Heine, Helge Niklas: Peptidmimetika an Zellulosemembranen - SPOT-Synthese und Screening kombinatorischer Peptoid-Bibliotheken
Peptidmimetika an Zellulosemembranen - SPOT-Synthese und Screening kombinatorischer Peptoid-Bibliotheken
Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
d o c t o r   r e r u m   n a t u r a l i u m
(Dr. rer. nat.)
im Fach Chemie
eingereicht an der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Dipl.-Chem. Helge Niklas Heine,
geboren am 04.08.1971 in Lübeck

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin,
Prof. Dr. Dr. h.c. H. Meyer

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. B. Ronacher

Gutachter:
1. Prof. Dr. U. Koert
2. Prof. Dr. J. Schneider-Mergener
3. Prof. Dr. N. Sewald

Tag der mündlichen Prüfung: 21.07.2000

Zusammenfassung

Die SPOT-Synthese an Zellulosemembranen wurde 1992 als eine hocheffiziente Methode zur parallelen Synthese von Peptiden beschrieben. Die wichtigste Anwendung der so synthetisierten Verbindungen ist das direkte Festphasen-Screening. Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, das Anwendungsgebiet der SPOT-Methode von Peptiden auf verschiedene Peptidmimetika auszudehnen und durch Screening entsprechender Bibliotheken bioaktive Substanzen zu identifizieren.

(1) Peptoid-Synthese an Zellulosemembranen

Die Ähnlichkeit von Oligo-N-alkylglycinen (Peptoiden) zu Peptiden sowie die Vereinbarkeit ihrer Synthese mit den Bedingungen der SPOT-Technik ließen sie als besonders geeignete Kandidaten für eine Erweiterung der SPOT-Synthese von Peptiden auf Peptidmimetika erscheinen. Die Peptoide wurden nach der 1992 für die Synthese am Harz beschriebenen Sub-Monomer-Methode synthetisiert, bei der die N-Alkylglycin-Monomere zweistufig durch Bromacetylierung und nachfolgende Bromsubstitution durch ein primäres Amin aufgebaut werden. Die Kernaufgabe bei der Anpassung der Synthesebedingungen an Zellulosemembranen war dabei die Entwicklung einer N/O-selektiven Bromacetylierungsmethode, da die Anwesenheit freier Membran-Hydroxyfunktionalitäten ein Reagenz erfordert, welches eine N-Acylierung in Anwesenheit von O-Nukleophilen zuläßt. Durch Untersuchung mehrerer Aktivester der Bromessigsäure konnte gezeigt werden, daß der kristalline Bromessigsäure-2,4-dinitrophenylester im Hinblick auf Ausbeute und N/O-Selektivität optimale Eigenschaften besitzt. Im Anschluß an die Bromacetylierungsmittel wurden 46 primäre Amine auf ihre Anwendbarkeit bei der Synthese von Modell-Tripeptoiden untersucht. Aus den Ergebnissen konnten Gesetzmäßigkeiten abgeleitet werden, die eine Abschätzung der Verwendbarkeit von Aminen für die Peptoidsynthese im Hinblick auf Flüchtigkeit, sterischen Anspruch, Nukleophilie des Stickstoffatoms sowie vorhandene funktionelle Gruppen in Seitenketten ermöglichen.

(2) Synthese und Screening von Peptoid-Bibliotheken

Unter den optimierten Synthesebedingungen wurden zwei Bibliotheken mit jeweils 8000 Tri- bzw. Hexapeptoiden synthetisiert. Die Trimeren-Bibliothek beinhaltete dabei den gesamten Sequenzraum basierend auf 20 Bausteinen, während die Verbindungen der Hexameren-Bibliothek aus einem wesentlich größeren, auf 40 Bausteinen basierenden Sequenzraum statistisch ausgewählt wurden. Um zu überprüfen, ob sich die Bibliotheken zur de novo Auffindung von Protein-Liganden eignen, wurden sie auf Bindung zum monoklonalen Antikörper Tab-2 untersucht. Es konnten in beiden Fällen bioaktive Oligomere identifiziert werden (Trimere: KD = 87 µM, Hexamere: KD = 2.7 µM), die sich vom Peptid-Epitop des Antikörpers [VVSHFND] deutlich unterschieden.

(3) Rückgratmodifizierte Peptoide

Mit dem Ziel, Rückgratmodifikationen in Peptoide einzufügen, wurden neun Biselektrophile im Rahmen eines „chemischen Screenings“ zur Synthese eines Modell-Trimers verwendet. Vier der Bausteine waren geeignet und ermöglichten damit die Einführung von beta-Peptoid-, m- und p-Aminomethylbenzoesäure- sowie Carbamat-Einheiten in Peptoide. Beim Versuch, in analoger Weise auch Harnstoffe zugänglich zu machen, wurde unter den Linker-Spaltungsbedingungen eine Cyclisierung zu Hydantoinen beobachtet. Diese interessante Reaktion wurde näher untersucht, um die SPOT-Methode auf die Synthese von Hydantoinen als heterocyclische Struktur zu erweitern.

