyclisierung zu 107 stattgefunden; 107: Reinheit: 77%; RT = 16.8; ber. (M+H⁺): 814.38 + 812.38; gef.: 814.0 (50%), 812.0 (100), 795.1 (10), 614.1 (20), 501.1 (40), 465.2 (40), 432.1 (10), 312.1 (10), 121.2 (20).

Das Diketopiperazin 107 wurde mittels präp. HPLC gereinigt: 107: 22 mg (Gesamtausbeute 29%; Reinheit: 89%). Da die Substanz sehr unpolar ist, ließ sie sich auch mit reinem Acetonitril nur schwer vom Trennmeduim eluieren. Dies führte somit zu einem Verlußt an Ausbeute.

109: 98 mg (= 98%; M (doppeltes TFA-Salz) = 1091,14). HPLC-MS: Reinheit: 93%; RT = 15.5; ber. (M+H+): 863.54; gef.: 863.4 (100), 686.4 (10). Trotz der hohen Reinheit des

Produktes erfolgte eine Reinigung mittels präp. HPLC: 109: 54 mg (Gesamtausbeute 54%; Reinheit: 98%).

¹H-NMR* [500 MHz, [D₆]-DMSO] = 0.80-1.90 (m, 27H, 4-H, 5-H₂, 6-H₂, 7-H₂, 18-H₃, 22-H, 23-H₂, 24-H₂, 25-H₂, 29-H₂), 2.70-5.00 (m, 23H, 2-H₂, 3-H₂, 9-H₂, 10-H₂, 17-H, 20-H₂, 21-H₂, 27-H₂, 28-H₂, 30-H₂, 32-H₂, 33-H₂), überlagert von 3.68, 3.69, 3.70, 3.71. 3.715, 3.716, 3.72, 3.74, 3.75, 3.76, 3.76, 3.77 (jeweils s, 6H, 15-H₃, 38-H₃), 6.80-7.56 (m, 14H, 12-H, 13-H, 30-NH₃⁺, 35-H, 36-H, 1-CONH₂, 19-CONH), 9,13 (br-s, 2H, NH₂⁺); (vergl. Abb. 35 , Seite 180).

Eine Auswertung des ¹³C-NMR-Spektrums* [126 MHz, [D₆]-DMSO, Standard-Messung (kein APT)] war aufgrund der zahlreichen Isomeren nicht möglich. Die beobachteten Signale waren häufig verbreitert, vermutlich durch die Überlagerung eng nebeneinander liegender Signale. Einige charakteristische Signale traten deutlicher hervor und konnten daher zugeordnet werden: = 25.4, 26.0, 30.1 (C-5, C-6, C-7, C-23, C-24, C-25), 55.0 , 55.1 (C-15, C-38) 113.0, 128.6, 129.1, 131.7 (C-12, C-13, C-35, C-36).

* Die Auswertung der NMR-Spektren wurde durch das Vorliegen von bis zu 16 Isomeren (theoretischer Wert) erschwert, die auf die cis/trans-Isomerie der N-Alkylamid-Bindungen an C-8, C-16, C-26 und C-31 zurückzuführen sind.

135

HPLC-MS: Reinheit: 90%; RT = 9.82; ber. (M+H⁺): 800.43; gef.: 800.2 (100), 649.3 (10), 538.1 (20), 263.1 (10).

Zur Reinigung wurden 60 mg des Rohproduktes mittels präp. HPLC gereinigt: 110: 22 mg (Gesamtausbeute 35% extrapoliert auf das gesamte Rohprodukt; Reinheit: 97%).

111: 90 mg (= 92%; M (dreifaches TFA-Salz) = 1059.97).

HPLC-MS: Reinheit: 76%; RT = 8.2; ber. (M+H⁺): 718.46; gef.: 718.3 (100), 550.3 (10), 436.2 (10), 369.2 (10), 283.2 (10).

Des Rohprodukt wurde mittels präp. HPLC gereinigt: 111: 31 mg (Gesamtausbeute 33%; Reinheit: 98%).

136

9.3 Synthesen an Zellulosemembranen

9.3.1 Allgemeine Arbeitsvorschriften

AAV 6:Bestimmung des Derivatisierungsgrades von aminoderivatisierten Zellulosemembranen modifiziert nach J. Eichler et al.^{[ 121 ]}

Methode A: Quantifizierung freier Aminofunktionen

Ein SPOT (0.23 cm²) wird ausgestanzt und in einem 2.0 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß mit 50 µl Fmoc-Ala-OPfp (0.6 M in DMF) versetzt. Nach 30 Minuten wird die Lösung entfernt und der SPOT mit DMF gewaschen (5 x 1.0 ml). In einem weiteren 1.5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß wird der SPOT mit 1.00 ml Piperidin (20% in DMF) versetzt. Nach 20 Minuten wird die UV-Absorption der unverdünnten Lösung bei = 301 nm bestimmt [Vergleichszelle: Stammlösung Piperidin (20% in DMF)]. Aus der Extinktion (E) wird der Derivatisierungsgrad nach der unten dargestellten Formel berechnet (₃₀₁ = 8100^{[ 121 ]}). Bei hohen Derivatisierungsgraden (Extinktion > 1.5) muß die Meßlösung verdünnt werden.

mit E = Extinktion bei 301 nm; V = Reagenzvolumen, mit dem der SPOT versetzt wurde; F = Fläche des SPOTs (typischerweise 0.23 cm²).

Methode B: Quantifizierung einer membrangebundenen Fmoc-Aminosäure

Ein SPOT (0.23 cm²) wird ausgestanzt und in einem 1.5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß mit 1.00 ml Piperidin (20% in DMF) versetzt. Zur Quantifizierung wird wie unter Methode A beschrieben verfahren.

137

AAV 7:3-Amino-2-hydroxypropyl-zellulose

In eine leere Instrumentenschale gibt man nacheinander Epibromhydrin (35; 20.0 ml), eine Lösung von Perchlorsäure (2.0 ml einer 60%igen Lösung in H₂O) in Dioxan (18.0 ml, ergibt 6.0 M Lösung; 8 Mol% Perchlorsäure) und die vorbereitete Membran und verschließt das Gefäß. Nach 24 Stunden bei 25°C gibt man Methanol (100 ml) zu. Nach 30 Minuten dekantiert man, wäscht mit Methanol (50 ml) und inkubiert die Membran 24 Stunden mit einer ges. Lösung von Ammoniak in Methanol (100 ml). Man wäscht nacheinander mit Methanol (50 ml), H₂O (50 ml), 0.5 M NaOH in H₂O (50 ml), H₂O (5 x 50 ml) und Methanol (3 x 50 ml) und läßt die Membran trocknen.

Der Derivatisierungsgrad wird nach AAV 6 -A bestimmt. Er beträgt 50 - 500 nmol/cm².

AAV 8:3-[3-{2-[2-(3-Aminopropoxy)-ethoxy]-ethoxy}-propylamino]-2-hydroxypropyl- zellulose

In einer Instrumentenschale aus Edelstahl versetzt man eine Zellulosemembran (19 x 28 cm) für 5 Minuten mit einer Lösung von Perchlorsäure (1.0 ml einer 60%igen Lösung in H₂O) in Methanol (50 ml), dekantiert die Lösung, wäscht zweimal mit Methanol, dekantiert erneut und läßt die Membran bei geöffneter Schalenabdeckung trocknen.

In eine leere Instrumentenschale gibt man nacheinander Epibromhydrin (35; 4.0 ml), eine Lösung von Perchlorsäure (0.40 ml einer 60%igen Lösung in H₂O) in Dioxan (35.6 ml, ergibt 1.2 M Lösung; 8 Mol% Perchlorsäure) und die vorbereitete Membran und verschließt das Gefäß. Nach 3 Stunden bei 25°C gibt man Methanol (100 ml) zu. Nach 30 Minuten dekantiert man und wäscht mit Methanol (2 x 50 ml). Die an der Luft getrocknete Membran gibt man in eine Instrumentenschale, die auf 80°C erwärmtes 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin (37; 40 ml) enthält. Nach 1 Stunde bei dieser Temperatur dekantiert man und inkubiert anschließend bei 25°C nacheinander mit MeOH (2 x 50 ml, 5 min), NaOMe (5 M

138

Der Derivatisierungsgrad wird nach AAV 6 -A bestimmt. Er beträgt 600 - 1400 nmol/cm².

B.) Niedrigbeladungsprotokoll (100 - 400 nmol/cm²)

Die Präparation erfolgt wie bei A.) mit den folgenden Unterschieden:

1. Man läßt die Epibromhydrin-Lösung 1 Stunde einwirken.
2. Man wendet das Diamin 37 als Lösung in DMF (20%) bei 25°C an.

Die Derivatisierung beträgt 100 - 400 nmol/cm².

AAV 9:Fmoc-Aminosäurepentafluorphenylester durch in situ Aktivierung von Fmoc-Aminosäuren

N-Fmoc-4-[Amino-(2,4-dimethoxyphenyl)-methyl]-phenoxyessigsäure („Fmoc-Rink-Linker-OH“, 0.1 mmol) wird mit 0.50 ml einer 0.2 M Lösung von Pentafluorphenol in NMP (0.50 ml) versetzt. Man gibt DIC zu (0.1 mmol) und läßt 30 Minuten reagieren. Die erhaltene 0.2 M Lösung kann nach Abtrennen von ggf. gebildetem Niederschlag mittels Zentrifugation zur SPOT-Synthese eingesetzt werden.

AAV 10: Fmoc-Aminosäure-7-azabenzotriazol-1-ylester durch in situ Aktivierung von Fmoc-Aminosäuren

N-Fmoc-4-[4´-(1´´-Aminoethyl)-2´-methoxy-5´-nitrophenoxy]-buttersäure („Fmoc-Photo-Linker-OH“, 0.25 mmol) und HATU (0.25 mmol) werden in 0.50 ml NMP gelöst und mit NMI (0.25 mmol) versetzt. Die Suspension wird im Wasserbad mit Ultraschall behandelt

139

AAV 11: Fmoc-Aminosäureanhydride durch in situ Aktivierung von Fmoc-Aminosäuren

Fmoc-Sarcosin (0.3 mmol) wird in 0.50 ml NMP gelöst und mit DIC (0.15 mmol) versetzt. Nach 30 Minuten wird ggf. gebildeter Niederschlag mittels Zentrifugation abgetrennt. Die erhaltene 0.3 M Lösung sollte innerhalb von 2 Stunden zur SPOT-Synthese eingesetzt werden.

AAV 12: Manuelle SPOT-Synthese von Peptoiden

Bei Synthesen am Photo-Linker müssen besondere Vorkehrungen getroffen werden, um eine vorzeitige Abspaltung zu verhindern: Bei allen Operationen, bei denen die Membran der Einwirkung von Licht ausgesetzt ist, wird Tageslicht durch Raumabdunklung ausgeschlossen. Desgleichen wird die Raumbeleuchtung im Umkreis von ca. 4 m ausgeschaltet, so daß die Membran nur indirekt beleutet wird.

140

Zur Peptoid-Synthese werden drei verschiedene Linker verwendet:

Zunächst wird eine Lösung des gewünschte Linkers in aktivierter Form bereitgestellt:

161: 0.3 M Lösung von Fmoc--Ala-OPfp in NMP;

47: 0.2 M in NMP nach AAV 9 ;

48: 0.5 M in NMP nach AAV 10 .

