]> Peptidmimetika an Zellulosemembranen - SPOT-Synthese und Screening kombinatorischer Peptoid-Bibliotheken Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades
d o c t o r   r e r u m   n a t u r a l i u m
(Dr. rer. nat.)
im Fach Chemie
eingereicht an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin von Dipl.-Chem. Helge Niklas Heinegeboren am 04.08.1971 in Lübeck

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin,
Prof. Dr. Dr. h.c. H. Meyer

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. B. Ronacher 1. Prof. Dr. U. Koert 2. Prof. Dr. J. Schneider-Mergener 3. Prof. Dr. N. Sewald Tag der mündlichen Prüfung: 21.07.2000 Zusammenfassung

Die SPOT-Synthese an Zellulosemembranen wurde 1992 als eine hocheffiziente Methode zur parallelen Synthese von Peptiden beschrieben. Die wichtigste Anwendung der so synthetisierten Verbindungen ist das direkte Festphasen-Screening. Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, das Anwendungsgebiet der SPOT-Methode von Peptiden auf verschiedene Peptidmimetika auszudehnen und durch Screening entsprechender Bibliotheken bioaktive Substanzen zu identifizieren.

(1) Peptoid-Synthese an Zellulosemembranen

Die Ähnlichkeit von Oligo-N-alkylglycinen (Peptoiden) zu Peptiden sowie die Vereinbarkeit ihrer Synthese mit den Bedingungen der SPOT-Technik ließen sie als besonders geeignete Kandidaten für eine Erweiterung der SPOT-Synthese von Peptiden auf Peptidmimetika erscheinen. Die Peptoide wurden nach der 1992 für die Synthese am Harz beschriebenen Sub-Monomer-Methode synthetisiert, bei der die N-Alkylglycin-Monomere zweistufig durch Bromacetylierung und nachfolgende Bromsubstitution durch ein primäres Amin aufgebaut werden. Die Kernaufgabe bei der Anpassung der Synthesebedingungen an Zellulosemembranen war dabei die Entwicklung einer N/O-selektiven Bromacetylierungsmethode, da die Anwesenheit freier Membran-Hydroxyfunktionalitäten ein Reagenz erfordert, welches eine N-Acylierung in Anwesenheit von O-Nukleophilen zuläßt. Durch Untersuchung mehrerer Aktivester der Bromessigsäure konnte gezeigt werden, daß der kristalline Bromessigsäure-2,4-dinitrophenylester im Hinblick auf Ausbeute und N/O-Selektivität optimale Eigenschaften besitzt. Im Anschluß an die Bromacetylierungsmittel wurden 46 primäre Amine auf ihre Anwendbarkeit bei der Synthese von Modell-Tripeptoiden untersucht. Aus den Ergebnissen konnten Gesetzmäßigkeiten abgeleitet werden, die eine Abschätzung der Verwendbarkeit von Aminen für die Peptoidsynthese im Hinblick auf Flüchtigkeit, sterischen Anspruch, Nukleophilie des Stickstoffatoms sowie vorhandene funktionelle Gruppen in Seitenketten ermöglichen.

(2) Synthese und Screening von Peptoid-Bibliotheken

Unter den optimierten Synthesebedingungen wurden zwei Bibliotheken mit jeweils 8000 Tri- bzw. Hexapeptoiden synthetisiert. Die Trimeren-Bibliothek beinhaltete dabei den gesamten Sequenzraum basierend auf 20 Bausteinen, während die Verbindungen der Hexameren-Bibliothek aus einem wesentlich größeren, auf 40 Bausteinen basierenden Sequenzraum statistisch ausgewählt wurden. Um zu überprüfen, ob sich die Bibliotheken zur de novo Auffindung von Protein-Liganden eignen, wurden sie auf Bindung zum monoklonalen Antikörper Tab-2 untersucht. Es konnten in beiden Fällen bioaktive Oligomere identifiziert werden (Trimere: KD = 87 µM, Hexamere: KD = 2.7 µM), die sich vom Peptid-Epitop des Antikörpers [VVSHFND] deutlich unterschieden.