(4) Synthese von Hydantoinen an Zellulosemembranen

Die Bildung von Hydantoinen in einer Cyclisierungsreaktion, bei der Ammoniak aus einem Amid freigesetzt wird, wurde an fester Phase noch nicht genutzt, während dieser Reaktionstyp in Lösung bereits intensiv untersucht wurde. Durch eine Optimierung der Cyclisierungsbedingungen ließ sich die zunächst unvollständige Reaktion zur Vollständigkeit bringen. Auch C-substituierte Hydantoine konnten durch Verwendung von alpha-Aminosäureamiden bzw. -tert-butylestern enantiomerenrein zugänglich gemacht werden.

Schlagwörter:
Peptidmimetika, SPOT-Synthese, Kombinatorische Chemie, N-Alkylglycine, Peptoide, Hydantoine, Bromessigsäure, N/O-selektive Acylierung, Festphasen-Synthese, Zellulosemembranen, Festphasen-Screening, Antikörper-Liganden de novo

Abstract

SPOT-synthesis on cellulose membranes was introduced as a highly efficient method for the parallel synthesis of peptides in 1992. The most important applications of libraries synthesized by SPOT-synthesis are solid phase binding assays. Within this work the extension of the SPOT-method to the synthesis of various peptidomimetics and the identification of bioactive substances by screening of corresponding libraries is described.

(1) peptoid synthesis on cellulose membranes

The similarity of oligo-N-alkylglycines (peptoids) and peptides as well as the compatibility of their synthesis with the conditions of the SPOT-technique made them ideally suited for the extension of the SPOT-synthesis from peptides to peptidomimetics. The peptoids were synthesized by the sub-monomer approach originally developed for the synthesis on standard resins in 1992. N-alkylglycine monomers are hereby synthesized in a stepwise manner by bromoacetylation and subsequent substitution of the bromine atom by a primary amine. The most critical point in the adaptation of the synthesis conditions was the development of an N/O-selective reagent for bromoacetylation due to the presence of free hydroxyl functionalities of the membrane support requiring a reagent suitable for N-acylation in the presence of O-nucleophiles. Several active esters of bromoacetic acid were synthesized and tested whereby crystalline 2,4-dinitrophenylbromoacetate gave the best results with respect to yield and N/O-selectivity. After optimization of bromoacetylation 46 primary amines were applied to the synthesis of model tripeptoids. Rules for the applicability of amines in peptoid synthesis with respect to volatility, sterical demand, nucleophilicity of the nitrogen atom and compatibility with sidechain functional groups were derived from the results.

(2) synthesis and screening of peptoid libraries

Two libraries consisting of 8000 tri- and hexapeptoids respectively were synthesized under optimized conditions. The library of trimers displayed the entire sequence space based on 20 building blocks, whereas the sequences of the hexamers were selected statistically from the sequence space based on 40 building blocks. In order to examine the suitability of the libraries for the de novo identification of protein ligands they were screened for binding to the monoclonal antibody Tab-2. Bioactive peptoids could be identified in both cases (trimers: KD = 87 µM, hexamers: KD = 2.7 µM) both differing significantly from the peptide epitope [VVSHFND].

(3) backbone modified peptoids

In order to introduce backbone modifications into peptoids nine biselectrophiles were applied in the synthesis of model trimers in a chemical screening. Four of the building blocks were well suited allowing the incorporation of beta-peptoid, m- and p-aminomethylbenzoic acid and carbamate units into peptoids. When the introduction of urea-units in a similar approach was attempted hydantoins were formed during cleavage from the solid support. This interesting reaction was examined in detail in order to extend SPOT-synthesis to the synthesis of heterocycles.

(4) synthesis of hydantoins on cellulose membranes

The formation of hydantoins from terminal amides was not yet described in a solid phase synthesis, whereas it was examined intensively in solution. By optimizing the conditions of cyclization the reaction could be driven to completion. C-substituted hydantoins were obtained as single enantiomers, when alpha-amino acid-amides or -tert. butylesters were used in the synthesis.

Keywords:
peptidomimetics, SPOT-synthesis, combinatorial chemistry, N-alkylglycines, peptoids, hydantoins, bromoacetic acid, N/O-selective acylation, solid phase synthesis, cellulose membranes, solid phase screening, ligands for antibodies de novo