Die aktivierte Linker-Lösung wird an einer esterfrei aminoderivatisierten Zellulosemembran 38 ( AAV 8 , Hoch- bzw. Niedrigbeladungsprotokoll in Abhängigkeit vom gewünschten Derivatisierungsgrad) durch Pipettieren aufgetragen (Doppelkopplung, 2 x 15 min; eine Markierung der Positionen kann mit einem Bleistift erfolgen). Dabei wird hier und in allen folgenden Schritten stets das gleiche Volumen (2.0 µl) angewendet. In einem erweiterten Waschschritt werden freie Aminogruppen durch Acetylierung blockiert (DMF, 2 x 2 min; DMF/Ac₂O/DIEA [70:10:20 (v/v), 2 x 15 min], die Membran gewaschen (DMF, 2 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; Et₂O, 1 x 2 min) und anschließend an der Luft getrocknet. Anhand von drei SPOTs, die nur zu diesem Zweck vorgesehen wurden, wird der Derivatisierungsgrad nach AAV 6 -B bestimmt. Die Membran wird den Bedingungen einer Fmoc-Abspaltung unterzogen (Piperidin (20% in DMF), 2 x 10 min), gewaschen (DMF, 5 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; Et₂O, 1 x 2 min) und an der Luft getrocknet.

B.) Peptoidsynthese 1:

Sub-Monomerschritt 1: Bromacetylierung

Alle SPOTs werden durch Pipettieren einer Lösung von Bromessigsäure-2,4-dinitrophenylester (11, 1 M in NMP, Doppelkopplung, 2 x 15 min) bromacetyliert. Die Membran wird gewaschen (DMF, 5 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; Et₂O, 1 x 2 min) und an der Luft getrocknet.

C.) Peptoidsynthese 2:

Sub-Monomerschritt 2: Bromsubstitution

In Abhängigkeit von der gewünschten Peptoid-Sequenz werden verschiedene Amin-Lösungen auf die SPOTs pipettiert (Konzentrationen je nach Amin: Feststoffe: 5 M in NMP oder H₂O bzw., falls diese Konzentration nicht erreicht werden kann, verdünnen einer gesättigten Lösung mit mit etwas Lösungsmittel (10%), um eine Kristallisation bei der Anwendung zu verhindern - die Konzentration sollte jedoch nicht geringer als 0.8 M sein; wäßrigen Lösungen wird 0.05% Tween^® 20 zugesetzt; Flüssigkeiten: 50 Vol-% in NMP;

141

D.) Wiederholung der Schritte B.) und C.) bis die endgültige Oligomerenlänge erreicht ist.

E.) Seitenkettenschutzgruppen-Abspaltung und Abspaltung von der Zellulose in Abhängigkeit vom verwendeten Linker.

161 und 48: Zur Seitenkettenschutzgruppen-Abspaltung wird die Membran mit TFA behandelt [TFA/H₂O/TIPS [95/3/2 (v/v)] unter Phenol-Zusatz (1 g/100ml), 2 x 15 min; TFA/CH₂Cl₂/H₂O/TIPS [50/45/3/2 (v/v)] unter Phenol-Zusatz (1 g/100ml), 1 x 2 h]. Die verwendete Instrumentenschale wird dabei nicht geschüttelt. Im Anschluß wird die Membran gewaschen (CH₂Cl₂, 2 x 5 min; DMF, 1 x 2 min; Et₃N (2 Vol-% in DMF), 1 x 2 min; DMF, 2 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; Et₂O, 1 x 2 min) und an der Luft getrocknet. Membranen mit dem Linker 161 sind nun bereit für Festphasen-Bindungsstudien. Vom Photo-Linker 48 werden die Substanzen durch Belichtung der trockenen Membran mit UV-Licht (Vilber Lourmat TFX 20 LC, Einstellung 365 nm, 100%, 60 min je Seite) abgespalten. Die SPOTs werden ausgestanzt und können in einem geeigneten Lösungsmittel abgelöst zu Assays in Lösung eingesetzt oder analysiert (HPLC, HPLC-MS) werden. Die Abspaltung ist nur bei Derivatisierungsgraden < 150 nmol/cm² vollständig. Bei höheren Derivatisierungsgraden verhindert die UV-Absorption des Photolyseproduktes die vollständige Spaltung.

47: Die SPOTs werden ausgestanzt, in 2 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt und mit TFA (95% in H₂O, 70 µl) versetzt. Nach 20 Minuten wird das Lösungsmittel bei 45°C in einer Vakuumzentrifuge entfernt. Die hellroten SPOTs werden direkt im Anschluß mit Acetonitril (30 Vol-% in H₂O, 50 µl) versetzt und analysiert (HPLC, HPLC-MS). Bei Vorhandensein einer Trityl-Schutzgruppe wird der TFA-Lösung TIPS (5 Vol-%) zugesetzt.

Bemerkung zur Qualitätskontrolle: Es hat sich bewährt, auf jeder Membran das Modell-Tripeptoid 16 am Rink-Linker zu synthetisieren. Die Qualität der Synthese läßt sich nach Analyse des abgespaltenen Tripeptoids mittels HPLC und quantitativer Auswertung der UV-Absorption bestimmen (vergl. Abb. 15 , Seite 37).

Bemerkung zur Peptoid-Synthese nach der Monomer-Methode: Die Peptoid-Synthese nach der Monomer-Methode ist neben der Sub-Monomer-Synthese auf derselben Membran möglich (vergl. Schema 15 , Seite 59). Dazu wird anstelle von Bromessigsäure-2,4-dinitrophenylester eine aktivierte Lösung eines Fmoc-N-Alkylglycins pipettiert^{[ 110 ]} (Aktivierung nach AAV 11 . Ein Niederschlag von Harnstoff wird ggf. durch Zentrifugation an den Gefäßboden fixiert). Anstelle eines Amins wird im nächsten Sub-Monomerschritt DBU (4 Vol-% in NMP) angewendet.

142

AAV 13:Halbautomatische SPOT-Synthese von Peptoiden

• Die Pipettierschritte werden unter Verwendung eines Pipettierroboters (Autospot Robot AMS 222) durchgeführt. Die Steuerdateien, in denen Ort und Sequenzen der SPOTs festgelegt ist, wurden mit dem Programm LISA erzeugt, welches speziell an die Synthese nach der Submonomer-Methode angepasst wurde. In einer Synthese können gleichzeitig 40 Sub-Monomer und 40 Monomer-Bausteine verwendet werden.
• Um die Repositionierung der Membran nach den Waschschritten zu ermöglichen werden freie Aminogruppen nach Schritt A) (SPOT-Definition) durch zusätzliches Waschen mit einer 0.01%igen Lösung von Bromphenolblau in MeOH angefärbt und ausgewählte SPOTs (z.B. Ecken der Membran) mit Bleistift markiert.
• Es ist dafür zu sorgen, daß in Schritt A) (SPOT-Definition) ein um 20% geringeres Pipettiervolumen als in den übrigen Schritten gewählt wird, um Fehlsequenzen am Rand des SPOTs vermeiden.
• Zur parallelen Synthese von „kleinen“ SPOTs für Festphasen-Bindungsstudien und „großen“ SPOTs für analytische Zwecke auf einer Membran unter Verwendung von einer Synthese-Steuerdatei hat es sich bewährt, an der Stelle der „großen“ SPOTs mehrere identische Sequenzen zu definieren. Das führt zur Mehrfachpipettierung kleiner Volumina an derselben Stelle und damit zu größeren SPOTs.
• Zur Dokumentation der Synthese hat sich die Aufnahme von Lichtbildern mit einer Digitalkamera nach den Schritten A) und C) bewährt.
• Niederschläge aus Diisopropylharnstoff, die bei der Aktivierung von Aminosäuren (Linker, Monomere) auftreten, werden zusätzlich zur Zentrifugation durch Filtration (Spritzenfilter aus PTFE, 0.45 µm) abgetrennt, um einen Verschluß der Nadeln zu vermeiden.
• Die Vorratsgefäße für Aminlösungen werden erst direkt vor der Synthese geöffnet, um eine Verflüchtigung von Lösungsmittel und Reagenzien zu vermindern.
• Alle Reagenzien müssen vor jedem Synthesecyclus frisch bereitgestellt werden, da die Gefäße während der Synthese geöffnet sind und flüchtige Bestandteile langsam verdampfen. Es hat sich bewährt, die Reagenzien für jeden Schritt vor Beginn der gesamten Synthese in entsprechende Gefäße abzufüllen und bei 4°C zu lagern. Vor den einzelnen Cyclen wird der benötigte Satz an Reagenzien entnommen. Monomere werden unter Beachtung der Voraktivierungszeit erst kurz vor der Synthese aktiviert.

143

AAV 14:Manuelle SPOT-Synthese von Hydantoinen vom Typ 143

A.) Einführung des Isocyanats (R¹-NCO)

Zur Vorbereitung der Acylierung mit einem Alky- oder Arylisocyanat wird die Membran mit Benzylimidazol behandelt (3 M in DMF, einfache Pipettierung). Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird das Isocyanat gekoppelt (1 M in NMP, Doppelkopplung, 2 x 15 min). Die Membran wird gewaschen (DMF, 5 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; Et₂O, 1 x 2 min) und an der Luft getrocknet.

B.) Fortsetzung der Synthese

Bei Verwendung bifunktioneller Isocyanate wie 119 oder 120 kann die Oligomeren-Synthese in Abhängigkeit von der Art des Isocyanats fortgesetzt werden.

C.) Cyclisierung zusammen mit der Seitenkettenschutzgruppen-Abspaltung in Abhängigkeit vom verwendeten Linker

161 und 48: Zur Cyclisierung und Seitenkettenschutzgruppen-Abspaltung wird die Membran bei 60°C mit TFA behandelt (95% in H₂O, 1 x 20 min). Dazu wird die Membran mit der Lösung in einer Instrumentenschale auf einer elektrischen Heizmatte erwärmt. Man läßt die Lösung abkühlen, wäscht die Membran [CH₂Cl₂, 2 x 5 min; DMF, 1 x 2 min; Et₃N (2 Vol-% in DMF), 1 x 2 min; DMF, 2 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; Et₂O, 1 x 2 min] und läßt an der Luft trocknen. Membranen mit dem Linker 161 sind nun bereit für Festphasen-Bindungsstudien. Vom Photo-Linker 48 werden die Substanzen durch Belichtung der trockenen Membran mit UV-Licht (Vilber Lourmat TFX 20 LC, Einstellung 365 nm, 100%, 60 min je Seite) abgespalten. Die SPOTs werden ausgestanzt und können in einem geeigneten Lösungsmittel abgelöst zu Assays in Lösung eingesetzt oder analysiert (HPLC, HPLC-MS) werden. Die Abspaltung ist nur bei Derivatisierungsgraden < 150 nmol/cm² vollständig. Bei höheren Derivatisierungsgraden verhindert die UV-Absorption des Photolyseproduktes die vollständige Spaltung.

144

Bemerkung:

Anstelle von -Aminosäureamiden können auch -Aminosäure-tert-butylester in der vorangegengenen Peptoidsynthese eingesetzt werden (vergl. Tab. 23 , Seite 109).