(3) Rückgratmodifizierte Peptoide

Mit dem Ziel, Rückgratmodifikationen in Peptoide einzufügen, wurden neun Biselektrophile im Rahmen eines “chemischen Screenings” zur Synthese eines Modell-Trimers verwendet. Vier der Bausteine waren geeignet und ermöglichten damit die Einführung von &bgr;-Peptoid-, m- und p-Aminomethylbenzoesäure- sowie Carbamat-Einheiten in Peptoide. Beim Versuch, in analoger Weise auch Harnstoffe zugänglich zu machen, wurde unter den Linker-Spaltungsbedingungen eine Cyclisierung zu Hydantoinen beobachtet. Diese interessante Reaktion wurde näher untersucht, um die SPOT-Methode auf die Synthese von Hydantoinen als heterocyclische Struktur zu erweitern.

(4) Synthese von Hydantoinen an Zellulosemembranen

Die Bildung von Hydantoinen in einer Cyclisierungsreaktion, bei der Ammoniak aus einem Amid freigesetzt wird, wurde an fester Phase noch nicht genutzt, während dieser Reaktionstyp in Lösung bereits intensiv untersucht wurde. Durch eine Optimierung der Cyclisierungsbedingungen ließ sich die zunächst unvollständige Reaktion zur Vollständigkeit bringen. Auch C-substituierte Hydantoine konnten durch Verwendung von &agr;-Aminosäureamiden bzw. -tert-butylestern enantiomerenrein zugänglich gemacht werden.

Peptidmimetika SPOT-Synthese Kombinatorische Chemie N-Alkylglycine Peptoide Hydantoine Bromessigsäure N/O-selektive Acylierung Festphasen-Synthese Zellulosemembranen Festphasen-Screening Antikörper-Liganden de novo

Abstract

SPOT-synthesis on cellulose membranes was introduced as a highly efficient method for the parallel synthesis of peptides in 1992. The most important applications of libraries synthesized by SPOT-synthesis are solid phase binding assays. Within this work the extension of the SPOT-method to the synthesis of various peptidomimetics and the identification of bioactive substances by screening of corresponding libraries is described.

(1) peptoid synthesis on cellulose membranes

The similarity of oligo-N-alkylglycines (peptoids) and peptides as well as the compatibility of their synthesis with the conditions of the SPOT-technique made them ideally suited for the extension of the SPOT-synthesis from peptides to peptidomimetics. The peptoids were synthesized by the sub-monomer approach originally developed for the synthesis on standard resins in 1992. N-alkylglycine monomers are hereby synthesized in a stepwise manner by bromoacetylation and subsequent substitution of the bromine atom by a primary amine. The most critical point in the adaptation of the synthesis conditions was the development of an N/O-selective reagent for bromoacetylation due to the presence of free hydroxyl functionalities of the membrane support requiring a reagent suitable for N-acylation in the presence of O-nucleophiles. Several active esters of bromoacetic acid were synthesized and tested whereby crystalline 2,4-dinitrophenylbromoacetate gave the best results with respect to yield and N/O-selectivity. After optimization of bromoacetylation 46 primary amines were applied to the synthesis of model tripeptoids. Rules for the applicability of amines in peptoid synthesis with respect to volatility, sterical demand, nucleophilicity of the nitrogen atom and compatibility with sidechain functional groups were derived from the results.

(2) synthesis and screening of peptoid libraries

Two libraries consisting of 8000 tri- and hexapeptoids respectively were synthesized under optimized conditions. The library of trimers displayed the entire sequence space based on 20 building blocks, whereas the sequences of the hexamers were selected statistically from the sequence space based on 40 building blocks. In order to examine the suitability of the libraries for the de novo identification of protein ligands they were screened for binding to the monoclonal antibody Tab-2. Bioactive peptoids could be identified in both cases (trimers: KD = 87 µM, hexamers: KD = 2.7 µM) both differing significantly from the peptide epitope [VVSHFND].

(3) backbone modified peptoids

In order to introduce backbone modifications into peptoids nine biselectrophiles were applied in the synthesis of model trimers in a chemical screening. Four of the building blocks were well suited allowing the incorporation of &bgr;-peptoid, m- and p-aminomethylbenzoic acid and carbamate units into peptoids. When the introduction of urea-units in a similar approach was attempted hydantoins were formed during cleavage from the solid support. This interesting reaction was examined in detail in order to extend SPOT-synthesis to the synthesis of heterocycles.