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Inhaltsverzeichnis

TitelseitePeptidmimetika an Zellulosemembranen - SPOT-Synthese und Screening kombinatorischer Peptoid-Bibliotheken
Widmung
Abkürzungsverzeichnis Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
1 Einleitung und Zielsetzung
1.1 Einleitung
1.2 Zielsetzung
2 Von Peptiden zu Peptidmimetika
2.1Peptid-Synthese an fester Phase
2.2 SPOT-Synthese von Peptiden
2.3 Peptoid-Synthese an Syntheseharzen
2.4Stukturelle Eigenschaften von Peptoiden
2.5 Vorgehensweise auf dem Weg zur Peptoid-Synthese an Zellulose
3 Peptoid-Synthese an Zellulosemembranen
3.1Derivatisierung der Zellulose für die Peptoid-Synthese
3.2 Geeignete Linker-Systeme
3.2.1Synthese ohne Linker
3.2.2Sauer spaltbare Linker in der SPOT-Synthese
3.2.3Photolytisch spaltbare Linker in der SPOT-Synthese
3.3Peptoid-Synthese an Zellulose nach der Sub-Monomer-Methode
3.3.1Aktivierung von Bromessigsäure
3.3.1.1Bromacetylierung von N-Alkylglycinen unter Bedingungen der SPOT-Synthese
3.3.1.2Untersuchungen zur N/O-Selektivität verschiedener Bromacetylierungsmittel
3.3.1.2.1 Synthese der Modellverbindungen 17 und 18 am Harz
3.3.1.2.2 SPOT-Synthese der Modellverbindung 17
3.3.1.2.3 Untersuchung der N/O-Selektivität von 11 in CDCl3
3.3.1.3 Ergebnisse der Bromacetylierung sekundärer Amine
3.3.2Bromsubstitution durch primäre Amine
3.3.2.1Lösungsmittel
3.3.2.2 Konzentrationen
3.3.3Einführung von Diversität: Test von Aminen auf ihre Eignung in der SPOT-Synthese
3.3.3.1 Untersuchung der zur Synthese notwendigen Amineigenschaften
3.3.3.1.1 Einfluß der Flüchtigkeit des Amins
3.3.3.1.2 Einfluß sterischer Faktoren (Verzweigungen)
3.3.3.1.3 Einfluß der Nukleophilie der NH2-Gruppe
3.3.3.1.4 Anwendbarkeit funktioneller Gruppen in der Seitenkette
3.3.3.2 Seitenkettenfunktionalitäten der proteinogenen Aminosäuren
3.3.4Zusammenfassung: Möglichkeiten und Grenzen der Peptoid-Synthese
4 Identifizierung bioaktiver Peptoide de novo
4.1Chemische Voraussetzungen
4.2 Biochemische Voraussetzungen: Bindung eines Antikörpers als Modellsystem
4.3 Identifizierung Antikörper-bindender Tripeptoide
4.4 Identifizierung Antikörper-bindender Hexapeptoide
5 Rückgratmodifizierte Peptoide
6 SPOT-Synthese von Heterocyclen: Hydantoine
6.1 Hydantoine - Neue Perspektiven in der SPOT-Synthese
6.2Optimierung der Cycliserungsbedingungen
6.3 Synthese C-substituierter Hydantoine
7 Zusammenfassung und Ausblick
8 Allgemeine Experimentelle Bedingungen
9 Durchführung
9.1 Synthesen in Lösung
9.1.1Allgemeine Arbeitsvorschriften
9.1.2 Spezielle Synthesen
9.1.3 Untersuchungen zur N/O-Selektivität von Bromessigsäure-2,4-dinitrophenylester in Lösung mittels 1H-NMR
9.2 Synthesen an Syntheseharzen
9.2.1 Allgemeine Arbeitsvorschrift
9.2.2 Spezielle Synthesen
9.3Synthesen an Zellulosemembranen
9.3.1Allgemeine Arbeitsvorschriften
9.3.2Spezielle Synthesen
9.4 Bindungsstudien
9.4.1 Bestimmung der Bindung von mAk Tab-2 an Tri- und Hexapeptoid-Bibliotheken
9.4.2 Bestimmung von Dissoziationskonstanten mittels Oberflächen-Plasmonenresonanz
Bibliographie Literaturverzeichnis
Anhang A Anhang
Danksagung
Lebenslauf
Selbständigkeitserklärung