9.3.2 Spezielle Synthesen

Optimierung der Membranderivatisierung (Abschnitt 3.1 )

Nach AAV 7 wurde eine Zellulosemembran (5 x 15 cm) derivatisiert (0.13-facher Ansatz). Vor und nach der Alkylierung mit Epibromhydrin sowie nach der Behandlung mit Ammoniak wurde die Membran bei 0.1 mbar für 1 Stunde getrocknet und direkt im Anschluß gewogen. Es wurden folgende Auswaagen und Massendifferenzen bestimmt:

	Auswaage [mg]	Differenz zur underivatisierten Membran [mg]	berechnete Derivatisierung* [µmol/cm2]
Vor der Alkylierung	707.0	= 0	= 0
Nach der Alkylierung	722.3	15.3	1.49
Nach der Behandlung mit Ammoniak	716.5	9.5	1.39

*: Unter der Annahme eines Reaktionsverlaufes wie in Schema 8 -A, Seite 24. [M(36/Zellulose)=137.0 g/mol; M(9/Zellulose)=91.1 g/mol].

Der nach AAV 6 -A bestimmte Derivatisierungsgrad betrug 122 nmol/cm².

Zu Abb. 10 , Seite 26:

Um den Einfluß der Epoxidkonzentration und der Reaktionszeit auf den Derivatisierungsgrad bei der Generierung von aminofunktionalisierten Membranen 38 zu bestimmen, wurden sechs Zellulosemembranen (7 x 10 cm) nach AAV 8 (Hochbeladungsprotokoll, jeweils 0.12-facher Ansatz) abweichend unter Anwendung der folgenden Bedingungen derivatisiert:

Membranen 1-3: 1.2 M Epibromhydrin, Alkylierungszeiten: 1 h (Membran 1), 3 h (Membran 2) und 20 h (Membran 3).

Membranen 4-6: 6.0 M Epibromhydrin, Alkylierungszeiten: 1 h (Membran 4), 3 h (Membran 5) und 20 h (Membran 6).

145

Membran Nr.	1	2	3	4	5	6
Derivatisierungsgrad [µmol/cm2]	0.63	1.10	2.12	1.77	2.09	2.17

Zu Abb. 11 , Seite 27:

Um den Einfluß der Diaminkonzentration und der Reaktionszeit auf den Derivatisierungsgrad bei der Generierung von aminofunktionalisierten Membranen 38 zu bestimmen, wurden neun Zellulosemembranen (1 x 1 cm) nach AAV 8 (Hochbeladungsprotokoll, jeweils 0.002-facher Ansatz) abweichend unter Anwendung der folgenden Bedingungen derivatisiert:

Membranen 1-3: 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin (37): 0.45 M in DMF, 25°C, für 1 h (Membran 1), 3 h (Membran 2) und 18 h (Membran 3).

Membranen 4-6: 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin (37): 0.90 M in DMF, 25°C, für 1 h (Membran 4), 3 h (Membran 5) und 18 h (Membran 6).

Membranen 7-9: 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin (37): 2.3 M in DMF, 25°C, für 1 h (Membran 7), 3 h (Membran 8) und 18 h (Membran 9).

Es wurden folgende Derivatisierungsgrade bestimmt (graphische Auftragung vergl. Abb. 11 , Seite 27):

Membran Nr.	1	2	3	4	5	6	7	8	9
Derivatisierungsgrad [µmol/cm2]	0.17	0.32	0.97	0.22	0.39	1.20	0.27	0.52	1.36

Zu Tab. 5 , Seite 27:

Um den Einfluß der Temperatur und der Reaktionszeit auf den Derivatisierungsgrad bei der Generierung von aminofunktionalisierten Membranen 38 zu bestimmen, wurden sechs Zellulosemembranen (1 x 1 cm) nach AAV 8 (Hochbeladungsprotokoll, jeweils 0.002-facher Ansatz) abweichend unter Anwendung der folgenden Bedingungen derivatisiert:

In allen Fällen erfolgte die Alkylierung mit 2.4 M Epibromhydrin (1 h).

Membranen 1-3: 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin (37): 0.90 M in DMF, 80°C, für 1 h (Membran 1), 3 h (Membran 2) und 5 h (Membran 3).

146

Membran 6 (Vergleichswert): 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin (37): 0.90 M in DMF, 25°C, 44 h.

Es wurden die in Tab. 5 , Seite 27 tabellierten Derivatisierungsgrade bestimmt .

Zu Abb. 12 , Seite 28:

Um den Einfluß der Diaminkonzentration und der Reaktionszeit auf den Derivatisierungsgrad bei erhöhter Temperatur zu bestimmen, wurden sieben Zellulosemembranen (1 x 1 cm) nach AAV 8 (Hochbeladungsprotokoll, jeweils 0.002-facher Ansatz) abweichend unter Anwendung der folgenden Bedingungen derivatisiert:

In allen Fällen erfolgte die Alkylierung mit 2.4 M Epibromhydrin (3 h).

Membranen 1-3: 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin (37): 80°C, 0.90 M in DMF (Membran 1), 2.3 M in DMF (Membran 2) und 4.6 M (pur) (Membran 3), je 1 h.

Membranen 4-6: 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin (37): Mikrowellenbestrahlung: 810 W Mikrowellenleistung, 0.90 M in DMF (Membran 4), 2.3 M in DMF (Membran 5) und 4.6 M (pur) (Membran 6), je 3 min.

Membran 7 (Vergleichswert): 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin (37): 2.3 M in DMF, 25°C, 44 h.

Es wurden folgende Derivatisierungsgrade bestimmt (graphische Auftragung vergl. Abb. 12 , Seite 28):

Membran Nr.	1	2	3	4	5	6	7
Derivatisierungsgrad [µmol/cm2]	0.56	0.86	1.14	0.80	0.93	1.01	2.31

[]

Optimierung der Kopplung des Rink-Linkers (Abschnitt 3.2.2 )

Um eine effiziente Aktivierungsmethode zur Kopplung des Rink-Linkers 47 an Zellulose zu untersuchen, wurden fünf verschiedene Acylierungslösungen auf 15 SPOTs einer nach AAV 8 (Niedrigbeladungsprotokoll) aminoderivatisierten Zellulosemembran 38 angewendet (jeweils Dreifachbestimmungen):

1) 47 (0.5 M), TBTU (0.5 M), DIEA (1 M); 2) 47, TBTU, DIEA (jeweils 0.5 M); 3) 47, DIC (jeweils 0.5 M); 4) 47, DIC, Pentafluorphenol (jeweils 0.5 M nach AAV 9 ); 5) Kontrolle: Fmoc-Ala-OPfp (0.6 M).

147

Spaltung des Photo-Linkers 48 unter Verwendung hoher Lichtenergien (Abschnitt 3.2.2 )

Tab. 25: Abspaltungsausbeuten und Produktreinheiten bei der lösungsmittelfreien, trockenen Photolyse zweier Zellulosemembranen 38, die das Tripeptoid 16 am Photo-Linker trugen.

Nr.	DG1)	Belichtungszeit (beidseitig)	UV-Lampe2)	Ausbeute3) [%]	Reinheit4) [%]
1	193	2 x 60 min	A	56	82
2	193	2 x 1 min	B	57	91
3	193	2 x 2 min	B	57	91
4	193	2 x 3 min	B	62	94
5	193	2 x 5 min	B	58	93
6	193	2 x 10 min	B	49	91
7	2086	2 x 60 min	A	21	86
8	2086	2 x 1 min	B	17	94
9	2086	2 x 2 min	B	22	92
10	2086	2 x 3 min	B	23	91
11	2086	2 x 5 min	B	26	90
12	2086	2 x 10 min	B	30	86

¹⁾ DG = Derivatisierungsgrad [nmol/cm²] nach Quantifizierung der Fmoc-Gruppe des Photo-Linkers nach AAV 6 -B; ²⁾ A: UV-Lampe Vilber Lourmat; B: UV-Lampe Beltron; ³⁾: Basierend auf einem Vergleich der erhaltenen Menge 16 (bestimmt durch quantitative Auswertung der UV-Absorption) mit dem Derivatisierungsgrad (DG); ⁴⁾ HPLC, 220 nm.

148

Synthesen von Tripeptoiden (Abschnitt 3.3 )

Optimierung des Acylierungsmittels

Tab. 6 , Seite 41:

Das Tripeptoid 16 wurde mit den Aminen n-Butylamin, Benzylamin und Piperidin (jeweils 5 M in NMP) nach AAV 12 am Rink-Linker synthetisiert. Abweichend von der allgemeinen Arbeitsvorschrift wurden die Bromsubstitutionsschritte nicht durch Pipettieren der Reagenzien, sondern durch Inkubieren (Tränken) der gesamten Membran mit den jeweiligen Aminlösungen durchgeführt (1 x 30 min). Im zweiten Acylierungsschritt wurden die Acylierungsbedingungen gemäß Tab. 6 variiert. HPLC-MS-analytisch wurden jeweils 20% des Rohproduktes eines SPOTs (0.23 cm²) untersucht (Injektionsmenge: 10 µl). Folgende Produkte wurden beobachtet, identifiziert und quantitativ (UV-Absorption) ausgewertet:

16: Beobachtete Daten sind konsistent mit dem Syntheseprodukt der Synthese am Polystyrol-Harz (vergl. Abschnitt 9.2.2 , Seite 130).

60: RT = 9.8; ber. (M+H⁺): 278.19; gef.: 278.1 (100), 233.1 (80), 143.2 (30), 91.1 (20); (vergl. Abb. 17 , Seite 42).

61: RT = 4.7; ber. (M+H⁺): 256.20; gef.: 256.1 (30%), 197.2 (10), 98.1 (100); (vergl. Abb. 17 , Seite 42).

Tab. 7 , Seite 47:

Das Tripeptoid 17 wurde mit den Aminen n-Butylamin, Ethanolamin und Piperidin (jeweils 5 M in NMP) nach AAV 12 am Rink-Linker synthetisiert. Abweichend von der allgemeinen Arbeitsvorschrift wurden die Bromsubstitutionsschritte nicht durch Pipettieren der Reagenzien, sondern durch Inkubieren (Tränken) der gesamten Membran mit den jeweiligen Aminlösungen durchgeführt (1 x 30 min). Im zweiten Acylierungsschritt wurden die Acylierungsbedingungen gemäß Tab. 7 variiert. HPLC-MS-analytisch wurden jeweils 20% des Rohproduktes eines SPOTs (0.23 cm²) untersucht (Injektionsmenge: 10 µl). Die Reaktionsprodukte 17 und 18 wurden beobachtet, identifiziert und quantitativ (UV-Absorption) ausgewertet (Die Daten waren konsistent mit den Produkten der Synthese am Harz: vergl. Abschnitt 9.2.2.2 , Seite 130 (17) und Abschnitt 9.2.2.3 , Seite 131 (18).