(4) synthesis of hydantoins on cellulose membranes

The formation of hydantoins from terminal amides was not yet described in a solid phase synthesis, whereas it was examined intensively in solution. By optimizing the conditions of cyclization the reaction could be driven to completion. C-substituted hydantoins were obtained as single enantiomers, when &agr;-amino acid-amides or -tert. butylesters were used in the synthesis.

 peptidomimetics SPOT-synthesis combinatorial chemistry N-alkylglycines peptoids hydantoins bromoacetic acid N/O-selective acylation solid phase synthesis cellulose membranes solid phase screening ligands for antibodies de novo

&ded; &abb; &ch1;&ch2;&ch3;&ch4;&ch5;&ch6;&ch7;118 Allgemeine Experimentelle Bedingungen

Reagenzien

Die verwendeten Reagenzien wurden von den Firmen Advanced ChemTech (Bamberg, Deutschland), Aldrich (Steinheim, Deutschland), Bachem (Heidelberg, Deutschland), J.T. Baker (Phillipsburg, USA), Fluka (Deisenhofen, Deutschland), Lancaster (Mühlheim/Main, Deutschland), Merck Eurolab (Darmstadt, Deutschland), Neosystem (Straßburg, Frankreich), Novabiochem (Bad Soden, Deutschland) oder Sigma (Taufkirchen, Deutschland) bezogen und ohne weitere Aufreinigung verwendet. Das TentaGel-S-RAM-Harz wurde bei der Firma RAPP Polymere (Tübingen, Deutschland) und das Rink-Amid MBHA-Harz bei der Firma Novabiochem (Bad Soden, Deutschland) bezogen.

Zur SPOT-Synthese wurden Whatman 50 Membranen (Whatman Maidstone, UK) verwendet, die auf die benötigte Größe zurechtgeschnitten wurden.

Folgende Substanzen wurden nach literaturbeschriebenen Verfahren hergestellt:

4-Hydroxyphenylmethylamin: Synthese aus 4-Hydroxybenzonitril nach A.G. Johnston et al.[193]

Mono-Boc-geschützte &agr;,&ohgr;-Diamine: Synthese aus den entsprechenden Diaminen nach A.P. Krapcho et al.[147] oder von Fluka.

Lösungsmittel

Alle verwendeten Lösungsmittel wurden in der angegebenen Qualität ohne weitere Reinigung eingesetzt:

Acetonitril (Gradient grade, J.T. Baker); Dichlormethan (zur Synthese, Merck Eurolab); Diethylether (zur Synthese, Merck Eurolab); N,N-Dimethylformamid (LAB, Merck Eurolab); Dioxan (zur Synthese, Aldrich); Methanol (zur Synthese, Merck Eurolab).

Wasser wurde unter Verwendung einer Vollentsalzungsanlage (Milli-Q Plus, Millipore) entmineralisiert.

Die Lösungsmittel für Reagenzien, die zur SPOT-Synthese verwendet wurden, wurden über Molsieb gelagert: N-Methylpyrrolidon und Dimethylsulfoxid (beide: Fluka).

Chromatographie und Physikalische Daten

Dünnschichtchromatographische Kontrolle (DC-Kontrolle) und Rf-Wert-Bestimmung erfolgten auf mit Kieselgel beschichteten Aluminiumfolien (Kieselgel 60 F254, Schichtdicke 0.2 mm, Merck Eurolab). Die Detektion erfolgte durch Beobachtung der Fluoreszenzlöschung bei 254 nm sowie der Färbungen nach Eintauchen in Ninhydrinlösung (0.3% in 119 n-Butanol mit 3% Essigsäure) oder Molybdatophosphorsäurelösung (5% in Ethanol) und Heißluftbehandlung.

Säulenchromatographie (SC) wurde an Kieselgel (Kieselgel 60, 0.063 - 0.200 mm Merck Eurolab) durchgeführt.

(RP-)HPLC (präparativ) erfolgte mit einem System der Firma Merck/Hitachi (Quaternäre Pumpe L-6250, Variabler UV-Detektor L-7400, Interface D-7000, Software: HPLC Systemmanager D-7000 für NT 4.0) unter Verwendung einer Säule der Firma Merck Eurolab (LiChrospher 100, RP18, 10 x 250 mm) bei einem Lösungsmittelfluß von 6.0 ml/min; Die Laufmittel-Gradienten wurden aus einem analytischen Probe-Chromatogramm abgeleitet. Das verwendete Lösungsmittelsystem setzte sich aus den Komponenten A (H2O/0.1 Vol-% TFA) und B (CH3CN/0.1 Vol-% TFA) zusammen.