Tabellenverzeichnis

Tab. 1: Abhängigkeit der Gesamtausbeute aufeinanderfolgender Reaktionen von der Ausbeute der Einzelreaktionen.
Tab. 2: Vergleich gängiger Synthesebedingungen für die Peptid-Synthese an Syntheseharzen und der SPOT-Synthese an Zellulose.
Tab. 3: Methoden zur Identifizierung bioaktiver Substanzen durch Bindungsstudien mit Peptiden, die mittels SPOT-Synthese hergestellt wurden (F = Heterogene (Festphasen-) Bindungsstudie; H = Bindungsstudie in homogener Phase).
Tab. 4: Vergleichende Gegenüberstellung einiger Eigenschaften von Peptiden und Peptoiden.
Tab. 5: Einfluß der Reaktionszeit auf den Derivatisierungsgrad bei der Generierung von aminofunktionalisierten Membranen 38 bei erhöhter Temperatur. Das zur Bromsubstitution eingesetzte Diamin wurde bei verschiedenen Temperaturen eingesetzt (0.90 M in DMF).
Tab. 6: Synthese von 16 unter Anwendung verschiedener Bromacetylierungsbedingungen. Bei der Bromacetylierung des Monomers 57 wurden die tabellierten Bedingungen angewendet, alle übrigen Acylierungen wurden mit 11 durchgeführt (jeweils 1 M in NMP).
Tab. 7: SPOT-Synthese von 17 unter Anwendung verschiedener Bromacetylierungsbedingungen.
Tab. 8: Konkurrenzexperiment zur Untersuchung der N/O-Selektivität bei der Umsetzung von Bromessigsäure-2,4-dinitrophenylester (11) mit Diethylamin (66) und Methanol (68).
Tab. 9: Reinheiten der Rohprodukte einer Synthese des Tripeptoids 16 an einer Rink-Linker-derivatsierten Zellulosemembran.
Tab. 10: Einfluß der Flüchtigkeit von Aminen R-NH2 auf die Produktreinheiten bei der Synthese der Tripeptoide 19 an Rink-Linker modifizierter Zellulose.
Tab. 11: Einfluß sterischer Faktoren auf die Produktreinheiten bei der Synthese der Tripeptoide 19 an Rink-Linker modifizierter Zellulose. Die zugrunde liegenden Amine R-NH2 wurden als Lösungen in NMP eingesetzt (50%).
Tab. 12: Einfluß der Nukleophilie der Amino-Gruppe von Aminen R-NH2 auf die Produktreinheiten bei der Synthese der Tripeptoide 19 an Rink-Linker modifizierter Zellulose.
Tab. 13: Produktreinheiten bei Anwendung von bifunktionellen Aminbausteinen R-NH2 in der Synthese der Tripeptoide 19 an Rink-Linker modifizierter Zellulose
Tab. 14: Zugänglichkeit der Sub-Monomer-Bausteine zur SPOT-Synthese von Peptoiden mit Seitenketten, die denen der proteinogenen Aminosäuren entsprechen. In der Zeile „0“ ist der Abstand zum Oligomeren-Rückgrat identisch mit den entsprechenden Peptiden. Bei
„-1“ bzw. „+1“ ist der Abstand um eine Methylengruppe kürzer bzw. länger.
Tab. 15: Produktreinheiten bei einer vergleichenden Synthese der Tripeptoide 16, 90 und 91 auf „großen“ und „kleinen“ SPOTs an Rink-Linker derivatisierter Zellulosemembran.
Tab. 16: Signalintensitäten von vier Tripeptoiden bei der Festphasen-Bindungsstudie (BLU) mit dem Antikörper mAk Tab-2 sowie Dissoziationskonstanten (KD) der freien Tripeptoide, bestimmt durch Oberflächen-Plasmonenresonanz.
Tab. 17: Größe des Sequenzraumes in Abhängigkeit von der Oligomerenlänge und der Anzahl der Bausteine. Zusätzlich ist der Anteil des Sequenzraumes tabelliert, der von 8000 Verbindungen abgedeckt wird.
Tab. 18: Reinheiten der Kontrollpeptoide bei der Synthese der Hexapeptoid-Bibliothek. Gekennzeichnet ist darüberhinaus, ob das gewünschte Produkt das Hauptprodukt darstellt.
Tab. 19: Sequenzen und Signalintensitäten (BLU) der SPOTs mit höchster Signalintensität in Abb. 28 . Die kursiv hervorgehobenen Verbindungen wurden am Syntheseharz resynthetisiert und auf Bindung getestet. Die Nummerierungen der Verbindungen beziehen sich auf die Reste in Abb. 27 .
Tab. 20: Dissoziationskonstanten [KD] von sechs Hexapeptoiden gemessen durch Bestimmung der spezifischen Bindung an den immobilisierten Antikörper mAk Tab-2 mittels Oberflächen-Plasmonenresonanz. Gekennzeichnet sind Substanzen, die Diketipiperazine (DKP) bei der Harzsynthese bildeten. Die Signalintensitäten (BLU) der Festphasen-Bindungsstudie sind zum Vergleich angegeben (vergl. Tab. 19 ).
Tab. 21:Produktreinheiten bei der Synthese der Trimere 20 an Rink-Linker modifizierter Zellulose unter Verwendung verschiedener Rückgrat-Bausteine 122. Zum Vergleich ist die Synthese mit Bromessigsäure gezeigt (Eintrag 1; vergl. Abschnitt 3.3 .).
Tab. 22: Optimierung der Cyclisierungsbedingungen zur Synthese von Hydantoinen. Bestimmt wurde das Verhältnis der Produktreinheiten der linearen Harnstoffe 148 zu den entsprechenden Hydantoinen 149. Die Synthese wurde an Photo-Linker (PL) bzw. Rink-Linker (R) durchgeführt.
Tab. 23: Untersuchung zur Synthese von substituierten Hydantoinen 154.
Tab. 24: Ansätze für die NMR-spektroskopische Bestimmung der N/O-Selektivität der Umsetzung von Bromessigsäure-2,4-dinitrophenylester (11) mit Diethylamin (66) und Methanol (68) in einem Konkurrenzexperiment [Die Buchstaben entsprechen den Lösungen wie oben im Text beschrieben. Die Nummer entspricht dem Versuchseintrag in Tab. 8 (Seite 49). Angegebene Werte in ml. Die Zugabe von (A) erfolgte als letztes; F = Deuterochloroform].
Tab. 25: Abspaltungsausbeuten und Produktreinheiten bei der lösungsmittelfreien, trockenen Photolyse zweier Zellulosemembranen 38, die das Tripeptoid 16 am Photo-Linker trugen.
Tab. 26: Acylierungsbedingungen für den zweiten Acylierungsschritt bei der Synthese des
Trimers 20.
Tab. 27: Bestimmung der Bindungsaffinitäten durch Auswertung der RU unter Steady-State-Bedingungen.
Tab. 28: Bestimmung der Bindungsaffinitäten durch Auswertung des kinetischen Verlaufs der Assoziation und Dissoziation der Verbindungen.