149

Optimierung des Lösungsmittels

Tab. 9 , Seite 52:

Das Tripeptoid 16 wurde mit den Aminen n-Butylamin, Benzylamin und Piperidin (jeweils 5 M) nach AAV 12 am Rink-Linker synthetisiert. Abweichend von der allgemeinen Arbeitsvorschrift wurden alle Bromsubstitutionsschritte in den in Tab. 9 angegebenen Lösungsmitteln mit und ohne Zusatz von Iodid (0.05 M) durchgeführt. HPLC-MS-analytisch wurden jeweils 20% des Rohproduktes eines SPOTs (0.23 cm²) untersucht (Injektionsmenge: 10 µl). Die analytischen Daten waren konsistent mit dem Produkt der Synthese am Polystyrolharz: vergl. Abschnitt 9.2.2 , Seite 130.

Optimierung der Amin-Konzentration

Abb. 20 , Seite 53:

Das Tripeptoid 16 wurde mit den Aminen n-Butylamin, Benzylamin und Piperidin (in NMP) nach AAV 12 am Rink-Linker synthetisiert. Abweichend von der allgemeinen Arbeitsvorschrift wurden alle Bromsubstitutionsschritte mit den in Abb. 20 angegebenen Amin-Konzentrationen durchgeführt. HPLC-MS-analytisch wurden jeweils 20% des Rohproduktes eines SPOTs (0.23 cm²) untersucht (Injektionsmenge: 10 µl). Die analytischen Daten waren konsistent mit dem Syntheseprodukt der Synthese am Polystyrolharz: vergl. Abschnitt 9.2.2 .

Untersuchung der Anwendbarkeit verschiedener Amine

Die Tripeptoide 19 wurden mit den Aminen n-Butylamin (C-terminal) und Piperidin (N-terminal; jeweils 5 M in NMP) nach AAV 12 an Rink- oder Photo-Linker synthetisiert. In der mittleren Position wurden die in den jeweiligen Tabellen angegebenen Amine eingesetzt. HPLC-MS-analytisch wurden jeweils 20% des Rohproduktes eines SPOTs (0.23 cm²) untersucht (Injektionsmenge: 10 µl). Im folgenden sind die analytischen Daten der Tripeptoide 19 sowie ggf. beobachteter Nebenprodukte aufgeführt (Die Nummern entsprechen den jeweiligen Tabelleneinträgen):

Tab. 10 , Seite 58 (Aminflüchtigkeit):

Nr. 1: Amin: Ammoniak (+ 0.05% Tween^® 20); RT = 6.6; ber. (M+H⁺): 313.23; gef.: 313.3 (40%), 98.1 (40); verunreinigt mit einer unidentifizierten Substanz: 329.2 (100), 341.3 (30), 357.2 (30).

Nr. 2: Amin: Methylamin (+ 0.05% Tween^® 20); RT = 6.7; ber. (M+H⁺): 327.24; gef.: 327.2 (100), 197.0 (5%), 98.1 (20).

Nr. 3: Amin: Ethylamin (+ 0.05% Tween^® 20); RT = 7.7; ber. (M+H⁺): 341.26; gef.: 341.2 (100), 211.1 (10), 98.2 (30).

Nr. 4: Amin: Allylamin; RT = 8.4; ber. (M+H⁺): 353.26; gef.: 375.2 (30, M+Na⁺), 353.1 (50, M+H⁺), 268.1 (10), 223.0 (10), 98.2 (100).

150

Tab. 11 , Seite 60 (sterische Faktoren):

Nr. 1: Amin: 3,3-Diphenylpropylamin; RT = 14.8; ber. (M+H⁺): 507.34; gef.: 507.3 (100), 377.4 (10), 98.2 (10).

Nr. 2a: Amin: Benzylamin (entspricht Tripeptoid 16. Daten konsistent mit dem Syntheseprodukt der Synthese am Polystyrolharz: vergl. Abschnitt 9.2.2 , Seite 130).

Nr. 2b: Amin: 1-Naphthylmethylamin; RT = 12.9; ber. (M+H⁺): 453.29; gef.: 453.2 (100), 323.1 (10), 141.2 (10), 98.2 (10).

Nr. 3: Amin: (+)-Dehydroabietylamin; RT = 19.5; ber. (M+H⁺): 581.45; gef.: 581.5 (100); Dimer 72: RT = 18.2; ber. (M+H⁺): 456.36; gef.: 456.4 (100), 131.2 (10).

Nr. 4: Amin: rac-1-Aminoindan; RT = 11.8; ber. (M+H⁺): 429.29; gef.: 429.0 (100), 313.1 (60), 183.0 (10), 117.2 (10), 98.2 (10).

Nr. 5: Amin: Cyclohexylamin; RT = 10.8; ber. (M+H⁺): 395.30; gef.: 395.3 (100), 265.2 (10), 98.2 (60); Dimer 72: RT = 8.8; ber. (M+H⁺): 270.22; gef.: 270.2 (100), 171.1 (10), 131.1 (30), 112.2 (10).

Nr. 6: Amin: rac-2-Aminoproionaldehyd-dimethylacetal; RT = 7.3; ber. (M+H⁺): 369.25; gef.: 369.1 (100), 258.1 (10), 98.2 (40); Dimer 72: RT = 3.0; ber. (M+H⁺): 244.17; gef.: 244.0 (100), 227.0 (40), 131.0 (40).

Nr. 7: Amin: Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan; RT = 4.9; ber. (M+H⁺): 417.27; gef.: 439.1 (20, M+Na⁺), 417.0 (20, M+H⁺), 399.1 (40), 274.0 (100), 200.0 (20), 183.0 (20), 171.0 (20), 98.2 (30); Dimer 72: RT = 2.6; ber. (M+H⁺): 292.19; gef.: 292.0 (100), 171.0 (10), 134.0 (50), 131.1 (40).

Nr. 8: Amin: 1-Adamantylamin; Dimer 72: RT = 10.8; ber. (M+H⁺): 322.25; gef.: 322.3 (100), 164.2 (10), 135.2 (40), 98.2 (20); verunreinigt mit einer unbekannten Substanz gleicher RT: 395.2 (40).

Tab. 12 , Seite 62 (Nukleophilie):

Dimer 71 (für alle Einträge): RT = 4.5-5.7; ber. (M+H⁺): 256.20; gef.: 256.1 (30%), 98.1 (100).

Nr. 1: Amin: Hydroxylamin (+ 0.05% Tween^® 20); RT = 6.3; ber. (M+H⁺): 329.22; gef.: 329.2 (100), 98.1 (90).

Nr. 2a: Amin: Hydrazinoameisensäure-tert-butylester (vor dem Versuch frisch gelöst); RT = 6.1; ber. (M+H⁺): 328.24; gef.: 350.1 (100, M+Na⁺), 328.1 (100, M+H⁺), 98.2 (70).

Nr. 2b: Amin: Hydrazinoameisensäuremethylester (+ 0.05% Tween^® 20); RT = 7.6; ber. (M+H⁺): 386.24; gef.: 408.0 (20, M+Na⁺), 386.1 (100, M+H⁺), 354.1 (10), 98.1 (40).

151

Nr. 4a: Amin: 4-Aminophenol; RT = 8.9; ber. (M+H⁺): 405.25; gef.: 427.2 (10, M+Na⁺), 405.1 (100, M+H⁺), 274.9 (10), 98.2 (30).

Nr. 4b: Amin: 3-Aminophenol; RT = 9.3; ber. (M+H⁺): 405.25; gef.: 405.2 (100), 240.4 (10), 98.1 (50); Dimer 72 als Diketopiperazin 80: RT = 9.6; ber. (M+H⁺): 263.14; gef.: 263.3 (100), 240.3 (40); verunreinigt mit einer unbekannten Substanz gleicher RT: 420.3 (30), 398.4 (40), 98.2 (60).

Nr. 4c: Amin: 2-Aminophenol; RT = 10.3; ber. (M+H⁺): 405.25; gef.: 427.2 (50, M+Na⁺), 405.2 (100, M+H⁺), 387.3 (20), 263.3 (20), 98.1 (50); Dimer 72: RT = 9.2; ber. (M+H⁺): 280.17; gef.: 280.0 (100), 263.1 (30), 131.1 (40), 122.1 (80); Dimer 72 als Diketopiperazin 80: RT = 9.4; ber. (M+H⁺): 263.14; gef.: 303.9 (20, M+CH₃CN+H⁺), 263.3 (100, M+H⁺), 240.3 (10), 122.2 (40); 4H-Benzo[1,4]oxazin-3-one 79: RT = 11.5; ber. (M+H⁺): 320.16; gef.: 319.9 (30, M+H⁺), 303.1 (100, M+H⁺-NH₃), 190.0 (60), 162.1 (80), 134.2 (30).

Nr. 4d: Amin: p-Anisidin; RT = 10.3; ber. (M+H⁺): 419.27; gef.: 441.3 (10, M+Na⁺), 419.2 (100, M+H⁺), 289.1 (10), 98.1 (50).

Nr. 4e: Amin: Anilin; RT = 9.8; ber. (M+H⁺): 389.26; gef.: 411.2 (20, M+Na⁺), 389.2 (60, M+H⁺), 259.1 (10), 98.1 (100); Dimer 72 als Diketopiperazin 80: RT = 10.9; ber. (M+H⁺): 247.15; gef.: 287.6 (50, M+CH₃CN+H⁺), 247.2 (100, M+H⁺), 106.1 (20).

Nr. 4f: Amin: 3-Fluoranilin; RT = 10.5; ber. (M+H⁺): 407.25; gef.: 429.2 (10, M+Na⁺), 407.1 (100, M+H⁺), 369.4 (10), 247.3 (10), 98.2 (20); Dimer 72 als Diketopiperazin 80: RT = 11.8; ber. (M+H⁺): 265.14; gef.: 305.5 (80, M+CH₃CN+H⁺), 265.1 (100, M+H⁺).

Nr. 5a: Amin: 2-Aminothiazol; RT = 8.3; ber. (M+H⁺): 396.21; gef.: 396.2 (90%), 353.4 (10), 244.3 (10), 98.1 (100).

Nr. 5b: Amin: 2-Amino-1,3,4-thiadiazol; RT = 8.2; ber. (M+H⁺): 397.20; gef.: 397.2 (70%), 98.1 (100).

Nr. 6: Amin: 2-Aminopyridin; RT = 7.8; ber. (M+H⁺): 390.25; gef.: 390.2 (100), 343.2 (10), 307.2 (20), 265.2 (10), 135.2 (10), 98.2 (20), 79.1 (30); Dimer 72: RT = 5.6; ber. (M+H⁺): 265.17; gef.: 265.1 (100), 135.1 (90), 107.2 (10).

Tab. 13 , Seite 66 (Funktionelle Gruppen):

Nr. 1a: Amin: Glycin-tert-butylester (aus dem Acetat mit 0.9 Äq. NaOH + 0.05% Tween^® 20); RT = 6.5; ber. (M+H⁺): 371.23; gef.: 371.2 (100), 98.2 (20).

Nr. 1b: Amin: -Alanin-tert-butylester (aus dem Hydrochlorid mit 0.9 Äq. NaOH + 0.05% Tween^® 20); RT = 6.8; ber. (M+H⁺): 385.25; gef.: 385.2 (100), 255.1 (10), 98.2 (20).

152

Nr. 1d: Amin: -Alaninamid (aus dem Hydrochlorid mit 0.9 Äq. NaOH + 0.05% Tween^® 20); RT = 6.1; ber. (M+H⁺): 384.26; gef.: 384.2 (100), 254.2 (10), 98.2 (20).