(RP-)HPLC-MS-Analysen wurden durch Chromatographie unter Verwendung eines Hewlett Packard Serie 1100-Systems (Entgaser G1322A, Quaternäre Pumpe G1311A, Automatischer Probengeber G1313A, Thermostatiertes Säulenfach G 1316A, Variabler UV-Detektor G1314A) und gekoppelter ESI-MS (Finnigan LCQ Ion-Trap-Massenspektrometer) durchgeführt. Dazu wurde einer Steuersoftware der Firma Finnigan verwendet (Navigator Ver 1.1 sp1). Als Stoßgas in der Ionenfalle diente Helium. Die Trennung erfolgte an RP-18-Säulenmaterial (Vydac 218 TP5215, 2.1 x 150 mm, 5 µm, C18, 300 A mit Vorsäule) bei 30°C und einem Fluß von 0.3 ml/min unter Anwendung eines linearen Gradienten für alle Chromatogramme (5-95% B innerhalb von 25 min, wobei A: 0.05% TFA in Wasser und B: 0.05% TFA in CH3CN). Die UV-Detektion erfolgte bei &lgr; = 220 nm. Retentionszeiten (RT) sind im Dezimalsystem angegeben (z.B. 1.9 min = 1 min 54 sec) und beziehen sich auf die Detektion im Massenspektrometer. Die Totzeit zwischen Injektion und UV-Detektion (HPLC) betrug 1.65 min, zwischen UV-Detektion und Massen-Detektion 0.21 min. Innerhalb eines Laufes erfolgte die Massenanalyse mittels einer Abfolge verschiedener Spektren-Typen: (a) Standard-Spektren in den Massen-Bereichen 50-600 und 150-2000, (b) MS2-Spektren der beiden intensivsten Ionen im Bereich 50-600 mit einer Kollisons-Energie von 24% und (c) Collision-Induced Dissociation- (CID-)Spektren im Bereich 50-600 bei 35% Kollisions-Energie. Für Produkte mit einer Masse 600 < M < 1000 wurde im Bereich 50-1000 anstelle von 150-600 gearbeitet. Die Zuordnung der Reaktionsprodukte zu den Signalen des UV-Detektors der HPLC wurde durch Anwendung von Massenfiltern für die gesuchte(n) Masse(n) durchgeführt. Die theoretischen Massen sind mit den exakten Massen der Hauptisotope berechnet. Die angegebenen Werte beschreiben die beobachtete Masse m/z, wobei im Massen-Bereich m/z < 1000 gewöhlich das M+H+ bzw. (selten) M+Na+-Ion die intensivsten Signale ergeben (keine Hochladungen wie z.B. M+2 H+). Die Beschreibung der Massenspektren wurde auf Signale mit einer Intensität > 15% sowie auf charakteristische Signale > 5% beschränkt (die Signalintensität in % ist in Klammern angegeben). Die Werte wurden auf 10%-Schritte gerundet. Die Genauigkeit des Massenspektrometers beträgt ca. m/z ± 0.2.

Schmelzpunkte wurden mit dem Gerät 9200 der Firma Elektrothermal gemessen.

120 FT-IR-Spektren wurden mit einem Gerät der Firma Bruker (IFS 66) aufgenommen. Die Peakmaxima sind in Wellenzahlen () in cm-1 angegeben.

UV-Absorbtionen wurden mit dem Gerät Ultrospec 3000 der Firma Pharmacia Biotech gemessen.

Kernspinresonanz- (NMR-)Spektren wurden an den Geräten Varian Unity-plus 300 und Unity-plus 500 aufgenommen. Als interner Standard diente in 1H-NMR-Spektren Tetramethylsilan (&dgr;H = 0.00 ppm) oder Signale der Restprotonen aus CDCl3 (&dgr;H = 7.24 ppm) oder [D6]-DMSO (&dgr;H = 2.50 ppm). Die 13C-NMR-Spektren wurden breitbandentkoppelt und, wenn nicht anders angegeben, mit APT aufgenommen und mittels internem Standard referenziert (CDCl3: &dgr;C = 77.0 ppm, [D6]-DMSO: &dgr;C = 39.4 ppm). Zugeordnete Signale sind im Einklang mit dem gemessenen Signal-Vorzeichen (prim/tert-C oder sek/quart-C). In 19F-NMR-Spektren diente CFCl3 (&dgr;F = 0 ppm) als interner Standard. Alle Verschiebungen (&dgr;) sind in ppm, alle Kopplungskonstanten (J) in Hz angegeben. Bei den Kopplungen handelt es sich, wenn nicht anders angegeben, um H,H-Kopplungen. Alle Spektren wurden bei 25°C aufgenommen.