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Peptide: Strukturformel und schematische Darstellung von Rückgrat und Seitenketten. Peptidmimetika: Beispiele für A) Rückgrat-Mimetika[ 8 ], B) Dipeptid-Analoga[ 9 ] und
C) Gerüst-Mimetika[ 10 ].
Abb. 2: Methoden zur parallelen Synthese an fester Phase (P: Feste Phase; R: Reagenzien;
G: Reaktionsgefäß).
Abb. 3: Roboter zur automatischen Pipettierung von Reagenzien auf eine Zellulosemembran (SPOT-Synthese). Links befinden sich die Reagenzienvorräte, rechts ist eine 19 x 28 cm große Membran mit 8000 (blau eingefärbten) SPOTs fixiert.
Abb. 4: Substitutionsanalyse des Hepta-Peptids VVSHFND: 140 (7 x 20) Hepta-Peptide zzgl. 7 Kopien des Wildtyps (wt) wurden an einer Zellulosemembran (6 x 13 cm) synthetisiert und mit dem Antikörper mAk Tab-2 inkubiert. Dunkel gefärbt sind diejenigen SPOTs erkennbar, an denen Peptide durch den Antikörper gebunden wurden. Sie unterscheiden sich in genau einer Aminosäure (hervorgehoben in den exemplarisch angegeben Sequenzen).[ 41 ]
Schema 1: Sub-Monomer-Synthese von Peptoiden nach R.N. Zuckermann et al.[ 12 ]
Schema 2: Esterfreie Aminoderivatisierung von Zellulose nach R. Volkmer-Engert et al.[ 48 ]
(SG = Schutzgruppe).
Schema 3: Syntheseschema zur Peptid-Synthese an fester Phase.
Abb. 5: Schutzgruppenstrategie für die Synthese von Peptid-Amiden nach der Fmoc / tBu-Schutzgruppenstrategie [R = Seitenkette einer Aminosäure mit Hydroxy- oder Carboxy-Funktionalität (z.B.: R = CH2 für Ser); das Peptid ist farbig hervorgehoben].
Abb. 6: Oben: Auswahl von Kopplungsreagenzien in der Peptid-Synthese. Unten: Mechanismus der in situ-Aktivierung am Beispiel der Aktivierung einer Fmoc-Aminosäure mit TBTU.
Abb. 7: Schematische Darstellung der SPOT-Synthese.
Abb. 8: Derivatisierung von Zellulose für die SPOT-Synthese von Peptiden (1) und Definition der SPOTs durch die erste Pipettierung einer Aminosäure (2). Durch Acetylierung (e) werden freie Aminogruppen zwischen den SPOTs blockiert und können nicht mehr durch Bromphenolblau (BPB) angefärbt werden. a) Fmoc-betaAla-OH / DIC / NMI, 12 h; b) 20% Piperidin / DMF; c) BPB / MeOH; d) Fmoc-beta-Ala-OPfp (SPOT-weise); e) Ac2O / DIEA / DMF.
Abb. 9: Veranschaulichung kontinuierlicher und diskontinuierlicher Protein-Protein Kontakte bei der Wechselwirkung zwischen zwei Proteinen A und B.
Schema 4: Synthese von Peptoiden an fester Phase A) nach der Monomer-Methode oder B) nach der Sub-Monomer-Methode.
Schema 5: Synthese von Peptoid-Monomerbausteinen. a) H2/Pd in H2O, pH = 6 oder NaBH3CN;
b) NaOH in H2O/CH3CN (R = organischer Rest mit geeignet geschützten funktionellen Gruppen. X = Br, Cl).
Schema 6: Amidbindungskonformere bei Peptiden und Peptoiden.
Schema 7: Esterfreie Aminoderivatisierung von Zellulose nach R. Volkmer-Engert et al.[ 48 ]
Schema 8: Neue Methoden zur Synthese esterfrei aminoderivatisierter Zellulosemembranen.
Schema 9: Mögliche Nebenreaktionen bei der Substitution des Zellulose-Brompropylethers 36 mit ges. Ammoniak in Methanol.
Abb. 10: Einfluß der Epoxidkonzentration und der Reaktionszeit auf den Derivatisierungsgrad bei der Generierung von aminofunktionalisierten Membranen 38. *) Zur Katalyse wurden 8 Mol% Perchlorsäure zugesetzt.
Abb. 11: Einfluß der Diaminkonzentration und der Reaktionszeit auf den Derivatisierungsgrad bei der Synthese von aminofunktionalisierten Membranen 38 (25°C).