Nr. 2: Amin: 1-(3-Aminopropyl)-2-pyrrolidinon; RT = 8.3; ber. (M+H⁺): 438.31; gef.: 438.1 (100), 308.1 (10), 98.2 (30).

Nr. 3a: Amin: N-Boc-1.2-diaminoethan; RT = 4.8; ber. (M+H⁺): 356.27; gef.: 378.2 (20, M+Na⁺), 356.1 (100, M+H⁺), 338.2 (30), 198.1 (10), 98.2 (60).

Nr. 3b: Amin: N-(2-Aminoethyl)acetamid; RT = 6.8; ber. (M+H⁺): 398.28; gef.: 398.1 (100), 98.1 (70); verunreinigt mit einer unbekannten Substanz gleicher RT: 481.1 (30).

Nr. 3c: Amin: Agmantin (aus dem Sulfat mit 0.25 Äq. NaOH + 0.05% Tween^® 20); RT = 6.8; ber. (M+H⁺): 426.32; gef.: 426.2 (100), 301.2 (10), 98.2 (10); Seitenkettenacyliertes Produkt: RT = 7.9; ber. (M+H⁺): 551.41; gef.: 551.3 (30%), 509.3 (60), 426.2 (100), 379.3 (10), 98.2 (30).

Nr. 3d: Amin: 2-Aminoethylhydrogensulfat (mit 1.0 Äq. NaOH + 0.05% Tween^® 20); RT = 5.0; ber. (M-H⁺): 435.19; gef. (Ionisierung im Anionenmodus): 435.2 (100), 385.0 (10), 113.0 (10), 69.1 (20).

Nr. 3e: Amin: 2-Aminoethyldihydrogenphosphat (mit 1.5 Äq. NaOH + 0.05% Tween^® 20); RT = 3.6; ber. (M-H⁺): 435.20; gef. (Ionisierung im Anionenmodus): 435.1 (100), 384.9 (70), 291.0 (20), 113.0 (30), 69.1 (50).

Nr. 3f: Amin: 2-Tritylthioethylamin (Synthese vergl. Abschnitt 9.1.1.1.1.5 ); RT = 8.8; ber. (M+H⁺): 373.23; gef.: 395.1 (40, M+Na⁺), 373.0 (100, M+H⁺), 355.1 (10), 288.1 (10), 98.2 (80); Disulfid: RT = 10.8; ber. (M+H⁺): 743.43; gef.: 743.2 (100), 725.2 (30), 373.1 (70).

Nr. 3g: Amin: 3-Tritylthiopropylamin (Synthese vergl. Abschnitt 9.1.1.1.1.6 ); RT = 9.5; ber. (M+H⁺): 387.25; gef.: 409.1 (10, M+Na⁺), 387.1 (100, M+H⁺), 302.0 (10), 257.0 (10), 98.1 (60); Disulfid: RT = 11.7; ber. (M+H⁺): 771.46; gef.: 771.3 (70), 458.0 (100), 409.0 (20), 387.0 (20).

Nr. 4a: Amin: Ethanolamin (entspricht Tripeptoid 17. Daten konsistent mit dem Syntheseprodukt der Synthese am Polystyrolharz: vergl. Abschnitt 9.2.2.2 , Seite 130).

Nr. 4b: Amin: (R)-1-Amino-2-propanol; RT = 7.12; ber. (M+H⁺): 371.27; gef.: 393.1 (10, M+Na⁺), 371.1 (100, M+H⁺), 241.1 (10), 98.2 (40).

Nr. 5: Amin: 4-Hydroxybenzylamin (Synthese aus 4-Hydroxybenzonitril nach Lit.^{[ 193 ]}); RT = 9.1; ber. (M+H⁺): 419.27; gef.: 419.1 (100), 313.0 (30), 183.0 (10), 98.2 (30).

153

Nr. 7: Amin: 3-Aminopropionitril; RT = 7.4; ber. (M+H⁺): 366.25; gef.: 366.1 (100), 281.2 (10), 236.1 (10), 98.2 (40).

Nr. 8: Amin: Histamin; RT = 6.3; ber. (M+H⁺): 407.28; gef.: 407.1 (100), 294.1 (20), 277.1 (10), 98.1 (60); verunreinigt mit einer unbekannten Substanz gleicher RT: 465.1 (30); bicyclisches Nebenprodukt 87: RT = 4.4; ber. (M+H⁺): 322.19; gef.: 322.1 (100), 192.0 (30), 164.0 (20).

Nr. 9: Amin: Tryptamin; RT = 11.8; ber. (M+H⁺): 456.30; gef.: 456.2 (100), 326.2 (10), 282.3 (10), 98.2 (10).

Schema 16 , Seite 64 (Versuch der Synthese von 81):

Mit den Aminen n-Butylamin (C-terminal, 5 M in NMP) und 4-Aminophenol (N-terminal, 1 M in NMP) wurde das entsprechende Dipeptoid 4-Hydroxyphenyl-73 nach AAV 12 am Rink-Linker synthetisiert. Nach der Einführung des letzten Aminbausteins wurde die Synthese des des trimeren Peptomers 81 nach AAV 12 (Monomermethode) mit Fmoc-L-Pro-OH versucht. HPLC-MS-analytisch wurde 20% des Rohproduktes des SPOTs (0.23 cm²) untersucht (Injektionsmenge: 10 µl). Das gewünschte Produkt ließ sich massenspektrometrisch nachweisen, die Reinheit lag nach HPLC unter 1%:

RT = 8.6; ber. (M+H⁺): 377.22; gef.: 377.0 (100), 358.1 (60); verunreinigt mit einer oder mehreren Substanzen gleicher RT: 500.2 (40); 478.2 (60).

Durch Verwendung von Piperidin als dritten Baustein nach AAV 12 wurde an der gleichen Membran das Tripeptoid 4-Hydroxyphenyl-19 in einer Reinheit von 80% erhalten (vergl. Tab. 12 , Eintrag 4a).

Synthesen von Peptoid-Bibliotheken (Abschnitt 4 )

Vorversuche

Tab. 15 , Seite 74 (Vergleich der Produktreinheiten an „großen“ und „kleinen“ SPOTs):

[„Große“ SPOTs: SPOT-Durchmesser: ca. 9 mm, Analysierte Fläche: 0.23 cm² aus der SPOT-Mitte; „kleine“ SPOTs: SPOT-Durchmesser: ca. 1.2 mm, Analysierte Fläche: 10 SPOTs mit identischer Tripeptoidsequenz und einer SPOTfläche von 0.01 cm² / SPOT.]

Die Tripeptoide 16, 90 und 91 wurden mit den Aminen n-Butylamin bzw. Furfurylamin (1. Baustein), Benzylamin bzw. Histamin (2. Baustein) und Piperidin bzw. Diethylamin (3. Baustein, alle Amine in NMP) nach AAV 13 am Rink-Linker synthetisiert. Der

154

16: Die analytischen Daten waren konsistent mit dem Syntheseprodukt der Synthese am Polystyrolharz: vergl. Abschnitt 9.2.2 , Seite 130.

90: Die analytischen Daten entsprechen dem Produkt Nr. 8 aus Tab. 13 (vergl. Seite 153).

91: RT = 10.2; ber. (M+H⁺): 415.24; gef.: 437.1 (20, M+Na⁺), 415.1 (100, M+H⁺), 261.0 (10), 86.1 (60).

Synthese der Peptoid-Bibliothek aus 8000 Tripeptoiden 96

Eine esterfrei aminoderivatisierte Zellulosemembran 9 ( AAV 7 , 19 x 28 cm, 500 nmol/cm²) wurde mit einer Lösung aus Fmoc-Gly-OH, TBTU und DIEA (je 15.0 mmol) in 50 ml DMF versetzt. Nach 30 Minuten wurde die Membran nacheinander mit den folgenden Lösungen behandelt: DMF (3 x 50 ml, je 5 min), Piperidin (20% in DMF, 50 ml, 1 x 20 min), DMF (5 x 50 ml, je 5 min) und Methanol (2 x 50 ml, je 5 min). Man ließ die Membran trocknen und wiederholte die Acylierung mit Glycin zweimal. Vor der Abspaltung der Fmoc-Gruppe des dritten Glycinbausteins mit Piperidin wurden drei SPOTs am Rand der Membran ausgestanzt und der Derivatisierungsgrad nach AAV 6 -B bestimmt (401 nmol/cm²). Die restliche Membran wurde wie in den vorangegangenen Schritten weiterbehandelt.

An dieser Membran 94 wurde eine Bibliothek aus allen 8000 Tripeptoiden, die durch Kombination von 20 Bausteinen möglich sind, nach AAV 13 synthetisiert. Zur SPOT-Definition wurde abweichend Fmoc-Gly-OPfp (0.3 M in DMSO) verwendet. Um die Synthesequalität zu überprüfen, wurde parallel zu jedem automatischen Pipettierschritt das Tripeptoid 16 an Rand der Membran aus den Aminen n-Butylamin, Benzylamin und Piperidin (jeweils 5 M in NMP) durch manuelle Synthese gemäß AAV 12 am Rink-Linker synthetisiert, der hier anstelle von Fmoc-Glycin zur SPOT-Definition verwendet wurde.

Die 20 Bausteine für die Synthese der Tripeptoid-Bibliothek sind im folgenden aufgezählt:

[Alle Bausteine wurden, wenn nicht anders angegeben, 50% (v/v) in NMP eingesetzt. Bei Bausteinen, die als Monomere gekennzeichnet sind, wurde zur Synthese des Bausteins eine Fmoc-Aminosäure eingesetzt. Diese wurde 0.6 M in NMP gelöst und mit 0.5 Äq. DIC aktiviert (Voraktivierungszeit: 30 min). Die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe erfolgte mit DBU (4% in NMP)]

B-01: Benzylamin; B-02: 2-Pyridin-2-yl-ethylamin; B-03: Cyclohexylmethylamin; B-04: n-Octylamin; B-05: Ethanolamin; B-06: Fmoc-Gly-OH (Monomer); B-07: rac-3-Amino-1,2-propandiol (30 Vol-% in NMP); B-08: Tryptamin (1.5 M in NMP); B-09: 2-Aminometylthiophen; B-10: Tyramin (1.0 M in NMP); B-11: Homoveratrylamin; B-12: Napht-1-ylmethylamin (30 Vol-% in NMP); B-13: Isobutylamin; B-14: Hydrazinoameisensäure-tert-butylester (2.0 M in NMP); B-15: Histamin (1.5 M in NMP); B-16: Fmoc-Sar-OH

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Analytische Daten der Kontrollverbindung:

16: Die analytischen Daten waren konsistent mit dem Syntheseprodukt der Synthese am Polystyrolharz: vergl. Abschnitt 9.2.2 , Seite 130.