ESI-Massenspektroskopie: siehe unter (RP-)HPLC-MS.

Elementaranalysen wurden am Institut für Chemie der Humboldt-Universität Berlin am Analyseautomat CHNS-933 der Firma LECO bestimmt. Die Brom-Bestimmung erfolgte durch Aufschluß der Verbindung nach Schöniger und Titration der freigesetzten Halogenidionen mit 0.01 N Hg(ClO4)2 unter Verwendung von Diphenylcarbazon als Indikator nach Dirscherl und Erne.

SPOT-Synthese

Die automatische SPOT-Synthese erfolgte mit dem Gerät Autospot Robot AMS 222 (Abimed, Langenfeld, Deutschland) unter Anwendung der Steuersoftware Autospot XL Ver. 2.02. Die benötigten Steuerdateien, in denen Ort und Sequenzen der SPOTs festgelegt wurden, wurden mit den Programmen LISA und DIGEN (beide: Jerini Bio Tools GmbH, Berlin, Deutschland) angefertigt. Die Waschschritte erfolgten in Edelstahlschalen (Merck Eurolab), die auf einem Wipptisch (Labortechnik Fröbel, Lindau/Bodensee, Deutschland) bewegt wurden. Für Reaktionen bei erhöhter Temperatur wurde die Membran in einer Edelstahlschale auf einer regelbaren Heizmatte (Merck Eurolab) erwärmt oder in einer mit einem Glasdeckel verschlossenen Glasschale in einem Haushaltsmikrowellenofen bei 810 W Mikrowellenleistung behandelt. Einzelne SPOTs wurden mit einem Büro-Locher ausgestanzt und zur Weiterbehandlung in eine Mikrotiterplatte oder 2.0 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt. Thermomixer 5437, Zentrifuge 5475C und Vakuumzentrifuge 5301 der Firma Eppendorf wurden zur Behandlung von Zellulosespots in Eppendorf-Reaktoren verwendet. Zur Beschleunigung des Lösungsvorganges von Reagenzien für die SPOT-Synthese wurde ein Ultraschallbad verwendet (Sonomatic 300 PC). Zur Spaltung des Photo-Linkers 48 wurde UV-Licht verwendet, welches mit dem Gerät Vilber Lourmat TFX 20 LC (7 mW/cm2 bei 320-390 nm, Bestrahlungsfläche: 20 x 20 cm) oder Beltron UV-121 Trockner 50/II [340 mW/cm2 bei &lgr; > 310 nm (Borsilikat-Filter)] erzeugt wurde. Bei den angegebenen UV-Energiedichten handelt es sich um Herstellerangaben.

Bindungsstudien

Die monoklonalen Antikörper Tab-2 und TE-33 wurden von W. Höhne (Institut für Biochemie, Charité, Humboldt-Universität, Berlin) bzw. T. Scherf (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel) zur Verfügung gestellt.

Die Bestimmung von Bindung an zellulosegebundene Peptoid-Bibliotheken erfolgte mit dem LumiImager™ der Firma Boehringer Mannheim (Mannheim, Deutschland), bei der auch die Reagenzien Blocking Reagent und Luminescence Substrate Solution A und B erworben wurden. Die verwendete TRIS-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) war 10 mM und auf pH = 8.0 eingestellt. Der anti-Maus IgG Nachweis-Antikörper wurde von Sigma (Taufkirchen, Deutschland) bezogen.

Die Bestimmung von Dissoziationskonstanten mittels Oberflächen-Plasmonenresonanz wurde mit einem System der Firma Biacore AB (Uppsala, Schweden) durchgeführt [Gerät: Biacore X, Software: Biacore X Control Software 2.1, BIAevaluation 3.0.1, Sensor Chip: CM5, Puffer: HBS-EP [Zusammensetzung: HEPES (0.01 M, pH = 7.4); NaCl (0.15 M), EDTA (3 mM), Polysorbat 20 (0.005%, v/v)], Immobilisierung: Kit zur Aminkopplung, Regenerierung: Glycin/HCl-Puffer (10 mM, pH = 2.0)].

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