Abb. 12: Einfluß der Diaminkonzentration auf den Derivatisierungsgrad bei der Generierung von aminofunktionalisierten Membranen 38 bei erhöhter Temperatur. Das Diamin 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecandiamin (37) wurde in DMF oder pur eingesetzt (80°C für 1 h oder 810 W Mikrowellenbestrahlung (MW) für 3 min).
Schema 10: Verschiedene Möglichkeiten zur räumlich getrennten Behandlung von Syntheseprodukten der SPOT-Synthese.
Abb. 13: Säurespaltbare Linker zur Immobilisierung von Carbonsäureamiden (R-CONH2) an Harzen. In Klammern: TFA-Volumenanteile in CH2Cl2, die zur Spaltung benötigt werden.
Abb. 14: Untersuchung der Kopplungseffizienz bei Anwendung verschiedener Aktivierungsbedingungen zur Immobilisierung des Rink-Linkers an aminoderivatisierter Zellulose 38. Lösungen des Fmoc-geschützten Rink-Linkers 47 (0.5 M in NMP) wurden mit den angegebenen Aktivierungsmitteln versetzt, 30 min voraktiviert und mit 38 zur Reaktion gebracht (2 µl; 3 x 15 min).
Schema 11: Fmoc-Photolinker 48 und Spaltungsmechanismus.
Abb. 15: Auftragung der Peakfläche des UV-Signals von 16 in einer Serie von HPLC-Läufen in Abhängigkeit von der injizierten Menge. Die Ausgleichskurven wurden quadratisch (durchgehende Linie) sowie für Injektionsmengen le 25 nmol linear (unterbrochene Linie) angenähert (Meßwerte für HP-1100 HPLC an Finnigan LCQ, Software Ver. 1.1).
Abb. 16: HPLC-UV-Spur (220 nm, links) und ESI-Massenspektrum (rechts) des Rohproduktes einer Synthese von 16 an Zellulose. Es wurden 10% der Substanz, die von einem SPOT (0.23 cm2) abgespalten wurde, zur HPLC injiziert (ca. 30 nmol).
Abb. 17: Oben: Nebenreaktionen und -produkte beim Versuch der Bromacetylierung des membrangebundenen Monomers 57 mit Bromessigsäure-4-nitrophenylester (12). a) Benzylamin (5 M in NMP, 30 min), b) Br-CH2-COODnp (1 M in NMP, 2 x 15 min), c) Piperidin (5 M in NMP, 30 min), d) TFA (95% in H2O, 20 min). Unten: HPLC-UV-Spur (220 nm, links) und ESI-Massenspektren (rechts) der Reaktionsprodukte. Es wurden 20% der Substanz, die von einem SPOT (0.23 cm2) abgespalten wurde, analysiert (ca. 60 nmol).
Schema 12: Bestimmung der N/O-Selektivität verschiedener Bromacetylierungsmittel durch Bestimmung des Verhältnisses von 17 zu 18. Bei unvollständiger Acylierung wird 63 als Nebenprodukt beobachtet. a) Br-CH2-COODnp (1.0 M in NMP, 2 x 15 min);
b) n-Butylamin (5 M in NMP, 30 min); c) Ethanolamin (5 M in NMP, 30 min);
d) Piperidin (5 M in NMP, 30 min); e) TFA (95% in H2O, 20 min).
Schema 13: Harz-Synthese von 17 und 18. a) 20 Äq. Br-CH2-COOH, 10 Äq. DIC, 10 Äq. 2,6-Dimethylpyridin (DMF, 1 x 15 min); b) 150 Äq. n-Butylamin (DMF, 1 x 30 min);
c) 150 Äq. Ethanolamin (DMF, 1 x 30 min); d) 1.5 Äq. Br-CH2-COODnp (DMF, 1 x 20 min); e) 20 Äq. Br-CH2-COOH, 10 Äq. DIC, 40 Äq. 2,6-Dimethylpyridin (CH2Cl2, 1 x 20 min); f) 150 Äq. Piperidin (DMF, 1 x 30 min); g) TFA (95% in H2O, 30 min).
Abb. 18: HPLC-UV-Spur (220 nm, links) und ESI-Massenspektren (rechts) der Produkte der SPOT-Synthese von 17 an Zellulose (vergl. Eintrag 1, Tabelle 7 ).
Abb. 19: Reaktivitätsreihe von Bromessigsäureestern gegenüber sekundären Aminen unter den Bedingungen der SPOT-Synthese.
Abb. 20: Reinheiten und Ausbeuten der Rohprodukte einer Synthese des Tripeptoids 16 an einer Rink-Linker-derivatisierten Zellulosemembran (Lösungen in NMP). 1) 9 M (77 Äq.) für Benzylamin; 2) Bei der verwendeten Membran (1.26 µmol/cm2), einer Reagenzienmenge von ca. 3.6 µl/cm2 und Dreifach-Pipettierung des Amins.
Schema 14: Mögliche Nebenprodukte bei der Synthese des Tripeptoids 19 mit dem Amin 5.
a) Br-CH2COODnp (1 M in NMP); b) Piperidin (5 M in NMP); c) In Abhängigkeit vom verwendeten Linker: 95% TFA/H2O (Rink-Linker) bzw. hny (365 nm) (Photolinker).