Synthese der Peptoid-Bibliothek aus 8000 Hexapeptoiden

Eine Bibliothek aus 8000 Hexapeptoiden, deren Sequenzen zufällig auf der Basis von 40 Bausteinen ausgewählt wurden (Programm LISA), wurde an einer aminoderivatisierten Zellulosemembran 38 [ AAV 8 , 19 x 28 cm, Niedrigbeladungsprotokoll (abweichend wurde das Diamin 37 2 h angewendet), 501 nmol/cm²] nach AAV 13 synthetisiert. Dazu wurde Fmoc-Ala-OPfp (0.3 M in DMSO) zur SPOT-Definition verwendet. Um die Synthesequalität zu überprüfen, wurden am Rand der Membran ein Tripeptoid sowie acht Hexapeptoide synthetisiert (Sequenzen vergl. Tab. 18 , Seite 85), indem man die Reagenzien an dieser Stelle 45-Mal pipettieren ließ, so daß SPOTs von ausreichender Größe für die Analyse entstanden. Letztere Vebindungen wurden am Rink-Linker synthetisiert, der hier anstelle von Fmoc--Alanin zur SPOT-Definition verwendet wurde. Zusätzlich wurden am Membranrand je zwei „große“ SPOTs mit Fmoc--Alanin bzw. Fmoc-Rink-Linker vorgesehen, die nach der SPOT-Definition ausgestanzt wurden, um den Derivatisierungsgrad nach AAV 6 -B zu bestimmen (-Alanin: 387 nmol/cm², Rink-Linker: 352 nmol/cm²). Als Ergänzung zur allgemeinen Synthesevorschrift wurden die Reagenziengefäße mit Aluminiumfolie verschlossen, um eine Verflüchtigung von Lösungsmitteln und Reagenzien zu minimieren. Eine Öffnung minimaler Größe wurde direkt vor Beginn des jeweiligen Synthesecyclus eingeführt.

Die 40 Bausteine für die Synthese der Hexapeptoid-Bibliothek sind im folgenden aufgezählt:

[Alle Bausteine wurden, wenn nicht anders angegeben, 50% (v/v) in NMP eingesetzt. Bei Bausteinen, die als Monomere gekennzeichnet sind, wurde zur Synthese des Bausteins eine Fmoc-Aminosäure eingesetzt. Diese wurde 0.6 M in NMP gelöst und mit 0.5 Äq. DIC aktiviert (Voraktivierungszeit: 30 min). Die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe erfolgte mit DBU (4% in NMP)]

Bausteine B-01 - B-20: siehe Tripeptoid-Bibliothek.

B-21: Glycinamid (5.0 M in H₂O aus dem Hydrochlorid mit 0.9 Äq. NaOH + 0.05% Tween^® 20); B-22: Glycin-tert-butylester (2.5 M in H₂O aus dem Acetat mit 0.9 Äq. NaOH + 0.05% Tween^® 20); B-23: 2-Amino-1,3-propandiol (3 M in NMP); B-24: N-Boc-1,2-diaminoethan; B-25: 3-Amino-1-propanol; B-26: N-Boc-1,3-diaminopropan; B-27: rac-2-Amino-1-propanol; B-28: Nicotinsäurehydrazid (0.75 M in NMP); B-29: 2-Methoxyethylamin; B-30: 2-Aminothiazol (1.5 M in NMP); B-31: Fmoc-L-Ala-OH (Monomer); B-32: Hydroxylamin (50% in H₂O + 0.05% Tween^® 20); B-33: Fmoc-L-Pro-OH (Monomer); B-34:

156

Analytische Daten der Kontrollverbindungen (vergl. Tab. 18 , Seite 85):

46-01-40 (16): Die analytischen Daten waren konsistent mit dem Syntheseprodukt der Synthese am Polystyrolharz: vergl. Abschnitt 9.2.2 , Seite 130.

46-01-40-20-01-40: RT = 14.6; ber. (M+H⁺): 791.48; gef.: 791.4 (100), 678.3 (10), 519.3 (10).

46-01-40-20-01-34: RT = 13.6; ber. (M+H⁺): 819.48; gef.: 819.4 (100), 706.4 (10), 547.3 (10).

33-29-27-13-19-10: RT = 9.6; ber. (M+H⁺): 764.42; gef.: 764.3 (100,), 667.3 (10), 552.2 (20), 437.1 (10); verunreinigt mit einer unbekannten Substanz gleicher RT: 800.3 (20).

33-38-24-21-20-29: RT = 3.2; ber. (M+H⁺): 685.40; gef.: 685.2 (100), 588.2 (10), 475.1 (10), 260.1 (40).

29-44-05-16-26-31: RT = 10.2; ber. (M+H⁺): 715.38; gef.: 715.2 (100), 644.2 (20), 600.2 (10), 340.9 (10).

14-36-36-16-33-03: (4 Diastereomere mit 2 RT) RT-1 (12%) = 12.9; ber. (M+H⁺): 765.43; gef.: 787.3 (30, M+Na⁺), 765.2 (100, M+H⁺), 747.2 (60), 717.3 (40), 516.2 (10), 339.2 (10), 268.1 (10); RT-2 (35%) = 14.0; ber. (M+H⁺): 765.43; gef.: 765.2 (100), 693.3 (20), 516.2 (20).

15-45-27-30-08-44: RT = 17.2; ber. (M+H⁺): 1100.48; gef.: 1122.3 (30, M+Na⁺), 1100.3 (100, M+H⁺), 733.1 (30), 609.2 (50), 339.2 (30).

23-25-22-03-28-13: RT = 10.1; ber. (M+H⁺): 822.44; gef.: 822.3 (10), 765.3 (50), 749.3 (30), 707.3 (20), 673.3 (10), 577.3 (10), 464.4 (10), 442.2 (20), 366.1 (20), 284.1 (100).

Synthesen von rückgratmodifizierten Peptoiden (Abschnitt 5 )

Das Trimer 20 wurden mit den Aminen n-Butylamin, Benzylamin und Piperidin (jeweils 5 M in NMP) nach AAV 12 am Rink-Linker synthetisiert. Abweichend von der allgemeinen Arbeitsvorschrift wurde im zweiten Acylierungsschritt anstelle von Bromessigsäure-2,4-dinitrophenylester zunächst eine tertiäre Base und nach 15 Minuten eine Lösung von 3-Chlormethylbenzoylchlorid (116) gemäß Tab. 26 eingesetzt. HPLC-MS-analytisch wurden jeweils 20% des Rohproduktes eines SPOTs (0.23 cm²) untersucht (Injektionsmenge: 10 µl). Die Reiheiten des Trimers 20 sowie des Dipeptoids 71 sind in Tab. 26 aufgeführt.

Tab. 26: Acylierungsbedingungen für den zweiten Acylierungsschritt bei der Synthese des
Trimers 20.

157 Nr.	Vorinkubation mit tertärer Base1)	3-Chlormethylbenzoyl-chlorid (116)2)	Reinheit 713) [%]	Reinheit 203) [%]
1	-	1 M in NMP + 1,2 Äq. DIEA4)	23	58
2	N-Benzylimidazol (124) (3 M in DMF)	1 M in NMP	3	84
3	Tris(3,6-dioxaheptyl)amin (125) (pur 3 M)	1 M in NMP	2	81
4	1,4-Diazabicyclo[2,2,2]octan (126) (1,5 M in DMF)	1 M in NMP	9	59

¹⁾ Einfach-Pipettierung; ²⁾ Zweifach-Pipettierung (2 x 15 min); ³⁾ HPLC, 220 nm; ⁴⁾ Eine rote Verfärbung der Lösung nach Basenzugabe deutete eine Zersetzung des Reagenzes an.

HPLC-MS:

Dimer 71: vergl. Daten zu Tab. 12 in Abschnitt 9.3.2 -„ Untersuchung der Anwendbarkeit verschiedener Amine “.

Trimer 20: RT = 12.5; ber. (M+H⁺): 479.30; gef.: 479.2 (100), 98.2 (10); Nebenprodukt 130: RT = 8.8; ber. (M+H⁺): 332.24; gef.: 332.1 (100), 315.1 (10), 202.0 (10), 119.0 (10).

Tab. 21 , Seite 97:

Die Trimeren 20 wurden mit den Aminen n-Butylamin, Benzylamin und Piperidin (jeweils 5 M in NMP) nach AAV 12 am Rink-Linker synthetisiert. Abweichend von der allgemeinen Arbeitsvorschrift wurden im zweiten Acylierungsschritt anstelle von Bromessigsäure-2,4-dinitrophenylester die in Tab. 21 angegebenen Acylierungsmittel eingesetzt (1 M in NMP). Zusätzlich ging der Acylierung in den angegebenen Fällen eine Pipettierung von Benzylimidazol (3 M in DMF, 1 x 15 min, 2.5 µl) voraus. HPLC-MS-analytisch wurden jeweils 20% des Rohproduktes eines SPOTs (0.23 cm²) untersucht (Injektionsmenge: 10 µl). Im folgenden sind die analytischen Daten der Trimeren 20 sowie ggf. beobachteter Nebenprodukte aufgeführt (Die Nummern entsprechen den jeweiligen Tabelleneinträgen):

Dimer 71 (für alle Einträge): vergl. Daten zu Tab. 12 in Abschnitt 9.3.2 -„ Untersuchung der Anwendbarkeit verschiedener Amine “.

Nr. 1: Acylierungsmittel: Bromessigsäure-2,4-dinitrophenylester (11). Identisch mit Tripeptoid 16: vergl. in Abschnitt 9.3.2 - 0 Optimierung des Acylierungsmittels .

158

Nr. 3: Acylierungsmittel: 3-Brompropionsäure (114). RT = 11.4; ber. (M+H⁺): 417.29; gef.: 439.2 (10, M+Na⁺), 417.1 (100, M+H⁺), 287.1 (10), 98.1 (30); Dimer 123: RT = 9.5; ber. (M+H⁺): 292.20; gef.: 292.1 (100), 156.0 (40), 120.0 (40), 98.2 (70), 91.2 (70); Nebenprodukt 129: RT = 6.5; ber. (M+H⁺): 270.22; gef.: 270.1 (10), 185.1 (10), 98.1 (100).

Nr. 4: Acylierungsmittel: Acrylsäure (115). RT = 11.3; ber. (M+H⁺): 417.29; gef.: 439.2 (10, M+Na⁺), 417.1 (100, M+H⁺), 287.1 (10), 98.1 (30); Dimer 123: RT = 9.5; ber. (M+H⁺): 292.20; gef.: 292.1 (80), 156.0 (30), 98.2 (100), 91.2 (70); Nebenprodukt 129: RT = 5.9; ber. (M+H⁺): 270.22; gef.: 270.1 (10), 185.1 (10), 98.1 (100).

Nr. 5a: Acylierungsmittel: 3-Chlormethylbenzoylchlorid (116). vergl. „ Vorversuche zur Auffindung einer geeigneten Base “, Seite 156.

Nr. 5b: Acylierungsmittel: 4-Chlormethylbenzoylchlorid (117). RT = 12.2; ber. (M+H⁺): 479.30; gef.: 479.1 (100), 98.2 (10); Nebenprodukt 130: RT = 8.4; ber. (M+H⁺): 332.24; gef.: 332.1 (100), 247.1 (10).

Nr. 6: Acylierungsmittel: 2-Bromethylchloroformiat (118). RT = 11.9; ber. (M+H⁺): 433.28; gef.: 433.1 (100), 259.2 (10), 191.9 (10), 98.2 (10).

Nr. 7a: Acylierungsmittel: 2-Chlormethylphenylisocyanat (119). RT = 12.4; ber. (M+H⁺): 494.32; gef.: 494.1 (100), 364.1 (10), 262.1 (10), 98.1 (10); Hydantoin 131: RT = 14.2; ber. (M+H⁺): 477.29; gef.: 477.2 (100), 245.2 (10), 98.2 (10); Dimer 123 (Harnstoff, 6%): RT = 11.6; ber. (M+H⁺): 369.23; gef.: 369.0 (20), 262.0 (100), 245.1 (60), 239.0 (30), 132.0 (40); Dimer 123 (cyclisiert zum Hydantoin, 1%): RT = 13.1; ber. (M+H⁺): 352.20; gef.: 352.0 (100), 245.1 (60), 132.2 (10).

Nr. 7b: Acylierungsmittel: 4-Chlormethylphenylisocyanat (120). RT = 12.9; ber. (M+H⁺): 494.32; gef.: 494.1 (100), 262.1 (10); Hydantoin 132 RT = 14.6; ber. (M+H⁺): 477.29; gef.: 477.1 (100), 245.2 (10), 98.2 (10); Dimer 123 (cyclisiert zum Hydantoin, 1%): RT = 12.4; ber. (M+H⁺): 352.20; gef.: 352.0 (100), 245.1 (50); Das Chromatogramm ist von einem breiten Signal im Bereich RT = 11-22 überlagert, das vermutlich von verunreinigtem Isocyanat verursacht wurde (Aspekt der Isocyanat-Lösung: gelb).

Nr. 8: Acylierungsmittel: 2-Bromethylisocyanat (121). RT = 11.1; ber. (M+H⁺): 432.30; gef.: 454.2 (30, M+Na⁺), 432.2 (100, M+H⁺), 302.1 (50), 201.1 (50), 183.1 (70), 98.2 (100%) (Anmerkung: das hier beschrieben Produkt wurde nur mittels Massendetektion nachgewiesen. Die Substanzmenge war zu gering, um eine messbare UV-Absorption zu zeigen.); Hydantoin 133: RT = 12.7; ber. (M+H⁺): 415.27; gef.: 437.2 (60, M+Na⁺), 415.2 (80, M+H⁺), 183.2 (10), 98.2 (100); 4,5-Dihydrooxazol 135: RT = 3.2; ber. (M+H⁺): 200.14; gef.: 200.1 (100), 183.1 (70), 155.0 (50), 113.1 (60), 99.1 (60).

159

Synthesen von Hydantoinen (Abschnitt 6 )

Die Hydantoine 149 wurden gemäß AAV 12 und AAV 14 synthetisiert. Nach AAV 12 wurde das zugrunde liegende membrangebundene Dipeptoid mit n-Butylamin (in NMP) und Glycinamid (in H₂O; beide Amine 5 M) an Rink- oder Photo-Linker synthetisiert. Abweichend von der allgemeinen Arbeitsvorschrift wurden die Bromsubstitutionsschritte nicht durch Pipettieren der Reagenzien, sondern durch Inkubieren (Tränken) der gesamten Membran mit den jeweiligen Aminlösungen durchgeführt (1 x 30 min). Direkt nach Pipettieren des letzten Aminbausteins und Waschen der Membran erfolgte die Fortsetzung der Synthese gemäß AAV 14 . Das Isocyanat wurde dazu gemäß Tab. 22 gewählt. Es wurden unterschiedliche Abspalt- und Cyclisierungsbedingungen gemäß Tab. 22 angewendet. HPLC-MS-analytisch wurden jeweils 20% des Rohproduktes eines SPOTs (0.23 cm²) untersucht (Injektionsmenge: 10 µl). Im folgenden sind die analytischen Daten der Reaktionsprodukte aufgeführt:

148a (R = Phenyl): RT = 9.9; ber. (M+H⁺): 364.20; gef.: 363.8 (60), 347.0 (50), 330.0 (20), 245.0 (100), 200.0 (70), 183.0 (60), 131.0 (30), 86.1 (10).

148b (R = n-Butyl): RT = 9.5; ber. (M+H⁺): 344.23; gef.: 366.1 (10, M+Na⁺), 343.9 (20, M+H⁺), 326.9 (30), 257.0 (10), 245.0 (100), 200.0 (60), 183.0 (50), 131.1 (20), 86.1 (10);

149a (R = Phenyl): RT = 10.6; ber. (M+H⁺): 347.17; gef.: 346.7 (40), 329.9 (100), 216.8 (30), 189.0 (20).

149b (R = n-Butyl): RT = 11.3; ber. (M+H⁺): 327.21; gef.: 349.1 (20, M+Na⁺), 326.9 (20, M+H⁺), 309.9 (100), 290.1 (10), 196.8 (20), 169.1 (20).

Tab. 23 , Seite 109 (Variation der Hydantoin-Substitutionen):

Die Hydantoine 154 wurden gemäß AAV 12 und AAV 14 synthetisiert. Nach AAV 12 wurde das zugrunde liegende membrangebundene Dipeptoid mit n-Butylamin (in NMP), und dem in Tab. 23 aufgeführten -Aminosäure-Derivat (in H₂O) an Rink-Linker modifizierter Membran synthetisiert. Direkt nach Pipettieren der letzten Aminbausteins und Waschen der Membran erfolgte die Fortsetzung der Synthese gemäß AAV 14 unter Verwendung von Phenylisocyanat. HPLC-MS-analytisch wurden jeweils 20% des Rohproduktes eines SPOTs (0.23 cm²) untersucht (Injektionsmenge: 10 µl). Im folgenden sind die analytischen Daten der Reaktionsprodukte aufgeführt:

Nr. 1: -Aminosäure-Derivat: Glycin-tert-butylester. Daten identisch mit 149a (R = Phenyl) vergl. „Optimierung der Cyclisierungsbedingungen“

Nr. 2: -Aminosäure-Derivat: L-Alaninamid. RT = 11.7; ber. (M+H⁺): 361.19; gef.: 360.8 (60), 343.9 (100), 290.0 (10), 230.8 (20), 203.0 (10); verunreinigt mit einer unbekannten Substanz gleicher RT: 448.0 (20).

Nr. 3: -Aminosäure-Derivat: L-Leucinamid. RT = 15.0; ber. (M+H⁺): 403.24; gef.: 402.8 (50), 385.9 (100), 272.8 (30), 244.9 (20), 189.0 (10).

160

Versuch der Synthese von Dihydropyrimidin-2,4-dionen 158:

Es wurde versucht, Dihydropyrimidin-2,4-dione 158 gemäß AAV 12 und AAV 14 zu synthetisieren. Nach AAV 12 wurde das zugrunde liegende membrangebundene Dipeptoid mit n-Butylamin (in NMP), und -Alaninamid (in H₂O) an Rink-Linker modifizierter Membran synthetisiert. Direkt nach Pipettieren des letzten Aminbausteins und Waschen der Membran erfolgte die Fortsetzung der Synthese gemäß AAV 14 unter Verwendung von Phenylisocyanat. HPLC-MS-analytisch wurde 20% des Rohproduktes eines SPOTs (0.23 cm²) untersucht (Injektionsmenge: 10 µl). Im folgenden sind die analytischen Daten der Reaktionsprodukte aufgeführt:

158: RT = 7.9; ber. (M+H⁺): 361.19; gef.: 361.1 (100), 344.1 (30), 302.0 (10), 290.1 (20).

159: RT = 6.2; ber. (M+H⁺): 248.11; gef.: 248.0 (30), 231.0 (100), 189.0 (90).

2-(2´,4´-Dioxo-3´-phenylimidazolidin-1´-yl)acetamid

Eine Zellulosemembran 38 (835 nmol/cm² nach AAV 8 , Hochbeladungsprotokoll) der Größe 5 x 5 cm wurde einer zusätzlichen Waschprozedur unterzogen [TFA (95% in H₂O), 1 x 20 min; CH₂Cl₂, 2 x 2 min; MeOH, 1 x 2 min; Et₃N (2 Vol-% in DMF), 2 x 2 min; H₂O, 2 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; Et₂O, 1 x 2 min]. Anschließend wurde die Membran mit einer nach AAV 9 aktivierten Lösung des Rink-Linkers 47 getränkt (0.50 ml, abweichend von AAV 9 : 0.5 M in DMF). Nach 30 Minuten wurde die Membran gewaschen (DMF, 4 x 2 min) und freie Aminogruppen durch Acetylierung blockiert [DMF/Ac₂O/DIEA 70:10:20 (v/v)], 2 x 15 min, DMF, 2 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; Et₂O, 1 x 2 min). Anhand von drei SPOTs wurde nach AAV 6 -B ein Derivatisierungsgrad von 581 nmol/cm² bestimmt. Die Membran wurde den Bedingungen einer Fmoc-Abspaltung unterzogen (Piperidin (20% in DMF), 2 x 10 min), gewaschen (DMF, 5 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; Et₂O, 1 x 2 min) und an der Luft getrocknet. Es folgte eine Inkubation mit einer Lösung von Bromessigsäure-2,4-dinitrophenylester (11, 0.50 ml, 1 M in NMP, 1 x 15 min) und nach Entfernen des Reagenzienüberschusses (DMF, 5 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; Et₂O, 1 x 2 min; Trocknen an der Luft) die Behandlung mit einer wäßrigen Glycinamidlösung (0.50 ml, 5 M aus 2.5 mmol Glycinamid-Hydrochlorid in 0.50 ml 4.8 M wässr. NaOH, Zusatz von 0.05% Tween^® 20, 1 x 20 min). Überschüsse wurden erneut entfernt (H₂O, 2 x 2 min; 0.5 M wäßrige NaOH, 1 x 1 min; H₂O, 5 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; Et₂O, 1 x 2 min) und die Membran an der Luft getrocknet. Die letzte Acylierung erfolgte durch Tränken der Membran mit einer Phenylisocyanat-Lösung (0.50 ml, 1 M in NMP, Zusatz von

161

HPLC-MS: RT = 4.9; ber. (M+H⁺): 234.09; gef.: 234.0 (80), 216.8 (40), 189.0 (100); (vergl. Abb. 30 , Seite 108).

¹H-NMR [500 MHz, [D₆]-DMSO, überlagert von 85 Mol% NH₄⁺CF₃COO^-: 7.13 (t, ¹J (H,N) = 51 Hz, 4H, NH₄⁺ und 7 Mol% Aceton: 2.07 (s, 6H)] = 3.95 (s, 2H, 2-H), 4.14 (s, 2H, 5´-H), 7.27 (br-s, 1H, CONH₂), 7.34-7.51 (m, 5H, Ar-H), 7.65 (br-s, 1H, CONH₂); (vergl. Abb. 31 , Seite 108).

¹³C-NMR [126 MHz, [D₆]-DMSO, Standard-Spektrum (kein APT)] = 45.0 (C-5´), 50.7 (C-2), 126.5, 127.8, 128.8 und 132.2 (Ar-C), 155.8 (C-2´), 169.4 und 169.5 (C-1 und C-4´).