Schema 15: Parallele Durchführung der Peptoid-Synthese nach der Sub-Monomer- und der Monomer-Methode auf einer zusammenhängenden Membran.[ 110 , 123 ] Die beiden Synthesewege können dabei an benachbarten SPOTs durchgeführt werden. Zur Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe innerhalb eines SPOT-Schrittes hat sich hier das im Vergleich zu Piperidin unflüchtigere DBU (4% in NMP) bewährt.
Schema 16: Versuch der Synthese von Peptoid/Peptid Hybriden (Peptomeren) mit Anilinen. Das membrangebundene Anilin 4-Hydroxyphenyl-73 läßt sich unter den für die SPOT-Synthese mit aliphatischen Aminen optimierten Bedingungen (mit Fmoc-Prolinanhydrid[ 110 ]) nicht mehr zum Peptomer 81 acylieren, während die Reaktion mit Bromessigsäure-2,4-dinitrophenylester glatt zu 4-Hydroxyphenyl-19 verläuft (vergl. Tab. 12 , Eintrag 4a). a) Piperidin (50% in DMF); b) TFA (95% in H2O); c) DBU (4% in DMF).
Abb. 21: Zellulosemembran (9.4 x 2.1 cm) mit „großen“ und „kleinen“ SPOTs im Vergleich. Die Aminogruppen des Rink-Linkers wurden durch Inkubation mit Bromphenolblau angefärbt. Die Markierungen wurden mit Bleistift gemacht.
Abb. 22: 20 Bausteine zur Synthese einer Bibliothek aus Tripeptoiden 92 (n-Oct = n-Octyl).
Abb. 23: LogP-Werte der N-Methylacetamide 93 der 20 Bausteine (R-• = B-1 - B-20), die zur Synthese einer Tripeptoid-Bibliothek verwendet wurden (Berechnet mit ChemDraw Ultra, Cambridge Soft; zur Identität der Bausteine vergl. Abb. 22 ).
Schema 17: Synthese der membrangebundener Tripeptoide 96.
Abb. 24: Festphasen-Bindungsstudie einer zellulosegebundenen Tripeptoid-Bibliothek (POD = Meerrettich-Peroxidase, Substrat: Chemolumineszenz-Substrat auf Luminol-Basis).
Abb. 25: Bindung von mAk Tab-2 an eine Bibliothek aus 8000 trimeren Peptoiden, die auf 20 Bausteinen basieren. Peptoide in den 20 markierten Blöcken besitzen den gleichen N-terminalen Baustein, Substanzen in einer Zeile gleichen sich im mittleren Baustein, in den Spalten ist jeweils der C-terminale Baustein identisch. Die markierten Verbindungen wurden später am Syntheseharz resynthetisiert.
Abb. 26: Ausschnittsvergrößerung von Block 3 in Abb. 25 (Baustein 03 in der N-terminalen Position), dargestellt mit veränderter Gradationskurve verglichen mit Abb. 25 .
Schema 18: Vereinfachte Darstellung der Messung von Bindungsaffinitäten durch Oberflächen-Plasmonenresonanz: Monochromatisches, polarisiertes Licht (hny) wird unter Totalreflektionsbedingungen durch ein Prisma auf eine Grenzfläche Glas/Wasser eingestrahlt. Ein Anteil des Lichtes (evaneszierende Welle) dringt dennoch, begünstigt durch eine Goldbeschichtung, in das wäßrige Medium in der direkten Nähe der Oberfläche ein (bis ca. 300 nm). Die resultierende Abschwächung des reflektierten Lichts ist bei einem bestimmten Winkel phi-gr maximal (Resonanz). Die Resonanzbedingung hängt vom Brechungsindex des wäßrigen Mediums und damit von der Masse der an der Oberfläche gebundenen Substanzen ab (hier: Antikörper und Tripeptoide).
Abb. 27: 40 Bausteine zur Synthese einer Bibliothek aus Hexapeptoiden 101. Für die Bausteine, bei denen die alpha-Position des Rückgrates beteiligt ist (B-31, B-33 und B-36) wurde aus Gründen der Übersichtlichkeit ein Teil des Rückgrates mitdargestellt (Pip = Pipecolinsäure).
Abb. 28: Bindung von mAk Tab-2 an eine Bibliothek aus 8000 hexameren Peptoiden, deren Sequenzen aus 40 Bausteinen nach dem Zufallsprinzip generiert wurden. Auf einem SPOT wurde stets nur eine Sequenz synthetisiert. Die markierten Verbindungen wurden später am Syntheseharz resynthetisiert (eingekreiste Verbindungen: Negativ-Kontrollen).
Schema 19: Bromessigsäure als Biselektrophil zur sequenziellen Acylierung (1) und nachfolgenden Alkylierung (2) bei der Peptoid-Synthese nach der Sub-Monomer-Methode [X = Aktivierende Gruppe (z.B. -Dnp)].
Abb. 29: Bifunktionelle Bausteine, die auf ihre Eignung für eine Synthese nach dem Sub-Monomer-Konzept getestet wurden (Bromessigsäure zum Aufbau von Peptoiden ist zum Vergleich aufgeführt). Der Teil der Bausteine, der zum späteren Rückgrat beiträgt, ist farbig hervorgehoben.
Schema 20: „Chemisches Screening“ auf die Möglichkeit zur Anwendung neuartiger Rückgrat-Strukturelemente nach der Sub-Monomer-Methode. Es ist der Reaktionsweg einschließlich der beobachteten möglichen Nebenprodukte beim Aufbau des Test-Trimeren 20 gezeigt. a) Benzylamin (5 M in NMP); b) Br-CH2COODnp (1 M in NMP);
c) Piperidin (5 M in NMP); d) 95% TFA/H2O.
Schema 21:Säurekatalysierte Bildung der Hydantoine 131/132 aus den Harnstoffen 20-7a/20-7b bei der Abspaltung vom Rink-Linker (vergleiche Einträge 7a und 7b in Tab. 21 ).
Schema 22: Verschiedene Systeme und Bedingungen zur Synthese von Hydantoinen an fester Phase (BSTFA = Bis(trimethylsilyl)trifluoracetamid).
Schema 23: Säurekatalysierte Cyclisierung von Peptoiden mit N-terminaler Harnstoff-Modifizierung 136 zu Hydantoinen 137 unter Austritt von Ammoniak.
Schema 24: Substitutenteneinfluß auf die Cyclisierungsgeschwindigkeit von Harnstoffen 138 zu Hydantoinen 139 nach J. Kaválek et al.[ 161 ] In der Tabelle ist angegeben, ob die Reaktion beschleunigt (+) bzw. verlangamt (-) wird, wenn ein Substituent Rn = H gegen Rn = Methyl bzw. Rn = Phenyl ausgetauscht wird (n.b. = nicht bestimmt).
Schema 25: Schema zur Synthese von Hydantoinen am N-Terminius von Peptoiden 140.
Schema 26: Verwendung bifunktioneller Isocyanate zur Synthese von Oligomeren 146, in die eine Hydantoin-Einheit eingeschoben ist (hier gezeigt am Beispiel von Chlormethyphenylisocyanaten 144 und Peptoiden).
Schema 27: Synthese des Hydantoins 151 zur NMR-spektroskopischen Untersuchung. a) Br-CH2-COODnp (1 M in NMP); b) Glycinamid (5 M in H2O); c) Ph-NCO (1 M in NMP; Zusatz von 1.1 Äq. NMI); d) TFA (95% in H2O, 60°C, 20 min).
Abb. 30: HPLC-UV-Spur (220 nm, links) und ESI-Massenspektrum (rechts) des Rohproduktes einer Synthese des Hydantoins 151 an Rink-Linker-modifizierter Zellulose. Abspaltung und Cyclisierung erfolgten mit TFA (95% in H2O) bei 60°C (20 min).
Abb. 31: 1H-NMR-Spektrum (500 MHz, [D6]-DMSO) des Hydantoins 151 (Rohprodukt) nach Synthese an 25 cm2 Rink-Linker-derivatisierter Zellulose. (Die Amid-Protonen-Zuordnung (Ha/Hb) ist nicht eindeutig.)
Schema 28: Peptoidsynthese nach der Sub-Monomer-Methode nach R.N. Zuckermann et al.[ 12 ]
Schema 29: Synthese der esterfrei aminoderivatisierten Zellulosemembran 38.
Abb. 32: Strukturen und Dissoziationskonstanten der aktivsten Verbindungen aus dem Screening einer Tripeptoid- sowie einer Hexapeptoid Bibliothek auf Bindung zum Antikörper Tab-2.
Schema 30: Mögliche Rückgratmodifikationen bei der Synthese des Trimers 20.
Schema 31: Hydantoinsynthese durch Cyclisierung N-terminal carbamoylierter Dipeptoide 147 (R´ = Ph, n-Butyl).
Abb. 33: 1H-NMR (500 MHz, [D6]-DMSO) vom Tripeptoid 151 (Auswertung vergl. Seite 132).
Abb. 34: 13C-NMR (126 MHz, [D6]-DMSO) vom Tripeptoid 151 (Auswertung vergl. Seite 132).
Abb. 35: 1H-NMR (500 MHz, [D6]-DMSO) vom Hexapeptoid 109 (Auswertung vergl. Seite 134).

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