(5´S)-N-Carbamoylmethyl-N-isobutyl-2-(5´-methyl-2´,4´-dioxo-3´-phenyl-imidazolidin-1´-yl)-acetamid

Eine Zellulosemembran 38 (835 nmol/cm² nach AAV 8 , Hochbeladungsprotokoll) der Größe 5 x 5 cm wurde einer zusätzlichen Waschprozedur unterzogen [TFA (95% in H₂O), 1 x 20 min; CH₂Cl₂, 2 x 2 min; MeOH, 1 x 2 min; Et₃N (2 Vol-% in DMF), 2 x 2 min; H₂O, 2 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; Et₂O, 1 x 2 min]. Anschließend wurde die Membran mit einer nach AAV 9 aktivierten Lösung des Rink-Linkers 47 getränkt (0.50 ml, abweichend von AAV 9 : 0.5 M in DMF). Nach 30 Minuten wurde die Membran gewaschen (DMF, 4 x 2 min) und freie Aminogruppen durch Acetylierung blockiert [DMF/Ac₂O/DIEA 70:10:20 (v/v)], 2 x 15 min, DMF, 2 x 2 min; MeOH, 2 x 2 min; Et₂O, 1 x 2 min). Anhand von drei SPOTs wurde nach AAV 6 -B ein Derivatisierungsgrad von 581 nmol/cm²

162

HPLC-MS: RT = 11.4; ber. (M+H⁺): 361.19; gef.: 360.8 (40), 343.9 (100), 230.8 (30), 203.0 (10). Das Isotopensignal bei 361.8 wies eine Intensität von 25% auf.

¹H-NMR* [500 MHz, [D₆]-DMSO, 25°C, überlagert von 61 Mol% NH₄⁺CF₃COO^- 7.13 (t, ¹J (H,N) = 51 Hz, 4H, NH₄⁺) und 36 Mol% Aceton: 2.08 (s, 6H)] = [0.81 (d, ³J = 7.2), 0.83 (d, ³J = 7.2), 0.909 (d, ³J = 7.2), 0.912 (d, ³J = 7.2) Summe der 4 Dupletts: 6H, Integralverhältnis 6:4 (0.81/0.83):(0.909/0.912), CH-(CH₃)₂], [1.38 (d, ³J = 7.2), 1.39 (d, ³J = 7.2) Summe der 2 Dupletts: 3H, 5´-CH₃], [1.81 (sept, ³J = 7.2), 1.91 (sept, ³J = 7.2) Summe der 2 Septetts: 1H, Integralverhältnis 6:4, CH-(CH₃)₂], 2.98 - 3.22 [m, 2H, CH₂-CH-(CH₃)₂], [4.20 (q, ³J = 7.2), 4.24 (q, ³J = 7.2) Summe der 2 Quartetts: 1H, 5´-H], überlagert von 3.72 - 4.53 [m, 5H, 2-H₂ und CH₂-CONH₂], 7.31 (br-s, 1H, CONH₂), 7.34-7.52 (m, 5H, Ar-H), 7.57 (br-s, 1H, CONH₂).

Bei der zusätzlichen Aufnahme von ¹H-NMR-Spektren bei 40°C und 70°C erhielt man identische Spektren, mit der Ausnahme, daß die Signale für NH₄⁺CF₃COO^- (7.13) und die

163

Durch die Aufnahme eines (H,H)-COSY-Spektrums konnten die Kopplungen der Signale 0.81 und 0.83 zum Signal bei 1.81 sowie der Signale bei 0.909 und 9.912 zum Signal bei 1.91 zugeordnet werden (Isopropylgruppe). Ferner wurde der Kopplungspartner der Signale bei 1.38 und 1.39 eindeutig den Signalen bei 4.20 und 4.24 zugeordnet (5´-CH₃ zu 5´-H-Kopplung). Weitere Zuordnungen waren durch die Koplexität des Spektrums aufgrund der vorliegeneden Isomere nicht möglich.

¹³C-NMR* [126 MHz, [D₆]-DMSO, Standard-Messung (kein APT), Mischung von zwei cis/trans-Amid-Isomeren, überlagert von = 30.7 (CH₃COCH₃)]: = 14.3 und 14.6 (5´-CH₃), 19.6, 19.7, 19.9 und 20.0 (CH-(CH₃)₂), 26.4 und 26.8 (CH-(CH₃)₂), 42.2 und 42.3 (CH₂CONH₂), 48.6 und 49.6 (C-2), 54.2 und 54.5 (CH₂-CH-(CH₃)₂), 55.7 und 55.9 (C-5´), 126.4, 126.5, 127.8, 127.9, 128.8 (br), 132.0 und 132.1 (Ar-C), 155.6 und 155.8 (C-2´), 167.6 und 168.0 (C-1), 169.9, 170.0, 172.6 und 172.7 (C-4´ und CONH₂).

* Die Auswertung der NMR-Spektren wurde durch das Vorliegen zweier Isomere erschwert, die auf die beiden Isomeren der N-Alkylamid-Bindung an C-1 zurückzuführen sind (Isomerenverhältnis 6:4 bei 25°C).

Untersuchung zur Racemisierung des Hydantoins 155 unter den Bedingungen der Cyclisierung

ESI-MS (D₂-155): ber. (M+Na⁺): 385.18; gef.: 385.1 (100), 344.1 (30), 230.9 (10), 203.1 (10). Das Isotopensignal bei 386.1 wies eine Intensität von 22% auf, was im Rahmen des Messfehlers der Isotopensignalintensität der Ausgangsverbindung (H₃-155) unter vergleichbaren Aufnahmebedingungen entspricht. Die Bedingungen der Direktinjektion bewirkten, daß hier nicht das deuterierte Produkt (+D⁺), sondern das Natrium-Addukt als Hauptprodukt beobachtet wurde.

164

9.4 Bindungsstudien

9.4.1 Bestimmung der Bindung von mAk Tab-2 an Tri- und Hexapeptoid-Bibliotheken

Die zellulosegebundene Peptoid-Bibliothek wurde mit Methanol (1 x 5 min) und TBS (3 x 10 min) gewaschen. Zur Unterdrückung unspezifischer Bindung wurde mit Blockierungs-Lösung (aus 10 ml Blocking Reagent und 90 ml TBS, 1 h) inkubiert. Es schloß sich eine Inkubation mit mAk Tab-2 an (1 µg/ml in Blockierungs-Lösung, 100 ml, 2 h). Die Membran wurde mit TBS/0.05% Tween^® 20 gewaschen (3 x 1 min). Gebundener Antikörper wurde durch Inkubation mit einem zweiten, Peroxidase-markierten anti-Maus IgG Antikörper nachgewiesen (1 µg/ml in Blockierungs-Lösung, 100 ml, 2 h). Nach Waschen mit TBS/0.05% Tween^® 20 (6 x 4 min) wurde die enzymatische Aktivität unter Verwendung eines Chemolumineszenz-Substrats (Luminescence Substrate Solution A und B: 100:1, 40 ml, 1 min) mittels Chemolumineszenz am Gerät LumiImager™ nachgewiesen (Belichtungszeit 1-10 min je nach Signalintensität, so daß eine Aufnahme mit hohem Signal/Rausch Verhältnis zustandekommt).

9.4.2 Bestimmung von Dissoziationskonstanten mittels Oberflächen-Plasmonenresonanz

Die Messung wurde nach Lit.^{[ 154 ]} durchgeführt. Der Fluß betrug für die Chipbeschichtung 5.0 µl/min, für die Messungen 15 µl/min (HBE-EP-Puffer, pH = 7.4).

Immobilisierung: An einem Goldchip mit Dextranbeschichtung wurden der Antikörper mAk Tab-2 [Flußzelle 2 (FC 2)] und in der Vergleichszelle der Antikörper mAk TE-33 [Flußzelle 1 (FC 1)] immobilisiert. Beide Flusszellen werden nacheinander nach dem gleichen Protokoll einzeln derivatisiert. (1) Aktivierung der Dextran-Carboxylfunktionalitäten: 7 min 1-Ethyl-3-(3´-dimethylaminopropyl)carbodiimid Hydrochlorid (0.2 M) und HONSu (0.05 M) in H₂O (Kit zur Aminkopplung). (2) Beschichten mit dem Antikörper: Inkubation mit einer Lösung des Antikörpers in Puffer (schrittweise in 30 sec-Schritten, bis eine Derivatisierung von etwa 5000-6000 RU erreicht ist). (3) Blocken der restlichen aktivierten Carboxylfunktionen: 7 min Ethanolamin Hydrochlorid (1 M in H₂O, pH = 8.5).

Bedingungen für mAk Tab-2: 2 min 24 sec, 50 µg/ml, NaOAc-Puffer (10 mM, pH = 5.0). Erreichte Beladung: 6083 RU.

Bedingungen für mAk TE-33: 15 min, 75 µg/ml, NaOAc-Puffer (10 mM, pH = 4.0). Erreichte Beladung: 5702 RU.

Meßbedingungen: Vor der Aufnahme jedes Meßpunktes wurde der Chip von gebundenen Proberesten durch Inkubation mit Glycin/HCl-Puffer (10 mM, pH = 2.0, 2 min) regeneriert. Jede Probe wurde in mindestens vier verschiedenen Konzentrationen in HBE-EP-Puffer (pH = 7.4) im Bereich 250 µM bis 2.0 mM angewendet und die spezifische Bindung durch Differenzbildung der Resonanzeinheiten beider Flußzellen bestimmt. Falls eine

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Tab. 27: Bestimmung der Bindungsaffinitäten durch Auswertung der RU unter Steady-State-Bedingungen.

Substanz	Meßparameter1)	KD [µM]	2
03-09-08	16-2000 µM; 2.8-31.7 RU; 8 DP	282	0.80
03-11-09	7.8-1000 µM; 3.9-25.2 RU; 8 DP	87.4	0.83
03-20-11	31-1000 µM; 3.9-25.2 RU; 6 DP	225	0.25
05-16-12	6.3-2000 µM; 1.2-4.6 RU; 4 DP	> 2000	-
104	63-2000 µM; 3.2-18.0 RU; 6 DP	408	0.11
103	250-2000 µM; 0.2-2.8 RU; 4 DP	> 2000	-
1052)	6.3-500 µM; 2.6-14.2 RU; 5 DP	(1633))	1.80
107	6.3-500 µM; 0.4-3.1 RU; 5 DP	> 500	-
109	0.20-125 µM; 3.9-38.2 RU; 10 DP	2.74	1.05
110	125-2000 µM; 0.2-1.9 RU; 4 DP	> 2000	-
111	25-2000 µM; 1.7-2.1 RU; 4 DP	> 2000	-

¹⁾: Konzentrationsbereich [µM]; RU-Bereich; Zahl der Datenpunkte (DP); ²⁾: Es wurde das Rohprodukt der Synthese eingesetzt (Mischung aus mindestens 6 Substanzen); ³⁾: Konzentrationsberechnung basiert auf der Molmasse von 105 [M = 889.5].

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Tab. 28: Bestimmung der Bindungsaffinitäten durch Auswertung des kinetischen Verlaufs der Assoziation und Dissoziation der Verbindungen.

Substanz	Meßparameter1)	ka [M-1s-1]	kd [s-1]	KD [µM]	2
109	0.49-31 µM; 7 DP	1.13 · 104	1.55 · 10-2	1.37	1.92
112	16-4000 nM; 9 DP	1.10 · 105	2.18 · 10-3	0.020	1.16 2)

¹⁾: Konzentrationsbereich [µM]; Zahl der Datenpunkte (DP); ²⁾: Doppelte Bestimmung.

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